一種中藥活性成分組合物及其制備方法和用途的制作方法

專利名稱：一種中藥活性成分組合物及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種中藥丹參的活性成分丹參酚酸A和丹參酚酸B組合而成的組合物及其制備工藝，含有該組合物的藥物制劑及其在預防和治療心腦血管疾病藥物或保健品方面的應用。
背景技術：
心血管疾病是全球衛生保健和衛生資源的巨大負擔。根據2000年公布的最近的世界衛生報告，全世界每年有1700萬人死于心血管疾病，到2020年心血管死亡將比該數字增加50％，高達2500萬。心腦血管疾病已成為人類健康的頭號殺手，發病率在中老年人群中最高，其發病率和死亡率已超過腫瘤性疾病而躍居第一，是當今世界上威脅人類健康及生命的最嚴重的疾病之一，是全球醫務界最關注的疾病。在我國隨著傳染病被控制，人民生活水平的提高，患心血管疾病的人群也日益龐大。
丹參是我國傳統醫學中常用藥物之一，有活血祛瘀、通經活絡等功效。其作為治療心腦血管性疾病的藥物，具有廣泛的臨床用藥基礎，且療效顯著，有悠久的臨床應用歷史。近三十年來，國內外學者通過研究發現丹參中水溶性酚酸類成分是其治療心腦血管疾病的主要活性成分，并從中分離得到丹參酚酸A～G，紫草酸，迷迭香酸，丹參素，原兒茶醛等諸多酚酸類成分。藥理實驗結果證明這些酚酸類成分具有抗血栓、改善微循環、抗細胞脂質過氧化損傷等作用。其中丹參酚酸A活性最強，丹參酚酸B次之，原兒茶醛和丹參素活性最弱。其中丹參酚酸A和丹參酚酸B結構如下 丹參酚酸A(Sal-A) 丹參酚酸B(Sal-B)而臨床常用的丹參的各類制劑皆以脂溶性的丹參酮和/或水溶性的原兒茶醛/和或水溶性的丹參素為含量測定指標，存在提取工藝落后，提取物中有效成份含量低，成分不明確；制劑穩定性差，療效不穩定等缺點。因此，提取丹參中活性最強組分丹參酚酸A及活性次強組分丹參酚酸B，使提取物化學成分明確，有效成分含量高，是提高丹參制劑的穩定性，保證藥品質量，確保療效的關鍵。目前，國內已有企業進行丹參總酚酸類制劑的研究開發。
中國專利，CN1247855A，2000年公開了采用水提后過樹脂法提取丹參中酚酸的方法，因水提物雜質多，致使樹脂再生率低，提取物酚酸含量低。在此基礎上，中國專利，CN1384090A，2002年公開了改進的水提后醇沉再過樹脂的提取方法，增加了醇沉工藝，提高了提取物中酚酸的含量，改善了樹脂得再生率問題，但其提取物中占含量50％以上的成分為丹參酚酸B，活性最強的丹參酚酸A則含量極微。中國專利，CN1425659A，2003年公開了從丹參酚酸中提取丹酚酸B的方法，也存在上述的缺陷，丹參酚酸中活性最強的有效成分丹參酚酸A亦未能分離。中國專利，CN1513848A，2004年公開了采用水提、超濾、酸化后乙酸酯類萃取，再過反相柱的方法提取丹參中酚酸各組分的方法，所采用的提取及萃取方法文獻中已有報道，過反相柱分離的方法在專利CN1425659A中已有提及，該方法沒有說明如何具體分離到丹參中的酚酸各組分，對所分到的酚酸各組分的含量如何亦沒有說明。
此外，需要說明的是上述各方法均以丹參藥材所含的酚酸類成分中含量最高的丹參酚酸B為指標對酚酸類成分的提取及分離純化工藝進行考察及說明，而未提及如何提取和保留丹參中活性最強，但相對含量較低的成分丹參酚酸A。我們通過研究發現，丹參酚酸A和丹參酚酸B雖然同屬于酚酸類成分但其在理化性質方面卻存在很大的不同。因此，僅以丹參酚酸B為指標來考察酚酸類成分的提取及分離純化工藝，而不考慮活性最強的丹參酚酸A的提取效果，其研究方法存在很大的問題。
中國專利，CN200610012615.1，2006年公開了將丹參藥材用水或醇提取，提取濃縮液后，采用高溫高壓反應，過柱色譜純化丹酚酸A，再經調pH值，用有機溶劑萃取，濃縮干燥，制備含量大于80％丹酚酸A提取物的方法。丹參酚酸類成分易氧化、易聚合，不穩定，該方法所采用的高溫高壓條件，使提取物中的丹參酚酸A和丹參酚酸B的大部分遭到了破壞，因此，該方法存在較大缺陷。
目前，關于丹參水溶性成分的藥理活性報道很多，關于其中主要活性成分丹參酚酸A和丹參酚酸B的藥理研究也很多，但尚未有關于二者協同作用方面的藥理研究，而中藥成分復雜，其藥效多為各種化學成分協同作用的結果，我們通過研究發現丹參藥材、不同的丹參制劑中丹參酚酸A和丹參酚酸B的含量及二者比例相差很大，本發明發現丹參酚酸A和丹參酚酸B在心腦血管藥理作用方面具有協同作用，因此制備一種建立在藥效學基礎上的最合理的丹參酚酸A和丹參酚酸B組合物。

發明內容
本發明提供一種含有丹參酚酸A或其鹽和丹參酚酸B或其鹽組成的中藥活性成分組合物以及它們的制備方法。其中所述鹽是指丹參酚酸A和丹參酚酸B與某些堿或金屬鹽形成的金屬鹽類衍生物。
本發明提供一種中藥活性成分組合物，可以將丹參酚酸A和丹參酚酸B混合在一起制得。也可以是從丹參等植物中提取出來的，其中丹參酚酸A∶丹參酚酸B的重量比例為1∶0.01～100，優選為1∶0.05～20，更優選為1∶1～10。
丹參酚酸A和丹參酚酸B可以是鹽的形式，丹參酚酸A和B，可以與某些堿或鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽、鋅鹽等金屬鹽，如氫氧化鉀、氫氧化鈉、碳酸氫鈉、碳酸氫二鈉、醋酸鈉等，形成金屬鹽衍生物。這些衍生物具有與上述丹參酚酸A加B相同或相近的藥理活性和用途。可以通過丹參酚酸A和B與0.01～5N的堿或鹽溶液混合制備。
本發明的組合物，包括從丹參等植物中提取出來的，為此本發明還提供本發明組合物的制備方法，所用原料可以是中藥丹參及其同科屬植物南丹參、白花丹參、滇丹參、黃花鼠尾草、戟葉鼠尾草、華鼠尾草、新疆鼠尾草等，本發明提取的組合物主要成分為丹參酚酸A和丹參酚酸B，兩者合計的總含量在50％以上，最優達80％以上。
本發明的制備方法，具體包括以下幾個步驟步驟一、總丹參酚酸提取物的制備1、提取將丹參藥材粉碎成粗粉，加入0～80％乙醇，采用加熱回流、煎煮、浸漬、滲漉、超聲提取、微波提取或高壓提取，分離提取液，過濾、自然沉降或離心除去提取液中的固體雜質。
2、沉淀(1)水沉將提取液常壓或減壓濃縮，冷卻后加入2～8倍藥材量的去離子水，冷藏，靜置，過濾得濾液。
(2)醇沉將濾液常壓或減壓濃縮，冷卻后加入2～8倍藥材量的無水乙醇，調解醇濃度為50～85％進行醇沉，靜置，取上清液，減壓濃縮。
步驟二、丹參酚酸A和丹參酚酸B組合物的分離、精制丹參酚酸A和丹參酚酸B是分別或者同時從總丹參酚酸提取物中分離精制獲得的，其分離精制方法采用以下任意一種方法，或這些方法的任意組合(1)溶劑萃取法，(2)大孔吸附樹脂柱色譜法，(3)聚酰胺吸附柱色譜法，(4)反相硅膠柱色譜法，(5)葡聚糖凝膠柱色譜法。
上述方法(1)溶劑萃取法，具體操作為取提取步驟中得到的提取液、沉淀步驟中得到水沉濾液、醇沉濃縮液中的一種，適當濃縮后用適量水分散，加酸堿調節pH＝1～8，接著用乙酸乙酯、正丁醇、異丙醇、氯仿，或這些溶劑的組合物萃取，有機部分回收溶劑，即得萃取物。可以采用一步或多步萃取的方法，其中有機溶媒優選的是乙酸乙酯，或乙酸乙酯-乙醇適當比例混合溶劑。
上述方法(2)～(5)為柱色譜方法，具體操作均包含以下步驟a、色譜柱的制備；b、色譜柱的活化；c、樣品上柱、洗脫除雜將樣品溶液加至色譜柱，用水、醇或水與醇類、丙酮、乙腈的適當比例的混合溶劑洗脫除雜；d、樣品的洗脫除雜后的色譜柱用醇類、丙酮、乙腈或水與醇類、丙酮、乙腈的適當比例的混合溶劑洗脫樣品，收集洗脫液；e、濃縮、干燥。
上述方法(2)～(5)步驟b、色譜柱的活化，方法為采用水、甲醇、乙醇、丙酮、乙腈等任意一種溶劑，或由這些溶劑按一定比例配成的混合溶劑，或由這些溶劑與酸、堿配成的酸性或堿性溶劑進行活化。
上述方法(2)～(5)步驟c中，洗脫用水中可含微量的酸或無機鹽。
上述方法(2)～(5)步驟c中，可以單用水洗脫除雜質，或單用稀醇水溶液或低濃度的丙酮-水的混合溶劑洗脫除雜質；也可先用水洗脫然后再用稀醇水溶液或低濃度的丙酮-水的混合溶劑洗脫除雜質。
上述方法(2)～(5)步驟c中，醇-水的混合溶劑的濃度一般在70％以下，常用為5％～50％，最好用10～30％的濃度，丙酮-水的混合溶劑常用丙酮含量一般在30％以下，常用為5～25％，最好用5～15％的濃度，乙腈-水的混合溶劑常用乙腈含量一般在30％以下，常用為5～25％，最好用10～20％的濃度。
上述方法(2)～(5)步驟d中，適當濃度的醇-水、丙酮-水或乙腈-水溶液中，有機相所占比例一般大于10％，常用為20％～100％，最好用40％～100％的濃度。
洗脫過程為，先用低濃度醇或低濃度的丙酮-水溶液洗脫得到丹參酚酸B(含量大于50％，最優為大于80％)，然后再用較高濃度的醇或丙酮溶液等溶劑洗脫得到丹參酚酸A(含量大于50％，最優為大于80％)洗脫過程也可以為，直接用適當濃度的醇或適當濃度的丙酮-水溶液洗脫得到組合物--丹參酚酸A加B(二者總含量大于50％，最優為大于80％)。
上述方法(2)～(5)步驟e中，由于丹參酚酸類成分對熱不穩定，且容易氧化，因此采用低溫減壓濃縮，噴霧干燥、真空干燥或冷凍干燥。
本發明中藥活性成分組合物---丹參酚酸A加B的制備方法，以丹參酚酸A和丹參酚酸B兩種成分為指標，對提取、除雜、分離純化等工藝過程進行了比較及研究，提出了優選的0～80％乙醇加熱回流提取、兩步沉淀除雜。然后通過柱色譜的手段，結合TLC檢測手段，分別分離得到含量較高的丹參酚酸B和丹參酚酸A(二者含量均大于50％，最優為大于80％)，再將二者按適當比例混合在一起制得組合物--丹參酚酸A加B，或直接洗脫出活性成分組合物--丹參酚酸A加B(二者總含量大于50％，最優為大于80％)。
本發明優選的制備方法如下1)、提取取丹參飲片，加去離子水或0～20％乙醇10倍量，室溫浸泡3小時，然后加熱至80～100℃回流提取1.5小時，分離第一次提取液，再加去離子水或0～50％乙醇8倍量，加熱至80～100℃回流提取1小時，分離第二次提取液；合并兩次提取液，采用過濾法除去提取液中的固體雜質；2)、沉淀將提取液減壓濃縮至相對密度1.05～1.35，冷卻后，加入2～8倍藥材量的去離子水或無水乙醇沉淀，靜置，取上清液，減壓濃縮得濃縮液；3)、分離、純化濃縮液上預先處理好的非極性至中等極性大孔吸附樹脂柱或聚酰胺柱或反相鍵合相色譜柱或葡聚糖凝膠柱，上柱樣品與樹脂量之比為1∶5～200，洗脫方式可采用下面任一種方式方式一先用去離子水洗脫10～20個柱床體積除雜，繼以5～20％乙醇水溶液洗脫20個柱床體積除雜，再用約10～50％乙醇水溶液洗脫丹參酚酸B，再后用20～85％的乙醇水溶液洗脫丹參酚酸A，在洗脫丹參酚酸B和丹參酚酸A的過程中以TLC監測洗脫液中丹參酚酸B和丹參酚酸A的含量變化，結合HPLC監測，待丹參酚酸B洗脫完全，再更換溶劑洗脫丹參酚酸A，繼續監測，待丹參酚酸A完全洗脫下來，收集洗脫液；方式二先用去離子水洗脫10～20個柱床體積除雜，繼以5～20％乙醇水溶液洗脫20個柱床體積除雜，再用約40～85％乙醇水溶液洗脫丹參酚酸B和丹參酚酸A，在洗脫過程中以TLC監測洗脫液中丹參酚酸B和丹參酚酸A的含量變化，結合HPLC監測，待二者完全洗脫下來，分段收集洗脫液；4)、濃縮、干燥按上述方式一得到丹參酚酸A洗脫液、丹參酚酸B洗脫液，分別在60℃下，減壓回收溶劑至無醇味，再經冷凍干燥，分別得到丹參酚酸A提取物、丹參酚酸B提取物；按上述方式二分段收集洗脫液，分別濃縮、干燥，得到不同比例的丹參酚酸A加B組合物；5)、取上述丹參酚酸A提取物、丹參酚酸B提取物適量，混合制成含有丹參酚酸A和丹參酚酸B的組合物，其中二者比例為1∶0.05～20。
本發明的組合物，可以作為藥物活性成分，單獨或與其它任何中西藥物或食品配伍，尤其是與某些具有活血化瘀和/或治療心腦血管疾病的中藥配伍，用于制備藥物制劑和功能性保健食品。單獨由本發明的組合物制備的藥物和功能性保健食品，或由該組合物與其它中西藥物或食品配伍組成的復方藥物和功能性保健食品，均具有抗動脈粥樣硬化、增加冠脈流量、提高心腦組織對缺氧缺血的耐受性、抗血小板凝集、抗血栓等藥理活性，可用于預防和治療心腦血管疾病，如腦梗塞、腦缺血、冠心病、心絞痛、心肌缺血、心肌梗死等。
本發明所述組合物或包含該組合物的藥物和食物組合，用于上述醫療和保健目的時，可以按中藥制劑常規方法和技術，直接添加必要的輔料，制成(1)片劑普通片(素片)、包衣片、口腔崩解片、泡騰片、分散片和緩釋片等；(2)膠囊劑硬膠囊和軟膠囊；(3)丸劑滴丸；(4)注射劑水針和粉針劑；(5)顆粒劑；(6)口服液等多種制劑成品。
本發明在該組合物及其制劑中添加適當的輔料，如加入抗氧化劑，可以防止丹參酚酸A和B分解變化，抗氧化劑包括各種水溶性的抗氧化劑和脂溶性抗氧化劑及其混合使用。水溶性的抗氧化劑如Vc、亞硫酸氫鈉、焦亞硫酸鹽、亞硫酸鈉、硫代硫酸鈉、甲醛合亞硫酸氫鈉、半胱氨酸、蛋氨酸、硫脲、硫代乙酸、硫代甘油等。脂溶性抗氧化劑如叔丁基對羥基茴香醚(BHA)、培酸丙酯(PG)、二丁甲苯酚(BHT)、卵磷脂、生育酚(Ve)等。抗氧化劑的加入量為制劑總量的0.01％-95％。
本發明提供的藥物組合物在用于心腦血管疾病時，其注射使用劑量范圍是5～1000mg，優選為10～300mg。其口服使用劑量范圍是100～6000mg，優選為300～3000mg。
本發明的優點在于提供了可期待用于治療和預防心腦血管疾病的中藥活性成分組合物——丹參酚酸A加B，其化學成分明確，有效成分含量高(主要成分為丹參酚酸A和丹參酚酸B，二者總含量在50.0％以上(最優可達到80％以上)，藥效顯著。本發明組合物--丹參酚酸A加B的制備方法，工藝成熟、產品質量穩定，可以大規模生產。應用本發明制備方法得到的中藥活性成分組合物或包含該組合物的藥物和食物組合，加入抗氧化劑，采用常規制劑方法和技術制成各種劑型的制劑成品，質量穩定。對于提高丹參類制劑療效具有重要的意義。
本發明人進行了下列試驗來證實由丹參酚酸A和丹參酚酸B組成的中藥活性成分組合物在制備治療或預防心腦血管疾病的藥物中的應用，并證實具有協同作用。
試驗例1不同劑量丹參酚酸A、丹參酚酸B、組合物對大鼠心肌缺血損傷的影響(1)材料丹參酚酸A、丹參酚酸B、組合物按實施例1制備。
復方丹參注射液貴州神奇制藥有限公司。
氯化硝基四氮唑藍(NBT)。
實驗動物普通級Wistar大鼠，雄性，體重280g-350g。
(2)方法與結果動物隨機分為假手術組(生理鹽水)，模型對照組(生理鹽水)，復方丹參注射液組(10mg/kg)，丹參酚酸A小劑量組(1.5mg/kg)，丹參酚酸A中劑量組(5mg/kg)，丹參酚酸A大劑量組(15mg/kg)，丹參酚酸B小劑量組(5mg/kg)，丹參酚酸B中劑量組(15mg/kg)，丹參酚酸B大劑量組(45mg/kg)，組合物小劑量組[丹參酚酸A(1.5mg/kg)+丹參酚酸B(5mg/kg)]，組合物大劑量組[丹參酚酸A(15mg/kg)+丹參酚酸B(45mg/kg)]，每組10只。禁食12小時后，ip烏拉坦(1.2g/kg)麻醉，測肢體II導聯心電圖。剪去左胸前皮毛，碘酒及酒精消毒，沿胸骨左緣1cm處，剪開胸壁肌肉及兩條肋骨，迅速打開胸腔，暴露心臟，在動脈圓錐與左心耳之間結扎左冠狀動脈，立即將心臟放回，排擠出胸腔空氣，用止血鉗閉合胸腔，造成大鼠急性心肌缺血模型。術后各組動物靜脈注射相應藥物。記錄給藥前及給藥后1.5h、3h心電圖，6h后取出心臟，以冷生理鹽水洗凈后，-20冰箱冷凍過夜。次日，將冷凍的心臟由結扎處至心尖部等厚切成5片，浸入新鮮配制的0.5％NBT磷酸緩沖液(pH 7.4)中。37水浴振搖10～15分鐘。用濾紙吸干切片表面的染色液，分離染色部分和未染色部分，稱重，計算面積。梗死面積(％)＝梗死部分重量/(非梗死部分重量+梗死部分重量)×100％。結果如下
表2不同劑量丹參酚酸A、丹參酚酸B、組合物對大鼠心肌缺血損傷的影響

與模型對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；組合物小劑量組與丹參酚酸A中劑量組比較#P＜0.05；組合物小劑量組與丹參酚酸B中劑量組比較△P＜0.05；n＝10試驗例2不同劑量丹參酚酸A、丹參酚酸B、組合物對大鼠局部腦缺血損傷的影響(1)材料丹參酚酸A、丹參酚酸B、組合物按實施例1制備。
紅四氮唑臨用前用生理鹽水配成4％溶液。
實驗動物普通級SD大鼠，雄性，體重280g-350g。
(2)方法與結果以電灼法阻斷大鼠大腦中動脈(MCAO)，造成局灶性腦缺血模型，給藥后進行神經行為評分、腦片染色觀察不同劑量丹參酚酸A、丹參酚酸B、組合物對腦缺血的保護作用，結果如下。
表3不同劑量丹參酚酸A、丹參酚酸B、組合物對大鼠局部腦缺血損傷的影響


與模型對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；組合物小劑量組與丹參酚酸A中劑量組比較#P＜0.05；組合物小劑量組與丹參酚酸B中劑量組比較△P＜0.05；n＝10試驗例3丹參酚酸A(DA)和丹參酚酸B(DB)不同配比的組合物對大鼠局部腦缺血損傷的影響(1)材料丹參酚酸A、丹參酚酸B、組合物A～I按實施例1制備。
組合物J按實施例2制備的其中1個部分(DA∶DB比例實測為1∶7.5，DA+DB總含量分別為81.4％)。
組合物K按實施例2制備的其中1個部分(DA∶DB比例實測為1∶20.7，DA+DB總含量分別為85.9％)。
紅四氮唑臨用前用生理鹽水配成4％溶液。
實驗動物普通級SD大鼠，雄性，體重280g-350g。
(2)方法與結果按試驗例2所示方法制作大鼠局部腦缺血模型，給藥后進行神經行為評分、腦片染色觀察丹參酚酸A和丹參酚酸B不同配比的組合物對腦缺血的保護作用，結果如下。
表4丹參酚酸A和丹參酚酸B不同配比的組合物對大鼠局部腦缺血損傷的影響


與模型對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001與組合物A組比較#P＜0.05與組合物I組比較△P＜0.0具體實施方式
以下實施例表示本發明的實用性，本發明不受此限制。
實施例1丹參酚酸A和丹參酚酸B及其組合物的制備方法(分別提取再混合法)具體工藝步驟如下1、提取取丹參飲片，加20％乙醇10倍量，室溫浸泡3小時，然后加熱至80～100℃回流提取1.5小時，分離第一次提取液，再加50％乙醇8倍量，加熱至80～100℃回流提取1小時，分離第二次提取液。合并兩次提取液，采用過濾法除去提取液中的固體雜質。
2、沉淀將提取液減壓濃縮至相對密度1.05～1.10，冷卻后加入8倍藥材量的去離子水，冷藏，靜置，取上清液，減壓濃縮得濃縮液。
3、分離、純化濃縮液上預先處理好的AB-8大孔吸附樹脂柱，上柱樣品與樹脂量之比為1∶8(W∶W)，先用去離子水洗脫20個柱床體積除雜，繼以10％乙醇水溶液洗脫20個柱床體積除雜，再用約50％乙醇水溶液洗脫丹參酚酸B，再后用85％的乙醇水溶液洗脫丹參酚酸A，在洗脫丹參酚酸B和丹參酚酸A的過程中以TLC監測洗脫液中丹參酚酸B和丹參酚酸A的含量變化，結合HPLC監測，待丹參酚酸B洗脫完全，再更換溶劑洗脫丹參酚酸A，繼續監測，待丹參酚酸A完全洗脫下來，收集洗脫液。
4、濃縮、干燥上述丹參酚酸A洗脫液、丹參酚酸B洗脫液，分別在60℃下，減壓回收溶劑至無醇味，再經冷凍干燥，分別得到丹參酚酸A提取物(收率不少于0.04％，其中丹參酚酸A含量為82.3％)、丹參酚酸B提取物(收率不少于1.5％，其中丹參酚酸B含量為84.5％)。
5、取上述丹參酚酸A提取物(丹參酚酸A含量為82.3％)、丹參酚酸B提取物(丹參酚酸B含量為84.5％)適量，混合制成含有丹參酚酸A和丹參酚酸B的組合物，其中二者比例為1∶0.05～20。
丹參酚酸A和丹參酚酸B的含量測定方法按照《中國藥典》2005年版一部高效液相色譜法(附錄VID)測定。
色譜條件與系統適用性試驗 用十八烷基鍵合硅膠為填充劑，甲醇-乙腈-甲酸-水(30∶10∶1∶59，V/V)，檢測波長為286nm。柱溫30℃，流速為1.0ml/min。理論板數按丹參酚酸A和丹參酚酸B計算，均應不低于2000。丹參酚酸A和丹參酚酸B與相鄰峰分離度均大于1.5。
丹參酚酸A對照品溶液制備 精密稱取丹參酚酸A對照品10mg置100ml容量瓶中，加甲醇定容。
丹參酚酸B對照品溶液制備 精密稱取丹參酚酸B對照品25mg置50ml容量瓶中，加甲醇定容。
供試品溶液制備 精密稱取丹參酚酸A加B粉末約30mg置50ml容量瓶中，加甲醇30ml，超聲30min使溶解，甲醇定容，用0.45μm微孔濾膜濾過，即得。
測定法 在上述色譜條件下分別取對照品與供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀。測定，計算，即得。
實施例2丹參酚酸A和丹參酚酸B及其組合物的制備方法，(同時提取法)該方法的其他部分與實施例1相同，柱色譜分離純化過程不同，柱色譜分離純化方法如下濃縮液上預先處理好的AB-8大孔吸附樹脂柱，上柱樣品與樹脂量之比為1∶8(W∶W)，先用去離子水洗脫20個柱床體積除雜，繼以20％乙醇水溶液洗脫20個柱床體積除雜，再用約70％乙醇水溶液洗脫丹參酚酸B和丹參酚酸A，在洗脫過程中以TLC監測洗脫液中丹參酚酸B和丹參酚酸A的含量變化，結合HPLC監測，待二者完全洗脫下來，分段收集洗脫液。分別濃縮、干燥，得到不同比例的丹參酚酸A加B組合物。
實施例3鈉鹽衍生物的制備工藝中pH的選擇取上述實施例1所得的丹參酚酸A加B原料100g，溶于500ml水中，加0.01～0.5N的碳酸氫鈉溶液分別調節pH至6、7、8、9、10、12、14，充分攪拌后離心，除去不溶物，溶液經減壓濃縮、加乙醇至醇濃度80％，靜置，濾取沉淀，減壓真空干燥即得丹參酚酸A加B的鈉鹽，計算重量，測定丹參酚酸A鈉鹽和丹參酚酸B鈉鹽含量，如表1所示。
表1鈉鹽衍生物的制備工藝中pH的考察結果

表1數據顯示，丹參酚酸A+B鈉鹽衍生物的制備工藝中pH的影響很重要pH＜7，丹參酚酸A加B的鈉鹽含量和比例沒有影響，但是收率很低，應該是有部分丹參酚酸A加B沒有成為鈉鹽；7＜pH＜10，丹參酚酸A加B的鈉鹽含量和比例沒有影響，但是收率很高，說明是丹參酚酸A加B成為鈉鹽的最佳條件；pH＞10，丹參酚酸A加B的鈉鹽含量和比例下降明顯，而且收率明顯下降，說明是丹參酚酸A加B在該條件下發生了分解變化。
實施例4鈉鹽衍生物的制備工藝取上述實施例1或2所得的丹參酚酸A加B原料100g，溶于500ml水中，加0.01～0.5N的碳酸氫鈉溶液至pH～8，充分攪拌后離心，除去不溶物，溶液經減壓濃縮、加乙醇至醇濃度80％，靜置，濾取沉淀，減壓真空干燥即得丹參酚酸A加B的鈉鹽，計99g，丹參酚酸A鈉鹽和丹參酚酸B鈉鹽總含量、比例保持不變。
實施例5丹參酚酸A加B片的制備丹參酚酸A加B10gVc 0.2g淀粉46g糊精44g硬脂酸鎂3g上述組分過篩，混勻，制成顆粒，干燥，壓制成1000片，包薄膜衣，即得。
實施例6丹參酚酸A加B復方制劑的制備丹參酚酸A加B10g三七總皂苷 10g冰片40gVc 0.2g可壓性淀粉 140g
上述組分混合均勻、裝入硬明膠膠囊中，共1000粒。
實施例7丹參酚酸A加B凍干粉針的制備取丹參酚酸A加B原料10g，加入3倍量注射用水溶解，加入葡萄糖50g或甘露糖50g或甘氨酸50g，Vc 0.2g或亞硫酸鈉0.2g或亞硫酸氫鈉0.2g，依地酸鈣鈉5g或依地酸鈉5g，攪拌使完全溶解后，添加注射用水至2000ml，用10％(g/ml)NaOH調整pH值在4-7.5范圍，活性炭脫色，0.2μ孔徑微孔濾膜濾過或超濾除菌脫熱源。在無菌操作下，灌裝于3ml滅菌小瓶(每瓶裝2ml)內，置冷凍干燥機內凍干，封口，即得。
實施例8丹參酚酸A加B復方注射液的制備丹參酚酸A加B鈉鹽10g降香揮發油 1.0gVc 0.2g上述組分混合均勻注射用水至2000ml，共制成1000支。
實施例9丹參酚酸A加B鈉鹽注射液的制備取上述實施例3所得的丹參酚酸A加B鈉鹽原料10g，加入3倍量注射用水溶解，Vc 0.2g，攪拌使完全溶解后，添加注射用水至2000ml，用10％(g/ml)NaOH調整pH值在4-7.5范圍，活性炭脫色，0.2μ孔徑微孔濾膜濾過或超濾除菌脫熱源。灌裝于3ml滅菌小瓶(每瓶裝2ml)內，封口，高壓濕熱滅菌，即得。
權利要求
1.一種含有丹參酚酸A或其鹽和丹參酚酸B或其鹽的中藥活性組合物，兩者的重量比例為1∶0.01～100，二者總含量占組合物的比例≥50％。
2.按照權利要求1所述的組合物，其特征在于，丹參酚酸A和丹參酚酸B二者總含量占組合物的比例≥80％。
3.按照權利要求1所述的組合物，其特征在于，兩者的重量比例為1∶0.05～20。
4.按照權利要求1所述的組合物，其特征在于，兩者的重量比例為1∶1～10。
5.按照權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述鹽是丹參酚酸A和丹參酚酸B與鈉、鉀、鎂、鈣、鋅等形成的金屬鹽衍生物。
6.根據權利要求1的組合物，其特征在于，所述組合物是將從市場上購買的將丹參酚酸A和丹參酚酸B混合在一起制得的，或從中藥丹參及其同科屬植物中提取制得的；其中提取制得，經過如下步驟A、提取，B、水沉和/或醇沉，C、丹參酚酸A和丹參酚酸B組合物的分離、精制；其中所述分離、精制方法選自(1)溶劑萃取法，(2)大孔吸附樹脂柱色譜法，(3)聚酰胺吸附柱色譜法，(4)反相硅膠柱色譜法，(5)葡聚糖凝膠柱色譜法。
7.根據權利要求6所述的組合物，其特征在于，其中所述的提取是將丹參藥材粉碎成粗粉，加入0～80％乙醇，采用加熱回流、煎煮、浸漬、滲漉、超聲提取、微波提取或高壓提取，分離提取液，過濾、自然沉降或離心除去提取液中的固體雜質；其中所述的水沉是將合并后提取液減壓濃縮，濃縮液冷卻后加入2～8倍藥材量的去離子水，冷藏，靜置，過濾得濾液；其中所述的醇沉是濾液減壓濃縮，冷卻后加入2～8倍藥材量的無水乙醇，調解醇濃度為50～85％進行醇沉，靜置，取上清液，減壓濃縮、干燥，即得總丹參酚酸提取物；其中所述的分離、精制方法，其中方法(2)～(5)為柱色譜法，均包含以下步驟a、色譜柱的制備；b、色譜柱的活化，方法為采用水、甲醇、乙醇、丙酮、乙腈等任意一種溶劑，或由這些溶劑按一定比例配成的混合溶劑，或由這些溶劑與酸、堿配成的酸性或堿性溶劑進行活化；c、樣品上柱、洗脫除雜將樣品溶液加至色譜柱，用水、醇或水與醇類、丙酮、乙腈的適當比例的混合溶劑洗脫除雜；d、樣品的洗脫除雜后的色譜柱用醇類、丙酮、乙腈或水與醇類、丙酮、乙腈的適當比例的混合溶劑洗脫樣品，收集洗脫液；e、濃縮、干燥低溫減壓濃縮，噴霧干燥、真空干燥或冷凍干燥。
8.根據要求7所述的組合物，其特征在于，其中所述的d、樣品的洗脫過程采用梯度的方法，先用低濃度醇或低濃度的丙酮-水溶液洗脫得到丹參酚酸B，然后再用較高濃度的醇或丙酮溶液等溶劑洗脫得到丹參酚酸A；或直接用適當濃度的醇或適當濃度的丙酮-水溶液洗脫得到組合物--丹參酚酸A加B。
9.根據要求7所述的組合物，其特征在于，其中所述的步驟c中，醇-水的混合溶劑的醇含量在70％以下，丙酮-水的混合溶劑常用丙酮含量在30％以下，乙腈-水的混合溶劑常用乙腈含量在30％以下，所述的步驟d中，適當比例的醇-水、丙酮-水或乙腈-水溶液中，有機相所占比例為20％～100％。
10.根據要求6所述的組合物，其特征在于，其中所述的提取制得，經過如下步驟1)、提取取丹參飲片，加去離子水或0～20％乙醇10倍量，室溫浸泡3小時，然后加熱至80～100℃回流提取1.5小時，分離第一次提取液，再加去離子水或0～50％乙醇8倍量，加熱至80～100℃回流提取1小時，分離第二次提取液；合并兩次提取液，采用過濾法除去提取液中的固體雜質；2)、沉淀將提取液減壓濃縮至相對密度1.05～1.35，冷卻后，加入2～8倍藥材量的去離子水或無水乙醇沉淀，靜置，取上清液，減壓濃縮得濃縮液；3)、分離、純化濃縮液上預先處理好的非極性至中等極性大孔吸附樹脂柱或聚酰胺柱或反相鍵合相色譜柱或葡聚糖凝膠柱，上柱樣品與樹脂量之比為1∶5～200，洗脫方式可采用下面任一種方式方式一先用去離子水洗脫10～20個柱床體積除雜，繼以5～20％乙醇水溶液洗脫20個柱床體積除雜，再用約10～50％乙醇水溶液洗脫丹參酚酸B，再后用20～85％的乙醇水溶液洗脫丹參酚酸A，在洗脫丹參酚酸B和丹參酚酸A的過程中以TLC監測洗脫液中丹參酚酸B和丹參酚酸A的含量變化，結合HPLC監測，待丹參酚酸B洗脫完全，再更換溶劑洗脫丹參酚酸A，繼續監測，待丹參酚酸A完全洗脫下來，收集洗脫液；方式二先用去離子水洗脫10～20個柱床體積除雜，繼以5～20％乙醇水溶液洗脫20個柱床體積除雜，再用約40～85％乙醇水溶液洗脫丹參酚酸B和丹參酚酸A，在洗脫過程中以TLC監測洗脫液中丹參酚酸B和丹參酚酸A的含量變化，結合HPLC監測，待二者完全洗脫下來，分段收集洗脫液；4)、濃縮、干燥按上述方式一得到丹參酚酸A洗脫液、丹參酚酸B洗脫液，分別在60℃下，減壓回收溶劑至無醇味，再經冷凍干燥，分別得到丹參酚酸A提取物、丹參酚酸B提取物；按上述方式二分段收集洗脫液，分別濃縮、干燥，得到不同比例的丹參酚酸A加B組合物；5)、取上述丹參酚酸A提取物、丹參酚酸B提取物適量，混合制成含有丹參酚酸A和丹參酚酸B的組合物，其中二者比例為1∶0.05～20。
11.權力要求1所述的組合物在制備治療或預防心腦血管疾病、腦損傷或心肌缺血的藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種中藥活性成分組合物及其制備方法和用途，該組合物中丹參酚酸A和丹參酚酸B的總含量大于50％，其中丹參酚酸A∶B的比例在1∶0.01～100，本發明還提供了該組合物在制備治療或預防心腦血管疾病的藥物中的應用。
文檔編號A61K36/537GK1943569SQ200610114139
公開日2007年4月11日 申請日期2006年10月30日 優先權日2006年10月30日
發明者王煜 申請人:王煜