流行性感冒原代地鼠腎細胞多價疫苗及其制備方法

專利名稱：流行性感冒原代地鼠腎細胞多價疫苗及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種流行性感冒原代地鼠腎細胞疫苗及其制備方法，其屬于生物制藥領域。
背景技術：
流行性感冒簡稱流感，是一種嚴重的呼吸道傳染病。在1918-1919年的流感大流行中，由于感染了流感病毒而死亡的人數比持續4年的第二次世界大戰中死亡人數還要多。流感的特征往往是反復流行，突然發生，迅速傳播，小則局部流行，大則遍及全球。嬰兒和老人病死率高，每年數以萬計。目前流感仍是影響世界公眾健康的重要問題，而最近高致病的禽流感又大有侵襲人類的危險，所以接種疫苗仍是當前預防流感和禽流感傳播感染的重要手段之一。
作為流感的病原體，流感病毒分為甲(A)、乙(B)、丙(C)型流感病毒。甲型流感病毒常以流行形式出現，能引起世界性流感大流行，它在動物中廣泛分布，也能在動物中引起流感流行和造成大量動物死亡。乙型流感病毒常常引起流感局部暴發，不會引起世界性流感大流行，至今尚未找到它存在于人之外的其它動物中的確鑿證據。丙型流感病毒主要以散在形式出現，主要侵襲嬰幼兒，一般不引起流感流行。過去一直認為人是丙型流感病毒唯一的天然宿主，但近年來這種看法已得到了徹底糾正，郭元吉等人于1981～1982年從我國豬群中分離出多株丙型流感病毒，并已得到了世界公認。所有流感病毒均為正粘病毒，分三個型別，即甲、乙和丙型流感病毒。根據血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)抗原性的差異又可分為不同亞型，迄今甲型流感病毒HA有15個亞型(H1-H15)，NA有9個亞型(N1-N9)，H和N均為糖蛋白，H、N的變異是獨立的。
根據1980年世界衛生組織公布的流感病毒的命名如下甲型流感病毒命名法可用下列公式表示之型別/宿主/分離地點/毒株序號(指采樣時標本號)/分離年代(血凝素亞型、神經氨酸酶亞型)，其中宿主為人的可以忽略不寫。乙型和丙型流感病毒的命名法和甲型相同，但無亞型劃分。
流感是一種古老性疾病，至今在防治方面尚未找到真正的突破口。由于流感病毒的抗原性，尤其HA蛋白的抗原性，能經常不斷地發生變異，這不僅給疫苗制備增加了難度，更主要的是能很快使疫苗免疫接種效果下降，甚至無效，所以人類一直不斷地在開發新的疫苗，以應對新一輪次流感的襲擊。
本世紀30年代初，流感病毒滅活疫苗就開始進行動物實驗。當時用受染的小鼠肺所制成勻液中的流感病毒，經甲醛滅活接種動物，然后用流感野毒株皮下和腹腔內攻擊，以了解是否有免疫保護。顯然這種疫苗不能用于人體。
1937年，雞胚培養流感病毒獲得成功，使大量生產疫苗成為可能。流感病毒滅活疫苗于1941年在美國首次被批準使用。1943年美國開始在軍隊中使用，并證實有效；1945年在美國開始廣泛應用。這種早期粗制的疫苗，是用含流感病毒粒的雞胚尿囊液，經紅細胞吸附和釋放有限的純化，然后甲醛滅活。接種疫苗后，局部和全身反應都很強。
本世紀60年代，超速離心機和層析色譜技術的應用，使毒粒純化操作能力大大提高，制成了全毒粒疫苗。然而，兒童使用時仍可出現不良反應。后來經過進一步用裂解劑裂解病毒并進行純化制備出流感裂解疫苗，使用時不良反應就大為減少。前后研制出多種裂解劑，如乙醚，3-N-丁基磷酸鹽(Tri-N-butylphosphate)，聚山梨酸酯80(Polysorbate 80)，脫氧膽酸鈉(Sodium deoxycholate)，三硝基甲苯X-100(Triton X-100)等。流感裂解疫苗1968年在美國首次被批準使用。
本世紀70和80年代，在裂解疫苗的基礎上，又研制出了毒粒亞單位和表面抗原(HA和NA)疫苗。英國在臨床疫苗試用中，證實了免疫效果與裂解疫苗相同，并可用于兒童。1980年英國首次批準使用，而后擴展到其它國家。在我國，以朱既明教授為首的一批科研工作者的辛勤工作下，建立了我國流感研究中心，并組織開發了超速離心提純的甲型流感單價滅活疫苗。隨著流感流行病學研究的深入，發現在流感流行中，常常有甲、乙型流感同時流行，特別是1976年以來，又形成了甲1(H1N1)及甲3(H3N2)同時流行的局面。因此，為了有效的預防流感，對流感滅活疫苗抗原的組成，不僅要求含有當前流行株的同類抗原，而且必須含有同時流行的各種型或亞型的抗原成份。所以，我國先是研究生產了雙價及三價(甲1、甲3、乙型)流感滅活疫苗，并在長春生物制品研究所投入生產。在預防和控制流感的流行中取得了比較滿意的防病效果。
最初的流感滅活全病毒疫苗是從感染的雞胚尿囊液中分離流感病毒顆粒制成的。其工藝中單純的超速離心雖然收集了大部分的流感病毒，但有大量的宿主蛋白，這是流感滅活疫苗引起副反應的主要原因之一。為了提高流感滅活疫苗的免疫原性，降低其副反應，許多工作者致力于疫苗生產工藝的研究。目前，國內外許多制造流感全病毒滅活疫苗的廠家，通常使用離心法和柱層析法從感染的雞胚尿液中分離流感病毒，用此種技術生產的病毒制品，純度是比較高的，疫苗接種后的副反應性也有減弱。
隨著人們對流感疫苗免疫研究的深入，發現流感病毒的表面抗原，即血凝素和神經氨酸酶所產生的抗體，對同型的流感病毒攻擊具有保護作用，而兩種表面抗原中產生抵抗力的主要是血凝素抗原。
血凝素抗原和神經氨酸酶的抗原所賦予的免疫性在機制上是不同的。血凝素抗體中和病毒的感染性，并抑制最初的感染，而神經氨酸酶抗體則限制病毒在感染個體中的散播，因而，限制了病毒自呼吸道擴散并減少了疾病的嚴重性。目前，沒有證據表明流感病毒顆粒的主要內部抗原，即核蛋白(NP)和基質蛋白(M)具有免疫性。由于以上的基礎研究工作的進展，使人們在考慮疫苗的安全性和有效性的基礎上，進一步對工藝進行了改進，開發出了流感裂解疫苗和流感亞單位疫苗。在開發過程中，很多科學工作者對裂解工藝進行了改進，如裂解劑的種類、濃度、裂解時間、裂解的時段等等，并且純化方法也有所提高。而不同的工藝使得最終病毒原液的性能也有所區別。這些研究成果，不僅為流感裂解疫苗明確了質控指標，而且為流感病毒滅活疫苗的新劑型和新技術打下了一定基礎。
由于在雞胚上流感病毒具有即強又快的適應性，使得目前人們一直沿用雞胚來作為流感疫苗生產過程中病毒培養和增殖的基質，這也使得在流感疫苗生產過程中，一直要嚴格控制生產用雞胚的質量，使之不能受到各種病毒(尤其是逆轉錄病毒)污染。而與此同時，由于雞胚的擴大生產受到多方面的影響，諸如禽流感、禽白血病等等，使得近年來國內外加速研究用細胞作為流感病毒傳代增殖的基質。目前美國使用一種傳代細胞，即MDCK細胞(一種狗腎細胞)進行流感病毒的傳代取得突破，該細胞制備的疫苗正在進行臨床試驗；而加拿大和我國的一些公司也在進行傳代細胞為基質的流感疫苗的研究。他們是在Vero細胞中培養流感病毒，并且取得了一些進展，其中進展快一些的加拿大公司已經進入臨床實驗階段。然而，用這兩種傳代細胞作為培養基質，都存在的共同問題是適應期長，收獲的病毒滴度偏低等不足，而且傳代細胞DNA很難通過純化的方法去除，因此利用傳代細胞制備的疫苗具有致瘤性的潛在危險。而原代細胞作為流感病毒增殖傳代的基質細胞來制備流感疫苗，不僅解決了雞胚來源不足和疫苗易受逆轉錄病毒污染的問題，還解決了流感病毒在傳代細胞適應慢和病毒滴度弱的不足的問題，同時由于原代地鼠腎細胞不具有傳代性，即細胞DNA不具有復制性，所以制備出來的疫苗不具有致瘤性的危險。自80年代，我國的一些單位已經將原代地鼠腎細胞應用于狂犬疫苗制備，也有利用原代地鼠腎細胞來制備出血熱疫苗，如中國專利申請第99107985.X號公開的技術。這說明原代地鼠腎細胞可以應用于疫苗的生產。然而，不同的病毒在原代細胞上的適應性也不同，對原代細胞的不同培養方式以及病毒適應時期都需要做大量的試驗摸索，以促進病毒的適應性和病毒在原代細胞上的穩定增殖性。國內外還沒人有報道過利用原代地鼠腎細胞制備流感疫苗的先例。

發明內容
本發明的一個目的在于提供一種新的流行性感冒疫苗(簡稱流感疫苗)，該疫苗是采用原代地鼠腎細胞作為流感病毒的增殖基質制備的。
該流感疫苗不同于國內外現有的采用雞胚作為病毒增殖的基質的流感疫苗。其優點在于，流感疫苗避免了爆發大規模雞瘟的情況下，雞胚的來源受限制的問題，同時也控制了由于雞胚的其他病毒(尤其是逆轉錄病毒)對疫苗的污染，消除了逆轉錄病毒進入機體導致腫瘤的危險。
現在國內外正在開發的傳代細胞制備的流感疫苗，如采用傳代Vero細胞或MDCK細胞制備的流感疫苗也具有很多缺點。首先，流感病毒在傳代的Vero細胞或MDCK細胞上適應期長，收獲的病毒原液滴度偏低，其次純化過程中，傳代細胞的DNA很難去除，制備的疫苗中有一定的傳代細胞DNA殘留，致使疫苗具有致瘤性的潛在危險。與之相比，采用采用原代地鼠腎細胞制備的流感疫苗，克服了上述流感疫苗的缺點。即流感病毒在原代地鼠腎細胞適應期短，收獲的病毒原液滴度高，制備過程中不考慮DNA的去除，因為該細胞基質制備的疫苗原液中不含有對人體或其它動物具有致瘤性的可復制的DNA。這不僅簡化了純化步驟，同時也消除了疫苗使用者的恐懼心理。
本發明的另一個目的是提供這種流行性感冒疫苗制備方法。
為實現上述目的，本發明采用以下技術方案按照本發明流行性感冒疫苗，是一種利用原代地鼠腎細胞作為流感病毒傳代增殖的基質而制備的疫苗。由于流感病毒在原代地鼠腎細胞適應性好，制備的病毒原液血凝滴度高，所以純化過程中，原液的濃縮倍數比雞胚或傳代細胞制備的原液濃縮倍數低，同時減少了去除DNA的純化步驟，從而降低流感疫苗的工作成本。
按照本發明流行性感冒疫苗與采用傳代細胞制備的流行性感冒疫苗相比，該疫苗中沒有對人體或其它動物具有致瘤性的傳代細胞可復制的DNA。因為原代地鼠腎細胞是直接有地鼠的腎臟組織制備而來的，這種細胞傳代能力很弱，即細胞中DNA復制很差，細胞個體分生2～3次后，其DNA就不具有復制能力了，所以本方法制備疫苗成品中沒可復制的DNA。而傳代細胞之所以稱之為傳代，是因為其細胞在體外培養時能夠傳5代以上，在1次傳代過程中，細胞個體一般分生2～4次。對于現行開發的Vero細胞或MDCK細胞制備的流感疫苗，Vero細胞可以傳代150次以上，MDCK細胞可以傳代80次以上，可見兩種細胞的DNA在體外培養過程中復制能力是非常強的，所以利用該兩種傳代細胞制備的流感疫苗具有一定的致腫瘤的危險。
按照本發明流行性感冒疫苗的一個優選方案，制備的疫苗可以是人、禽或其它動物的流感全病毒疫苗、流感裂解疫苗或流感亞單位疫苗，其優選為流感裂解疫苗。
按照本發明流行性感冒疫苗的制備方法，包括如下步驟(a).將流行性感冒病毒原始毒種通過無特定病原(SPF)雞胚適應性傳代，作為主代種子；(b).原代地鼠腎細胞的制備及利用培養瓶或細胞生物反應器進行培養；(c).用主代種子感染原代地鼠腎細胞，并進行適應性傳代，直至得到病毒血凝效價不低于1∶640的毒種作為疫苗的工作種子；(d).用工作種子感染原代地鼠腎細胞，進行病毒擴增，直至病毒血凝效價不低于1∶320為疫苗單價原液；(e).疫苗單價原液經濃縮、滅活、純化后，將不同型別的單價病毒液進行混合，分裝成成品。
上述步驟中的原代地鼠腎細胞可以是新制備的原代地鼠腎細胞，也可以是經過培養了的原代地鼠腎細胞，優選為經過培養了的原代地鼠腎細胞，以增加細胞的量，有利于病毒感染后，提高病毒收獲液的血凝滴度；另外，與傳代細胞制備流感疫苗工藝比，在制備過程中沒有去除DNA的純化工序。
按照本發明流行性感冒疫苗的制備方法的一個優選方案，將世界衛生組織(WHO)每年推薦的或國家相關部門批準的人流行性感冒病毒毒種或禽流行性感冒病毒毒種，通過1～3代的SPF雞胚適應性傳代，作為主代種子，更優選取血凝效價(HA)達到1∶320以上的雞胚尿囊液作為主代種子；主代種子到工作種子在原代地鼠腎細胞適應性傳代的次數為8代以內，更優選為3～6代。
按照本發明流行性感冒疫苗的制備方法的一個優選方案，將地鼠進行消毒處理后，無菌取腎、剪碎、用胰蛋白酶和EDTA組成的消化液將組織小塊消化分散成為單個細胞懸液，其細胞濃度優選為約1.0×107～5.0×108個/ml。
按照本發明流行性感冒疫苗的制備方法的一個優選方案，原代地鼠腎細胞的培養方式或感染了流感病毒后的原代地鼠腎細胞的培養方式選自玻璃瓶貼壁培養、生物反應器微載體懸浮培養或生物反應器聚酯纖維片狀載體籃式培養。
按照本發明流行性感冒疫苗的制備方法的一個優選方案，原代地鼠腎細胞用于所述的工作種子適應性傳代和疫苗原液的制備，該原代地鼠腎細胞感染前，先進行自身的擴大培養。
按照本發明流行性感冒疫苗的制備方法的一個優選方案，原代地鼠腎細胞培養時，采用基礎培養基中另外加入一定濃度的促生長劑作為生長液；流感病毒感染地鼠腎細胞后培養時，采用基礎培養基中另外加入一定濃度促生長劑作為細胞維持液(包括I和II)；所述促生長劑能促細胞生長和促病毒增殖，其成分為小牛或胎牛血清、人血白蛋白、胰蛋白酶、胰島素、半胱氨酸和多聚賴氨酸中的一種或多種的組合；當使用的基礎培養基為液體時，所述促生長劑的加量與基礎培養基按重量與體積(g/ml)比為1∶1000到1∶10，當培養基為干粉時，取相當量，余量為水。
按照本發明流行性感冒疫苗的制備方法的一個優選方案，所述基礎培養基選自M199、MEM、DMEM、IMDM、IPM1640和Ham F12培養基中的一種或多種的組合，其配方根據培養的不同階段采取不同濃度配比。
按照本發明流行性感冒疫苗的制備方法的一個優選方案，不論是在毒種制備還是在疫苗生產時，原代地鼠腎細胞的培養階段，所用生長液中促生長劑的量與液體基礎培養基按重量與體積(g/ml)比為1∶50到1∶10；原代地鼠腎細胞感染流感病毒后采用的維持液中促生長劑的量與液體基礎培養基按重量與體積(g/ml)比為1∶1000到1∶50；當培養基為干粉時，取相當量，余量為水。
按照本發明流行性感冒疫苗的制備方法的一個優選方案，原代地鼠腎細胞培養時加入的促生長劑優選為小牛血清、胰島素和多聚賴氨酸，每100ml生長液中含有基礎培養基IMDM或者DMEM為90～95ml(或相當量的干粉培養基，余量為水)、小牛或胎牛血清為5～10克(相當于5～10ml)、胰島素為0.005～0.05克、多聚賴氨酸為0.001～0.05克，更優選小牛血清、胰島素和多聚賴氨酸的重量份之比為80∶0.2∶0.1；原代地鼠腎細胞感染流感病毒后所用維持液I中加入的促生長劑優選為人血白蛋白、半胱氨酸和胰島素，每100ml的維持液I含有基礎培養基IMDM或者DMEM為75～97.5ml(或相當量的干粉培養基，余量為水)、人血白蛋白0.5～5克(相當于20％(質量/體積)的人血白蛋白為2.5～25ml)、半胱氨酸0.05～0.5克以及胰島素為0.005～0.05克，更優選人血白蛋白、半胱氨酸和胰島素的重量份之比為20∶1∶0.1；所用維持液II中加入的促生長劑優選為人血白蛋白、半胱氨酸和胰蛋白酶，100ml的維持液II含有基礎培養基為90～99ml(或相當量的干粉培養基，余量為水)、人血白蛋白0.2～2克(相當于20％(質量/體積)的人血白蛋白為1～10ml)、半胱氨酸為0.05～0.5克以及胰蛋白酶0.01～0.1克，更優選人血白蛋白、半胱氨酸和胰蛋白酶的重量份之比為10∶1∶0.5。
按照本發明流行性感冒疫苗的制備方法的一個優選方案，將腎組織消化下來的細胞接種于培養瓶或細胞生物反應器中，接種后培養容器中的細胞初始濃度為約1.0×105～1.0×106個/ml，采用生長液培養60～80小時，換成維持液進行病毒感染。
按照本發明流行性感冒疫苗的制備方法的一個優選方案，原代地鼠腎細胞培養達到細胞濃度為約1.0×107～1.0×108個/ml時，或者原代地鼠腎細胞在培養瓶(包括細胞培養瓶、轉瓶等可用于細胞培養的器皿)中培養達到占據培養面的約60％～80％或生物反應器培養中細胞在載體上的貼壁率達到約70％～90％時，進行流感病毒的感染。
按照本發明流行性感冒疫苗的制備方法的一個優選方案，在用工作種子感染原代地鼠腎細胞時，原代地鼠腎細胞適應的流感病毒工作種子用維持液I稀釋102～104倍，然后感染原代地鼠腎細胞，并在37℃適應吸附于細胞1～6小時，改變成32～35℃維持培養，感染后的1～2天，更換成維持液II，繼續維持培養1～3天，收獲細胞感染液及細胞。
按照本發明流行性感冒疫苗的制備方法的一個優選方案，單價病毒液經檢定合格后進行離心、超濾濃縮、滅活、超速離心、凝膠層析以及不同型別的單價病毒液的混合后，分裝成成品。
本發明的流感疫苗的制備工藝方法通過了大量的試驗研究，總結了原代地鼠腎細胞生長和生活特點。根據這些特點，充分驗證了原代地鼠腎細胞能夠很好地應用于流感疫苗毒種的適應傳代，并能使該適應株很好地保持原病毒株的毒力，且利用該病毒株可以在培養瓶或生物反應器中培養的原代地鼠腎細胞上增殖，生產出了優質的流行性感冒純化疫苗。由于地鼠繁殖能力強，生長快，其腎來源充足。與雞胚相比，體內的腎臟不易受到其它病毒的污染，生產的流感疫苗不含其它病毒，尤其是逆轉錄病毒；與傳代細胞制備的流感疫苗相比，疫苗原液中沒有致腫瘤性的傳代細胞可復制的DNA成分，簡便了疫苗的純化步驟，等等。這些優點都有利于流感疫苗的大規模生產；同時還解決了流感病毒在傳代細胞適應慢和病毒滴度弱的不足的問題；尤其是在禽流感爆發時，由于雞的禽流感病毒感染的可能性使雞胚的來源中斷時，生產流感疫苗必須要通過其他有效的培養基質和可以產業化的工藝進行疫苗的生產，本方法解決了該項問題。該工藝制備的流感疫苗降低了使用者感染其它病毒的危險以及降低了使用者潛在的致瘤性危險。
具體實施例方式
一、流行性感冒病毒原代地鼠腎細胞適應的毒種制備1.流行性感冒病毒毒種的獲取原始毒種甲1(H1N1)型為IVR-116，系雞胚8代尿囊液凍干保存毒種；甲3(H3N2)型為NYMC X-15F，系雞胚8代尿囊液凍干保存毒種；乙型為B/Jiangsu/10/2003，系雞胚6代尿囊液凍干保存毒種。上述三種毒種均購自英國國家生物制品及標準化控制研究所(NIBSC)，為WHO推薦的流感疫苗株。
2.主代病毒種子庫的建立將上述三種毒種分別在專用的無菌室內啟封，在SPF雞胚上進行1～3次適應性傳代。將收獲的病毒尿囊液分別進行無菌試驗、血凝效價的測定。無菌試驗合格，選擇血凝效價(HA效價)達到1∶320以上的作為生產用主代種子。并對其進行EID50、HI及中和試驗等指標進行檢定，建立主代病毒種子庫。
3.原代地鼠腎細胞的培養選10～14日齡健康的金黃地鼠(Mesocricetus auratus，簡稱地鼠)，用飲用水殺死并清洗1～2次，用1‰新潔爾滅消毒1～3次，每次3～8分鐘。在無菌環境下，用無菌剪子解剖地鼠并取出腎臟，剪碎后加入含0.1％～0.5％的胰蛋白酶和0.01％～0.05％的EDTA組成的消化液，置于2-8℃冷消化15～20小時，棄掉消化液，加入生長液分散細胞，并制備成1.0×107～1.0×108個/ml的懸液。取1～2ml細胞懸液接種于玻璃方瓶中，用生長液加至10ml，放置于37℃的CO2培養箱中培養24～48小時，培養瓶中培養達到占據培養面的60％～80％時棄掉生長液，用生理鹽水輕輕地漂洗1～3次細胞面，然后換成病毒感染液。生長液由基礎培養基IMDM或者DMEM加入小牛(胎牛)血清、胰島素、多聚賴氨酸制成，其中每100ml生長液中含有基礎培養基IMDM或者DMEM為90～95ml、小牛(胎牛)血清為5～10ml、胰島素為0.005～0.05克、多聚賴氨酸為0.001～0.05克。
4.用主代流感病毒種子感染原代地鼠腎細胞用維持液I將主代流感病毒種子液稀釋102～104倍作為病毒感染液感染制備好了的細胞。維持液I是由基礎培養基IMDM或者DMEM加入人血白蛋白、半胱氨酸和胰島素組成。其中每100ml的維持液I含有基礎培養基IMDM或者DMEM為75～97.5ml、20％(質量/體積)的人血白蛋白為2.5～25ml、半胱氨酸0.05～0.5克以及胰島素為0.005～0.05克。
5.原代地鼠腎細胞感染后培養(工作種子庫的建立)將感染后的培養瓶放于37℃的CO2培養箱中，使病毒吸附1～5小時，然后改變溫度為32～35℃維持培養1～2天，更換一次維持液I。繼續維持培養1～2天，收獲病毒液。然后分別進行無菌試驗、血凝效價的測定。如無菌試驗合格，血凝效價在1∶640以下，則用病毒液繼續感染培養好了的地鼠腎細胞，同樣在32～35℃維持培養2～4天，收獲病毒液，再進行無菌試驗、血凝效價(HA效價)的測定。當無菌試驗合格，血凝效價(HA效價)達到1∶640或以上時，將病毒液作為流行性感冒原代地鼠腎細胞純化疫苗生產用的工作種子。對其進行EID50、HI及中和試驗等指標的檢定。
如收獲的病毒液無菌試驗不合格，則重新利用主代病毒種子在原代地鼠腎細胞上適應傳代。主代種子到工作種子，在地鼠腎細胞上適應性傳代為8代以內，一般為3～8代，更優選3～6代，其毒株的抗原性、毒力、毒性與原始毒株應當保持一致。
二、疫苗原液的生產1.地鼠腎細胞的制備選10～14日齡健康的金黃地鼠，飲用水殺死并清洗1～2次，用1‰新潔爾滅消毒1～3次，每次3～8分鐘。在無菌環境下，用無菌剪子解剖地鼠并取出腎臟，剪碎后加入由0.1％～0.5％的胰蛋白酶和0.01％～0.05％的EDTA組成的消化液，置于2～8℃冷消化15～20小時，棄掉消化液，加入生長液分散細胞，制備成1.0×107～1.0×108個/ml的細胞懸液。取該原代細胞懸液，按照細胞懸液∶生長液為1∶20～1∶100的比例接種于3L、10L轉瓶中或者接種于細胞生物反應器中，再加入生長液，使細胞的初始濃度為1.0×105～5.0×106個/ml。轉瓶在37℃有CO2的環境下進行細胞培養，而細胞生物反應器則設定好培養條件進行培養，其培養條件為轉速為50～80rpm，溫度為36℃～38℃，pH為6.5～7.5，溶氧為15％～85％。
2.種子病毒的接種和疫苗原液的收獲當細胞培養濃度達到1.0×107～1.0×108個/ml時；或者原代地鼠腎細胞在轉瓶中培養達到占據培養面的60％～80％或生物反應器培養中細胞在載體上的貼壁率達到70％～90％時，用生理鹽水漂洗1～3次，換成維持液I。將原代地鼠腎細胞適應的流感病毒工作種子用維持液I稀釋103～105倍，然后進行感染，并在37℃適應吸附于細胞1～6小時，改變成32～35℃維持培養，感染后的1～2天，更換成維持液II。繼續維持培養1～3天，收獲細胞感染液及細胞，置于-60℃凍溶融2～3次后，取樣做無菌試驗和血凝效價(HA效價)測定。其中，維持液II是由基礎培養基M199或者MEM加入人血白蛋白、半胱氨酸和胰蛋白酶組成。100ml的維持液II含有基礎培養基為90～99ml、20％(質量/體積)的人血白蛋白為1～10ml、半胱氨酸為0.05～0.5克以及胰蛋白酶0.01～0.1克。
三.疫苗原液的處理純化及疫苗的配制當無菌試驗合格，血凝效價達到1∶320以上時，則將單價病毒液，離心后進行超濾濃縮，然后按滅活劑和單價病毒液的體積比1∶4000加入滅活劑進行滅活，滅活劑為甲醛溶液或者β-丙內酯溶液。然后進行1000～2000rpm低速離心，取上清，經過超濾，可使樣品濃縮20倍以上，同時去除相當的雜質。經超速離心和Sepharose 4FF凝膠過濾層析純化，經平衡、上樣、清洗和洗脫后，總回收可達80-90％，純化后的單價病毒液過濾除菌，并抽樣進行單價病毒液檢定。然后根據不同單價原液血凝素抗原含量的相應比例進行混合(合并)，即為疫苗半成品。檢定合格后分裝成為成品。
實施例一流行性感冒病毒原代地鼠腎細胞適應的毒種制備原始毒種甲1(H1N1)型為IVR-116，系雞胚8代尿囊液凍干保存毒種；甲3(H3N2)型為NYMC X-15F，系雞胚8代尿囊液凍干保存毒種；乙型為B/Jiangsu/10/2003，系雞胚6代尿囊液凍干保存毒種。
將上述三種毒種在專用的無菌室內啟封，分別在SPF雞胚上進行2次適應性傳代。最終收獲的病毒尿囊液，分別進行無菌試驗、血凝效價(HA效價)的測定。無菌試驗合格，甲1和甲3的血凝效價均為1∶640，乙型的血凝效價為1∶320，從而建立生產用主種子庫。并對其進行EID50、HI及中和試驗等指標的檢定。其結果見表1。
表1.流感主代毒種的檢定結果

取11日齡健康的金黃地鼠，用飲用水殺死并清洗2次，用1‰新潔爾滅消毒2次，每次5分鐘。在無菌環境下，用無菌剪子解剖地鼠并取出腎臟，剪碎后加入含0.15％胰蛋白酶和0.01％EDTA的消化液，置于2-8℃冰箱中冷消化18小時，棄掉消化液，用生理鹽水洗滌2次，加入生長液分散細胞，制備成4.0×107個/ml的懸液。生長液為基礎培養基IMDM加入8％(以生長液為100的重量百分比)小牛血清、0.02％胰島素、0.01％多聚賴氨酸等細胞生長促進劑。取2ml細胞懸液接種于玻璃方瓶中，再加入生長液8ml，放于37℃的CO2培養箱中培養。
培養40小時后，培養瓶中的細胞達到占據培養面的60％～80％時，棄掉生長液，用生理鹽水輕輕地漂洗2次細胞面，換成維持液I。其組成為每100ml維持液I中加入基礎培養基IMDM 1克(培養基為干粉時)、人血白蛋白2克、半胱氨酸0.1克、胰島素0.01克，其余的為水。同時，將主代單價的流感病毒種子用維持液I按103倍稀釋，分別進行感染。感染后的培養瓶放于37℃的CO2培養箱中，使病毒吸附4小時，然后改變溫度為34℃維持培養2天，將維持液I吸出換成新鮮的維持液I，繼續培養2天，收獲病毒液，分別進行無菌試驗、血凝效價(HA效價)。其無菌試驗合格，血凝效價分別均為1∶320，收獲病毒液，并將其病毒液繼續感染培養好了的地鼠腎細胞，同樣34℃維持培養，4天時收獲病毒液，然后進行無菌試驗、血凝效價的測定。無菌試驗合格，甲1和乙型的血凝效價分別為1∶320，甲3的血凝效價為1∶640。保存病毒收液，同時也將收獲的病毒液接種于已換成維持液的培養瓶中(細胞達到占據培養面的60％～80％時)，接種比例為4∶6(病毒收液∶維持液)34℃維持培養2天，收獲病毒液，進行無菌試驗、血凝效價的測定。其檢定結果為無菌試驗合格，可復制的DNA為陰性，血凝效價均為1∶640。將各單價收液分別分成兩部分，一部分冷凍干燥成凍干粉劑，一部分不凍干，并分別儲存于-70℃的超低溫冰箱中備用。
實施例二流行性感冒病毒原代地鼠腎細胞適應的毒種制備原始毒種甲1(H1N1)型為IVR-116，系雞胚8代尿囊液凍干保存毒種甲3(H3N2)型為NYMC X-15F，系雞胚8代尿囊液凍干保存毒種；乙型為B/Jiangsu/10/2003(2004年WHO推薦)，系雞胚6代尿囊液凍干保存毒種。
主代種子為實施例一制備的三個型別的流感主代種子。
地鼠腎解剖、制備細胞懸液以及接種玻璃瓶培養均同實施例一。
當培養瓶中細胞達到占據培養面的60％～80％時，漂洗后換成維持液I，并分別用維持液I按103倍稀釋各型別的主代流感病毒種子進行感染。將感染后的培養瓶放于37℃的CO2培養箱中，使病毒吸附6小時，然后改變溫度為34℃維持培養2天，收獲病毒液，分別進行無菌試驗、血凝效價。其無菌試驗合格，血凝效價均為1∶320，收獲病毒液，并將其病毒液繼續感染培養好了的地鼠腎細胞，同樣34℃維持培養3天，收獲病毒液，然后進行無菌試驗、血凝效價(HA效價)的測定。無菌試驗合格，甲1和甲3的血凝效價(HA效價)為1∶640，乙型的血凝效價(HA效價)為1∶320。保存病毒收液，同時也將收獲的病毒液接種于已換成維持液的培養瓶中(細胞達到占據培養面的60％～80％時)，接種比例為2∶3(病毒收液∶維持液)34℃維持培養3天，收獲病毒液，進行無菌試驗、血凝效價(HA效價)的測定。其檢定結果為無菌試驗合格，血凝效價(HA效價)為1∶640，保存病毒收液，同時再將收獲的病毒液接種于已換成維持液的培養瓶中(細胞達到占據培養面的60％～80％時)，接種比例為1∶5(病毒收液∶維持液)34℃維持培養2天，收獲病毒液，進行無菌試驗、血凝效價的測定。其檢定結果為無菌試驗合格，甲1和乙型的血凝效價分別為1∶640，甲3的血凝效價(HA效價)為1∶1280。將此收液分成兩部分，一部分冷凍干燥成凍干粉劑，一部分不凍干，并分別儲存于-70℃的超低溫冰箱中作為工作種子備用。
實施例三流感全病毒滅活疫苗的制備毒種為實施例二的原代地鼠腎細胞適應的流感病毒工作種子。
取11日齡健康的金黃地鼠，飲用水殺死并清洗2次，用1‰新潔爾滅消毒2次，每次5分鐘。在無菌環境下，用無菌剪子解剖地鼠并取出腎臟，剪碎后加入含0.15％胰蛋白酶和0.01％EDTA的消化液，置于2-8℃冷消化16小時，棄掉消化液，加入生長液分散細胞，并制備成5.0×107個/ml的細胞懸液。取該原代細胞懸液15ml接種于3L轉瓶中，補加285ml的生長液，使細胞的初始濃度為2.5×106個/ml。轉瓶在37℃有CO2的環境下進行細胞培養。2天后，原代地鼠腎細胞在轉瓶中培養已達到占據培養面的80％時，棄去細胞生長夜，用生理鹽水漂洗細胞培養面2次，換成維持液I，其換液量為270ml，同時分別感染30ml已制備好(用維持液I進行103倍稀釋)的三個型別的單價流感地鼠腎細胞適應的病毒工作種子。在37℃適應吸附3小時，改變成34℃維持培養，感染后2天，換成維持液II。維持液II是由基礎培養基M199加入1％(以維持液II為總量100計)的人血白蛋白、0.1％的半胱氨酸、0.05％的胰蛋白酶組成。繼續維持培養3天，收獲細胞獲感染液，再將細胞撞下，置于-60℃凍溶融后再與收獲液混合，并取樣做無菌試驗和血凝效價測定。檢定結果為甲1、乙型為1∶640，甲3為1∶1280。
將上述檢定合格的單價病毒液合并，1000～2000rpm低速離心后，上清進行超濾濃縮，濃縮液再經超速離心取沉淀，并用PBS溶解后按1∶4000加入滅活劑進行甲醛溶液滅活。滅活的病毒液經離子交換和凝膠過濾純化。其病毒回收率可達到90％以上，同時可使樣品濃縮20倍以上。純化后的單價病毒液過濾除菌，并抽樣進行單價病毒液的檢定。其檢定結果為甲1、乙型為1∶10240，甲3為1∶20480。根據不同單價原液血凝素抗原含量，按2∶2∶1的比例進行混合，加入硫柳汞至終濃度0.008％作為防腐劑，即為疫苗半成品。檢定合格后分裝成為成品。
實施例四流感裂解疫苗的制備毒種為實施例二的原代地鼠腎細胞適應的流感病毒工作種子。
取腎制備的細胞懸液的過程同實施例三。取該原代細胞懸液(細胞濃度為5.0×107個/ml)70ml接種于5L生物反應器中，生物反應器中事先經過滅菌以及裝有Cytodex 1(或Cytodex 3)的微載體，接種細胞后補加生長液至3.5L，使細胞的初始濃度為1.0×106個/ml。設定培養條件為，溫度37℃，pH6.7，溶氧35％。2天后取樣觀察并計數細胞，細胞的滿球率達到85％，細胞濃度為2.4×107個/ml。將帶有細胞的微載體自然沉降，排出生長液，用生理鹽水漂洗1次，然后更換成維持液I。將甲1型原代地鼠腎細胞適應的流感病毒工作種子用維持液I 1000倍稀釋，然后加入100ml于生物反應器中進行感染。并在不改變培養條件下，適應吸附5小時，然后改設溫度為34℃，pH7.2，溶氧45％維持培養。感染后2天，換成維持液II，繼續維持培養2天，收獲細胞獲感染液，并將細胞從微載體上撞下，置于-60℃凍溶融后再與收獲液混合，2000rpm離心去沉淀，并取樣做無菌試驗和血凝效價測定。
同樣的方法，利用生物反應器培養原代地鼠腎細胞，而分別再感染甲3型和乙型的工作毒種，分別取樣測定無菌試驗和血凝效價測定。
測定的結果無菌試驗均合格，甲1、甲3的血凝效價均為1∶1280，乙型為1∶640。
將上述檢定合格的單價病毒液分別以1000～2000rpm低速離心后，上清進行超濾濃縮，濃縮液再經超速離心取沉淀，并用PBS溶解沉淀后按1∶4000加入甲醛溶液對單價病毒液進行滅活。滅活的單價病毒液加入Triton X100裂解液裂解1～2小時，再經離子交換和凝膠過濾純化。收集抗原液，經過濾除菌后成為單價病毒裂解液，并抽樣進行的檢定。其檢定結果為甲1、甲3為1∶40960，乙型為1∶20480。根據不同單價疫苗血凝素抗原含量，按1∶1∶2的比例進行混合，加入硫柳汞至終濃度0.008％作為防腐劑，即為裂解疫苗的半成品。檢定合格后分裝成為成品。
實施例五流感亞單位疫苗的制備毒種為實施例二的原代地鼠腎細胞適應的流感病毒工作種子。
原代地鼠腎細胞的制備同實施例二，細胞制備成5.0×107個/ml的細胞懸液。取該原代細胞懸液35ml接種于5L籃式生物反應器中，生物反應器以及其中的聚酯纖維片狀載體事先經過滅菌處理并浸泡于生長液中，接種細胞后補加生長液至3.5L，使細胞的初始濃度為5.0×105個/ml。設定培養條件為，溫度37℃，pH6.8，溶氧40％。2天后取樣觀察并計數細胞，細胞濃度為1.5×107個/ml。然后更換成維持液I，并感染已稀釋好的(1000倍稀釋)甲1型原代地鼠腎細胞適應的流感病毒工作種子100ml。在不改變培養條件下，適應吸附4小時，然后改設溫度為34℃，pH7.2，溶氧50％維持培養。感染后2天，換成維持液II，設溫度為33℃，pH7.4，溶氧50％繼續維持培養3天，收獲感染液，同時將載體和部分維持液在無菌條件下取出，置于-60℃凍溶融后再與收獲液混合，2000rpm離心去沉淀，并取樣做無菌試驗和血凝效價測定。
同樣的方法，利用籃式生物反應器培養原代地鼠腎細胞，而分別再感染甲3型和乙型的工作毒種，分別取樣測定無菌試驗和血凝效價測定。
測定的結果無菌試驗均合格，三型血凝效價均為1∶1280。
將上述檢定合格的單價病毒液上清分別進行超濾濃縮，濃縮液再經超速離心取沉淀，并用PBS溶解沉淀后按1∶4000加入甲醛溶液對單價病毒液進行滅活。滅活的單價病毒液用Triton X100裂解液裂解和高壓勻質機勻質后，經離子交換和凝膠過濾，并收集HA和NA的抗原峰。再經過濾除菌成為單價流感病毒亞單位疫苗的原液，并抽樣進行無菌試驗，DNA檢測以及血凝效價測定。
其檢定結果無菌試驗合格，可復制的DNA為陰性，甲1、甲3、乙型均為1∶20480，所以按1∶1∶1的比例進行混合，并加入硫柳汞至終濃度0.008％作為防腐劑，即為裂解疫苗的半成品。檢定合格后分裝成為成品。
試驗實施例一工作種子檢定的相關試驗
(一)實驗材料病毒株主代種子為實施例一所制備的三個型別的流感主代種子，工作種子為實施例二所制備的流感工作種子。
稀釋液等滲的磷酸鹽緩沖液(PBS)。
陽性對照為實施例一所制備的主種子。
陰性對照PBS。
血球雞的紅血球，深圳市孚沃德生物技術有限公司制備。
雞胚11日齡的普通受精的雞胚，市售。
動物小白鼠，市售。
(二)實驗方法1.血凝效價測定試驗1)在V型96孔板的12孔中，各加1滴約25μl的PBS；2)用微量稀釋棒蘸取待測病毒，依次與孔中的PBS混合稀釋。同時設標準陽性和陰性對照。
3)每孔中加2滴1％的雞紅血球，混勻，4℃、60分鐘后觀察并判定結果。
2.工作毒種的EID50測定試驗采用固定血清稀釋病毒法，將病毒稀釋成10-6、10-7、10-8、10-9，與等量的血清混合作用適當時間后，接種雞胚尿囊腔，每個稀釋度接種4個雞胚。孵化72hr后，收獲尿囊液，分別測定血凝效價。同時設標準陽性和陰性對照。按照Reed和Muench法計算待測病毒的EID50。
3.工作毒種血凝抑制(HI)試驗1)在96孔凝板的12孔中，各加一滴約25μL PBS；2)用微量稀釋棒蘸到待測抗血清或標準血清，依次與孔中的PBS混合稀釋。再滴加等量的標準抗原或待測抗原；3)每孔中加1滴1％的雞紅血球，用微量震蕩儀混勻，4℃、60分鐘后，觀察并判定結果。同時設標準陽性和陰性對照。
4.工作毒種的中和試驗采用固定血清稀釋病毒法，同時設標準陽性和陰性對照。接種雞胚尿囊腔，每個稀釋度0.2ml接種4個雞胚。孵化72小時后，收獲尿囊液，分別測定血凝效價。按照Reed和Muench法計算待測病毒的中和指數。
5.工作毒種的傳代限度試驗用原代地鼠腎細胞對三個型別的流感病毒株主代種子進行連續適應性傳代，并同時進行毒種的HA測定、EID50及小白鼠安全試驗。其結果見表2，說明流感病毒在原代地鼠腎細胞上連續傳遞10代內毒力穩定。
(三)實驗結果1.經血凝效價測定，甲1、甲3和乙型三型地鼠腎細胞已適應的流感病毒工作毒種的血凝效價均在640～1280之間。
2.測定經按照Reed和Muench法計算，甲1、甲3和乙型三個毒株工作毒種的EID50分別為10-9.0、10-9.25和10-9.253.甲1、甲3和乙型三個毒株工作毒種的HI效價均大于640。
4.甲1、甲3和乙型三個毒株工作毒種的中和指數分別為9.0logEID50/0.2ml、9.25logEID50/0.2ml和9.25logEID50/0.2ml。
5.生產毒種毒力、傳代限度及穩定性見表2。
表2.毒種毒力、傳代限度及穩定性結果

由上表可見，上述三株原代地鼠腎細胞適應的流行性感冒病毒的工作種子，其血凝效價均在640以上，型別及亞型完全正確。其EID50分別為10-9.0/0.2ml、10-9.25/0.2ml和10-9.25/0.2ml，與原始毒種具有相似的免疫原性。
試驗實施例二流感病毒原代地鼠腎細胞適應株穩定性試驗(一)實驗材料病毒種子實施例二中制備的三個型別的原代地鼠腎細胞適應的流感工作種子。
(二)實驗方法根據《中華人民共和國藥典》2005年版三部附錄XF的方法，對以上樣品定期進行活性測定。
(三)實驗結果-70℃條件下保存的凍干種子及液體種子，在不同的保存時間，對其EID50以及HA的穩定性進行檢測，結果見表4、表5。
表3.主代種子庫

表4.地鼠腎細胞適應的流感病毒株工作種子在-70℃保存不同時間EID50的穩定性結果

表5.地鼠腎細胞適應的流感病毒株工作種子在-70℃保存不同時間HA的穩定性結果

試驗實施例三疫苗免疫原性或效力試驗本試驗的目的是觀察流行感冒病毒亞單位疫苗免疫小鼠后免疫原性是否良好，產生中和抗體能力如何。為判斷疫苗效果提出一個試驗依據或參考標準。
(一)試驗材料1.疫苗為實施例三所制備的三批流感疫苗疫苗產品，分別為20050601，20050602和20050603。疫苗的血滴度均為1∶2560。
2.小白鼠深圳光明衛武制品公司提供。體重18～20克健康小白鼠。
3.病毒株實施例二所制備的工作種子，每個毒株分別制成含有100～1000個EID50的新鮮病毒液備用。
4.雞胚為9～11日齡健康雞胚。
5.1％雞血球，深圳市孚沃德生物技術有限公司自行配制。
6.稀釋疫苗的稀釋液為生理鹽水或PBS，病毒稀釋液為維持液II。
(二)實驗方法將疫苗兩倍連續稀釋，由1∶40至1∶280各稀釋度分別免疫體重18～20克小白鼠12只，腹腔注射每支0.5ml，同時任選12只不予免疫，并與免疫組小白鼠置相同條件下飼養，作為對照。
免疫14天后，每個稀釋度及對照各取10只小鼠，分別采血，同一稀釋度者混于一個試管中，分離血清后，立即置56℃水浴中滅活30分鐘，然后與疫苗毒種100～1000EID50病毒量相混合，置37℃水浴中和30分鐘。
中和后立即接種9-11日齡雞胚，每個稀釋度及對照至少接種四個雞胚，每胚尿囊腔0.1ml。置35℃培育，48-72小時后冷胚，收獲尿囊液每胚0.25ml，加入1％雞血球0.25ml，做直接血凝。對照組血清中和結果均為HA陽性，免疫組按Reed和Muench氏法計算50％中和效價。
(三)試驗結果三批價流行性感冒病毒疫苗免疫小白鼠，其血清對甲1(IVR-116)，甲3(NYMC X-15F)，乙型(B/Jiangsu/10/2003)地鼠腎適應毒株由原代地鼠腎細胞生產的疫苗中和試驗結果見表6。
表6.流行性感冒病毒疫苗效力試驗結果

注分子為中和試驗雞胚尿囊液直接血凝陽性數。
從上表的結果可以看出，三批疫苗的50％保護稀釋度在1∶320～1∶640之間。使用該工藝生產的流感滅活疫苗的50％中和效價均在1∶640以上，與進口樣品效果相當。
試驗實施例四疫苗抗原性試驗(一)試驗材料抗原疫苗批號為20050601，20050602和20050603，深圳市孚沃德生物技術有限公司生產。
動物小白鼠，體重16～18克。深圳光明衛武制品公司提供。
(二)實驗方法將三批疫苗分別免疫小白鼠各10只，每只小鼠皮下接種0.2ml，另取10只小白鼠皮下接種生理鹽水，置相同條件下飼養。免疫后21天，分別采血分離血清，用血凝及血凝抑制試驗方法測定抗體效價。
(三)試驗結果抗原性試驗結果見表7。
表7.抗原性試驗結果

從上表可以看到，使用本工藝制備的裂解型流感滅活疫苗接種小鼠后，針對各亞型抗原產生的抗體水平均在1∶480以上，可以認為我們的疫苗接種是有效的。
試驗實施例五疫苗的過敏性試驗
(一)試驗材料(1)疫苗實施例三制備的流感疫苗。
(2)豚鼠體重300～400克。
(3)標準過敏原(陽性對照)牛血清白蛋白，分析純。
(4)陰性對照無菌的生理鹽水。
(二)實驗方法按照現行的中華人民共和國藥典要求的方法進行。取流感疫苗各6ml，皮下接種3只豚鼠，每只接種1ml，間隔一周，進行第二次注射，每只皮下1ml，使豚鼠致敏。第二次注射后三周，再以相同樣品靜脈注射，每只0.5ml。觀察豚鼠有無過敏性反應出現。同時設陰性和陽性對照。
(三)試驗結果第三次注射后當天及三天內觀察結果9只豚鼠未見鼻癢、噴嚏、煩躁不安或呼吸困難或休克、痙攣等過敏反應癥狀，全部試驗動物健康存活。而陽性對照均有不同程度的過敏反應癥狀噴嚏、煩躁不安、呼吸困難或休克、痙攣等。見下表。
表8.疫苗過敏原性試驗結果

可見，本疫苗樣品接種豚鼠進行過敏原性試驗，最后一次注射后連續觀察三天，全部豚鼠均一切正常。說明本疫苗對豚鼠過敏原性試驗為陰性。
試驗實施例六異常毒性試驗(一)試驗材料(1)疫苗實施例三制備的流感疫苗。
(2)試驗動物小白鼠18～20克。共10只。
豚鼠300g左右，10只。
(二)實驗方法腹腔注射法。小白鼠，2ml/只；豚鼠，5ml/只。將小白鼠和豚鼠分別隨機均分為兩組一組為實驗組，另一組為對照。小白鼠為皮下接種，接種劑量0.5ml/只；豚鼠為腹腔接種，接種劑量5ml/只。注射前稱量體重，注射后逐日觀察精神狀態、食欲和體溫等變化，并于結束前再稱體重。以精神狀態、食欲和體溫等正常，結束前體重由所增加為無異常毒性試驗，即為合格。
(三)試驗結果表9.疫苗異常毒性試驗結果

14日后，各實驗組受試動物均存活，同時體重均有不同程度的增加，可見疫苗沒有異常毒性反應，疫苗是安全的。
試驗實施例七過敏原性試驗(一)試驗材料(1)疫苗實施例三制備的流感疫苗。
(2)對照陽性對照為小牛血清；陰性對照為生理鹽水。
(3)試驗動物健康豚鼠，體重為300～400克，9只。
(二)實驗方法取疫苗10ml，同時以小牛血清作為陽性對照，生理鹽水作為陰性對照。皮下接種三只豚鼠，每只接種1ml，間隔一周后進行第二次注射，每只皮下1ml，使豚鼠致敏，致敏三周后再以相同樣品靜脈注射每只0.5ml，觀察豚鼠有無過敏性反應出現。
(三)試驗結果表10.觀察的結果記錄

備注疫苗組1、2、3，陰性對照組4、5、6，陽性對照組7、8、9。
靜脈注射后當天及三天內觀察可見接種疫苗組三只豚鼠未出現鼻癢、噴嚏、煩躁不安、呼吸困難、休克、痙攣等過敏反應癥狀，全部實驗動物健康存活；陽性對照組的三只實驗動物中有三只出現呼吸困難、輕度休克。試驗說明，此工藝制備的流感疫苗動物不會發生過敏反應。
權利要求
1.一種流行性感冒疫苗，其特征在于，所述疫苗是一種利用原代地鼠腎細胞作為流感病毒傳代增殖的基質而制備的疫苗。
2.根據權利要求1所述的流行性感冒疫苗，其特征在于，所述疫苗沒有對人體或其它動物具有致瘤性的傳代細胞可復制的DNA。
3.根據權利要求1所述的流行性感冒疫苗，其特征在于，所述疫苗為人、禽或其它動物流感全病毒疫苗、流感裂解疫苗或流感亞單位疫苗。
4.一種流行性感冒疫苗的制備方法，包括如下步驟(a).將流行性感冒病毒原始毒種通過無特定病原雞胚適應性傳代，作為主代種子；(b).原代地鼠腎細胞的制備及利用培養瓶或細胞生物反應器進行培養；(c).用主代種子感染原代地鼠腎細胞，并進行適應性傳代，直至得到病毒血凝效價不低于1∶640的毒種作為疫苗的工作種子；(d).用工作種子感染原代地鼠腎細胞，進行病毒擴增，直至病毒血凝效價不低于1∶320為疫苗單價原液；(e).疫苗單價原液經濃縮、滅活、純化后，將不同型別的單價病毒液進行混合，分裝成成品。
5.根據權利要求4所述的流行性感冒疫苗的制備方法，其特征在于，將世界衛生組織每年推薦的或國家相關部門批準的人流行性感冒病毒毒種或禽流行性感冒病毒毒種，通過1～3代的無特定病原雞胚適應性傳代，取血凝效價達到1∶320以上的雞胚尿囊液作為主代種子；主代種子到工作種子在原代地鼠腎細胞適應性傳代的次數為3～6代。
6.根據權利要求4所述的流行性感冒疫苗的制備方法，其特征在于，原代地鼠腎細胞的培養方式或感染了流感病毒后的原代地鼠腎細胞的培養方式選自玻璃瓶貼壁培養、生物反應器微載體懸浮培養或生物反應器片狀載體籃式培養。
7.根據權利要求4所述的流行性感冒疫苗的制備方法，其特征在于原代地鼠腎細胞培養時，采用基礎培養基中另外加入促生長劑作為生長液；流感病毒感染地鼠腎細胞后培養時，采用基礎培養基中另外加入促生長劑作為細胞維持液；所述促生長劑能促細胞生長和促病毒增殖，其成分為小牛或胎牛血清、人血白蛋白、胰蛋白酶、胰島素、半胱氨酸和多聚賴氨酸中的一種或多種的組合；當使用的基礎培養基為液體時，所述促生長劑的加量的重量與所述基礎培養基的體積之比為1∶1000到1∶10，當培養基為干粉時，取相當量，余量為水。
8.根據權利要求7所述的流行性感冒疫苗的制備方法，其特征在于，在原代地鼠腎細胞的培養階段，所用生長液中促生長劑的加量的重量與所述液體基礎培養基的量的體積之比為1∶50到1∶10；原代地鼠腎細胞感染流感病毒后采用的維持液中促生長劑的量與液體基礎培養基按重量與體積比為1∶1000到1∶50。
9.根據權利要求4所述的流行性感冒疫苗的制備方法，其特征在于，所述基礎培養基選自M199、MEM、DMEM、IMDM、IPM1640和Ham F12培養基中的一種或多種的組合。
10.根據權利要求4所述的流行性感冒疫苗的制備方法，其特征在于，原代地鼠腎細胞培養達到細胞濃度為1.0×107～1.0×108個/ml時，或者原代地鼠腎細胞在培養瓶中培養達到占據培養面的60％～80％或生物反應器培養中細胞在載體上的貼壁率達到70％～90％時，進行流感病毒的感染。
全文摘要
本發明涉及一種流行性感冒原代地鼠腎細胞多價純化疫苗其制備方法，該疫苗中不含有致瘤性的傳代細胞可復制的DNA。其制備方法是采用原代地鼠腎細胞為病毒培養基質，將每年世界衛生組織推薦的、或國家相關部門批準的人流感病毒或禽流感病毒毒種，通過原代地鼠腎細胞的適應傳代，短時間內獲得能在原代地鼠腎細胞中進行適應增殖的流感病毒株，該毒株具有與當年流行的流感病毒原始毒株相似的免疫原性，并且能夠利用培養瓶或細胞生物反應器培養該感染了人(或禽)流感病毒的地鼠腎細胞，從而收獲流感病毒原液，進而通過離心、超濾、滅活等初步純化和進一步的超速離心及柱層析等精制純化步驟，得到符合疫苗要求的流行性感冒疫苗。
文檔編號A61P31/16GK1911445SQ20061011212
公開日2007年2月14日 申請日期2006年8月11日 優先權日2006年8月11日
發明者李云英, 王玉清, 吳歧 申請人:深圳市孚沃德生物技術有限公司