具有抗腫瘤作用的雞血藤提取物及其制作方法

專利名稱：具有抗腫瘤作用的雞血藤提取物及其制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗腫瘤作用的中藥雞血藤，特別是具有抗腫瘤作用的雞血藤提取物及其制作方法。
背景技術(shù)：
雞血藤為豆科(Leguminosae)植物密花豆(Spatholobus suberectus Dunn.)的干燥藤莖。古籍記載其性溫，味苦、甘，歸肝、腎經(jīng)，有補(bǔ)血、活血、通絡(luò)之功效，為血分之圣藥，多用于月經(jīng)不調(diào)、血虛萎黃、麻木竣瘓、風(fēng)濕痹痛等癥，是一種常用的中藥材。
中國專利200510086165申請一種雞血藤保健茶，輔助治療肺癆久咳、風(fēng)濕痹痛、風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等。
雞血藤化學(xué)成分復(fù)雜，藥理作用多樣。目前文獻(xiàn)報道的雞血藤主要含黃酮類、三萜類、甾醇類以及蒽醌類化合物，其中黃酮類成分最多，包括異黃酮類，如芒柄花素(Formononetin)、芒柄花甙(Ononin)、櫻黃素(Prunetin)等；二氫黃酮類，如密花豆素；擬雌內(nèi)酯類，如苜蓿內(nèi)酯(medicagol)等；查爾酮類，如異甘草素(isoliquiritigenin)、2’，4’，3，4-四羥基查爾酮(2’，4’，3，4-tetrahydroxy chalcone)；花青素類，如表兒茶精(epicatechin)、原兒茶酸(procatechuisacid)、兒茶素(catechin)等。以往的研究表明，雞血藤能擴(kuò)張外周血管，降低血壓；抑制血小板凝聚；降脂，抗動脈硬化；促進(jìn)腎臟總磷代謝；對免疫系統(tǒng)有雙向調(diào)節(jié)作用。近幾年對雞血藤刺激骨髓造血功能的研究較多，雞血藤能升高因60Co照射和腹腔注射鹽酸苯肼引起的骨髓抑制性貧血小鼠的紅細(xì)胞、白細(xì)胞，并刺激BFU-E、CFU-E和CFU-GM的增殖。雞血藤體內(nèi)誘導(dǎo)制備的小鼠巨噬細(xì)胞、脾細(xì)胞、肺和骨骼肌體外條件培養(yǎng)液，能明顯促進(jìn)正常小鼠和貧血小鼠的骨髓細(xì)胞增殖，考慮與其直接或間接刺激造血微環(huán)境的基質(zhì)細(xì)胞分泌較高活性的造血生長因子有關(guān)。但迄今為止尚未發(fā)現(xiàn)雞血藤具有直接抑制腫瘤生長的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供具有抗腫瘤作用的雞血藤提取物及其制作方法，雞血藤提取物是用中藥材雞血藤制備的。用本發(fā)明方法提取的雞血藤提取物具有抗腫瘤作用，特別是具有直接抗腫瘤作用。本發(fā)明的目的是按如下的技術(shù)方案實現(xiàn)的。本發(fā)明為具有抗腫瘤作用的雞血藤提取物，其特征是它是由中藥材雞血藤提取制備而成的。所述的腫瘤細(xì)胞包括人高轉(zhuǎn)移巨細(xì)胞肺癌PG、人腸腺癌HT-29、人肺腺癌A549、人胰腺癌PANC-1、人肝癌SMMC-7721、大鼠小腸上皮細(xì)胞癌IEC-6以及小鼠移植性Lewis肺癌。
其制作方法包括以下步驟1)制作原料藥，將中藥材雞血藤去除雜質(zhì)，粗細(xì)分開；用水浸泡8-24小時，洗凈泥土，取出，悶潤8-12小時，至內(nèi)外濕度一致，切片，曬干，過篩，制成原料藥。
2)水溶性提取將原料藥碎成小塊，加去離子水浸泡1h，回流提取，濾過，冷藏過夜；取上清液濃縮至稠膏，真空干燥，為水溶性提取物；或用下述的步驟3)代替步驟2)，3)醇溶性提取將原料藥碎成小塊；加入80％乙醇浸泡過夜；回流提取三次，濾過，合并提取液，冷藏過夜；取上清液減壓回收乙醇至無醇味，繼續(xù)濃縮至稠膏；真空干燥，得醇溶性提取物。
以上為初步提取步驟。還可進(jìn)一步純化提取，增加以下步驟4)聚酰胺柱層析產(chǎn)物將水溶性提取物或醇溶性提取物加水溶解；上已處理好的聚酰胺柱，水洗至洗出液無色后，換不同濃度乙醇洗脫，分別收集洗脫液?；厥找掖贾翢o醇味，經(jīng)水浴蒸至稠浸膏，真空干燥得各洗脫物。
所述洗脫用乙醇的濃度為從20％-95％；推薦的乙醇濃度為50％或70％或95％。
本發(fā)明雞血藤提取物有3種，由步驟2)取得的水溶性提取物、由步驟3)取得的醇溶性提取物和由步驟4)取得的聚酰胺柱層析產(chǎn)物，三者均能抑制腫瘤細(xì)胞的生長。水溶性或醇溶性提取較簡單，其實驗用藥劑量偏大，但成本較低，可用于中藥湯劑配方以及顆粒制劑、膠囊制劑中，有一定的抑瘤效果。聚酰胺柱層析產(chǎn)物為在該水溶性或醇溶性提取的基礎(chǔ)上，采用聚酰胺層析柱和乙醇洗脫液對其進(jìn)一步分離純化，以顯著提高效果，但成本較高，可用于滴丸、片劑等。試驗證明，本發(fā)明雞血藤水溶性提取物、乙醇提取物、聚酰胺柱層析產(chǎn)物對上述的七種腫瘤細(xì)胞系均有一定的生長抑制作用。其特點是對不同種屬細(xì)胞敏感性不同。對同種屬、不同器官來源的細(xì)胞敏感性也不同。對同種屬、同器官來源，但組織學(xué)來源不同的細(xì)胞系、例如A549和PG作用也有明顯差異。
雞血藤化學(xué)成分復(fù)雜，主要含黃酮類、三萜類、甾醇類以及蒽醌類化合物，本發(fā)明中所述的水溶性提取物、醇溶性提取物或聚酰胺柱層析產(chǎn)物中均含有黃酮等化合物，采用聚酰胺柱層析后，黃酮類成分成為主成分，乙醇梯度洗脫后，對其黃酮類成分進(jìn)行了進(jìn)一步的分離，試驗結(jié)果顯示50％、70％和95％的乙醇洗脫物的抑瘤效果好，IC50值大幅度下降，說明黃酮類成分很可能是其抗癌成分。但是，其中一些酚酸類和大分子物質(zhì)也可能具有抗癌活性，要確切證明其中的抗腫瘤生物活性成分，有待進(jìn)一步研究。
在毒副作用方面，現(xiàn)有化療藥物通常抑制骨髓造血，產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用，而雞血藤未表現(xiàn)出明顯毒性，通過對動物外周血象的分析發(fā)現(xiàn)，白細(xì)胞和血小板數(shù)量未下降，而紅細(xì)胞數(shù)量明顯增加，增長率可達(dá)40.52％，這對改善腫瘤晚期貧血和化療引起的骨髓抑制是有益的。這也證明了雞血藤可以刺激骨髓而具有造血功能。
綜上所述，本發(fā)明提供的雞血藤提取物是用中藥材雞血藤提取制備的，用本發(fā)明方法制備的雞血藤提取物對腫瘤細(xì)胞具有直接殺傷作用，且未發(fā)現(xiàn)明顯的毒性。


圖1為雞血藤提取物作用于HT-29細(xì)胞系的IC50圖，圖中代號A雞血藤水提物B水洗脫物 C30％乙醇洗脫物D50％乙醇洗脫物 E70％乙醇洗脫物F95％乙醇洗脫物圖2為雞血藤提取物作用于A549細(xì)胞系的IC50圖，圖中代號A雞血藤水提物B水洗脫物 C30％乙醇洗脫物D50％乙醇洗脫物 E70％乙醇洗脫物F95％乙醇洗脫物具體實施方式
通過實施例具體說明本發(fā)明的內(nèi)容。
本發(fā)明具有抗腫瘤作用的雞血藤提取物，它是由中藥材雞血藤提取制成的。
所述的腫瘤細(xì)胞包括人高轉(zhuǎn)移巨細(xì)胞肺癌PG、人腸腺癌HT-29、人肺腺癌A549、人胰腺癌PANC-1、人肝癌SMMC-7721、大鼠小腸上皮細(xì)胞癌IEC-6、小鼠Lewis肺癌。
其制備方法包括以下步驟1)制作原料藥，其制作方法為將中藥材雞血藤去除雜質(zhì)，粗細(xì)分開。用水浸泡16小時，泡至9成透時，洗凈泥土，取出，悶潤10小時，至內(nèi)外濕度一致，切厚片，曬干，過篩，制成原料藥雞血藤飲片。本實施例中的原料藥雞血藤飲片購自北京衛(wèi)仁中藥飲片廠(批號603305101)，該廠生產(chǎn)的雞血藤飲片的制作方法如上所述。
2)水溶性提取將原料藥雞血藤飲片1kg；加去離子水浸泡1小時；回流提取1.5小時；濾過；冷藏過夜；取上清濃縮至稠膏；真空干燥(溫度60℃、真空度0.01Pa、時間6小時)，干膏稱重110.8g。
另一提取方法為醇溶性提取，按下述的步驟3)，3)醇溶性提取將原料藥雞血藤飲片1kg，加入80％乙醇5000ml浸泡過夜；回流提取三次，每次1.5h，濾過，合并提取液，冷藏過夜；取上清液減壓回收乙醇至無醇味，繼續(xù)濃縮至稠膏；真空干燥(溫度60℃、真空度0.01Pa、時間6小時)，干膏稱重173.12g。
以上為初步提取步驟。進(jìn)一步純化提取，增加以下提純步驟4)聚酰胺柱層析產(chǎn)物取水溶性或醇溶性提取的干膏，用水溶解(經(jīng)多次水溶解后，仍有部分不溶物，棄去)；上已處理好的聚酰胺柱(柱直徑5cm、柱高120cm)，水洗至流出液無色后，換不同濃度乙醇(30％、50％、70％、95％)梯度洗脫(每一梯度的乙醇用量以流出液近無色為度)，分別收集洗脫液；回收乙醇，至無醇味，經(jīng)水浴蒸至稠浸膏，真空干燥得各乙醇洗脫物，即純化提取物。
采用的實驗材料藥品與試劑聚酰胺(柱層析用，30-60目)，江蘇臨江試劑化工廠生產(chǎn)；95％藥用酒精北京市遠(yuǎn)弘要用酒精有限責(zé)任公司；95％乙醇(AR)北京化工廠；DMEM培養(yǎng)基，GIBCO公司；新生牛血清，奧地利PAA股份有限公司(Cat NoB15-001)；胰蛋白酶，GIBCO公司；噻唑藍(lán)(MTT)，華美公司進(jìn)口分裝。
細(xì)胞系及細(xì)胞培養(yǎng)人高轉(zhuǎn)移巨細(xì)胞肺癌PG由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部病理室提供。人腸腺癌HT-29，人肺腺癌A549，人胰腺癌PANC-1、人肝癌SMMC-7721、大鼠小腸上皮細(xì)胞癌IEC-6由本科中心實驗室提供。細(xì)胞培養(yǎng)條件高糖DMEM培養(yǎng)基，含10％小牛血清和雙抗(青霉素100u·ml-1、鏈霉素100μg·ml-1)，置37℃、5％CO2的恒溫箱中傳代培養(yǎng)。
動物與瘤株選用清潔級C57BL/6小鼠，雄性，18-20g。中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物研究所生產(chǎn)，許可證號SCXK京2004-0001。小鼠移植性Lewis肺癌由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所提供。
試驗過程MTT比色法 將單層貼壁且處于對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞，用0.25％Trypsine～0.02mol·L-1EDTA消化液消化后，用含10％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋成單細(xì)胞懸液，根據(jù)不同細(xì)胞生長速率，調(diào)細(xì)胞濃度2.5～5×107·L-1。將上述細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100μl，于37℃、5％CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后，每孔加100μl含藥或無藥培養(yǎng)液，設(shè)空白及細(xì)胞對照組、各濃度用藥組、各濃度藥品調(diào)零組，每組至少設(shè)三個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)72小時后，每孔加入MTT(5g·L-1)15μl，同等條件繼續(xù)培養(yǎng)4小時。棄培養(yǎng)液，每孔加入150μl DMSO，充分震蕩混勻，使結(jié)晶溶解，在奧地利SA1000酶聯(lián)儀上測490nm處光吸收度(A值)，并計算細(xì)胞生長抑制率(IR)。實驗重復(fù)3遍。
細(xì)胞生長抑制率(IR)＝[(對照組OD值-實驗組OD值)/對照組OD值]×100％所有數(shù)據(jù)采用SAS 6.12統(tǒng)計分析軟件處理，以x±s表示。應(yīng)用Origin軟件根據(jù)細(xì)胞生長抑制率(IR)計算藥物半數(shù)抑制濃度(IC50)。
體內(nèi)抑瘤實驗 將荷瘤(Lewis肺癌)14天的小鼠(C57BL/6)頸椎脫臼法處死，無菌選取新鮮瘤組織，剪碎研磨，加生理鹽水稀釋成單細(xì)胞懸液并計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度5×106·mL-1，于每只小鼠右前肢腋部皮下接種0.2mL。接種后第二天稱重，將荷瘤小鼠隨機(jī)分成對照組、雞血藤聚酰胺柱層系產(chǎn)物(95％乙醇洗脫物)高、中、低劑量組，每組10只。對照組每只每天純凈水灌胃0.3mL，雞血藤組分別按0.6、0.3、0.15g·kg-1灌胃給藥，每只每天0.3mL，連續(xù)給藥12天。于末次給藥次日處死小鼠，稱體重及瘤重，計算抑瘤率。實驗重復(fù)2次，合并統(tǒng)計。
抑瘤率(％)＝(1-實驗組平均瘤重/對照組平均瘤重)×100％試驗效果1.雞血藤水溶性提取物對六種腫瘤細(xì)胞生長的影響參見表1、表2，雞血藤水溶性提取物對六種腫瘤細(xì)胞均有一定生長抑制作用，具有劑量依賴關(guān)系。特點是對不同種屬細(xì)胞敏感性不同，大鼠腸上皮癌細(xì)胞IEC-6的IC50僅為人腸上皮HT-29的四分之一。對同種屬、不同器官來源的細(xì)胞敏感性也不同，對肝癌細(xì)胞SMMC-7721作用最強(qiáng)，腸腺癌HT-29最差。對同種屬、同器官來源，但組織學(xué)來源不同的細(xì)胞系A(chǔ)549和PG作用也有明顯差異。
表1不同濃度的雞血藤水提物對六種腫瘤細(xì)胞系的生長抑制作用(x±s，n＝3)

表2六種腫瘤細(xì)胞系應(yīng)用雞血藤水提物后的IC50(x±s，n＝3)

2.雞血藤醇溶性提取物對三種腫瘤細(xì)胞生長的影響雞血藤醇溶性提取物比水溶性提取物抗腫瘤活性強(qiáng)，其對A549細(xì)胞系、HT-29細(xì)胞系和PANC-1細(xì)胞系的IC50值與水提物相比約降低一倍，如表3、4所示。
表3不同濃度的雞血藤醇提物對三種腫瘤細(xì)胞系的生長抑制作用(x±s，n＝3)

表4三種腫瘤細(xì)胞系應(yīng)用雞血藤醇提物后的IC50(x±s，n＝3)

3.雞血藤的聚酰胺柱層析產(chǎn)物(純化提取產(chǎn)物)對二種腫瘤細(xì)胞生長的影響。
如圖1、2所示為雞血藤提取物、特別是雞血藤聚酰胺柱層析產(chǎn)物(將雞血藤的水溶性提取物上聚酰胺層析柱，用不同濃度乙醇洗脫獲得的洗脫物)作用于HT-29和A549細(xì)胞系的IC50圖。從圖1、2中可以看出，各乙醇洗脫物C、D、E、F與水溶性提取物A相比，用50％(D)、70％(E)、和95％(F)乙醇洗脫得到的乙醇洗脫物的抑瘤作用明顯高于雞血藤的水溶性提取物A的；其半數(shù)生長抑制濃度用量IC50減少約一半左右。且30％乙醇洗脫物C與水溶性提取物A之間無明顯差別，而水洗脫物B則基本無效。
4.雞血藤聚酰胺柱層析產(chǎn)物(95％乙醇洗脫物)對小鼠Lewis肺癌的抑制作用雞血藤95％乙醇洗脫物體內(nèi)具有一定抗腫瘤作用，呈劑量依賴關(guān)系，高劑量對小鼠移植性肺癌的抑制率可達(dá)31.01％(見表5)。
表5雞血藤95％乙醇洗脫物對小鼠Lewis肺癌的抑制作用(x±s)

注與對照組比較*P＜0.05結(jié)論用本發(fā)明方法制備的雞血藤提取物在體外對腫瘤細(xì)胞系有廣譜生長抑制作用，其純化制備產(chǎn)物IC50明顯降低。雞血藤提取物體內(nèi)實驗也表現(xiàn)出抗腫瘤活性，對小鼠移植性Lewis肺癌的抑制率可達(dá)31.01％。此外，雞血藤提取物對小鼠骨髓造血功能沒有抑制作用，可以明顯提高荷瘤小鼠紅細(xì)胞數(shù)量；且本發(fā)明雞血藤提取物的毒副作用小。
權(quán)利要求
1.具有抗腫瘤作用的雞血藤提取物，其特征是它是由中藥材雞血藤提取制備而成的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抗腫瘤作用的雞血藤提取物，其特征是所述的腫瘤細(xì)胞包括人高轉(zhuǎn)移巨細(xì)胞肺癌PG、人腸腺癌HT-29、人肺腺癌A549、人胰腺癌PANC-1、人肝癌SMMC-7721、大鼠小腸上皮細(xì)胞癌IEC-6、小鼠Lewis肺癌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抗腫瘤作用的雞血藤提取物的制備方法，其特征是包括以下步驟1)制作原料藥，將中藥材雞血藤去除雜質(zhì)，粗細(xì)分開；用水浸泡8-24小時，洗凈泥土，取出，悶潤8-12小時，至內(nèi)外濕度一致；切片，曬干，過篩，制成原料藥；2)水溶性提取將所述的原料藥碎成小塊；用去離子水浸泡；回流提??；濾過，冷藏過夜；取上清液濃縮至稠膏；真空干燥，得水溶性提取物；或3)醇溶性提取將所述的原料藥碎成小塊；加入80％乙醇浸泡過夜；回流提取三次，濾過，合并提取液，冷藏過夜；取上清液減壓回收乙醇至無醇味，繼續(xù)濃縮至稠膏；真空干燥，得醇溶性提取物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的具有抗腫瘤作用的雞血藤提取物的制備方法，其特征是還包括以下步驟4)聚酰胺柱層析產(chǎn)物將所述的水溶性提取物或醇溶性提取物加水溶解；上已處理好的聚酰胺柱，水洗至洗出液澄明后；換不同濃度乙醇洗脫，分別收集洗脫液。回收乙醇至無醇味，經(jīng)水浴蒸干，真空干燥得各洗脫物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的具有抗腫瘤作用的雞血藤提取物的制備方法，其特征是所述步驟4)中的洗脫用乙醇，包括濃度20％-95％的乙醇。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的具有抗腫瘤作用的雞血藤提取物的制備方法，其特征是所述步驟4)中的洗脫用乙醇的濃度為50％或70％或95％。
全文摘要
本發(fā)明為具有抗腫瘤作用的雞血藤提取物，其特征是它是由中藥材雞血藤提取制備而成。其制備方法包括以下步驟1)制作原料藥，將中藥材雞血藤用水浸泡8－24小時，洗凈泥土，取出，悶潤8－12小時，至內(nèi)外濕度一致；切片，曬干，過篩，制成原料藥；2)水溶性提?。换?)醇溶性提??；4)聚酰胺柱層析純化產(chǎn)物將所述的水溶性提取物或醇溶性提取物加水溶解；上已處理好的聚酰胺柱，水洗至洗出液澄明后；換不同濃度乙醇洗脫，分別收集洗脫液。回收乙醇至無醇味，經(jīng)水浴蒸干，真空干燥得各洗脫物。本發(fā)明雞血藤提取物是用中藥材雞血藤提取制備的，用本發(fā)明方法獲得的雞血藤提取物對腫瘤細(xì)胞具有直接殺傷作用，且毒副作用小。
文檔編號A61P35/00GK1939396SQ20061013771
公開日2007年4月4日 申請日期2006年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月26日
發(fā)明者王笑民, 唐勇, 何薇, 楊國旺 申請人:首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院