專利名稱：一種中華稻蝗成蟲抗菌蛋白的制取方法
技術領域：
本發明屬用生物學方法制取抗菌蛋白及其組份提純的領域，特別涉及一種中華稻蝗成蟲抗菌蛋白的制取方法。
背景技術：
抗菌肽是具有抗菌活性的小分子蛋白質，是生物長期進化過程中保留的先天免疫系統或原生宿主防衛機制中重要的活性分子。抗菌肽在生物界廣泛分布。已經在細菌、細菌發酵液、昆蟲、鳥類、動物及植物等生物中發現700多中內源多肽類抗菌物質。
自1974年瑞典的HG.Boman小組首次從美國天蠶蛹中純化第一個誘導的昆蟲抗菌肽并測定其一級結構后，昆蟲免疫機制的研究成為一個非常活躍的領域。昆蟲抗菌肽的研究成為免疫學和分子生物學研究的熱點。研究的內容包括抗菌肽的分離與純化、氨基酸序列的分析；蛋白質構型與功能的關系；抗菌肽的作用機理；應用基因工程克隆與表達抗菌肽基因；改造合成抗菌肽基因以及動植物的轉抗菌肽基因工程等。
昆蟲不像高等動物那樣有完善專一的免疫體系，缺乏B和T淋巴細胞，沒有免疫球蛋白和補體，但是它們有極強的適應能力和防御能力。大量研究表明，昆蟲在感染病菌或體壁受到損傷等情況下能夠迅速合成一系列低分子量的抗菌蛋白/多肽，殺死病菌并且阻止病菌的繼續侵染。昆蟲抗菌肽具有分子量小、熱穩定、水溶性好、抗菌譜廣及材料來源豐富等優點，具有廣闊的應用前景。到目前為止，從鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、膜翅目、半翅目、毛翅目、蜚蠊目和蜻蜒目等8個目昆蟲中誘導出抗菌物質，已純化的抗菌物質達200多種。近年來在分子水平的有關抗菌肽的研究主要集中于鱗翅目和雙翅目昆蟲，其中以天蠶和蠅類的抗菌肽的研究尤為深入。中華稻蝗屬直翅目蝗科，其材料來源廣泛，但到目前為止，尚未實現中華稻蝗抗菌肽的系統高效分離純化。
發明內容
本發明的目的在于提供一種純度較高的中華稻蝗成蟲抗菌蛋白及操作簡單的制取方法。
本發明采用如下的技術方案實現中華稻蝗成蟲抗菌蛋白的制取方法，其步驟為1)、采回的中華稻蝗成蟲在室內飼養5～10天后，將其去頭、足及翅；
2)、置于研缽中加入5～15倍體積預冷的pH6.0～7.0，0.01～0.1mol/L緩沖液，同時加入酶抑制劑于-4℃～20℃溫度下研磨，得提取液；3)、將提取液進行4000～20000r/min的離心過程，時間5～30min，收集上清液，于沸水浴中邊加熱邊攪拌5～15min；4)、將攪拌液進行4000～20000r/min的離心過程，時間5～30min，再次收集上清液；5)、將再次收集的上清液濃縮，即得中華稻蝗成蟲抗菌蛋白粗提液；6)、粗提液上Sephadex凝膠柱層析，洗脫條件為pH6.0～7.0，0.01～0.1mol/L緩沖液，收集活力峰，并濃縮；7)、將經Sephadex凝膠色譜半純化的中華稻蝗成蟲抗菌蛋白依次裝入截流分子量為10KDa、5KDa、3KDa的超濾離心管，在4000～12000r/min條件下離心30min，將純化物分為4部分，即分子量高于10KDa的組分；分子量介于5～10KDa的組分；分子量介于3～5KDa的組分；分子量低于3KDa的組分；8)、收集3～5KDa的組分，即為中華稻蝗成蟲抗菌蛋白。
本發明所述的一種中華稻蝗成蟲抗菌蛋白的制取方法，其步驟為1)、采回的中華稻蝗成蟲在室內飼養7天后，取其前腸；2)、置于研缽中加入10倍體積預冷的pH6.0，0.01mol/L緩沖液，同時加入酶抑制劑于0℃溫度下研磨，得提取液；3)、將提取液進行12000r/min的離心過程，時間15min，收集上清液，于沸水浴中邊加熱邊攪拌10min；4)、將攪拌液進行12000r/min的離心過程，時間10min，再次收集上清液；5)、將再次收集的上清液濃縮，即得中華稻蝗成蟲抗菌蛋白粗提液；6)、粗提液上Sephadex凝膠柱層析，洗脫條件為pH6.0，0.01mol/L緩沖液，收集活力峰，并濃縮；7)、將經Sephadex G-25/50半純化的中華稻蝗成蟲抗菌蛋白依次裝入截流分子量為10KDa的超濾離心管，在12000r/min條件下離心30min，將純化物分為4部分，即分子量高于10KDa的組分；分子量介于5～10KDa的組分；分子量介于3～5KDa的組分；分子量低于3KDa的組分；8)、收集3～5KDa的組分，即為中華稻蝗抗菌蛋白。
抗菌蛋白F1為白色粉末狀，易溶于水、甲醇、乙醇和乙腈，不溶于丙酮和乙醚。
本發明所述的緩沖液為磷酸或乙酸，各步驟中濃縮方法為超濾濃縮或冷凍干燥濃縮。
本發明所述方法制取的中華稻蝗抗菌蛋白各項性能的測定試驗總結如下1、生理活性測定試驗采用兩種方法測定抗菌蛋白的生理活性(1)抑菌圈法測定在涂有適量細菌的瓊脂板上打孔(直徑為2mm)，每孔加入適量樣品，37℃培養1～2天.抑菌活性用抑菌圈直徑表示(抑菌直徑＝總直徑-孔直徑，mm)。
(2)比濁法用0.1mol/L pH6.4的磷酸緩沖液沖洗固體斜面上的檢測菌，配成一定濃度的懸濁液(A＝0.2～0.5)，取該懸濁液置于冰浴中，再加入適量純化抗菌蛋白，混勻，測定其保溫前在600nm波長處的光密度值A0，然后將其放入37℃恒溫水浴1小時，取出后立刻置于冰浴中5min，中止反應，測其600nm波長處的光密度值A，按U＝(A0-A)/A計算抑菌活力。U為抑菌活力單位。
(3)實驗結果經測定，中華稻蝗抗菌蛋白可廣泛的抑制革蘭氏陽性細菌，但對革蘭氏陰性細菌沒有抑制作用，結果見圖1、圖2、圖3。
2、生化特性測定試驗(1)熱穩定性中華稻蝗抗菌蛋白經沸水浴處理，抗菌物質損失很少，具有很好的熱穩定性；(2)pH值穩定性用不同pH溶液處理時，在pH2～13范圍內抗菌活力穩定；(3)等電點采用等電聚焦電泳法測定中華稻蝗抗菌蛋白的pI值pI值為8.0～11.0的堿性蛋白；(4)分子量采用凝膠過濾層析法、聚丙烯酰胺垂直板電泳法及激光解吸電離飛行時間質譜法，測得本抗菌蛋白的分子量為3～6KD；結果見圖6。
本發明所述方法制取的中華稻蝗成蟲抗菌蛋白，是現有首次從直翅目昆蟲中華稻蝗中分離得到的一種抗菌蛋白。本發明首先利用其熱穩定性強，分子量小的特點，第一步采用沸水浴處理的方法，除去大量的雜蛋白，由此得到中華稻蝗成蟲抗菌蛋白的粗品。然后進行分離純化。首先用分子篩柱層析得到5個峰，峰2、3、4都有抑菌活性，取抑菌作用最強的峰4(F1-4)進行下一步操作。F1-4經截流分子量為10KDa、5KDa、3KDa超濾離心管離心過濾后，最終將純化物分為4部分，經抑菌活性檢測分子量介于3KDa～5KDa的組分具有抑菌作用，該組分即為中華稻蝗成蟲抗菌蛋白F1。上述的分離純化方法，在儀器設備及操作步驟上簡單易行。抗菌蛋白純度較高，產率為0.05～1.7mg/g中華稻蝗成蟲。
本發明相比現有技術具有原材料(中華稻蝗)來源廣泛、制取方法簡單、產品純度高等優點。
圖1為中華稻蝗成蟲抗菌蛋白對金黃色葡萄球菌的抑制結果圖2為中華稻蝗成蟲抗菌蛋白對藤黃微球菌的抑制結果圖3為中華稻蝗成蟲抗菌蛋白對枯草芽孢桿菌的抑制結果圖4為本發明中華稻蝗成蟲抗菌蛋白的Sephadex G-50凝膠過濾層析圖。
圖5為本發明中華稻蝗成蟲抗菌蛋白的高壓液相(HPLC)層析圖。
圖6為中華稻蝗抗菌蛋白MS分析結果具體實施方式
實施例是用來說明本發明的，而不是對其作任何限制。
中華稻蝗成蟲抗菌蛋白的制取方法，其步驟為下1、中華稻蝗抗菌蛋白粗提液的制取采回的中華稻蝗成蟲在室內飼養7d后，取20頭去頭、足及翅后稱重，置于研缽中加入10倍體積預冷的pH6.0，0.05mol/L的磷酸緩沖液，同時加入酶抑制劑于4℃充分研磨，在12000r/min條件下，離心15min，收集上清液；于沸水浴中加熱10min，在12000r/min條件，離心10min，二次收集上清液，冷凍干燥濃縮；2、Sephadex凝膠柱層析按上述方法得到原材料中華稻蝗成蟲抗菌蛋白的粗提液的凍干粉，凍干粉溶于pH6.0，10mol/L磷酸緩沖液，上樣于Sephadex G-50凝膠柱層析(Pharmacia進口分裝凝膠過濾柱)(1.6×75cm)，洗脫液為pH6.0，10mol/L磷酸緩沖液，然后收集各管；將收集的溶液冷凍干燥濃縮；取各管測280nm的紫外吸收繪圖，得5個峰。結果見圖4。經抑菌活性檢測，其中峰2、3、4為活性成分，都有抑菌作用，各峰中抑菌圈直徑最大的管號分別14，34和38管，經比濁法測定38號管的抑菌活性最高。取抑菌活性最高的峰4記作F1-4，進行下一步操作.
3、高效液相層析(HPLC)分析取38號管濃縮液上HPLC，以pH6.0，0.01mol/L的磷酸緩沖液進行洗脫，流速為0.6ml/min。
結果見圖5。38號管在HPLC上有5個峰，與未經誘導的中華稻蝗成蟲提取液相比保留時間為18.0min峰的相對面積百分比在誘導樣品中有所增加，此外誘導樣中多了一個保留時間為17.3min的峰，因此推測這兩個峰是抑菌成分所在；4、超濾處理F1-4經截流分子量為10KDa、5KDa、3KDa超濾離心管離心過濾后，最終將純化物分為4部分，即分子量高于10KDa的組分；分子量介于5～10KDa的組分；分子量介于3～5KDa的組分；分子量低于3KDa的組分。抑菌實驗證明，分子量介于3KDa～5KDa的組分具有抑菌作用，其余組分則無抑菌活性。分子量介于3KDa～5KDa的組分即為本發明所說的由中華稻蝗成蟲制取的抗菌蛋白F1。
最后得到的抗菌蛋白F1為白色粉末狀，易溶于水、甲醇、乙醇和乙腈，不溶于丙酮和乙醚。
權利要求
1.一種中華稻蝗成蟲抗菌蛋白的制取方法，其步驟為1)、采回的中華稻蝗成蟲在室內飼養5～10天后，將其去頭、足及翅；2)、置于研缽中加入5～15倍體積預冷的pH 6.0～7.0，0.01～0.1mol/L緩沖液，同時加入酶抑制劑于-4℃～20℃溫度下研磨，得提取液；3)、將提取液進行4000～20000r/min的離心過程，時間5～30min，收集上清液，于沸水浴中邊加熱邊攪拌5～15min；4)、將攪拌液進行4000～20000r/min的離心過程，時間5～30min，再次收集上清液；5)、將再次收集的上清液濃縮，即得中華稻蝗成蟲抗菌蛋白粗提液；6)、粗提液上Sephadex凝膠柱層析，洗脫條件為pH 6.0～7.0，0.01～0.1mol/L緩沖液，收集活力峰，并濃縮；7)、將經Sephadex凝膠色譜半純化的中華稻蝗成蟲抗菌蛋白依次裝入截流分子量為10KDa、5KDa、3KDa的超濾離心管，在4000～12000r/min條件下離心30min，將純化物分為4部分，即分子量高于10KDa的組分；分子量介于5～10KDa的組分；分子量介于3～5KDa的組分；分子量低于3KDa的組分；8)、收集3～5KDa的組分，即為中華稻蝗成蟲抗菌蛋白。
2.根據權利要求1所述的一種中華稻蝗成蟲抗菌蛋白的制取方法，其步驟為1)、采回的中華稻蝗成蟲在室內飼養7天后，取其前腸；2)、置于研缽中加入10倍體積預冷的pH 6.0，0.01mol/L緩沖液，同時加入酶抑制劑于0℃溫度下研磨，得提取液；3)、將提取液進行12000r/min的離心過程，時間15min，收集上清液，于沸水浴中邊加熱邊攪拌10min；4)、將攪拌液進行12000r/min的離心過程，時間10min，再次收集上清液；5)、將再次收集的上清液濃縮，即得中華稻蝗成蟲抗菌蛋白粗提液；6)、粗提液上Sephadex凝膠柱層析，洗脫條件為pH 6.0，0.01mol/L緩沖液，收集活力峰，并濃縮；7)、將經Sephadex G-25/50半純化的中華稻蝗成蟲抗菌蛋白依次裝入截流分子量為10KDa的超濾離心管，在12000r/min條件下離心30min，將純化物分為4部分，即分子量高于10KDa的組分；分子量介于5～10KDa的組分；分子量介于3～5KDa的組分；分子量低于3KDa的組分；8)、收集3～5KDa的組分，即為中華稻蝗抗菌蛋白。
3.根據權利要求1或2所述的一種中華稻蝗成蟲抗菌蛋白的制取方法，其特征在于所述的緩沖液為磷酸或乙酸。
4.根據權利要求1或2所述的一種中華稻蝗成蟲抗菌蛋白的制取方法，其特征在于各步驟中濃縮方法為超濾濃縮或冷凍干燥濃縮。
全文摘要
本發明屬用生物學方法制取抗菌蛋白及其組份提純的技術領域，特別涉及一種中華稻蝗成蟲抗菌蛋白的制取方法。本發明的抗菌蛋白以中華稻蝗成蟲為原料，通過將中華稻蝗成蟲提取液經離心、沉淀、分子篩層析、高壓液相層析分析、超濾處理、濃縮、收集活力成分等步驟，最后制得。本發明具有原材料中華稻蝗來源廣泛、制取方法簡單、回收率高等優點。
文檔編號A61P31/04GK1962690SQ20061010214
公開日2007年5月16日 申請日期2006年11月9日 優先權日2006年11月9日
發明者黃登宇, 宋強, 李婷, 邢志國, 趙立蘋 申請人:山西中醫學院