專(zhuān)利名稱(chēng)：Vegf緩釋注射微球支架及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，是一種載蛋白質(zhì)藥物VEGF(血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子vascular endothelial growth factor，VEGF)緩釋注射微球支架及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一種特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)因子，能促進(jìn)血管的增生、轉(zhuǎn)移和分化出新的血管，同時(shí)由于VEGF可以增強(qiáng)血管通透性，故又稱(chēng)作血管通透因子。最早于1989年由Ferrara等從牛腦垂體濾泡星狀細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中提純。重組人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(recombinant human vascular endothelial growth factor，rhVEGF)治療缺血性疾病已經(jīng)從廣泛的臨床前研究進(jìn)入了臨床試驗(yàn)階段并可望于近期成為治療性藥物應(yīng)用于臨床。(N.Ferrara，K.Alitalo.Clinical applications of angiogenicgrowth factors and their inhibitors，[J].Nature Med.1999，5(12)1359)。然而，與其他生長(zhǎng)因子相似，VEGF由于半衰期短而導(dǎo)致體內(nèi)降解速度過(guò)快(Jeffrey L.Cleland Ph.D，Eillen T.Puenas et al.Cuthbertson Development ofpoly-(D，L-Lactide-co-glycolide) microspheres fermulation containing recombinanthuman vascular endothelial growth factor to promote local angiogenesis[J].controlled Release 2001，7213)，從而限制了它的臨床應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，結(jié)合微球制備技術(shù)與組織工程支架技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)提供一種VEGF的緩釋注射微球支架及其制備方法，蛋白藥物VEGF可持續(xù)釋藥達(dá)4周，達(dá)到增加細(xì)胞存活率促進(jìn)其生長(zhǎng)從而增加新生血管的形成的作用，用于治療局部缺血性疾病。
近年來(lái)生物可降解的高分子材料廣泛應(yīng)用于蛋白多肽類(lèi)藥物緩釋微球的制備及組織工程技術(shù)，其中聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(lactide-co-glycolide)，PLGA]，由于其良好的生物相容性及生物降解性已被美國(guó)FDA批準(zhǔn)為藥用高分子材料使用。以PLGA作為微球基質(zhì)，體內(nèi)外降解實(shí)驗(yàn)證明，在藥物釋放過(guò)程中，整個(gè)聚合物骨架呈均勻性降解，隨著分子量的下降，骨架材料的親水性增強(qiáng)，由于水分的不斷滲入使蛋白多肽類(lèi)藥物持續(xù)釋放出來(lái)(Wang YM，Sato H，Horikoshi.In vitro and in vivo evalution of taxol release fromploy(lactic-co-glycotic acid)microspheres containing isopropyl myristate anddegradation of the microspheres.J Control Rel，1997，49157)。本發(fā)明就是使用PLGA作為基質(zhì)制備VEGF緩釋微球支架。本發(fā)明以PLGA為基基本骨架，制備VEGF緩釋注射微球支架，為具有多孔狀的載蛋白質(zhì)藥物微球，一方面微球中的孔洞通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)種植相應(yīng)細(xì)胞通過(guò)注射途徑定位到組織缺損部位，另一方面微球中的VEGF可以以恒定的釋藥速率釋放藥物來(lái)刺激細(xì)胞生長(zhǎng)分化形成新的組織。
本發(fā)明的VEGF緩釋注射微球支架，其組成包括基質(zhì)、VEGF、保護(hù)劑和碳酸氫銨，其特征在于所述基質(zhì)為聚乳酸∶羥基乙酸＝25∶75-75∶25的聚乳酸-羥基乙酸共聚物；所述保護(hù)劑包括碳酸鋅、血清白蛋白、海藻糖和甘露醇；VEGF與聚乳酸-羥基乙酸共聚物的重量比例為1∶100000至1∶10，微球粒徑在室溫時(shí)為50μm至1000μm。
本發(fā)明的VEGF緩釋注射微球支架制備方法有兩種1.w/o/w溶劑揮發(fā)法采用w/o/w復(fù)乳化-溶劑揮發(fā)法制備微球制備油相將基質(zhì)材料PLGA溶于有機(jī)溶劑二氯甲烷制成油相，濃度為30mg～300mg/ml；制備內(nèi)水相取適量VEGF和保護(hù)劑以及碳酸氫銨溶于水形成內(nèi)水相，碳酸氫銨濃度為2％-50％，VEGF濃度為1μg～1mg/ml，保護(hù)劑選自碳酸鋅、血清白蛋白、海藻糖和甘露醇等，其含量為1～5％；制備微球?qū)?nèi)水相加入上述油相均質(zhì)勻化(或超聲)形成初乳，將初乳迅速滴加在0.01-6％聚乙烯醇(PVA)水溶液中，機(jī)械攪拌充分勻化(攪拌速度為100～1800rpm)，室溫下繼續(xù)低速攪拌4小時(shí)(攪拌速度為100～300rpm)，洗滌，收集，冷凍干燥即可。
2.藥物以微粉形式加入的w/o/w溶劑揮發(fā)法制備油相將基質(zhì)材料PLGA溶于有機(jī)溶劑二氯甲烷制成油相，濃度為30mg～300mg/ml；制備內(nèi)水相取適量碳酸氫銨溶于水形成內(nèi)水相，碳酸氫銨濃度為2％-50％；制備VEGF微粉將適量的聚乙二醇(PEG)和VEGF及保護(hù)劑(其比例為4∶1∶2)分散于水中，為冷凍干燥后，用二氯甲烷洗滌、離心，除去PEG，得到VEGF微粉，保護(hù)劑選自碳酸鋅、血清白蛋白、海藻糖和甘露醇等；制備微球?qū)EGF微粉及內(nèi)水相加入油相，勻化分散乳化混勻形成初乳，將初乳迅速滴加在0.01-6％聚乙烯醇(PVA)水溶液中，機(jī)械攪拌充分勻化(攪拌速度為100～1800rpm)，室溫下繼續(xù)低速攪拌4小時(shí)(攪拌速度為100～300rpm)，洗滌，收集，冷凍干燥即可。
本發(fā)明所用的基質(zhì)材料PLGA，分子量為3000～40000，聚乳酸(PLA)∶羥基乙酸(PGA)為25∶75～75∶25，濃度為30mg～300mg/ml。均質(zhì)勻化條件為2000～10000rpm。
本發(fā)明中的微球支架采用了微球的常規(guī)制備方法與組織工程支架發(fā)泡法相結(jié)合，微球支架由血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，生物可降解基質(zhì)和添加劑組成，制備成VEGF緩釋注射微球支架，見(jiàn)圖1。
本發(fā)明VEGF緩釋微球經(jīng)體外釋放實(shí)驗(yàn)，緩釋達(dá)4周以上，釋放符合近似零級(jí)模式，可用于治療局部缺血性疾病的治療。
圖1為VEGF緩釋注射微球支架，圖2為方法1制備的VEGF緩釋注射微球體外累積釋放～時(shí)間曲線(xiàn)圖，圖3為方法2制備的VEGF緩釋注射微球體外累積釋放～時(shí)間曲線(xiàn)圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1w/o/w溶劑揮發(fā)法制備VEGF緩釋微球支架將PLGA(PLA∶PGA＝75∶25，Mw＝10,000)100mg溶于3.2ml二氯甲烷制成油相，VEGF3μg及碳酸氫銨100mg溶于1ml的重蒸餾水中(內(nèi)含3％海藻糖、5％甘露醇)形成內(nèi)水相，將其加入上述油相，均質(zhì)勻化，形成w/o的初乳，將含0.1％PVA溶液120ml置于攪拌容器中，將初乳在攪拌(450rpm)下快速加入外水相中充分勻化，五分鐘后，將轉(zhuǎn)速下調(diào)至200rpm同時(shí)外水相加入30ml蒸餾水，室溫下攪拌4小時(shí)，微球硬化后抽濾并洗滌，冷凍干燥。密封分裝后輻照消毒即可。粒徑500μm左右。
實(shí)施例2藥物以微粉形式加入的w/o/w溶劑揮發(fā)法制備VEGF緩釋微球支架將PEG(PEG6000)1.2mg和VEGF300μg及保護(hù)劑(碳酸鋅600μg)分散于1ml重蒸餾水中，旋渦混合3分鐘左右，分裝，冷凍干燥后，用二氯甲烷洗滌、離心，除去PEG，得到VEGF微粉。將PLGA(PLA∶PGA＝75∶25，Mw＝10000)100mg溶于3.2ml二氯甲烷制成油相，碳酸氫銨100mg溶于1ml的重蒸餾水中(內(nèi)含3％海藻糖、5％甘露醇)形成內(nèi)水相，將其加入上述油相，均質(zhì)勻化三分鐘后，加入微粉化的藥物再低速勻化一分鐘，形成w/o的初乳，將含0.1％PVA溶液120ml置于攪拌容器中，將初乳在攪拌(450rpm)下快速加入外水相中充分勻化，五分鐘后，將轉(zhuǎn)速下調(diào)至200rpm同時(shí)外水相加入30ml蒸餾水，室溫下攪拌4小時(shí)，微球硬化后抽濾并洗滌，冷凍干燥。密封分裝后輻照消毒即可。粒徑500μm左右。
實(shí)施例3VEGF緩釋微球經(jīng)體外釋放實(shí)驗(yàn)儀器0508-2型臺(tái)式低速離心機(jī)(上海醫(yī)療器械有限公司)；XW-80型旋渦混合器(上海第一醫(yī)學(xué)院儀器廠(chǎng))CARY 100紫外分光光度儀(美國(guó)varian公司)；CS501型超級(jí)恒溫水浴(上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司)，F(xiàn)A1004型萬(wàn)分之一電子天平(上海天平儀器廠(chǎng))；方法及操作精密稱(chēng)取含藥微球或空白微球約20mg置于7ml離心管中，加入1.5ml 10mM pH 7.2磷酸鹽緩沖液(含0.02％疊氮化鈉作為抑菌劑，0.02％F-68作為潤(rùn)濕劑)，置于37℃恒溫水浴搖床中，振蕩速度100rpm。分別在1天、3天取出離心管，置于離心機(jī)2000rpm離心5min，將釋放介質(zhì)小心吸出2mL并更換等量新的釋放介質(zhì)，以后每隔3-4天以上方法取樣一次，以空白微球的釋放上清液作為空白對(duì)照，按BCA試劑盒要求進(jìn)行加樣，反應(yīng)顯色后于562nm處測(cè)得其吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算求得釋放液中BSA的含量。
(1)方法1制備的VEGF緩釋微球支架結(jié)果見(jiàn)圖2。試驗(yàn)表明，蛋白質(zhì)藥物在微球支架中體外釋放達(dá)4周以上，其釋放近似符合零級(jí)動(dòng)力學(xué)模式。
(2)方法2制備的VEGF緩釋微球支架結(jié)果見(jiàn)圖3。試驗(yàn)表明，蛋白質(zhì)藥物在微球支架中體外釋放達(dá)4周以上，其釋放近似符合零級(jí)動(dòng)力學(xué)模式。
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域與組織工程學(xué)相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域，是一種組織工程用聚合物微球支架的制備方法及其包裹蛋白藥物應(yīng)用上的創(chuàng)新。本發(fā)明的新穎性在于，改變了傳統(tǒng)支架需手術(shù)植入體內(nèi)的傳統(tǒng)觀(guān)念，應(yīng)用注射劑型減小了傳統(tǒng)支架需手術(shù)植入的不便，增加了病人的順應(yīng)性。在微球支架中加入促細(xì)胞生長(zhǎng)的生長(zhǎng)因子類(lèi)蛋白質(zhì)藥物，使之在注射后緩慢釋放，從而達(dá)到增加細(xì)胞成活率、促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖并在體內(nèi)組織缺損部位形成新鮮組織，。本發(fā)明方法簡(jiǎn)便，易于操作，重現(xiàn)性好。蛋白質(zhì)藥物在微球支架中體外釋放達(dá)4周以上，其釋放近似符合零級(jí)動(dòng)力學(xué)模式。本發(fā)明的VEGF緩釋注射微球支架可應(yīng)用于各類(lèi)組織血管缺損的修復(fù)與治療。
權(quán)利要求
1.一種VEGF緩釋注射微球支架，其組成包括基質(zhì)、VEGF、保護(hù)劑和碳酸氫銨，其特征在于所述基質(zhì)為聚乳酸∶羥基乙酸＝25∶75-75∶25的聚乳酸-羥基乙酸共聚物；所述保護(hù)劑包括碳酸鋅、血清白蛋白、海藻糖和甘露醇；VEGF與聚乳酸-羥基乙酸共聚物的重量比例為1∶100000至1∶10，微球粒徑在室溫時(shí)為50μm至1000μm。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種VEGF緩釋注射微球支架，其特征在于其制備采用下列方法方法1w/o/w溶劑揮發(fā)法，或方法2藥物以微粉形式加入的w/o/w溶劑揮發(fā)法，具體步驟如下方法1將基質(zhì)溶于有機(jī)溶劑制成油相，濃度為30mg-300mg/ml；取VEGF、保護(hù)劑以及發(fā)泡劑碳酸氫銨溶于水中形成內(nèi)水相，其中碳酸氫銨濃度為2％-50％，VEGF濃度為1μg～1mg/ml，保護(hù)劑含量為1～5％；將內(nèi)水相加入上述油相，均質(zhì)乳化形成初乳，將初乳迅速滴加在0.01-6％聚乙烯醇水溶液中，機(jī)械攪拌充分勻化(攪拌速度為100～1800rpm)，室溫下繼續(xù)低速攪拌4小時(shí)(攪拌速度為100～300rpm)，洗滌，收集，冷凍干燥即得經(jīng)W/O/W溶劑揮發(fā)法制備的VEGF緩釋注射微球支架；方法2將基質(zhì)溶于有機(jī)溶劑制成油相，濃度為30mg-300mg/ml，取適量發(fā)泡劑碳酸氫銨溶于水中形成內(nèi)水相，碳酸氫銨濃度為2％-50％；將聚乙二醇(PEG)、VEGF及保護(hù)劑(其比例為4∶1∶2)分散于水中，冷凍干燥后，用二氯甲烷洗滌、離心，除去PEG，得到VEGF微粉；將內(nèi)水相加入油相，水油相混合勻化幾分鐘后，加入經(jīng)過(guò)冷凍干燥處理得到的VEGF微粉，勻化分散乳化混勻形成初乳，將初乳迅速滴加在0.01-6％聚乙烯醇(PVA)水溶液中，機(jī)械攪拌充分勻化(攪拌速度為100～1800rpm)，室溫下繼續(xù)低速攪拌4小時(shí)(攪拌速度為100～300rpm)，洗滌，收集，冷凍干燥即得藥物以微粉形式加入的w/o/w溶劑揮發(fā)法制備的VEGF緩釋注射微球支架。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種VEGF緩釋注射微球支架在各類(lèi)組織血管缺損的修復(fù)與治療中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種VEGF緩釋注射微球支架，其組成包括基質(zhì)、VEGF、保護(hù)劑和碳酸氫銨，其特征在于所述基質(zhì)為聚乳酸∶羥基乙酸＝25∶75－75∶25的聚乳酸－羥基乙酸共聚物；所述保護(hù)劑包括碳酸鋅、血清白蛋白、海藻糖和甘露醇；VEGF與聚乳酸－羥基乙酸共聚物的重量比例為1∶100000至1∶10，微球粒徑在室溫時(shí)為50μm至1000μm。其制備采用下列方法w/o/w溶劑揮發(fā)法，或藥物以微粉形式加入的w/o/w溶劑揮發(fā)法。本發(fā)明方法簡(jiǎn)便，易于操作，重現(xiàn)性好。蛋白質(zhì)藥物VEGF在微球支架中體外釋放達(dá)4周以上，其釋放近似符合零級(jí)動(dòng)力學(xué)模式，可應(yīng)用于各類(lèi)組織血管缺損的修復(fù)與治療中。
文檔編號(hào)A61K47/42GK1973828SQ20061011818
公開(kāi)日2007年6月6日 申請(qǐng)日期2006年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月10日
發(fā)明者鐘延強(qiáng), 齊琰, 魯瑩, 史國(guó)兵, 樊莉, 鄧?yán)?申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)