專利名稱：：中藥刺五加治療帕金森病有效部位提取方法
技術領域：
：本發明屬于中草藥刺五加提取工藝
技術領域：
，具體是指一種以中草藥刺五加治療帕金森病有效部位的提取方法。冃夙儀不來自世界帕金森病協會的統計數字表明，全球帕金森病患者超過400萬人，其中我國有170萬。研究表明，近20年來，我國大城市患此病的人數猛增。據估計，我國每年有近K)力人成為新發的帕金森病患者。患者病后出現肢體震顫、僵直、行動遲緩和姿勢平衡障礙以及植物神經癥狀，病情呈進行性加重，嚴重限制病人的活動能力及影響病人的生活質量，給病人造成極大的痛苦，也給社會和家庭帶來嚴重的負擔，所以迫切需求尋找預防和治療帕金森病的有效中藥，以延緩帕金森癥的進程和防止病情的加重。刺五加為五加科植物刺KM！(Acanthopanaxsenticosus(Rupr.etMaXim.)Harms.)的干燥根禾口根蓬。二)-:產于黑龍江-行山區。味辛、微苦、性溫、無毒，具有益腎健脾，補腎安神作用。目前刺五加復方和刺五加注射液已用于帕金森病的臨床治療，并取得了一定療效，但是迄今為止，尚未見有刺五加治療帕金森病有效部位的提取方法，也未見將該有效部位用于帕金森病的治療，所以篩選刺/丄加有效部位治療帕金森病具有廣闊的市場開發前景。
發明內容本發明的目的是提供一種中草藥刺五加治療帕金森病的有效部位提取工藝方法。本發明的目的是通過以下措施來實現的本發明采用水煎煮法、水提醇沉法、大孔吸附樹脂法對刺五加進行提取純化，得到八個組分，通過藥效學實驗方法得到刺五加治療帕金森病的有效部位，確定有效部位的提取方法。本發明所要解決的技術問題是提供一種剌五加有效部位提取物的提取方法工藝及其藥效學實驗。本發明通過以下技術方案實現的一、刺五加有效部位提取工藝取刺五加藥材，粉碎，用水提取，加水4-IO倍量，煎煮1一4小時，水煎液濃縮。濃縮液置于塑料離心管，向其中緩慢加入50-95%乙醇，并不斷攪拌，至一定醇濃度，0-20L'靜置6-24h、于1500-5000轉/分離心5-20rain,分別收集上清液，上清液回收乙醇后.tA:孔吸附樹脂柱，藥液與樹脂體積比(1:H:10)，依次用0-95%乙醇洗脫,分別收集乙醇洗脫液，回收乙醇，混合洗脫物，得到刺五加有效部位提取物。二、藥效學實驗本發明所述方法得到的八個組分分別做藥效學實驗。實驗動物C57小鼠，由黑龍江省腫瘤防治研究所提供。實驗方法MPTP造模，注射10---40tng/kg,連續5-20天。八個組分濃縮液連續灌胃10-30天，測定小鼠爬竿時間、中腦MA0-B活性、紋狀體DA含量。統計學分析實驗數據。結論通過以上藥效學實驗可以得知，本發明所述方法得到^J組分中有刺:/!.加的有效部位，本發明的有效部位提取物對帕金森病有良好的藥效。本發明刺五加有效部位提取方法的有益效果體現在(1)提取工藝簡單，不需高溫高壓和特殊設備，安全，易于操作且成本低。(2)應用本發明，可以除去大量的蛋.白質，糖類，淀粉等雜質。由于嚴格控制了提取和濃縮的濃度，其有效部位含量在60%以上。(3)利用本發明得到的刺五加提取物質量穩定，富含活性成分，具有保護神經元的藥理作用.因此可以用來制備療效好，安全可靠的防治帕金森病的藥物。具體實施例方式一、提取工藝實施例實施例1將刺五加干燥根及根莖切片1000g,粉碎，浸泡30分鐘，加水6倍量，煎煮1時，水煎液濃縮至lg/ml。濃縮液置于塑料離々管，向其中緩慢加入95%乙醇，并不斷攪拌，至醇濃度達到70%，4'C靜置12h，于3500轉/分離心10min，收集上清液，上清液回收乙醇至盡，干燥、粉碎，與AB-8型大孔樹脂混合，上AB-8型大孔吸附樹脂柱，用蒸餾水洗脫至無色，收集洗脫液，回收乙醇，再用50%乙醇洗脫至無色，收集洗脫液，回收乙醇，再用70《乙醇洗脫至無色，收集洗脫液，回收乙醇，將3種洗脫物混合，得到剌五加有效部位提取物。實施例2將刺五加干燥根及根莖切片1000g，粉碎，浸泡30分鐘，加水8倍量，煎煮1小時，煎煮2次，水煎液濃縮至2g/ml。縮液置于塑料離心管，向其中緩慢加入75%乙醇，并不斷攪拌，至醇濃度達到50%，20。C靜置12h，于3000轉/分離心20min，收集上清液，t清液回收乙醇至盡，干燥、粉碎，用水溶解至,度為2g/ml，上D101型大孔吸附樹脂柱，用6倍蒸餾水洗脫，洗脫液棄去，再用8倍50%乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，得到刺五加有效部位提取物。實施例3將刺五加干燥根及根莖切片1000g，粉碎，浸泡.30分鐘，加水10倍量，煎煮2時，煎煮2次，水煎液濃縮至3g/ml。濃縮液置于塑料離心管，向其中緩慢加入50%乙醇，并不斷攪拌，至醇濃度達到30%，2(TC靜置2'4h，于1500轉/分離心10min，收集上清液，上清液回收乙醇至盡，干燥、粉碎，與HZ-802型大孔樹脂混合，上HZ-802型大孔吸附樹脂柱，用10倍蒸餾水洗脫，洗脫液棄去，再用10倍20%乙醇洗脫，洗脫液棄去，再一用10倍40%乙醇洗脫，洗脫液棄去，再用10倍60%乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，再用10倍8();;乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，將兩種洗脫物混合，得到刺五加有效部位提取物。二、藥效實施例實施例1實驗藥物刺五加水煎液(I)和醇提液(II)實驗動物C57小鼠，由黑龍江腫瘤防治研究所提供實驗方法①模型制備模型組和給藥組每日腹腔注射MPTP20mg'kg—'體重，空白組以等量的生理鹽水腹腔注射，共10天。觀察模型小鼠行為改變、出現步長縮短、動作遲緩、震顫、豎毛、爬竿不能對外界刺激反應低下者作為衡量標準。②行為學實驗將一直徑為2cm的泡沫塑料小球固定于一根長50cm粗lcm的木桿頂端，木桿上纏2層紗布以防打滑。持小鼠尾部將其頭向下置于竿頂(以小鼠雙后肢至于球上為準)，讓其自然爬下，小鼠自站于竿頂至雙前肢接觸竿底平臺為爬完全長。記錄爬竿時間。③MAO-B檢測及方法.冰上剝離中腦，稱重，按l:20(W/V)加入預冷的0.5mol/L蔗糖和0.lraol/L磷酸鹽緩沖液(pH7,0),置玻璃勻漿器內冰浴下勻漿，離心(4。C,1500r/min)10min，取上清液繼續離心(4。C，1500r/mm)10min，將沉淀用上述緩沖液重新懸浮，再離心(4。C，1500r/rain)10min,所得沉淀用上述緩沖液稀釋至蛋白質含量為10mg/mL(以小牛血清蛋白為標準蛋白)，采用考馬斯亮藍G250法測定酶液蛋白含量，于--2(TC下儲存備用。按照單胺氧化酶試劑盒操作方法進行，在520nm下測定其氧化產物的光密度值0D，以U/nig表示MAO的活性。④紋狀體多巴胺含量測定斷頭取腦，剝離雙側紋狀體，稱重，液氮保存。樣品處理取各組小鼠紋狀體，加入0.05mol/l的高氯酸O.lml制備勻漿，離心誦0r/min,20min，取上清再離心10000r/mm，10min，取上清液20W.進樣。色譜條件色譜柱15cmX0.5cmlD,填料LichrosorbeRP(咖)，流動相6%甲醇-0.15mo丄/1氯乙酸緩沖液，內含0.imol1-'乙二胺四乙酸二鈉，125mg/L辛烷磺酸鈉，超聲脫氣，流速1.0ml/min。柱溫室溫。實驗結果表l<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注與模型組比較*P<0.01,"P〈0.05。結果表明，組(I)和組(n),均能改善帕金森病小鼠的運動協調能力和MAO-B活性，說明對帕金森病小鼠有治療作用。其中組(I)作用顯著。實施例2實驗藥物刺五加上清液(III)和沉淀(IV)實驗動物C57小鼠，由黑龍江腫瘤防治研究所提供實驗方法①模型制備模型組和給藥組每日皮下注射MPTP30mg'kg—i體重，空白組以等量的生理鹽水腹腔注射，共5天。觀察模型小鼠行為改變、出現步長縮短、動作遲緩、震顫、豎毛、爬竿不能對外界刺激反應低下者作為衡量標準。②行為學實驗將一直徑為2cm的泡沫塑料小球固定于一根長50cm粗lcm的木桿頂端，木桿上纏2層紗布以防打滑。持小鼠尾部將其頭向下置于竿頂(以小鼠雙后肢至于球上為準)，讓其自然爬下，小鼠自站于竿頂至雙前肢接觸竿底平臺為爬完全長。記錄爬竿時間。③MAO-B檢測及方法冰上剝離中腦，稱重，按l:10(W/V)加入預冷的0.32mol/L蔗糖和0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)，置玻璃勻漿器內冰浴下勻漿，離心(4'C，600r/min)10min，取上清液繼續離心(4°C，600r/min)10min，將沉淀用上述緩沖液重新懸浮，再離心(4。C,600r/"肌n)10min，所得沉淀用上述緩沖液稀釋至蛋白質含量為lmg/mL,(以小牛血清蛋白為標準蛋白)，采用考馬斯亮藍G250法測定酶液蛋白含量，于-2(TC下儲存備用。按照單胺氧化酶試劑盒操作方法進行'在520nm下測定其氧化產物的光密度值0D，以U/mg表示MAO的活性。④紋狀體多巴胺含量測定斷頭取腦，剝離雙側紋狀體，稱重，液氮保存。樣品處理取各組小鼠紋狀體，加入().4Vi高氯酸除蛋白，制備勻漿，12000/min4"C離心15min,取上清液進樣。色譜條件色譜柱Nova-PakC,s柱(150腿X4.Omra)，RF-474熒光檢測器，流動相0.lmol4'NaAc，0.丄moi'1乙二胺四乙酸二鈉，10%甲醇，HAc調PH5.1，超聲脫氣，流速L()ml/min。發射波長33()nm，激發波長290nm。柱溫室溫。實驗結果表2<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實驗方法①模型制備模型組和給藥組每日腹腔注射MPTP40mg'kg—'體重，空白組以等量的生理鹽水腹腔注射，共10天。觀察模型小鼠行為改變、出現步長縮短、動作遲緩、震顫、豎毛、爬竿不能對外界刺激反應低下者作為衡量標準。②行為學實驗將一直徑為2cm的泡沫塑料小球固定于一根長50cm粗lcm的木桿頂端，木桿上纏2層紗布以防打滑。持小鼠尾部將其頭向下置于竿頂(以小鼠雙后肢至于球上為準)，讓其自然爬下,小鼠自站于竿頂至雙前肢接觸竿底平臺為爬完全長。記錄爬竿時間。③MAO-檢測及方法冰上剝離中腦，稱重，按1:5(W/V)加入預冷的0.30mol/L蔗糖和0.OlmolZL磷酸鹽緩沖液(pH8.0)，置玻璃勻漿器內冰浴下勻漿，離心(20。C,3500r/min)15min，取上清液繼續離心(20。C，3500r/min)15min，將沉淀用上述緩沖液重新懸浮，再離心(20°C，3500r/min)15min,所得沉淀用上述緩沖液稀釋至蛋白質含量為lmg/niL(以小牛血清蛋白為標準蛋白)，采用考馬斯亮藍G250法測定酶液蛋白含量，于-2(TC下儲存備用。按照單胺氧化酶試劑盒操作方法進行，在242nm下測定其氧化產物的光密度值OD,以U/mg表示MAO的活性。④紋狀體多巴胺含量測定斷頭取腦，剝離雙側紋狀體，稱重，液氮保存。樣品處理取各組小鼠紋狀體，加入0.4V;高氯酸(每100ml含L-半光氨酸)0.4ml,制備勻漿，12000/min4。C離心15min，取上清液SOW進樣。色譜條件BeckmanC18色譜柱(15cmX0.46cmID)，電化學檢測器，工作電壓O.7V,流動相lOOMm磷酸氫二鈉，O.5mM乙二胺四乙酸二鈉，lmM辛烷磺酸鈉，1Cm甲醇，HAc調85.超聲脫氣，流速1.0ml/min。柱溫37°C。實驗結果表3爬竿時間、.MAO-B活性和紋狀體多巴胺含量測定<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注與模型組比較'P〈0.01,"P<0.05。其中在爬竿時間和MAO-B活性中組(VI)與組(VII)之間無顯著性差異(P>0.05、藥效學實驗結果表明，組(vi)和組(vn)均能顯著改善帕金森病小鼠的運動協調能力、降低MAO-B活性、提高中腦紋狀體DA含量，且在爬竿實驗和MAO-B活性測定中，兩組之間無顯著性差異，因此確定組(VI)和組(VII)為刺五加治療帕金森病的有效部位。權利要求1、刺五加有效部位的提取方法，該方法采用水煎煮法、水提醇沉、大孔吸附樹脂法對刺五加進行提取分離，得到所述有效部位。2、根據權利要求l的方法，其特征在于(1)將刺五加藥材，粉碎后水煎，濃縮干燥，得棕黑色粉末()，備用；(2)將刺五加藥材，粉碎后乙醇回流提取，l一3次，回收乙醇，T-燥，得棕黃色粉末UI),備用；(3)將(1)中藥液置于塑料離心管中，向其中緩緩加入50%-95%乙醇，并不斷攪拌，至醇濃度達到50-90%，靜置，于1500-5000轉/分離心5-20min，分別收集上清液和沉淀，上清液回收乙醇，濃縮干燥，得棕黃色粉末-(m)，備用；(4)將(3)中沉淀洗滌，加水溶解過濾，濃縮干燥，得棕黑色粉末(IV)，備用；(5)將(2)中濃縮液上大孔吸附樹脂柱，依次用0-95%乙醇洗脫，洗脫至無色，分別收集乙醇洗脫液，回收乙醇至盡，濃縮干燥，得粉末(V)、(VI)、(VII)、(Wl)，備用3、根據權利要求2所得組分分別做藥效學實驗，確定刺五加有效部位。4、利用權利要求2至3所述方法得到的刺五加有效部位的提取方法。5、根據權利要求1至4所述剌五加有效部位提取物的藥用用途，該提取物用于治療帕金森病。全文摘要刺五加治療帕金森病有效部位提取方法。本發明涉及中藥刺五加有效部位的提取方法。該方法是采用水煎煮法，水提醇沉法，大孔吸附樹脂法對刺五加進行提取分離，得到不同組分，通過藥效學實驗確定了刺五加治療帕金森病的有效部位及其提取方法。文檔編號A61K36/185GK101190246SQ20061015106公開日2008年6月4日申請日期2006年11月27日優先權日2006年11月27日發明者劉樹民,琳張申請人:劉樹民;張琳