用單糖和二糖類化合物預防和治療傳染病和其他疾病的方法

專利名稱：用單糖和二糖類化合物預防和治療傳染病和其他疾病的方法
本申請是申請日為2001年5月18日，申請?zhí)枮?1811488.1，發(fā)明名稱同上的專利申請的分案申請。
背景技術(shù)：
天然免疫系統(tǒng)通過一個系統(tǒng)協(xié)調(diào)對病原體的炎性反應(yīng)，此系統(tǒng)通過識別僅由微生物合成的分子種類的受體區(qū)分自身(病原體)和非自身(病原體)。這些種類有時被稱為病原體相關(guān)的分子模式(PAMPs)并包括例如，脂多糖(LPS)、肽葡聚糖、脂磷壁酸質(zhì)和細菌脂蛋白(BLPs)。
LPS是一種被天然免疫系統(tǒng)識別的來源于革蘭氏陰性細菌的豐富的細胞壁外組分。雖然已經(jīng)知道LPS的化學結(jié)構(gòu)有一段時間，但是僅在最近開始闡明了血清蛋白質(zhì)和/或細胞識別LPS的分子基礎(chǔ)。在最近的一系列報告中，已將受體家族，被稱為Toll樣受體(TLRs)，與對LPS和其他微生物成分的有效的天然免疫應(yīng)答相聯(lián)系。所有TLR家族的成員都是有單一跨膜結(jié)構(gòu)域的膜蛋白。細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域約200個氨基酸，并類似地與IL-1受體的細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域分享。蛋白質(zhì)Toll家族的胞外域相對較大(約550-980個氨基酸)并可以含有多個配體結(jié)合位點。
對于至少兩種Toll樣受體，Tlr2和Tlr4，已明確證實了TLR在對LPS的免疫應(yīng)答中的重要性。例如，用胚胎腎細胞進行的轉(zhuǎn)染研究顯示人的Tlr2足以使LPS產(chǎn)生響應(yīng)能力(Yang等，自然(Nature)395284-288(1998)；Kirschning等，實驗醫(yī)學雜志(J Exp Med.)112091-97(1998))。LPS產(chǎn)生的強烈的反應(yīng)看來需要LPS-結(jié)合蛋白(LBP)和CD14二者，它以高親合力與LPS結(jié)合。觀察到了LPS與Tlr2以較低親合力的直接結(jié)合，提示輔助蛋白質(zhì)可能在體內(nèi)通過LPS促進Tlr2的結(jié)合和/或活化。
利用在lps突變小鼠品系中進行的定位克隆證明了Tlr4在對LPS的免疫應(yīng)答中的重要性。已識別了小鼠lps基因的兩個突變等位基因，出現(xiàn)在C3H/HeJ品系中的半顯性等位基因和出現(xiàn)在C57BL/10ScN和C57BL/10ScCr品系中的第二隱性等位基因。對lps的突變等位基因純合的小鼠對革蘭氏陰性細菌引起的感染敏感，并能抵抗LPS-誘導的膿毒性休克?？寺∵@些品系的lps基因座，證明在兩個例子中突變均改變小鼠Tlr4基因(Portorak等，科學(Science)2822085-2088(1998)；Qureshi等，實驗醫(yī)學雜志4615-625(1999))。從這些報告得出結(jié)論Tlr4對于對LPS的應(yīng)答是必需的。
LPS的生物活性內(nèi)毒素的亞結(jié)構(gòu)部分是脂質(zhì)A，磷?；亩嘀刂舅狨；咸前范?，用以將整個結(jié)構(gòu)固定在革蘭氏陰性細菌的外膜上。我們以前報道了可以通過脂質(zhì)A的選擇性化學修飾生成一磷?；|(zhì)A化合物而改善脂質(zhì)A的毒性作用(MPL免疫刺激劑；CorixaCorporation；Seattle，WA)。在疫苗佐劑和其他應(yīng)用中制備和使用MPL免疫刺激劑和結(jié)構(gòu)類似化合物的方法已有記載(見，例如，美國專利4,436,727；4,877,611；4,866,034和4,912,094；4,987,237；Johnson等，醫(yī)學化學雜志(J Med Chem)424640-4649(1999)；Ulrich和Myers，疫苗設(shè)計亞單位和佐劑探討(Vaccine DesignThe Subunit and Adjuvant Approach)；Powell和Newman，編輯；Plenum紐約，495-524，1995；將這些文獻公開的內(nèi)容全部引入文本作為參考)。特別地，這些和其他參考資料證明在疫苗制劑中與蛋白質(zhì)和糖類抗原共同使用以促進體液和/或細胞介導的對于抗原的免疫時，MPL免疫刺激劑和相關(guān)化合物具有顯著的佐劑活性。
另外，我們以前描述了一磷?；|(zhì)A的一類合成的單糖和二糖模擬物，稱為氨烷基氨基葡糖苷磷酸脂(AGPs)，例如在美國專利申請08/853,826、09/074,720、09/439,839和在PCT/US 98/09385中，將這些申請公開的內(nèi)容全部引入本文作為參考。如同一磷?；|(zhì)A，已證明當與抗原配制在疫苗組合物中時，這些化合物保留顯著的佐劑特性，另外，當與一磷?；|(zhì)A比較時，有相似或改良的毒性全貌。AGPs所提供的顯著的優(yōu)勢是它們能通過合成手段容易地以商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)。
雖然原來已記載了一磷?；|(zhì)A和AGPs在疫苗制劑中與抗原結(jié)合使用，但以前并沒有報道過在沒有抗原時，它們作為單一治療劑在預防和/或治療植物和動物疾病-例如傳染病、自身免疫性疾病和變應(yīng)性疾病中的用途。
本發(fā)明作為對成為一磷酰基脂質(zhì)A和AGP化合物活性基礎(chǔ)的某些機制的理解加深的結(jié)果，使本文記載的新的治療機會成為可能。
發(fā)明概述一方面，本發(fā)明提供了通過施用有效量的具有下式的化合物及其藥物可接受的鹽治療、改善或基本上預防動物疾病的方法 其中X是-O-或-NH-；R1和R2各自獨立地是(C2-C24)?；柡?、不飽和及分支的?；?；R3是-H或-PO3R11R12，其中R11和R12各自獨立地是-H或(C1-C4)烷基；R4是-H、-CH3或-PO3R13R14，其中R13和R14各自獨立地選自-H和(C1-C4)烷基；Y是選自下式的基團
其中下標n、m、p和q各自獨立地是從0至6的整數(shù)；R5是(C2-C24)酰基(如上所述，包括飽和、不飽和和分支的?；?；R6和R7獨立地選自H和CH3；R8和R9獨立地選自H、OH、(C1-C4)烷氧基、-PO3H2、-OPO3H2、-SO3H、-OSO3H、-NR15R16、-SR15、-CN、-NO2、-CHO、-CO2R15、-CONR15R16、-PO3R15R16、-OPO3R15R16、-SO3R15和-OSO3R15，其中R15和R16各自獨立地選自H和(C1-C4)烷基；R10選自H、CH3、-PO3H2、ω-膦?；醮?C2-C24)烷基和ω-羧基(C1-C24)烷基；Z是-O-或-S-；限制條件為當R3是-PO3R11R12時，R4不是-PO3R13R14。
在本發(fā)明的某些說明性方面，在治療、改善或基本上預防傳染病、自身免疫性疾病和變應(yīng)性疾病中使用上述方法。
在其他方面，本發(fā)明提供了在適宜的賦形劑中含有一或多種上述化合物的藥物組合物，在沒有外源性抗原的情況下配制和/或給藥。
對附圖的簡要描述

圖1是描述小鼠在一磷酰基脂質(zhì)A(MPL)給藥后或給藥同時對抗致命性流感攻擊的非特異性保護的曲線圖。
圖2是描述L-絲氨?；被榛被咸擒樟姿嶂?AGPs)對小鼠鼻內(nèi)給藥后臨床癥狀的曲線圖。
圖3是描述L-絲氨酰基氨基烷基氨基葡糖苷磷酸脂(AGPs)單獨治療和流感冒攻擊后的臨床癥狀的曲線圖。
圖4-6是描述RC522對細胞因子的誘導作用，與在全血的過夜培養(yǎng)物中MPL對細胞因子的誘導作用相比較的曲線圖，全血的過夜培養(yǎng)物來源于3個人的供體(分別為供體A-C)。
圖7是描述RC522對細胞因子的誘導作用與來源于供體A的全血的短時間培養(yǎng)物中的MPL對細胞因子的誘導作用比較的曲線圖。
圖8是描述RC522對細胞因子的誘導作用與小鼠(Balb/c和C3H/HEJ)的脾細胞培養(yǎng)物中的MPL對細胞因子的誘導作用比較的曲線圖。
圖9是描述RC529和RC552對細胞因子的誘導作用與人外周血單核細胞(PBMC)中的MPL對細胞因子的誘導作用比較的曲線圖。
對本發(fā)明的說明性實施方案的描述說明性的預防和治療性應(yīng)用本發(fā)明廣泛涉及通過施用有效量的本文所述的一或多種單糖和二糖化合物或含有一或多種此化合物的藥物組合物治療某些疾病和其他內(nèi)科病癥的預防和治療方法。雖然已記載某些單糖和二糖化合物在疫苗制劑中作為佐劑與外源性給藥的抗原聯(lián)用，和用于某些其他應(yīng)用，但是本發(fā)明提供了優(yōu)選在單一治療應(yīng)用中-即在沒有外源性給藥的抗原的情況下-采用此化合物的新的治療方法。
因此，本發(fā)明一方面提供了治療、改善和/或基本上預防真核生物-特別是動物，優(yōu)選人-傳染病的方法。TLR-介導的信號傳輸在對微生物進攻的天然免疫應(yīng)答中的重要性是已知的，選擇性地并以最小毒性刺激這些途徑的能力代表用于對抗廣泛范圍的傳染因子的預防和/或治療用藥程式的一種有力的方法。
本文描述的方法適用于對抗基本上任何種類的傳染因子，包括細菌、病毒、寄生蟲和真菌。示例性地，本發(fā)明對于預防和/或治療假單胞菌屬(Pseudomonas)、埃希氏桿菌屬(Escherichia)、克雷伯氏桿菌屬(Klebsiella)、腸桿菌屬(Enterobacter)、變形桿菌屬(Proteus)、沙雷氏菌屬(Serratia)、念珠菌屬(Candida)、葡萄球菌屬(Staphylococci)、鏈球菌屬(Streptococci)、衣原體屬(Chlamydia)、支原體屬(Mycoplasma)和許多其他種屬的菌種引起的細菌感染是有效的?？梢园凑毡景l(fā)明治療的示例性的病毒性疾病包括由流感病毒、腺病毒、副流感病毒、鼻病毒、呼吸合胞體病毒(RSVs)、皰疹病毒、巨細胞病毒、肝炎病毒，例如乙型肝炎和丙型肝炎病毒，及其他病毒引起的疾病。示例性的真菌包括，例如，曲霉菌(Aspergillis)、白色念珠菌(Candida albicans)、新型隱球酵母(Cryptococcus neoformans)、粗球胞菌(Coccidioides immitus)及其他。
在一個示例性的實施方案中，本發(fā)明提供了對已發(fā)生感染或具有發(fā)生感染的危險-例如醫(yī)源性(nosocomial)細菌和病毒感染-的接受治療者，特別是無免疫應(yīng)答的接受治療者進行治療的方法。每年住院的4千萬個體中約有2百萬在逗留期間發(fā)生了醫(yī)源性感染，他們中的約1％，或約400,000患者發(fā)生了醫(yī)源性肺炎，其中超過7000人死亡。這使醫(yī)源性肺炎成為導致在醫(yī)院發(fā)生的感染中死亡的主要原因。因此，本實施方案滿足了在治療醫(yī)源性感染中對于有效預防方法的重大需求。
在相關(guān)的實施方案中，本發(fā)明提供了預防性治療無免疫應(yīng)答患者的方法，例如HIV-陽性患者，他們由于偶然的感染或已受到抑制的或潛伏的感染的重激活而發(fā)生肺炎或有發(fā)生肺炎的危險。在1992年，僅美國就報道了約20,000例艾滋病患者中的卡氏肺囊蟲(Pneumocystiscarinii)感染。另外，全部艾滋病患者中的60-70％在其生病的某些時候感染了卡氏肺囊蟲。因此，本發(fā)明在此實施方案中為此高危群體提供了有效的預防方法。
在另一個相關(guān)的實施方案中，本發(fā)明的方法用于治療其他可能是無免疫應(yīng)答的和/或存在發(fā)生傳染病的危險的患者群體，例如，包括膽囊纖維化、慢性阻塞性肺病和其他無免疫應(yīng)答和/或被收容入院的患者。
為支持本發(fā)明的這些和其他實施方案，我們已證實在受到攻擊前將本發(fā)明的示例性化合物對無免疫應(yīng)答的小鼠給藥，能提供對抗卡氏肺囊蟲感染的顯著的預防性保護作用(見實施例1)。
在本發(fā)明的另一方面，在治療、改善或基本上預防變應(yīng)性疾病和病癥，例如竇炎、慢性鼻竇炎、哮喘、異位性皮炎和牛皮癬的方法中使用本文記載的單糖和二糖化合物。此方法至少部分基于單糖和二糖化合物激活靶細胞產(chǎn)生細胞因子的能力，此細胞因子能與定型化變應(yīng)性類型細胞因子的應(yīng)答競爭，此應(yīng)答以IL-4的產(chǎn)生或?qū)L-4活性的超強響應(yīng)能力為特征。施用本文記載的某些單糖和二糖化合物導致IFN-γ和IL-12從抗原加工和呈遞細胞及其他細胞中表達，導致與變應(yīng)性應(yīng)答相關(guān)的細胞因子，例如IL-4，5，6，10和13的減量調(diào)節(jié)。
在本發(fā)明的另一方面，在治療自身免疫性疾病和病癥的方法中采用單糖和二糖化合物。用于此實施方案中的單糖和二糖化合物將典型地選自能拮抗、抑制或負調(diào)制一或多個Toll樣受體，特別是Tlr2和/或Tlr4，以致與特定的病癥相關(guān)的自身免疫應(yīng)答得到改善或基本上被阻止的化合物。示例性地，在治療疾病-例如腸炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎、慢性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥和牛皮癬中可以用本實施方案提供的方法。
不希望被理論所束縛，認為上述預防和治療性應(yīng)用的功效至少部分基于單糖和二糖化合物參與調(diào)節(jié)Toll樣受體的活性。特別地，認為Toll樣受體Tlr2、Tlr4和其他將被特異性地活化、競爭性地抑制或受到本文公開的無毒的LPS衍生物和模擬物的影響。因此，本發(fā)明的方法提供了調(diào)節(jié)動物天然免疫應(yīng)答途徑的有效的和選擇性的方法，而不引起通常與正常刺激這些途徑的天然細菌組分相關(guān)的毒性。
說明性的單糖和二糖化合物在上述預防和治療性應(yīng)用中采用的說明性的單糖或二糖化合物包含具有下式的化合物
和其藥物可接受的鹽，其中X是-O-或-NH-，R1和R2各自獨立地是(C2-C24)酰基，包括飽和、不飽和和分支的?；?；R3是-H或-PO3R11R12，其中R11和R12各自獨立地是-H或(C1-C4)烷基；R4是-H、-CH3或-PO3R13R14，其中R13和R14各自獨立地選自-H和(C1-C4)烷基；Y是選自下式的基團
其中下標n、m、p和q各自獨立地是從0至6的整數(shù)；R5是(C2-C24)?；?如上所述，包括飽和、不飽和和分支的?；?；R6和R7獨立地選自H和CH3；R8和R9獨立地選自H、OH、(C1-C4)烷氧基、-PO3H2、-OPO3H2、-SO3H、-OSO3H、-NR15R16、-SR15、-CN、-NO2、-CHO、-CO2R15、-CONR15R16、-PO3R15R16、-OPO3R15R16、-SO3R15和-OSO3R15，其中R15和R16各自獨立地選自H和(C1-C4)烷基；R10選自H、CH3、-PO3H2、ω-膦?；醮?C2-C24)烷基和ω-羧基(C1-C24)烷基；Z是-O-或-S-；限制條件為當R3是-PO3R11R12時，R4不是-PO3R13R14。
另外，當R3是-PO3H2，R4是H，R10是H，R1是正十四烷?；?，R2是正十八烷酰基，R5是正十六烷?；鶗r，X不是-O-。
在上述通式中，連接正常的脂肪酸?；鶜埢?’立體結(jié)構(gòu)產(chǎn)生中心的構(gòu)型是R或S型，但優(yōu)選R型。連接R6和R7的碳原子的立體化學構(gòu)型是R或S型。所有立體異構(gòu)體、對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體及其混合物都被認為包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
在一組優(yōu)選實施方案中，Y具有下式
在這組實施方案中，將選擇?；鵕1、R2和R5使該組中的至少兩個是(C2-C6)?；?。進一步優(yōu)選的實施方案是其中R1、R2和R5中的碳原子總數(shù)是約6至約22，更優(yōu)選約12至約18。在其他優(yōu)選的實施方案中，X是O，Z是O。下標n、m、p和q優(yōu)選0-3的整數(shù)，更優(yōu)選0-2的整數(shù)。在剩余的取代基中，R6和R7優(yōu)選H。本發(fā)明進一步關(guān)注優(yōu)選的取代基結(jié)合在一個分子中的實施方案。
在另一組實施方案中，R1、R2和R5選自(C12-C20)酰基，限制條件是R1、R2和R5中的碳原子總數(shù)是從約44至約60。更優(yōu)選R1、R2和R5的碳原子總數(shù)是從約46至約52。另外進一步優(yōu)選的是其中X和Z均為-O-的實施方案。
在另一組實施方案中，Y具有下式
對于上面提供的優(yōu)選的實施方案組，在此組中也將選擇?；鵕1、R2和R5使至少兩個基團是(C2-C6)?；?。進一步優(yōu)選的是其中R1、R2和R5的碳原子總數(shù)是約6至約22，更優(yōu)選約12至約18的實施方案。在其他優(yōu)選實施方案中，X是O。在剩余的取代基中，R3優(yōu)選膦?；?-PO3H2)，R4優(yōu)選H。本發(fā)明進一步關(guān)注這樣的實施方案其中優(yōu)選取代基的各種組合結(jié)合在一個分子中。
在另一組實施方案中，R1、R2和R5選自(C12-C24)?；疤釛l件是R1、R2和R5中的碳原子總數(shù)是從約44至約60。更優(yōu)選地，R1、R2和R5中碳原子的總數(shù)是從約46至約52。對于R1、R2和R5特別優(yōu)選的脂肪酸基團是正常的C14、C16和C18脂肪酸基團。進一步優(yōu)選的是其中的X是-O-的實施方案。類似于上面提供的較短?；湹膶嵤┓桨?，R3優(yōu)選膦酰基(-PO3H2)，R4優(yōu)選H。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，Y是式(Ib)的基團，X是O，R3是膦酰基，R4是H，R1、R2和R5選自(C12-C24)酰基，前提條件是R1、R2和R5中的碳原子總數(shù)是從約46至約52。進一步優(yōu)選其中的R2是(C16-C18)酰基的化合物。
除非另外說明，術(shù)語“烷基”本身或作為另一取代基的一部分，是指直鏈或支鏈或環(huán)狀烴基團，或其組合，可以完全飽和，單-或多不飽和，并可以包括二價和多價基團，有指定的碳原子數(shù)(即，C1-C10意味著1-10個碳)。飽和烴基團的例子包括這樣的基團如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、異丁基、仲丁基、環(huán)己基、(環(huán)己基)甲基、環(huán)丙基甲基，例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基等的同系物和異構(gòu)體，及類似基團。不飽和烷基是有1或多個雙鍵或三鍵的基團。不飽和烷基的例子包括乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-異戊烯基、2-(丁間二烯基)、2，4-戊二烯基、3-(1，4-戊二烯基)、乙炔基、1-和3-丙炔基、3-丁炔基，和高級的同系物和異構(gòu)體。典型地，烷基將有1-24個碳原子。“低級烷基”是較短鏈的烷基，通常有8個或更少的碳原子。
術(shù)語“烷氧基”、“烷基氨基”和“烷基硫代基團”(或硫代烷氧基)按其通常的概念使用，分別指通過氧原子、氨基或硫原子連接到分子的殘余部分上的烷基。
術(shù)語“?；敝竿ㄟ^從有機酸中除去羥基而得到的基團。酰基的例子包括乙?；⒈；?、十二烷?；?、十四烷酰基、異丁?；邦愃苹鶊F。因此，術(shù)語“?；卑硗舛x為-C(O)-烷基的基團。
上述每個術(shù)語(例如“烷基”“酰基”)包括所示基團的取代和未取代形式。對于每種類型基團優(yōu)選的取代基是下面列出的。
烷基和?；娜〈梢允且韵露喾N基團-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-鹵素、-SiR’R”R、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO2R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R、-NR”C(O)2R’、-NH-C(NH2)＝NH、-NR’C(NH2)＝NH、-NHC(NH2)＝NR’、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-CN和-NO2，其數(shù)值范圍是0-(2m’+1)，其中m’是在這些基團中的碳原子總數(shù)。R’、R”和R各自獨立地指氫和未取代的(C1-C8)烷基。當R’和R”連接到同樣的氮原子上時，它們可以與氮原子結(jié)合形成5-、6-或7-元環(huán)。例如，NR’R”包括1-吡咯烷基和4-嗎啉基。從以上對取代基的討論，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解術(shù)語“烷基”包括如鹵代烷基(例如-CF3和-CH2CF3)這樣的基團和類似基團。
術(shù)語“藥物可接受的鹽”包括根據(jù)在本文記載的化合物上發(fā)現(xiàn)的特定的取代基，與相對無毒的酸或堿制備的活性化合物的鹽。當本發(fā)明的化合物含有相對酸性的官能團時，可以通過使此化合物的中性形式與足夠量的所需的堿直接接觸，或在適合的惰性溶劑中相接觸，得到堿加成鹽。藥物可接受的堿加成鹽的例子包括鈉、鉀、鈣、銨、有機胺鹽或鎂鹽或類似的鹽。當本發(fā)明的化合物含有相對堿性的官能團時，可以通過使此化合物的中性形式與足夠量的所需的酸直接接觸，或在適合的惰性溶劑中相接觸，得到酸加成鹽。藥物可接受的酸加成鹽的例子包括從無機酸如鹽酸、氫溴酸、硝酸、碳酸、一氫碳酸、磷酸、一氫磷酸、二氫磷酸、硫酸、一氫硫酸、氫碘酸或亞磷酸及類似物，以及從相對無毒的有機酸如乙酸、丙酸、異丁酸、馬來酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、富馬酸、乳酸、扁桃酸、鄰苯二甲酸、苯磺酸、對-甲苯磺酸、檸檬酸、酒石酸、甲磺酸及類似物衍生得到的鹽。也包括氨基酸的鹽，例如精氨酸鹽和類似物，及有機酸如葡糖醛酸或半乳糖醛酸及類似物的鹽(見，例如，Berge，S.M.，等，“藥用鹽”，藥物科學雜志(“Pharmaceutical Salts”，Journal ofPharmaceutical Science)，66，1-19，1977)。本發(fā)明某些特定的化合物同時含有酸性和堿性官能團，使化合物既能轉(zhuǎn)變成堿加成鹽，也能轉(zhuǎn)變成酸加成鹽。
可以通過使鹽與堿或酸接觸，并按通常的方式分離母體化合物而再生成化合物的中性形式。化合物的母體形式在某些物理性質(zhì)-例如在極性溶劑中的溶解度等方面不同于各種鹽的形式，但對于本發(fā)明的目的這些鹽與化合物的母體形式是等同的。
除鹽的形式外，本發(fā)明提供了前藥形式的化合物。本文記載的化合物前藥是在生理條件下易經(jīng)受化學變化產(chǎn)生本發(fā)明化合物的化合物。另外，前藥能在體外環(huán)境中通過化學或生物化學方法轉(zhuǎn)化成本發(fā)明的化合物。例如，當與適宜的酶或化學試劑置于透皮貼劑儲器中時，前藥能緩慢轉(zhuǎn)化成本發(fā)明的化合物。
本發(fā)明的某些化合物可以以非溶劑化形式及溶劑化形式存在，包括水合形式。一般地，溶劑化形式等同于非溶劑化形式，均包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明的某些化合物可以以多晶型或無定形形式存在。一般地，所有物理形式對于本發(fā)明所關(guān)注的用途都是等同的，都在本本發(fā)明的某些化合物有不對稱的碳原子(光學中心)或雙鍵；外消旋體、非對映體、幾何異構(gòu)體和單個異構(gòu)體都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的化合物也可以在構(gòu)成此化合物的一或多個原子處含有非天然比例的原子同位素。例如，可以用放射性同位素-例如氚(3H)、碘-125(125I)或碳-14(14C)放射性標記此化合物。本發(fā)明化合物的所有同位素變體，無論是否有放射性，都包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
可以用任何適當?shù)姆椒ㄖ苽鋯翁呛投腔衔铮渲性S多方法已公開。例如，可用于本發(fā)明的某些化合物記載在共同未決專利申請08/853,826、09/439,839(1999年11月12日遞交)和PCT/US98/09385中，將公開的內(nèi)容全部并入本文作為參考?？梢园搭愃朴诿绹鴮＠?,013,640中記載的制備RC-552(L34)的方法制備其他化合物?？梢杂迷贘ohnson，等，醫(yī)學化學雜志(J.Med.Chem).424640-4649(1999)，Johnson，等，Bioorg.Med.Chem.Lett.92273-2278(1999)，和PCT/US98/50399中概述的方法制備另外的其他化合物。可以按例如，美國專利4,436,727、4,877,611、4,866,034、4,912,094和4,987,237制備另外的其他化合物。一般地，在上述參考文獻中記載的合成方法和其他本領(lǐng)域熟知的合成方法廣泛適用于制備這些化合物。例如，在制備有不同的?；腿〈幕衔镏校绢I(lǐng)域的技術(shù)人員將認識到可以修改本文記載的會聚性方法，以使用替代的酰化劑，或可以用商業(yè)可得的附加有合適的?；奈锪弦l(fā)反應(yīng)。
說明性的藥物組合物及其送遞在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及在對細胞、組織、動物或植物給藥的藥物可接受的載體/賦形劑中單獨含有本文所述的一或多種單糖和二糖化合物，或?qū)⑵渑c一或多種其他治療形式聯(lián)合的藥物組合物。在一個優(yōu)選的實施方案中，在無外源性抗原存在時配制藥物組合物，即，將該藥物組合物用于單一治療應(yīng)用中。對于許多這樣的實施方案，本發(fā)明的藥物組合物將含有一或多種本文所述的單糖化合物。
用于配制藥物組合物的說明性載體包括，例如，水包油或油包水乳液、包含或不包含適于靜脈使用的有機共溶劑的水性組合物、脂質(zhì)體或含有表面活性劑的泡囊、微球、微珠和微粒體、粉末、片劑、膠囊、栓劑、水性懸浮液、氣霧劑和對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯而易見的其他載體。
在某些實施方案中，藥物組合物將含有一或多種緩沖劑(例如中性緩沖鹽水或磷酸鹽緩沖鹽水)、糖類(例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖)、甘露糖醇、蛋白質(zhì)、多肽或氨基酸-例如甘氨酸，抗氧化劑、抑菌劑、鰲合劑-例如EDTA或谷胱甘肽、佐劑(例如氫氧化鋁)，使制劑相對于接受者的血液為等滲、低滲或弱高滲的溶質(zhì)，懸浮劑，增稠劑和/或防腐劑。
對于某些應(yīng)用，優(yōu)選水性制劑，特別是含有有效量的一或多種表面活性劑的制劑。例如，組合物可以是含有至少一種適宜的表面活性劑，例如磷脂類表面活性劑的膠束分散體形式。磷脂的說明性實例包括二?；字；视?，例如二肉豆蔻酰基磷脂?；视?DPMG)、二棕櫚酰基磷脂?；视?DPPG)和二硬脂酰基磷脂酰基甘油(DSPG)；二?；字Ｄ憠A，例如二肉豆蔻酰基磷脂酰膽堿(DPMC)、二棕櫚?；字Ｄ憠A(DPPC)和二硬脂?；字Ｄ憠A(DSPC)；二酰基磷脂酸，例如二肉豆蔻酰基磷脂酸(DPMA)、二棕櫚酰基磷脂酸(DPPA)和二硬脂?；字?DSPA)；和二?；字；掖及?，例如二肉豆蔻?；字；掖及?DPME)、二棕櫚?；字；掖及?DPPE)和二硬脂?；字；掖及?DSPE)。典型地，在水性制劑中表面活性劑單糖/二糖的摩爾比將從約10∶1至約1∶10，更典型地在約5∶1至約1∶5，然而在水性制劑中可以用任何有效量的表面活性劑以最好地適合感興趣的特定的目的。
本發(fā)明的化合物和藥物組合物可以配制成用于基本上任何給藥途徑，例如注射、經(jīng)口或鼻的途徑吸入、直腸、陰道或氣管滴注、食入或經(jīng)皮或經(jīng)粘膜途徑，以及類似方式。按這種方法，根據(jù)本發(fā)明的特定應(yīng)用的具體需要，本發(fā)明的方法和組合物可以達到的治療效果可以是，例如，全身性、局部、組織特異性的等。
可以制備說明性的制劑并胃腸外給藥，即腹膜內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)或靜脈內(nèi)給藥。靜脈用藥的載體的一個說明例包括10％USP(美國藥典)乙醇，40％USP丙二醇或聚乙二醇600和余量的USP注射用水(WFI)的混合物。另外的說明性載體包括10％USP乙醇和USP WFI；0.01-0.1％三乙醇胺的USP WFI溶液或0.01-0.2％二棕櫚?；字Ｄ憠A的USPWFI溶液；和1-10％角鯊烯或胃腸外水包植物油乳液。通常選擇藥物學可接受的胃腸外溶劑以使它們提供可以濾過0.22微米濾器而不去除活性成分的溶液或分散體。
用于皮下或肌肉內(nèi)使用的載體的說明性例子包括磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)溶液，5％葡萄糖的WFI溶液和0.01-0.1％三乙醇胺在5％葡萄糖中形成的溶液或0.9％氯酸鈉的USP WFI溶液，或10％USP乙醇與40％丙二醇的1∶2或1∶4的混合物且余量為可接受的等滲溶液如5％葡萄糖或0.9％氯化鈉；或0.01-0.2％二棕櫚?；字Ｄ憠A的USP WFI溶液和1-10％角鯊烯或胃腸外水包植物油乳液。
通過粘膜表面用給藥的載體的例子取決于特定的給藥途徑，例如口服、舌下用藥、鼻內(nèi)給藥等等?？诜o藥時，說明例包括藥物級的甘露醇、淀粉、乳糖、硬酯酸鎂、糖鈉、纖維素、碳酸鎂和類似物，優(yōu)選甘露醇。鼻內(nèi)給藥時，說明例包括聚乙二醇、磷脂、乙二醇和糖脂類、蔗糖和/或甲基纖維素，有或無填充劑如乳糖和防腐劑如苯扎氯銨、EDTA的粉末懸浮液。在一個特定的說明性實施方案中，磷脂1，2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(DPPC)作為0.01-0.2％的等滲水性載體，用于本發(fā)明的化合物以約0.1至3.0毫克/毫升的濃度鼻內(nèi)給藥。
在通過吸入給藥時，說明性載體包括聚乙二醇或乙二醇、DPPC、甲基纖維素、粉末化分散劑，和防腐劑，優(yōu)選聚乙二醇和DPPC。在許多實例中，單糖或二糖化合物優(yōu)選以噴霧形式用于吸入式給藥。說明性地，可以使用一次性給藥裝置、噴霧器、氣息活化的粉末吸入器、氣霧劑定量吸入器(MDI))或本領(lǐng)域可利用的其它多種噴霧送遞裝置來遞送藥物。另外，也可以使用霧帷或通過氣管直接給藥。通過氣管或鼻咽方式送遞藥物對于某些適應(yīng)癥是有效的。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員會認識到以上描述只是說明性的而不是窮舉性的。實際上，許多其它制劑技術(shù)和藥物可接受的賦形劑和載體溶液是為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的，是在各種治療方式中使用本文記載的特定組合物的適當給藥和治療方式的發(fā)展。
可以用各種測定方式評估此化合物，以確定并選擇具有最適合本發(fā)明的特定應(yīng)用的特性的化合物。例如，可以使用動物模型確定并評估單糖和/或二糖化合物給藥后細胞因子向全身循環(huán)釋放的曲線圖。并且，存在各種體外和體內(nèi)模型來檢查對于不同抗原成分的免疫應(yīng)答的一或多方面的變化，以確定最適于引起感興趣的特異性免疫應(yīng)答的化合物。例如，一種化合物可以與靶細胞-如巨噬細胞、樹狀細胞或朗格罕氏細胞在體外接觸，可以測量加工后的(elaborated)細胞因子。并且，可以使用基因表達陣列來確定由感興趣的特定的單糖或二糖激活或抑制的特異性路徑。
將能理解的是如果需要，本文公開的化合物可以與其它治療形式聯(lián)合給藥，如與抗微生物、抗病毒和抗真菌的化合物或療法，與各種以DNA為基礎(chǔ)的治療劑、以RNA為基礎(chǔ)的治療劑、以多肽為基礎(chǔ)的治療劑，和/或與其它免疫效應(yīng)物聯(lián)合給藥。實際上，也可以包括基本上任何其它組分，只要此附加的組分不會在與靶細胞或宿主組織接觸時引起明顯反作用。因此該組合物可以與所實施的本發(fā)明的特定實施方案所需的或期望的各種其他藥劑一起送遞。
說明性地，本發(fā)明的藥物組合物可以包括編碼一或多種治療性蛋白質(zhì)的DNA、反義RNA、核酶或類似物，或與它們聯(lián)合使用。DNA可以存在于任何本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的各種送遞系統(tǒng)，包括核酸表達系統(tǒng)、細菌和病毒表達系統(tǒng)中。大量基因送遞技術(shù)在本領(lǐng)域中是眾所周知的，如Rolland在Crit.Rev.Therap.Drug Carrierr Systems15143-198，1998和其中所引用的參考文獻中所描述的那些技術(shù)。適當?shù)暮怂岜磉_系統(tǒng)含有在接受治療者中表達的必需DNA序列(如合適的啟動子和終止信號)。在一優(yōu)選實施方案中，可以使用病毒表達系統(tǒng)(例如牛痘或其它痘病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或腺病毒)引入DNA，此系統(tǒng)可能包括使用非致病性(缺損的)、可復制病毒。例如，在以下的文獻中公開了適合的系統(tǒng)Fisher-Hoch等人，美國國家科學院院報86317-321，1989；Flexner等，Ann.N.Y.Acad.Sci.56986-103，1989；Flexner等，疫苗(Vaccine)817-21，1990；美國專利4,603,112、4,769,330和5,017,487；WO 89/01973；美國專利4,777,127；GB 2,200,651；EP 0,345,242；WO 91/02805；Berkner，生物技術(shù)6616-627，1988；Rosenfeld等，科學252431-434，1991；Kolls等，美國國家科學院院報91215-219，1994；Kass-Eisler等，美國國家科學院院報9011498-11502，1993；Guzman等，循環(huán)(Circulation)882838-2848，1993；和Guzman等，循環(huán)研究(Cir.Res.)731202-1207，1993。使DNA摻入這些表達系統(tǒng)的技術(shù)是為本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所熟知的。
DNA也可以是“裸露的”，如在Ulmer等，科學2591745-1749，1993中所述的和Cohen所綜述的(科學2591691-1692，1993)。通過將DNA涂布在生物降解性珠粒上能增加對裸DNA的攝取，所述珠?？杀挥行У剞D(zhuǎn)運到細胞中。顯然本發(fā)明的藥物組合物可以含有多核苷酸和蛋白質(zhì)組分。
本發(fā)明的組合物中可以包含各種附加的免疫刺激劑中的任何一種。例如，包含細胞因子-如GM-CSF、干擾素或白介素以進一步調(diào)節(jié)所感興趣的免疫應(yīng)答。例如，在某些實施方案中，在組合物中可以包含附加成分以進一步增強的Th1-型細胞因子(例如IFN-γ、TNFα、IL-2和IL-12)的誘導作用。另外，對于某些治療應(yīng)用可能需要高水平的Th2-型細胞因子(例如IL-4、IL-5、IL-6和IL-10)。可以用標準的測定方法容易地確定這些細胞因子的水平。對于細胞因子家族的綜述，參見Mosmann和Coffman，免疫學年鑒(Ann.Rev.Immunol.)7145-173，1989。
用于誘導Th1-型細胞因子的示例性組合物例如包括，如WO96/02555、WO 99/33488和美國專利6,008,200和5,856,462中所記載的含CpG的寡核苷酸的組合(其中CpG二核苷酸是未甲基化的)。例如，Sato等在科學(Science)273352，1996中也記載了免疫刺激性DNA序列。其它合適的免疫刺激劑包括皂甙，如QS21(AquilaBiopharmaceuticals Inc.，F(xiàn)ramingham，MA)，和相關(guān)的皂甙衍生物及其模擬物。
可以與本發(fā)明聯(lián)合使用的其它示例性的免疫刺激劑包括Montanide ISA 720(Seppic，法國)、SAF(Chiron，California，美國)、ISCOMS(CSL)、MF-59(Chiron)、SBAS系列的佐劑(例如SBAS-2或SBAS-4，可從SmithKline Beecham，Rixensart，比利時獲得)，和EnhanzynTM免疫刺激劑(Corixa，Hamilton，MT)。WO 99/52549A1記載了聚氧乙烯醚免疫刺激劑。
一般的定義本文使用的“有效量”是指顯示超過賦形劑或陰性對照的響應(yīng)值的量。如上所述，給患者施用的本發(fā)明化合物的精確劑量將取決于給藥途徑、藥物組合物和患者。
術(shù)語“藥物可接受”是指在對人給藥時不引起過敏或類似不期望的反應(yīng)的分子和組合物。
本文使用的“載體”或“賦形劑”包括任何及所有溶劑、分散介質(zhì)、賦形劑、包衣材料、稀釋劑、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑、緩沖劑、載體溶液、懸浮液、膠體和類似物。對于藥物活性物質(zhì)使用這樣的介質(zhì)和藥劑在本領(lǐng)域中是眾所周知的。除非任何常規(guī)介質(zhì)或藥劑與活性成分不相容，可以考慮它在治療組合物中的應(yīng)用。
實施例實施例1通過預防性施用一磷?；|(zhì)A防止卡氏肺囊蟲感染用L3T4抗-CD4抗體預處理小鼠最少2周(每周注射2次，每次0.2毫克)或直到外周CD4計數(shù)降低至少約50％。
制備在水中含有1mg/ml 3-O-去?；涣柞；|(zhì)A和108μg/ml表面活性劑DPPC的水性制劑。在開始研究前24小時將此制劑通過一根小插管經(jīng)氣管內(nèi)給藥并在此研究的剩余時間內(nèi)每周給藥兩次。下表1指明給藥濃度。在第0天通過氣管接種1百萬卡氏肺囊蟲。每周治療兩次，持續(xù)7周，摘除肺并制作壓痕涂片。用吉姆薩染劑(Giemsa)和銀將載玻片染色并如下所述對卡氏肺囊蟲的存在評分。
分數(shù) 5＞100/1000×視野410-100/視野31-10/視野21-10/10視野11-10/50視野00/50視野這些實驗的結(jié)果概括在下表1中表1

重復此研究并得到以下結(jié)果(表2)

結(jié)果顯示一磷酰基脂質(zhì)A的肺部送遞促進了無免疫應(yīng)答小鼠體內(nèi)對卡氏肺囊蟲感染的非特異性抵抗力。吸入一磷?；|(zhì)A導致局部(和末梢)天然免疫應(yīng)答的活化，產(chǎn)生增強的非特異性保護作用。一磷酰基脂質(zhì)A主要通過能導致吞噬活性增強和免疫刺激性細胞因子釋放的抗原呈遞細胞的活化來介導這種保護作用。對從肺部灌洗出的細胞進行FACS分析顯示了活化的嗜中性粒細胞的標記物，但作為整體炎性反應(yīng)(ARDS)特征的白細胞流入不明顯。脾細胞分析顯示CD11b或CD69的負表達，提示此應(yīng)用中一磷?；|(zhì)A制劑及其作用不是全身性的而是局限在肺中。
實施例2通過一磷酰基脂質(zhì)A的預防性給藥防止致命性流感攻擊在致命性流感攻擊前2天或當天以劑量為20μg的一磷酰基脂質(zhì)A(MPL)對多組雌性BALB/c小鼠鼻下(i.n.)給藥。鼻內(nèi)給予大約2LD50傳染性流感A/HK/68對所有小鼠進行攻擊。流感攻擊后監(jiān)測死亡率21天。這些實驗的結(jié)果示于圖1。這些數(shù)據(jù)顯示一磷?；|(zhì)A的鼻內(nèi)送遞促進了對小鼠體內(nèi)用致命性流感攻擊引起的感染的非特異性抵抗力。
實施例3L-絲氨?；被榛被咸擒樟姿嶂?AGPs)鼻內(nèi)給藥后的臨床癥狀按照全部引入本文作為參考的2000年9月5日授權(quán)的美國專利6,113,918和1999年11月12日提交的美國專利申請09/439,839制備一系列L-絲氨?；被榛被咸擒樟姿嶂?AGPs)。
通過鼻內(nèi)(i.n.)給藥給多組雌性BALB/c小鼠施用劑量為20μg的L-絲氨?；鵄GPs(RC-526、RC-554、RC-555、RC-537、RC-527、RC-538、RC-560、RC-512和單純的賦形劑)。在AGP給藥后的最初4天中，對小鼠監(jiān)測疾病的三項主觀指征(即疾病指數(shù))，包括觀察發(fā)皺的皮毛、隆起的體態(tài)和緩慢的呼吸。實驗結(jié)果示于圖2。這些數(shù)據(jù)顯示RC-537、RC-527、RC-538和RC-560以20μg的給定劑量鼻內(nèi)給藥在小鼠體內(nèi)誘發(fā)一定的毒性。
實施例4
L-絲氨酰基氨基烷基氨基葡糖苷磷酸脂(AGPs)鼻內(nèi)給藥和流感攻擊后的臨床癥狀在致命性流感攻擊前2天或當天以劑量為20μg的L-絲氨酰基AGPs(RC-526、RC-554、RC-555、RC-537、RC527、RC-538、RC-560、RC-512和單純的賦形劑)對多組雌性BALB/c小鼠鼻內(nèi)(i.n.)給藥。鼻內(nèi)給予大約2LD50傳染性流感A/HK/68對所有小鼠進行攻擊。在流感攻擊后4-19天內(nèi)監(jiān)測疾病指數(shù)(發(fā)皺的皮毛、隆起的體態(tài)和緩慢的呼吸)。在流感攻擊后監(jiān)測體重減輕和死亡率21天。實驗結(jié)果示于圖3。
這些數(shù)據(jù)證明了AGP化合物RC-538、RC560和RC-512在提供對流感攻擊的實質(zhì)保護作用方面的功效。
實施例5使用人全血培養(yǎng)物和小鼠脾細胞培養(yǎng)物的RC552和MPL比較本實施例揭示了使用人全血培養(yǎng)物和小鼠脾細胞培養(yǎng)物的合成脂質(zhì)A化合物RC552與經(jīng)過修飾的天然物質(zhì)一磷酰基脂質(zhì)A(MPL)相比細胞因子的誘導作用。
將脂質(zhì)A化合物在0.2％三乙醇胺的沖洗用無菌水溶液中重建，進行試驗，在56℃保溫并在37℃超聲波處理2×10分鐘。將LPS 055B5(Sigma-Aldrich；St Louis，MO)稀釋到PBS中。
將化合物加入到450μl人全血中，并攪拌培養(yǎng)5到24小時。選擇三個供試者(圖4-6，分別為供試者A-C)。經(jīng)離心收集上清液并用等體積PBS稀釋到1/2(不認為此稀釋是細胞因子計算的稀釋因子)。借助ELISA(R&D Systems；Minneapolis，MN)利用全濃度或稀釋十倍之多的所需體積的上清液測定細胞因子的加工產(chǎn)物(elaboration)。
從Jackson實驗室(Bar Harbor，ME)購買BALB/c、DBA/2和C3H/HEJ小鼠。在下午2點和3點之間從小鼠體內(nèi)取出脾臟，并得到每個小鼠品系的單獨的單細胞懸浮液。利用Tris-氯化銨溶液(Sigma-Aldrich)將紅細胞溶解，清洗細胞并用臺盼藍(Trypan Blue)(Sigma-Aldrich)排除法計數(shù)。在每孔1.0mL培養(yǎng)基中培養(yǎng)一百萬個脾細胞。設(shè)計脾細胞培養(yǎng)基(SCM)用于5天或更長時間的小鼠脾細胞培養(yǎng)，該培養(yǎng)基由用胎牛血清(HyClone；Logan，UT)補充到5％的RPMI 1640(Sigma-Aldrich)、100μg/mL慶大霉素(Sigma-Aldrich)、250ng/mL兩性霉素(InVitrogen Life Technologies；Carlsbad，California)、lx ITS(牛胰島素500ng/mL，人轉(zhuǎn)移(human transferring)500ng/mL、亞硒酸鈉250ng/mL，Sigma)、β-巰基乙醇43nM(Sigma-Aldrich)、丙酮酸(purivic acid)1mM(Sigma Aldrich)、HEPES10mM(Sigma-Aldrich)組成。實驗結(jié)果示于圖8。
利用人全血培養(yǎng)物，測定了四種細胞因子IL-10、MIP-1β、TNFα和IL-8。兩名供試者被測試了一次，而一名供試者被測試了兩次。值得注意的是這名被測試了兩次的供試者在一次測試中有很高的背景TNFα，但在一個月之后背景TNFα很低。但很明顯，這是因培養(yǎng)的時間跨度所致。用5.5小時的培養(yǎng)物得到高背景TNFα，而用過夜-大約24小時的培養(yǎng)物得到低背景TNFα。然而，即使是用5.5小時的培養(yǎng)物得到的低背景TNFα(約600pg/ml)也比用某些以前的培養(yǎng)物得到的值(在5小時測試中為518.2pg/ml；在4小時測試中為417pg/ml；在4小時為0pg/ml，低應(yīng)答者)。
在3個24小時培養(yǎng)物中的2個，和1個5.5小時的培養(yǎng)物中，在TNFα加工產(chǎn)物方面RC552近似于MPL。然而在所有三種情況下RC552對IL-8的誘導作用與MPL不同。在兩個過夜培養(yǎng)物中RC552對IL-8的誘導作用比MPL低，而在另外一個過夜培養(yǎng)物中比MPL高。
對于所有過夜培養(yǎng)物，RC552對IL-10的誘導比MPL低。在三個過夜培養(yǎng)物中，一個的MIP-1β誘導作用降低。
比較了MPL和RC552在BALB/c和C3H/HEJ中產(chǎn)生的應(yīng)答。由于在toll樣受體4中的突變，C3H/HEJ小鼠對于LPS是遺傳性低應(yīng)答者。在這些培養(yǎng)物中，用寡核苷酸刺激劑作為C3H/HEJ培養(yǎng)物的陽性對照。寡核苷酸在BALB/c小鼠和C3H/HEJ小鼠中誘導出大量IL-6(分別為1000pg/mL和488.5pg/mL)。類似地，在BALB/c和C3H/HEJ培養(yǎng)物中誘導出MIP-1β(589pg/mL和554pg/mL)，同樣，分別響應(yīng)于10μg/mL MPL或RC552，誘導了IL-10(342pg/mL和609pg/mL)和TNFα(204pg/mL和30pg/mL)。
利用C3H/HEJ脾細胞，無論是MPL還是RC552都沒有引起細胞因子應(yīng)答。但在BALB/c脾細胞培養(yǎng)物中，誘導出IL-10、MIP-1β、TNFα和IL-6。在同樣的濃度下，與MPL相比，RC552誘導出較少的MIP-1β、TNFα和IL-6。與MPL相比(1144.1至176.6pg/mL)，RC552誘導出非常少的IL-10(10.4至11.6pg/mL)。
在人全血的三個過夜培養(yǎng)物中的兩個，和一個短期培養(yǎng)物中，在0.2％三乙醇胺溶液中測試時，RC552與MPL有相似的但不相同的對TNFα的誘導作用的促炎性曲線圖。見圖4-6(分別是供試者A-C的過夜培養(yǎng)物)和圖7(供試者A的短期培養(yǎng)物)。另外，在三個過夜培養(yǎng)物的兩個中RC552產(chǎn)生的對MIP-1β的誘導作用是相似的。在一個過夜培養(yǎng)物中RC552比MPL誘導出減少的IL-10。在所有測試例中，RC552產(chǎn)生的對IL-8的誘導作用均與MPL不同。
使用受體缺陷的小鼠，很清楚RC552是通過toll樣受體4發(fā)出信號。使用對脂質(zhì)A有應(yīng)答的BALB/c小鼠，在測試濃度下RC552誘導出減弱的細胞因子曲線圖。有趣的是，測試濃度位于一劑量應(yīng)答關(guān)系的高端，并且RC552在低測試濃度(10μg/mL)下要比在高測試濃度(20μg/mL)下誘導出稍高的MIP-1β和TNFα。
比較人和小鼠的細胞因子曲線圖，當在高刺激劑濃度下測試時，在2日小鼠脾細胞培養(yǎng)物中和在3個人血液過夜培養(yǎng)物的1個中，合成脂質(zhì)A化合物RC552減弱了對IL-10的誘導能力。一般地，在人血液過夜培養(yǎng)物中RC552比MPL誘導出較少的TNFα。在短期(5.5小時)人血液培養(yǎng)物中RC552和MPL誘導出大約相同水平的TNFα。采用由RC552和MPL刺激的人巨噬細胞得到的RNA的微陣列數(shù)據(jù)表明，對于兩種化合物都有早期(1小時)TNFαRNA而無晚期TNFαRNA。但與MPL有能測出的6小時RNA相反，RC552誘導出很少的6小時TNFα。
實施例6RC529與MPL和RC552相比的刺激能力此實施例證明當使用人外周血單核細胞(PBMC)的IL-6、IL-10和MIP-1β加工產(chǎn)物評價時，RC529具有比MPL高的免疫刺激能力。相反，對于IL-8加工產(chǎn)物，RC529與MPL的誘導能力相似。
PBMC在使用前一直冷凍儲藏。指定PBMC供試者為AD112。在48孔的平板中，將密濃度為6.26×105的PBMC置于含有1.0ml培養(yǎng)基的每孔。培養(yǎng)基由RPMI-1640加碳酸氫鈉、10％胎牛血清、4mM谷氨酰胺、100μg/ml慶大霉素和10mM HEPES組成。在二氧化碳培養(yǎng)箱中，在37℃將PBMC培養(yǎng)22小時。收集上清液，用ELISA(R&DSystems)測試IL-6、IL-8、IL-10和MIP-1β濃度。比較此上清液中與從同樣培養(yǎng)但未受刺激的PBMC獲取的上清液中的細胞因子濃度。
在測試劑量下，最低劑量的RC529未達到對于IL-6或IL-8的劑量響應(yīng)能力。與MPL相比，RC529誘導出更多IL-6、IL-10和MIP-1β。作為二糖化合物，以質(zhì)量計，RC552的刺激能力一般是中等的。見圖9。這些數(shù)據(jù)顯示RC529是從冷凍的人PBMC中誘導IL-6、IL-10和MIP-1β的強誘導物。
在此說明書中引用的所有出版物和專利申請都引入本文作為參考，如同具體地并單獨地指出每個單獨的出版物或?qū)＠暾埗甲鳛閰⒖冀Y(jié)合在本文中。雖然為了清楚地理解，通過圖表和實施例對上述發(fā)明作了詳細描述，但對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言顯而易見的是，根據(jù)本發(fā)明的教導，可以對本發(fā)明作出某些改變和改進，而不背離所附權(quán)利要求書的要旨或范圍。
權(quán)利要求
1.一種在沒有外源性抗原的情況下配制和給藥的藥物組合物，該組合物含有一或多種具有下式的化合物及其藥物可接受的鹽 其中X選自-O-和-NH-；R1和R2各自獨立地選自(C2-C24)?；籖3選自-H和-PO3R11R12，其中R11和R12各自獨立地選自-H或(C1-C4)烷基；R4選自-H、-CH3和-PO3R13R14，其中R13和R14各自獨立地選自-H和(C1-C4)烷基；并且Y是選自下式的基團 其中下標n、m、p和q各自獨立地是從0至6的整數(shù)；R5是(C2-C24)?；籖6和R7獨立地選自H和CH3；R8和R9獨立地選自H、OH、(C1-C4)烷氧基、-PO3H2、-OPO3H2、-SO3H、-OSO3H、-NR15R16、-SR15、-CN、-NO2、-CHO、-CO2R15、-CONR15R16、-PO3R15R16、-OPO3R15R16、-SO3R15和-OSO3R15，其中R15和R16各自獨立地選自H和(C1-C4)烷基；R10選自H、CH3、-PO3H2、ω-膦酰基氧代(C2-C24)烷基和ω-羧基(C1-C24)烷基；Z是-O-或-S-；限制條件為當R3是-PO3R11R12時，R4不是-PO3R13R14，進一步的限制條件是當R3是-PO3H2，R4是H，R10是H，R1是正十四烷?；?，R2是正十八烷?；蚏5是十六烷?；鶗r，X不是-O-。
2.權(quán)利要求1所述的藥物組合物，進一步含有一或多種表面活性劑。
3.權(quán)利要求2所述的藥物組合物，其中所述的一或多種表面活性劑選自二肉豆蔻?；字；视?DPMG)、二棕櫚酰基磷脂?；视?DPPG)、二硬脂?；字；视?DSPG)、二肉豆蔻?；字Ｄ憠A(DPMC)、二棕櫚?；字Ｄ憠A(DPPC)、二硬脂?；字Ｄ憠A(DSPC)、二肉豆蔻?；字?DPMA)、二棕櫚?；字?DPPA)、二硬脂?；字?DSPA)、二肉豆蔻?；字；掖及?DPME)、二棕櫚?；字；掖及?DPPE)和二硬脂?；字；掖及?DSPE)。
全文摘要
提供了治療或改善疾病和其他癥狀，例如傳染病、自身免疫性疾病和變應(yīng)性疾病的方法和組合物。此方法使用單糖和二糖類化合物以選擇性地刺激動物和植物的免疫應(yīng)答。
文檔編號A61P37/00GK1907289SQ20061010803
公開日2007年2月7日 申請日期2001年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2000年5月19日
發(fā)明者D·H·珀辛, R·T·克瑞恩, G·T·埃利奧特, J·T·阿爾里奇, M·J·萊西, D·A·約翰森, J·R·鮑德里奇, R·王 申請人:科里克薩有限公司