專利名稱：：基因的鑒定的制作方法本申請是申請號為03154948.9，申請日為1995年12月11日，發明名稱為“基因的鑒定”的中國專利申請的分案申請。本發明涉及微生物適應環境有關的基因的鑒定方法，特別是決定病原微生物毒力的基因的鑒定。細菌病原體和其它病原體中的抗生素抗性顯得日益重要。因而很重要的是找到攻擊病原微生物的新治療途徑。病原微生物不得不避開宿主的防御機制，并且生長在營養不良的環境中形成感染。為此需要很多微生物的毒力基因。已用經典遺傳學方法檢測了毒力基因，并且已采用各種方法通過轉座子誘變鑒定細菌毒力基因。例如，已篩選具特定生理缺陷的突變體，如缺失鐵調節蛋白(Holland等，1992)，或者在測定中以研究上皮細胞的侵入(Finlay等，1988)和巨噬細胞內的存活(Fields等，1989；Miller等，1989a；Groisman等，1989)。也測定了轉座子突變體在活體動物感染模型中的毒力改變(Miller等，1989b)。這一方法的優點在于能夠鑒定那些在不同感染階段重要的基因，但嚴重的局限在于需要單個試驗大量的突變體的毒力變化。Miller等(1989b)用8-10個一組的小鼠，用不同突變體口服感染95個獨立的組，因而所用小鼠數在760-950之間。由于需要極多量的動物，廣泛篩選細菌基因組中的毒力基因是不可行的。最近有人描述了一個可靠篩選沙門氏菌(Salmonella)基因的遺傳系統(體外表達技術[IVET])，這些基因是在感染過程中被專門誘導的(Mahan等，1993)。這一技術將能鑒定那些在感染過程的特殊階段表達的基因。但這不能鑒定那些轉錄后被調節的基因，更重要的是這一技術不能提供信息以表明已鑒定的基因是感染過程中所實際需要的，還是有助于這一感染過程。Lee和Falkow(1994)在“酶學方法”(MethodsEnzymol.)236，531-545中描述了通過分離超侵染性突變體，以鑒定那些影響沙門氏菌在體外侵入哺乳動物細胞的因子的方法。Walsh和Cepko(1992)在“科學”(Science)255，434-440中描述了在大鼠大腦皮層發育過程中示蹤大腦皮層祖細胞的空間位置的方法。Walsh和Cepko的方法采用了含有一段單一核酸序列和lacZ基因的標記，但結果表明他們的方法不能檢測到有用的突變體或基因。WO94/26933和Smith等(1995)在“美國國家科學院院刊”(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)92，6479-6483中描述了用于確定一個已知基因的功能區，或至少是一些序列已知的一個DNA分子的方法。Groisman等(1993)在“美國國家科學院院刊”(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90，1033-1037中描述了沙門氏菌特異序列的分子、功能和進化上的分析。病原微生物的有些毒力基因已為人知，這些微生物如大腸桿菌(Escherichiacoli)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)、傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphi)、霍亂弧菌(Vibriocholerae)、肉毒核菌(Clostridiumbotulinum)、鼠疫桿菌(Yersiniapestis)、弗氏志賀氏菌(Shigellaflexneri)和單核細胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)，但總起來說只有全部中的相對少數已被確定。鼠傷寒沙門氏菌在小鼠中引起疾病提供了傷寒的一個很好實驗模型(Carter和Collins，1974)。目前已確定的影響沙門氏菌毒力的約有42個基因(Groisman和Ochman，1994)這些基因大約占所預計的毒力基因總數的三分之一(Groisman和Saierr，1990)。本發明的目的是鑒定與微生物適應環境有關的基因，特別是更高效地鑒定病原微生物中的毒力基因。還有一個目的是減少在鑒定毒力基因中所用的實驗動物數量。本發明的目的還在于提供疫苗，以及提供方法以篩選降低毒力的藥物。本發明第一方面是提供一種方法，用于鑒定對特定環境的適應性下降的微生物，這種方法包括以下步驟(1)將一種核酸導入各種不同的微生物，使其中每種微生物通過一個基因插入失活而各自發生突變，其中的核酸包含一段單一標記序列，因而每一突變體含有不同的標記序列，或所述微生物的克隆；(2)單獨提供由步驟(1)生長的每個突變體的保存樣品，單獨提供含有各突變體單一標記序列的保存的核酸；(3)將由步驟(1)產生的各種突變體導入所述的特定環境中，并使那些能導入特定環境的微生物在所述環境中生長；(4)從所述環境中取回微生物或取回所選擇的其中一部分，并從取回的微生物中分離核酸；(5)將步驟(4)中分離的核酸中任何標記序列與步驟(2)中所保存的各突變體的單一標記序列相比較；以及(6)選擇不含步驟(4)所分離的任何標記序列的單個突變體。因此，本方法采用負選擇以確定在環境中增殖能力下降的微生物。一種微生物能夠生活在很多不同的環境中，已知有特定的基因和它們的產物使這些微生物適應于特定的環境。例如，為了使一種病原微生物，如病原細菌或病原真菌在其宿主中存活，需要有一個或多個毒力基因的產物。因此，在本發明的一個優選實施例中，使微生物適應于特定環境的一種微生物基因為毒力基因。合適的特定環境是一個分化的多細胞生物，如一種植物或一種動物。許多細菌和真菌已知能感染植物，它們能在植物內存活并引起疾病，因為有毒力基因的存在及其表達。當特定的環境為一種植物中，合適的微生物包括根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)，它能形成腫瘤(菌癭)，特別是在葡萄中；解淀粉歐文氏桿菌(Erwiniaamylovara)；引起很多植物枯萎的茄假單胞菌(Pseudomonassolanacearum)；引起豆類病害的豆科根瘤菌(Rhizobiumleguminosarum)；引起柑桔果實潰瘍的田野黃單胞菌(Xanthomonascampestris)P.V.柑桔黃單胞菌(X.Citri)；真菌中包括引起稻瘟病的Magnaporthegrisea；引起各種植物病害的鐮刀菌(Fusariumspp.)；Erisyphespp.；盤長孢狀毛盤孢(Colletotrichumgloeosporiodes)；在禾谷和草中引起根和冠病害的Gaeumannomycesgraminis；Glomusspp.，Laccariaspp.；Leptosphaeriamaculans；Phomatracheiphila；疫霉(Phytophthoraspp.)，圓核腔菌(Pyrenophorateres)；棉黃萎輪枝孢(Verticilliumalboatrum)和大麗花輪枝孢(V.dahliae)；以及Mycosphaerellamusicola和M.fijiensis。如以下更詳細的描述中，當一種微生物是真菌時，需要其生活中的單倍體。同樣地，很多微生物，包括細菌、真菌、原生動物和錐蟲已知能感染動物，特別是哺乳動物，包括人。動物體內微生物的存活和這些微生物引起疾病的能力，很大程度取決于毒力基因的存在和表達。合適的細菌包括博德特氏桿菌(Bordetellaspp)，特別是百日咳博德特氏桿菌(B.pertussis)；彎曲桿菌(Campylobacterspp)特別是C.jejuni；梭狀芽孢桿菌(Clostridiumspp.)特別是肉毒梭狀芽孢桿菌(C.botulinum)；腸體菌(Enterococcusspp.)，特別是E.facecalis；埃希氏桿菌(Escherichiaspp.)特別是大腸桿菌(E.coli)；嗜血桿菌(Haemophilusspp.)特別是杜克氏嗜血桿菌(H.ducrevi)和流感嗜血桿菌(H.influenzae)；Helicobacterspp.特別是H.pylori；克雷白氏桿菌(Klebsiellaspp.)特別是肺炎克雷白氏桿菌(K.pneumoniae)；Legionellaspp.特別是L.pheumophila；利斯特氏菌(Listeriaspp.)特別是單核細胞增生利斯特氏菌(L.monocytogenes)；分枝桿菌(Mycobacteriumspp.)特別是恥垢分枝桿菌(M.smegmatis)和結核分枝桿菌(M.tuberculosis)；奈瑟氏球菌(Neisseriaspp.)特別是淋病奈瑟氏球菌(N.gonorrhoeae)和腦膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)；假單胞菌(Pseudomonasspp.)特別是銅綠假單胞菌(Ps.aeruginosa)；沙門氏菌(Salmonellaspp.)；志賀氏菌(Shigellaspp.)；葡萄球菌(Staphylococcusspp.)特別是金黃色萄葡球菌(S.aureus)；鏈球菌(Streptococcusspp.)特別是化膿鏈球菌(S.pyogenes)和肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)；弧菌(Vibriospp.)和耶爾森氏菌屬(Yersiniaspp.)特別是鼠疫耶爾森氏菌(Y.pestis)。所有這些細菌引起人體疾病，同時還有這些疾病的動物模型。因此當這些細菌應用于本發明的方法時，這一特定的環境為細胞感染的動物，并且在動物中這些細菌會引起疾病。例如，當用鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)感染小鼠時，該小鼠患病，這種疾病即作為人傷寒的模型。金黃色葡萄球菌在小鼠中引起菌血癥和腎膿腫的形成(Albus等(1991))“感染與免疫”(Infect.Immun)59，1008-1014)，在兔子中引起心內膜炎(Perlman&Freedman)(1971)“耶魯生物醫學雜志”(YaleJ.Biol.Med.)44，206-213)。需要一種真菌或高等真核寄生蟲在其生活史的相關部分為單倍體(如生長在這一環境中)。優選地可獲得一個DNA介導的整合轉化系統，并且當該微生物是人體病原時，可方便地獲得人體疾病的動物模型。對于人體合適的真菌病原包括某些曲霉(Aspergillusspp.)(如煙曲霉(A.fumigatus))、新型隱球酵母(Cryptococusneformans)和莢膜組織胞漿菌(Histoplasmacapsulatum)。顯然上述真菌有單倍體階段，并且可獲得它們的DNA介導整合轉化系統。Toxoplasma也可以應用，因它是在感染過程中為單倍體階段的一種寄生蟲。細菌具單倍體基因組。人體知病的動物模型常常可以從小鼠、大鼠兔子、狗或猴子中獲得。優選的動物為小鼠。采用本發明方法用人體疾病的動物模型檢測的毒力基因，顯然很可能是那些在人體中決定微生物毒力的基因。應用本發明的方法優選的微生物為鼠傷寒沙門氏菌、金黃色萄葡球菌、肺炎鏈球菌、Enterococcusfaecalis、銅綠假單胞菌和煙曲霉。現描述本發明的一個優選實施例。含有一段單一標記序列的核酸如下制備。采用寡核苷酸合成和聚合酶鏈反應(PCR)產生一個雙鏈DNA序列標記的復合庫。每個DNA“標記”有一個約20-80bp的獨特序列，優選為約40bp，旁側為約15-30bp的“臂”，優選為20bp，這些在所有“標記”都是存在的。單一序列中的堿基對數目足以通過隨機寡核苷酸合成而產生大量(如71010)的單一序列，但不要太大以免形成二級結構而干擾PCR。同樣地“臂”的長度應足夠用于PCR中寡核苷酸的有效引導。眾所周知寡核苷酸5′末端的序列不需要與所要擴增的靶序列匹配。通常PCR引物相互之間不含長于2個堿基的互補結構，特別是在3′末端，因為這一特征會促使被稱為“引物二聚體”的人工產物的形成。當兩個引物的3′末端雜交時，它們形成了一個“引物模板”復合物，引物延伸形成了短的雙鏈體產物，稱之為“引物二聚體”。在引物中應避免內部二級結構。對于對稱PCR，建議的兩個引物常為40-60％G+C含量，沒有任何堿基的長序列。用經典的解鏈溫度計算結合DNA探針雜交研究常常預測出某一引物應在特定溫度下退火，或者72℃的延伸溫度會提前解離引物/模板雜合體。在實際中，雜交體在PCR過程中比通常按簡單Tm計算預計的更為有效。最佳退火溫度可根據經驗決定，可比預計的要高。TaqDNA聚合酶在37-55℃范圍內確定具有活性，因此引物延伸會在退火步驟中發生，雜交體會穩定下來。在常規(對稱)PCR中，引物的濃度通常在0.1-1μM范圍內。“標記”連入轉座子或類似轉座子的元件中以形成含一段單一標記序列的核酸。方便的轉座子裝在自殺載體上，該載體在“輔助”生物中以質粒形式存在，但在轉至本發明方法的微生物中后會丟失。例如，該“輔助”生物可以是一株大腸桿菌，本方法的微生物可以是沙門氏菌，轉移是接合轉移。盡管轉座子在轉移后會失去，但在一部分細胞中該轉座子經歷轉座作用，通過轉座作用轉座子同單一標記一起隨機整合入本方法所用的微生物基因組中。最優選為該轉座子或類似轉座子的元件是可選擇的。例如，對于沙門氏菌，卡那霉素抗性基因可出現于轉座子，并且接合后體可在含卡那霉素的培養基上進行選擇。也可能用含有單一標記的核酸中的功能基因互補受體細胞中的營養缺陷型標記。當真菌用于本方法時，這一方法尤其方便。優選的互補功能基因不是源自與受體微生物相同的種，不然的話可能會出現非隨機整合。當在第一種給定條件下，如果轉座子或類似轉座子的元件裝載于處于一個載體上，而該載體在本發明第一方面的方法中的微生物體內處于附加體狀態(即不是染色體的部分)時，這也是特別方便的。然而當第一種給定條件轉至第二種給定條件時，該附加體不能維持以進行細胞的選擇。在該細胞中轉座子或類似轉座子的元件經歷轉座作用，通過這一作用轉座子隨同其單一標記隨機整合進本方法所用的微生物的基因組中。這一特別方便的實施例有著優點，因為一旦獲得了帶有附加型載體的微生物，那么每當轉座作用被選作用于將微生物條件(或其克隆)從第一種給定條件改變至第二種給定條件，或由這種轉變所誘導時，轉座子可以微生物基因組的不同位點整合。因此，一旦建立了微生物標準收藏物，每一種微生物在附加型載體(在第一種給定條件下)上所帶的轉座子或類似轉座子元件中含有一段單一標記序列，每種微生物可重復使用以產生隨機插入突變體庫，其中每一種突變體含有一個不同標記序列(即庫內的單一序列)。這一實施例特別有用，因為(a)它減少了產生本方法步驟(1)中大量獨立突變微生物所需的操作數量和復雜性；(b)所需的不同標記的數量只與本方法步驟(1)的大量微生物的數目相同。(a)使本方法較容易應用于那些很難進行轉座子誘變的生物(如金黃色葡萄球菌)，(b)意味著可選擇那些具特別好的雜交特性的標記序列，因而使得較易進行質控。如下較詳細的描述中，合適的“庫”大小約為100至200獨立突變的微生物，因此微生物標準收藏物可方便地保存在1或2個96孔微量滴定板中。在一個特別優選的實施例中，第一個給定的條件是第一個特定的溫度或溫度范圍，如25℃-32℃，最優選為約30℃，第二個給定的條件是第二個特定的溫度或溫度范圍，如35-45℃，最優選為42℃，在優選的實施例中，第一個給定的條件是含有抗生素，如鏈霉素，第二個給定的條件是不含所述的抗生素；或是第一個給定條件不含有抗生素而第二個給定條件含有所述抗生素。適合于整合入革蘭氏陰性細菌基因組的轉座子包括Tn5、Tn10和它們的衍生物。適合于整合入革蘭氏陽性細菌基因組的轉座子包括Tn916和其衍生物或類似物。特別適合于應用金黃色葡萄球菌的轉座子包括Tn917(Cheung(1992)“美國國家科學院院刊”(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89，6462-6466)和Tn918(Albus等(1991)“感染與免疫”(Infect.Immun)59，1008-1014)。特別優選的轉座子為具有Tn914衍生物特性，見Camilli等(1990)“細菌學雜志”(J.Bacteriol.)172，3738-3744，并且由溫度敏感的載體，如PE194Ts攜帶(Villafane等(1987)“細菌學雜志”(J.Bacteriol.)169，4822-4829)。人們會意識到盡管轉座子對于插入失活一個基因是方便的，但也可采用其它已知的方法，或將來發展的新方法。插入滅活一個基因，特別是在某些細菌，如鏈球菌中的簡便方法還包括用插入復制誘變法，如Morrison等在“細菌學雜志”(J.Bacteriol.)159，870中就肺炎鏈球菌所作的描述。也可以對其他微生物，特別是細菌應用普通的方法。對于真菌，采用DNA的片段或帶標記的質粒通過轉化產生插入突變，優選的可選擇標記編碼對潮霉素B或福來霉素的抗性(Smith等(1994)“感染與免疫”(Infect.Immunol.)62，5247-5254)。已知用限制性酶介導的整合，可將編碼潮霉素B抗性的DNA片段隨機單整合入絲狀真菌的基因組(REMI；Schiestl&Petes(1991)；Lu等(1994)“美國國家科學院院刊”(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)91，12649-12653)。一個用于真菌的簡單的插入誘變技術見Schiestl&Petes(1994)的描述，引入此文作為參考，它包括了例如用酵母的Ty元件和核酸體DNA。轉座子或其他DNA序列的隨機整合可使大量獨立突變的微生物得以分離，其中不同的基因在各突變體中為插入失活，并且各突變體含有一個不同的標記序列。這一插入突變體庫排列在帶孔的微量滴定皿上，使每孔含有一個不同的突變體微生物。保存含有單個突變體微生物的單一標記序列的DNA(可方便地用來自克隆的總DNA)。方便地，可從微量滴定皿上取微生物樣品，點樣于核酸雜交膜(如硝酸纖維素膜或尼龍膜)，在堿中裂解微生物并將核酸固定于膜上。這樣制成了帶孔微量滴定皿內容的影印。從帶孔的微量滴定皿中制備微生物庫，并提取DNA。所得DNA用作PCR的靶片段，所用引物為與位于“標記”旁側的普通“臂”相退火的引物，并將擴增的DNA進行標記，如用32P。PCR產物用于探測各個突變體所保存的DNA，為帶孔微量滴定皿的影印提供參照雜交圖。這是對每一微生物實際上確實含有一段標記序列的檢查，并且這一標記序列可有效擴增和標記。制備轉座子突變體庫以導入特殊環境。方便的可采用96孔微量滴定皿，這一庫含有96個轉座子突變體。然而，這一庫的低限為2個突變體；庫的大小沒有理論上的上限，如下所討論的，上限可按照導入突變體的環境來確定。一旦微生物被導入所述的特定環境中，那些能被導入的微生物可以生長在該環境中。微生物留在環境中的時間長短根據微生物和環境的特性決定。經過適當時間，從環境中取回微生物，提取DNA并用作PCR模板，引物為與標記旁側臂退火的引物。標記PCR產物，如用32P標記，并用于檢測來自各突變體的保存的DNA，該突變體從帶孔的微量滴定皿復制而來。鑒定那些與探針雜交很弱或根本不發生雜交的保存的DNA，該探針來自環境中取回的微生物中分離的DNA。這些非雜交DNA對應于那些突變體，這些突變體對特定環境的適應性已由于轉座子或其他DNA序列的插入而減弱。在一個特別優選的實施例中，“臂”與“標記”相比沒有或極少有標記。例如，適合PCR引物設計為不含或含單個G殘基，32P標記的核苷酸為dCTP，在這種情況下，沒有或僅一個放射性標記的C殘基摻入每一“臂”，但在“標記”中有大量放射性標記C殘基摻入。可取的是“標記”中至少比“臂”中有多于10倍的標記摻入；優選為20倍或更多；更優選的為50倍或更多。方便的“臂”可采用一種適當的限制酶從“標記”中除去，這一位點可摻入引物設計中。如上所討論，本發明一個特別優選的實施例是當微生物是一種病原微生物，并且特定的環境是一個動物。在一實施例中，導入動物突變體庫的大小取決于(a)在動物體內可能存活的各突變體細胞數目(假定毒力基因尚未失活)和(b)微生物總的接種量。如(a)中數量太低；那些會出現假陽性結果，而如果(b)中數量太高，那些在足夠突變體有機會以所要求方式生長之前，動物會死亡。(a)中的細胞數目可確定所用的每種微生物，但優選的為多于50，更優選的為超過100。能夠導入單個動物的不同突變體的數目優選為50-500，方便的可采用約100。雖然接種量大小可以在106細胞之一數量上下變化，這取決于微生物和這一動物，可行的接種總是不超過106細胞(優選為105細胞)。特別方便的方法為對單個動物采用105的接種量，其中含100種不同突變體，每種1000個細胞。可以看出在本方法中一個動物可用于篩選100種突變體，而現有技術需要至少100個動物以篩選100突變體。然而較合適的是用同樣突變體庫接種三個動物，這樣至少有兩個可以進行測定(一個作為重復，以檢查方法的可靠性)，而第三個可作為備份。但這一方法在所用動物數量上仍然節省了30多倍。將突變體庫導入動物和將微生物收回的時間間隔可隨微生物和所用動物而不同。例如，當動物是小鼠而微生物是鼠傷寒沙門氏菌時，接種和回收的時間間隔約為3天。本發明的一個實施例中，將微生物從遠離步驟(4)中導入位點的步驟(5)的環境中取回，使被研究的毒力基因包括那些涉及兩個位點之間微生物散布的基因。例如，在一株植物中，可將微生物導入莖的傷口或葉子上的一個位點，可從已表現出疾病狀態的葉子的另一位點上分離這一微物。對于一個動物，微生物可以通過口服、腹膜內、靜脈或鼻內途徑導入，并且一段時間后從內部器管，如脾中分離。比較通過口途徑和腹膜內途徑鑒定的毒力基因是有用的，因為可能有些基因在通過某一種途徑引起感染時是需要的，但對另一種途徑可能是不需要的。優選為將沙門氏菌通過腹膜內導入。其他優選的可用于鑒定毒力基因的環境為培養的動物細胞(特別是巨噬細胞和上皮細胞)和植物細胞。雖然從其本身特點看培養的細胞是有用的，視具體情況它也要以互補作為環境的整個動物或植物的使用。優選的還有環境是動物體的一部分。在一個給定的宿主一寄主相互作用中，可能有很多不同的環境，包括不同的器官和組織及其部分，如派伊爾結(Peyer′spatch)。從環境中分離的單個微生物(即細胞)的數量應為導入環境的不同突變體數目的至少2倍，優選為至少10倍，更優選為至少100倍。例如，當用100種不同的突變體接種一個動物時，應分離約10000個單個微生物，并提取其標記DNA。進一步優選實施例包括步驟(1A)在步驟(1)中產生的大量突變體中去掉營養缺陷型；或(6A)測定步驟(6)所選的突變體是否為營養型缺陷；或同時進行(1A)和(6A)。需要區分一種營養缺陷型(即一種突變體微生物，它需要野生型或原養型不需要的生長因子)和一種突變體微生物，其中能使該微生物適應于特殊環境的一個基因處于失活狀態。這可以方便地在步驟(1)和(2)之間，或步驟(6)之后進行。優選為當鑒定毒力基因時，不去掉營養缺陷型。本發明的第二個方面提供了一種鑒定基因的方法，該基因可使微生物適應于一個特殊環境，這一方法包括本發明第一方面的方法，接著是另外的步驟(7)從步驟(6)選擇的單個突變體中分離插入滅活的基因或其部分。用于分離含一個單一標記基因的方法為分子生物學領域內所熟知。進一步的優選實施例還包括另外的步驟(8)用步驟(7)分離的插入滅活基因或其部分作為探針，從野生型微生物中分離相應的野生型基因。用于基因探針的方法為分子生物學領域內所熟知。實施本發明所用的適合的分子生物學方法公開于Sambrook等(1989)的文獻，引文此文作為參考。當微生物是一種動物的微生物病原，基因是一個毒力基因以及轉座子已被用于插入滅活基因時，可通過用一種切于轉座子外的限制酶消化來自步驟(6)所選的單個突變體的基因組DNA，然后將含有轉座子的大小分級的DNA連接至質粒，并且根據由轉座子產生的而不是由質粒產生的抗生素抗性篩選質粒重組體，從而很方便地進行毒力基因的克隆。用與轉座子末端區退火的兩個引物和與質粒多接頭序列相近區退火的兩個引物，測定靠近轉座子的微生物基因組DNA的序列。這一序列可通過DNA數據庫檢索，以確定該轉座子是否已間斷了一個已知的毒力基因。因此可很方便地將這一方法所得的序列與公共可獲得的數據庫，如EMBL和GenBank中存在的序列進行比較。最后，如果這一間斷的序列看起來象一個新的毒力基因，則將突變體轉至一個新的遺傳背景下(如對于沙門氏菌通過噬菌體P22介導的轉導)，測定突變株的LD50，以證實這一減毒表型是由于轉座作用，而非次級突變。用于檢測微生物中所有毒力基因所需篩選的單個突變體的數目取決于該微生物基因組中的基因數目。例如，很可能需要篩選鼠傷寒沙門氏菌的3000-5000個突變體以檢測大多數毒力基因，而對于基因組比沙門氏菌大的曲霉，需篩選20000個突變體。約有4％的非必需的鼠傷寒沙門氏菌基因被認為對毒力是必需的(Grossman&Saier，1990)，如果是這樣的話，鼠傷寒沙門氏菌含有約150個毒力基因。然而本發明的方法提供了一種更快、更方便、更可行的方法以鑒定毒力基因。本發明的第三個方面是提供用本發明第一方面的方法所得的一種微生物。這樣的微生物是有用的，因為它們具有不適應于特定環境中存活的特性。在一個優選的實施例中，一種病原性微生物不能適應于在宿主生物(環境)中存活，并且當微生物對動物，特別是哺乳動物，更特殊的為對人有致病性時，用本方法所得的突變體可用于疫苗。該突變體無毒性，因而預計適用于病人，但預計它具抗原性并能產生保護性免疫反應。在一個進一步的優選實施例中，對從本發明所得的、不適應于宿主生物中存活的病原微生物進行修飾，優選為通過導入合適的DNA序列，以表達來自另一病原體的抗原表位。這一修飾的微生物可用作其他病原體的疫苗。本發明的第四方面是提供一種微生物，包括用本發明第二方面的方法鑒定的基因中的突變。因此，雖然本發明第三方面的微生物是有用的，但優選為突變特定地導入鑒定了的基因。在一個優選的實施例中，特別當該微生物將用于疫苗時，基因中的突變是缺失或移碼突變或大致不能回復的其他突變。這樣的基因特異性突變可采用標準程序而獲得，如將自主復制子(如質粒或病毒基因組)上的突變基因的一個拷貝導入微生物中，并依靠同源重組將突變導入該微生物基因組中該基因的拷貝中。本發明的第五和第六方面提供了一種合適的微生物，以用于疫苗和包含一種合適微生物和一種藥學上可接受的載體上的疫苗。合適微生物為前面提到的減毒突變體。優選為病人的主動免疫。在這一方法中，在免疫原性的制劑中制備一種或多種突變體微生物，該制劑含有合適的佐劑和載體，并以已知的方式應用于患者。合適的佐劑包括弗羅因德氏完全或不完全佐劑，胞壁酰二肽，EP109942、EP180564和EP231039的“Iscoms”，氫氧化鋁，皂苷，DEAE-葡聚糖，中性油(如miglyol)，植物油(如花生油)，脂質體，普盧蘭尼克多元醇或Ribi佐劑系統(如見GB-A-2189141)。“普盧蘭尼克”是一個已注冊的商標。將要免疫的患者是需要保護使其不得由該微生物毒性形成所引起的疾病的患者。前面所提到的本發明的無毒性微生物或其制劑可通過任何常規方法應用，包括口服和不經腸(如皮下或肌肉)注射。治療可由一段時間內的單劑量或多劑量組成。雖然本發明無毒性的微生物有可能單獨使用，但優選的是以藥物制劑的形式，與一種或多種可接受的載體一起使用。這些載體必須是“可接受的”，即與本發明的無毒性微生物是可容的，并且對其受體沒有毒性。典型地，這些載體是無菌的和無熱原的水或鹽水。人們會意識到本發明的疫苗，依據其微生物組成，可用于人體藥物和獸藥領域。由微生物引起的疾病在許多動物中是已知的，如家養動物。本發明的疫苗，當含有一種合適的無毒性微生物，特別是無毒性細菌時，可用于人體中，但也可以用于牛、羊、馬狗、貓和家禽、如雞、火雞、鴨和鵝。本發明的第七和第八方面提供了從本發明第二方面的方法所得的基因和由該基因編碼的多肽。“基因”不僅包括編碼多肽的DNA區域，也包括DNA的調節區，如調節轉錄、翻譯以及在某些微生物中調節RNA剪接的DNA區。因此，這一基因包括啟動子、轉錄終止子、核糖體結合序列，以及某些生物中的內含子和剪接識別位點。通常可獲得步驟7所得的失活基因的序列資料。方便地可將靠近轉座子末端的序列用作測序引物的雜交位點。衍生的序列或靠近失活基因的DNA限制性片段本身用于制備雜交探針，用該探針從野生型生物中鑒定和分離相應的野生型基因。優選為在嚴格條件下進行雜交探測，以保證獲得該基因，而不是其相關基因。“嚴格的”指當基因固定在膜上時，將基因與探針雜交，并且探針(在此情況下＞200核苷酸長度)在溶液中固定的基因/雜交的探針在0.1×SSC中65℃下洗10分鐘。SSC為0.15MNaCl/0.015M檸檬酸鈉。克隆沙門氏菌毒力基因的優選探針示于圖5和圖6，描述于實施例2中。在一個特別優選的實施例中，沙門氏菌毒力基因包括圖5和圖6所示的序列，描述于實施例2中。進一步優選的基因在其基因內含有圖11和圖12所示序列或至少含其中一部分，并且經本發明第二方面的方法所鑒定。示于圖11和圖12的序列是來自鼠傷寒沙門氏菌的基因簇的一部分，我稱該基因簇為毒力基因簇2(VGC2)。轉座子插入位置示于序列內，這些轉座子插入滅活了生物的毒力決定簇。如下更詳細討論的，特別是在實施例4中，當本發明第二方面的方法用于鑒定鼠傷寒沙門氏菌的毒力基因時，許多核酸插入(和因此鑒定的基因)集中于基因組相對小的部件。這一區域即VGC2含有其他的毒力基因，這些基因如下所述構成本發明的部分。按本發明方法分離的基因可在合適的宿主細胞中表達。因此，這一基因(DNA)可按已知的技術、經過按此處所轉換的內容的適當修改，以構建一個表達載體，然后這一載體用于轉化一個適當的宿主細胞，而進行本發明多肽的表達和產生。這些技術包括下列專利中所公開的技術1984年4月3日頒發給Rutter等美國專利4,440,859，1985年6月23日頒發給Weissman的4,530,901，1986年4月15日頒發給Crowl的4,582,800，1987年6月30日頒發給Mark等的4,677,063，1981年7月7日頒發給Goeddel的4,678,751，1987年11月3日頒發給Itakura等的4,704,362，1987年12月1日頒發給Murray的4,710,463，1988年7月12日頒發給Toole，Jr等的4,757,006，1988年8月23日頒發給Goeddel等的4,766,075和1989年3月7日頒發給Stalker的4,810,648。所有這些引入此文作為參考。編碼組成本發明化合物的多肽的DNA可與很多其他的DNA序列連起來，用于導入一個合適的宿主。這一相伴的DNA取決于宿主的特性，DNA導入宿主的方式以及需要附加型維持還是整合。通常將DNA插入一個表達載體，如質粒，使之處于適當的定向和讀框中以用于表達。如果需要時可將DNA連接到被所需宿主識別的適當的轉錄和翻譯調節控制核苷酸序列上，盡管這種控制通常在表達載體是可得的。然后將這一載體通過標準技術導入宿主。一般來說不是所有宿主會被這一載體轉化。因此，需要選擇轉化的宿主細胞。一種選擇技術涉及到將一段DNA序列，連同在轉化細胞中編碼一個可選擇性狀，如抗生素抗性的任何必要的控制元件摻入表達載體中。或者，這種可選擇性狀的基因可在另一個載體上，這一載體可用于共轉化所需的宿主細胞。通過本發明的重組DNA轉化的宿主細胞然后培養足夠的時間，并且在本領域熟練技術人員所知的適當條件下，還考慮到此處所公開的內容，使之進行多肽的表達，多肽可隨后被分離。已知有很多表達系統，包括細菌(如大腸桿菌和枯草桿菌)(Bacillussubtilis)、酵母(如啤酒糖酵母)，絲狀真菌(如曲霉)，植物細胞、動物細胞和昆蟲細菌。載體包括一個原核生物復制子，如ColElori，用于原核生物中的增殖，即使該載體也用于在其他非原核生物的細胞類型中進行表達。這些載體也可包括一個適當的啟動子，如一個原核生物的的啟動子，它能引導轉化了基因的細菌性宿主細胞，如大腸桿菌中的這些基因的表達(轉錄和翻譯)。一個啟動子是由一段DNA序列形成的表達控制元件，該序列允許RNA聚合酶結合和轉錄的發生。在含有方便的限制性位點以用于本發明DNA片段插入的質粒載體中，通常提供與典型細菌宿主相容的啟動子序列。典型的原核生物載體質粒是從Biorad實驗室(Richmond，CA，USA)可得的pUC18，pUC19，pBR322和pBR329，以及從Pharmacia(Piscataway，NJ.USA)可得的pTrc99A和pKK223-3。典型的哺乳動物細胞載體質粒是可從Pharmacia(Piscataway，NJ，USA)可得的pSVL。這一載體用SV40晚期啟動子驅動克隆的基因的表達，發現的最高量的表達在產生T抗原的細胞中，如COS-1細胞。可誘導的哺乳動物表達載體的一個例子是pMSG，它也可從Phamacia可得。這一載體用小鼠乳腺腫瘤病毒的長末端重復序列的糖皮質激素可誘導的啟動子，以驅動克隆的基因的表達。有用的酵母質粒載體是pRS403-406和pRS413-416，它們通常可從StratageneCloningSystems，LaJolla，CA92037，USA中獲得。質粒pRS403、pRS404、pRS405和pRS406是酵母整合型質粒(YIps)，并且摻入酵母可選擇的標記HIS3、TRP1、LEU2和URA3。質粒pRS413-416是酵母著絲粒質粒(YCps)。已研制各種方法通過互補粘性末端可切實地將DNA與載體連接起來。例如，可將互補的同聚體片段加入將要插入載體DNA的DNA片段。載體和DNA片段然后通過互補同聚體尾部之間的氫鍵連接起來，以形成重組DNA分子。含有一個或多個限制性位點的合成接頭提供了另一種將DNA片段連接載體的方法。如較早時所描述的，通過內切酶的限制性消化所產生的DNA片段用噬菌體T4DNA聚合酶或大腸桿菌DNA聚合酶I處理，這兩種酶用其3′-5′核酸外切活性去掉突出的3′單端末端，并用其聚合活性補上凹陷的3′末端。因此這些活性結合產生了平末端的DNA片段。這些平末端的片段在一種能催化平端DNA分子連接的酶，如噬菌體T4DNA連接酶存在下，與大摩爾數的過量連接頭分子一起培養。因此反應的產物是在其末端帶有聚合連接頭序列的DNA片段。這些DNA片段然后用適當的限制酶酶切，并連接到一個表達載體上，該載體已經過能產生與那些DNA片段相容末端的酶的酶切。含有各種限制性內切酶位點的人工接頭可從許多來源購得，包括InternationalBiotechnologiesInc.NewHaven，CN，USA。修飾編碼本發明多肽的DNA的合乎需要的方法是使用如Saiki等(1988)在“科學”(Science)239，487-491中所公開的聚合酶鏈反應。在這一方法中，將要酶學擴增的DNA旁側有兩個特異的寡核苷酸引物，引物本身摻入擴增的DNA中。所述特異性引物含有限制性內切酶識別位點，這些位點可通過本領域所知的方法用于克隆入表達載體。這些基因的變體也構成了本發明的部分。優選為變體與本發明方法所分離的基因至少有70％序列相同，更優選為至少85％序列相同，最優選為至少95％序列相同。當然置換、缺失和插入是耐受的。一個核酸序列和另一個核酸序列之間的相似性程序可用威斯康星大學計算機組的GAP程序確定。同樣地還包括了由這些基因編碼的蛋白質變體。“變體”包括插入、缺失和替換，無論是保守性的或非保守性的，其中的變化沒有本質上改變該蛋白質的正常功能。“保守性取代”指以下一組合，如Gly，Ala；Val，Ile，Leu；Asp，Glu；Asn，Gln；Ser，Thr；Lys，Arg；和Phe，Tyr。這些變體可用熟練的蛋白質工程和定點誘變的方法進行制備。本發明的第九方面提供了鑒定一個化合物的方法，該化合降低微生物適應一個特殊環境的能力，該方法包括挑選一種干擾以下二種物質功能的化合物的步驟(1)由本發明第二方面的方法所得的基因或(2)由這一基因編碼的多肽。成對篩選那些化合物，使它們能影響野生型細胞，但不影響超量生產本發明方法所分離的基因的細胞，這一篩選構成了本發明這一方面的部分。例如，在一個實施例中，一種細胞是野生型細胞，第二種細胞是沙門氏菌，它是被構建以超表達本發明方法所分離的基因。在所要測定的化合物存在下，測定特殊環境中的每個細胞的生存力和/或生長，以確定哪種化合物降低了野生型細胞的生存力和生長，但不降低超表達所述基因的細胞的這些特性。優選為這一基因是一個毒力基因。例如，在一個實施例中，制備微生物(如鼠傷寒沙門氏菌)的超表達用本發明第一方面的方法所鑒定的毒力基因。將(a)超表達的微生物和(b)相當的微生物(不超表達該毒力基因)用于感染培養的細胞。通過測定所試化合物的量確定這一特殊的試驗化合物是否會選擇性地抑制毒力基因的功能。該化合物是防止宿主細胞被(a)超表達微生物和(b)相當的微生物感染所必需的(至少對一些毒力基因產物來說，可以設想試驗產物通過與毒力基因產物結合使這些產物失活，同時其本身也失去活性。如果防止由(a)引起感染比防止由(b)引起感染所需更多的該化合物，那么這就表明這一化合物是選擇性的。優選為微生物(如沙門氏菌)被一種溫和的抗生素，如慶大霉素(它不滲透宿主細胞)胞外殺滅，并且所試化合物對防止細胞被微生物感染的作用是通過裂解所述細胞和測定有多少微生物存在來進行(如植板于瓊脂上)。成對篩選和其他篩選化合物的方法通常披露于Kirsch&DiDomenico(1993)的“具有治療潛力的天然產物的發現”(TheDiscoveryofNaturalProductswithaTherapeuticPotential)(V.P.Gallo編)第六章PP177-221，Butterworths，V.K.(引文此文作為參考)。成對篩選可以設計成很多相關形式，其中用兩個遺傳上相關的菌株比較對一種化合物的相對敏感性。如果菌株的差別在單個位點上，那么特異于該靶位點的化合物可通過比較每一菌株對抑制劑的敏感性而得到鑒定。例如，對靶位點特異的抑制劑對起敏感試驗菌株比其他方面同基因的“姐妹”菌株更有活性。在瓊脂擴散形式的試驗中，這一活性的大小是通過測定藥敏紙片或帶有化合物孔周圍的抑制區大小來確定的。由于擴散作用，建立了化合物連續濃度梯度，菌株對抑制劑的敏感性與紙片或孔到抑制區邊緣的距離呈正比。普通的抗微生物劑，或作用方式不同于所需方式的微生物通常觀察到具相似的抗兩種菌株的活性。另一類型的分子遺傳篩選，涉及菌株對，其中克隆的基因產物在一個菌株中與對照菌株相比是超表達的。這類測定的基本原理是含有增加量的靶蛋白的菌株應比含正常靶蛋白量的同基因菌株對于特異于克隆的基因產物的抑制劑更具抗性。在瓊脂擴散試驗中，超表達靶蛋白的菌株的特定化合物周圍的抑制區比其他方面相同的同基因菌株要小。另外的或其他的選擇一種化合物是通過如下步驟獲得的1.采用本發明第一方面的方法所得的突變體微生物用作為對照(它有一個給定的表型，如無毒性)。2.要測試的化合的與野生型微生物相混合。3.將野生型微生物導入環境(含有或不含試驗的化合物)。4.如果這一野生型微生物不能適應于這一環境(經化合物處理，或在化合物存在下)，則這一化合物是一種降低微生物在特殊環境中適應能力或存活能力的化合物。當這一環境是動物體，并且這一微生物是一種病原微生物時，用這一方法鑒定的化合物可用作藥劑，以防止或減輕這一微生物的感染。本發明的第十方面因而提供了一種可用第九方面方法鑒定的化合物。人們會意識到第十方面的化合物的運用涉及到可鑒定該化合物的方法，并且特別涉及病原微生物的宿主。例如，如果這個化合物通過用毒力基因或其編碼的多肽方法，在感染哺乳動物的細菌中是可鑒定的，那么這一化合物可用于治療由這一細菌引起的哺乳動物感染。同樣地，如果這個化合物通過用毒力基因或其編碼的多肽方法，在感染植物的真菌中是可鑒定的，那么這一化合物可用于治療由這一真菌引起的植物感染。本發明第十一方面提供了一個分子，它有選擇地與本發明第七方面的基因或其核酸產物作用，并實質上抑制該基因或產物。“其核酸產物”包括任何從該基因轉錄而來的RNA，特別是mRNA。優選的選擇性與所述基因或所述核酸產物作用，并且實質上抑制其功能的分子為反義核酸或核酸衍生物。更優選的是所述分子為反義寡核酸苷酸。反義寡核苷酸為單鏈核酸，它能特異地結合到互補的核酸序列。通過與適當的靶序列結合，形成了RNA-RNA、DNA-DNA或RNA-DNA雙鏈體。這些核酸常被稱為“反義”，因為它們互補于這一基因的有義鏈或編碼鏈。最近，已證實在寡核苷酸結合于DNA雙鏈體處可能形成三股螺旋。已發現寡核苷酸能夠識別DNA雙螺旋主溝中的序列。因此形成一個三股螺旋。這表明有可能合成序列特異性分子，這些分子通過識別主溝氫的結合位點特異結合雙鏈DNA。顯然，反義核酸或寡核苷酸的序列可很容易地通過參照該基因的核苷酸序列而確定。例如，反義核酸或寡核苷酸可以設計成互補于圖11或圖12所示序列的一部分，特別是形成毒力基因一部分的序列。寡核苷酸易被細胞內源性核酸酶降解或滅活。為對付這一問題，有可能采用修飾的寡核苷酸，如改變核苷酸之間的連接，其中用另一種連接替代天然產生的磷酸二酯連接。例如，Agrawal等(1988)在“美國國家科學院院刊”(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)85，7079-7083中表明用寡核苷酸氨基磷酸酯和硫代磷酸酯可增強HIV-1組織培養的抑制。Sarin等(1988)在“美國國家科學院院刊”(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)85，7448-7451中證明了用寡核苷酸甲基膦酸酯可增強HIV-1的抑制。Agrawal等(1989)在“美國國家科學院院刊”(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86，7790-7794中顯示在早期感染和慢性感染的細胞培養物中，用核苷酸序列特異的寡核苷酸硫代磷酸酯可抑制HIV-1復制。Leither等(1990)在“美國國家科學院院刊”(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)87，3430-3434中報告了用寡核苷酸硫代磷酸酯抑制流感病毒復制的組織培養物。帶有人工連接的寡核苷酸已顯示出對體內降解具抗生。例如，Shaw等(1991)在“核酸研究”(NucleicAcidsRes.)19，747-750中報道了當其他方面未作修飾的寡核苷酸在3′末端被某些加帽結構阻遏時，這些核苷酸在體內對核酸酶變得較有抗性，并且那些未加帽的寡核苷酸硫代磷酸酯在體內不被降解。合成寡核苷酸硫代磷酸酯的H-膦酸酯方法的詳細描述由Agrawal和Tang在(1990)在“四面體快報”(TetrahedronLetters)31，7541-7544中提供，其所述內容引入此文作為參考。寡核苷酸甲基膦酸酯、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、磷酸酯、橋連氨基磷酸酯和橋連硫代磷酸酯的合成是本領域已知的。例如見Aggrawal和Goodchild(1987)的“四面體快報”(TetrahedronLetters)28，3539；Nielsen等(1988)的“四面體快報”(TetrahedronLetters)29，2911；Jager等(1988)“生物化學”(Biochemistry)27，7237；Uznanski等(1987)“四面體快報”(TetrahedronLetters)28，3401；Bannwarth(1988)“赫爾維齊化學條例”(Helv.Chim.Acta.)71，1517；Crosstick和Vyle(1989)“四面體快報”(TetrahedronLetters)30，4693；Agrawal等(1990)“美國國家科學院院刊”(Proc.Natl.Acad.SciUSA)87，1401-1405，其內容引入此文作為參考。用于合成或生產的其他方法也是可能的。盡管核糖核酸(RAN)序列也可以合成和應用，但優選實施例中的寡核苷酸是脫氧核糖核酸(DNA)。本發明中有用的寡核苷酸優選是設計來抗內源性溶核酶的。寡核苷酸體內降解產生長度變短的寡核苷酸降解產物。這種降解的產物更可能產生非特異性雜交，相對于其全長的對應物來說可能不太有效。因此需要用能抗體內降解的寡核苷酸，并且它們能夠到達靶細胞。通過用一個可多個內部的人工核苷酸間連接替代原來就存在的磷酸二酯連接，如在連接中用硫替代磷酸酯，可以使這些寡核苷酸對體內降解產生更強抗性。可使用的連接的例子包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、砜、硫酸酯、羰基、二硫代磷酸酯、各種氨基磷酸酯、磷酸酯、橋連的二硫代磷酸酯和橋連的氨基磷酸酯。這些例子是用于說明的而非用于限制，因為其他的核苷酸之連接是本領域所知的。例如，見Cohen(1990)的“生物工程進展”(TrendsinBiotechnology)。合成含有一個或多個這種連接的寡核苷酸的方法為本領域所熟知，而這些連接是用于替代磷酸二酯核苷酸間連接的。這一合成方法包括產生具有混合核苷酸間連接的合成途徑。可用內源性酶通過“加帽”使寡核苷酸抗延伸，或在5′或3′末端核苷酸中摻入相似的基團以達到這一目的。用于加帽的試劑是可購得，如AppliedBiosystemsInc，FosterCity，CA的Amino-LinkIITM。加帽的方法如見Shaw等(1991)“核酸研究”(NucleicAcisRes.)19，747-750和Agrawal等(1991)“美國國家科學院院刊”(Proc.Natl.Acad.SciUSA)88(17)，7595-7599，這些內容引入此文作為參照。使寡核苷酸抗核酸酶攻擊的還有一個方法是使這些核苷酸“自我穩定”，見Tang等(1993)在“核酸研究”(Nucl.AcidsRes.)21，2729-2735中的描述，引入此處作為參考。自我穩定的寡核苷酸在其3′端有發夾環結構，并顯示出對蛇毒液磷酸二酯酶，DNA聚合酶I和胎牛血清的降解的抗性增強。寡核苷酸自我穩定區不影響與互補核酸的雜交，小鼠中的藥物動力學和穩定性研究表明自我穩定的寡核苷酸比其線性的對應物在體內的穩定性要高。按照本發明，通過限制反義化合物對人體內傾向位點的可獲得性，使較低劑量被應用以及盡可能減小系統的影響，以增強堿基配對為特征的反義寡核苷酸的固有結合特異性。因此，局部應用寡核苷酸以獲得所需效果。在所需位點的寡核苷酸濃度大大高于全身應用的寡核苷酸，并且可用顯著低的總量取得治療效果。局部高濃度的寡核苷酸增強了靶細胞的滲透和有效地阻遏了靶核苷酸序列的翻譯。寡核苷酸可通過任何適合于局部用藥的方法送至該位點。例如，可將寡核苷酸溶液直接注射至位點，或用一個灌注泵灌注傳送。也可以將寡核苷酸整入一個可植入的裝置中，然后將該裝置放于所需位點，使寡核苷酸釋放至周圍。寡核苷酸最優選的是通過水凝膠物質施用，水凝膠是非炎癥性的和生物可降解的。現在已知有許多這樣的物質，包括那些從天然和合成聚合物所制成的物質。在一個優選的實施例中，本方法應用了一種水凝膠，它在體溫以下處于液態，但在體溫或接近體溫時為凝膠，能形成一種保持形狀的半固體水凝膠。優選的水凝膠是以乙烯氧化物一丙烯氧化物為重復單元的聚合物。聚合物的特性取決于聚合物的分子量和聚合物中聚乙烯氧化物和聚丙烯氧化物的相對百分比。優選的水凝膠含有約10-80％重量的乙烯氧化物和約20-90％重量的丙烯氧化物。特別優選的水凝膠含有約70％聚乙烯氧化物和30％聚丙烯氧化物。可以使用的水凝膠例如可從BASFCorpParsippany，NJ獲得，商品名為PluronicR。在這一實施例中，冷卻水凝膠至液態，并將寡核苷酸混入液體中至濃度達到約每克水凝膠中1mg寡核苷酸。所得的混合物然后應用于要處理的表面，例如可通過在手術過程中噴灑或涂布，或使用一個導管或內窺鏡的方法。隨著聚合物變焦，它固體而形成凝膠，經過一段時間寡核苷酸擴散出凝膠而進入周圍細胞，這段時間取決定凝膠的確切組分。寡核苷酸可通過可購得的或描述于科學文獻的其他植入劑，包括脂質體、微膠囊和可植入的裝置的方法應用。例如，由可生物降解的物質組成的植入劑，如聚酐、多正酯類、聚乳酸和多羥乙酸以及共聚物、膠原和蛋白質聚合物，或者象乙烯乙酸乙烯酯(EVAc)、聚乙酸乙烯酯、乙烯乙酸乙醇和其衍生物可用于局部釋放寡核苷酸。在采用熔化或溶劑蒸發技術或與物質的機械混合進行聚合化或固化時，可將寡核苷酸摻入這一物質中。在一個實施例中，混入寡核苷酸或用于可植入裝置，如葡聚糖包被的二氧化硅珠、展布劑或導管的涂層上。寡核苷酸的劑量取決于寡核苷酸的大小和應用它的目的。通常根據要治療的組織的表面積計算劑量范圍。寡核苷酸的有效劑量多少取決于寡核苷酸的長度和化學組分，但通常的范圍為每平方厘米組織表面積中含30-3000μg。寡核苷酸可以全身性地用于患者，以作為治療和預防的目的。可通過任何有效方法用寡核苷酸，如通過注射(如靜脈、皮下、肌肉)或通過口、鼻或其他能使寡核苷酸到達患者血液并在血流中循環的方法。全身使用的寡核苷酸優選為同局部使用的寡核苷酸一起應用，但在沒有局部應用的情況下也有功效。對一個成年人來說，通常每次0.1-10g范圍的劑量對這一目的來說是有效的。人們會認識到本發明這一方面的分子可用于治療或防止由一種微生物或與其密切相關的微生物所引起的任何感染。從這種微生物中分離到所述基因。因此，所述分子是一種抗生素。因此，本發明的第十二方面提供了本發明第十一方面的一種分子，以用于藥物。本發明的第十三方面提供了治療宿主的一種方法，該宿主受到一種微生物的感染或易被其感染，這一方法包括按照本發明第十一方面應用有效量的一種分子，其中所述基因存在于所述微生物，或其緊密相關的微生物。“有效的量”我們指能夠實質上防止或減輕感染的量。“宿主”包括任何能被微生物感染的動物或植物。人們會認識到本發明的第十一方面的分子的藥物制劑構成了本發明的一部分。這種藥物制劑包含所述分子以及一種或多種可接受載體。載體必須是“可接受的”，即能與本發明所述的分子共容而對其受體無害。通常載體為無菌和無熱原的水或鹽水。如上所提到的，以及如同以下實施例4中更詳細描述的，我發現某些毒力基因聚于我稱之為VGC2的沙門氏菌染色體的一個區域。DNA-DNA雜交實驗確定了與至少一部分VGC2同源的序列存在于很多種和沙門氏菌的菌株中，但在所試的大腸桿菌和志賀氏菌菌株中沒有出現(見實施例4)。這些序列幾乎肯定相關于保守基因，至少在沙門氏菌中，并且至少其中的一些為毒力基因。人們認為在其他沙門氏菌中的相應基因，以及如果存在的其他腸細菌或其他細菌的相應基因也是毒力基因。很容易確定VGC2區內的基因是否是一個毒力基因。例如，經用本發明第二方面的方法(當應用鼠傷寒沙門氏菌，和其中的環境是一個動物，如小鼠時)鑒定的VGC2內的那些基因是毒力基因。毒力基因的鑒定也可以通過在基因內構建一個突變(優選為非極性突變)和測定該突變株是否為無毒性進行。在所選的基因中構建突變的方法為人所熟知，并描述如下。本發明第十四方面提供了鼠傷寒沙門氏菌的VGC2DNA或其部分，或所述DNA的一個變體或其部分的一個變體。鼠傷寒沙門氏菌的VGC2DNA圖示于圖8，并且根據實施例4所提供資料很容易從鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028(可從美國典型培養物保藏中心，12301ParklawnDrive，Rockville，Maryland20852，USA獲得；也保藏于NCTC，PublicHealthLaboratoryService，Colindale，UK，編號NCTC12021)中獲得。例如，來自圖11和圖12序列的探針可用于鑒定來自鼠傷寒沙門氏菌基因組文庫的入克隆。可用采標準的基因組行走方式獲得所有的VGC2DNA。示于圖8的限制性酶譜可用于鑒定和定位來自VGC2的DNA片段。“鼠傷寒沙門氏菌的VGC2DNA的部分”指任何的DNA序列，其中包括VGC2中的至少10個核苷酸，優選為至少20個核苷酸，再優選的至少50個核苷酸，更優選的為至少100個核苷酸，最優選為至少500個核苷酸。VGC2DNA的特別優選部分為示于圖11的序列或其一部分。另一個特別優選的VGC2DNA的部分為示于圖12的序列或其一部分。有利的是VGC2DNA的部分為一個基因或其部分。用本
技術領域：
所知的計算機程序通過統計分析開讀框，可在VGC2區內鑒定基因。如果開讀框大于100個碼密子，那么這可能是一個基因(雖然已知有比這小的基因)。可通過實驗測定一個開讀框是否對應于基因的多肽編碼區。例如，對應于開讀框的DNA的一部分可用作northern(RNA)印跡的探針，以測定與所述DNA雜交的mRNA是否表達；替代或另外的方法是將突變引入開讀框，就能測定突變對微生物表型的影響。如該表型發生改變，那么這一開讀框對應于一個基因。在DNA序列內鑒定基因的方法為本領域所知。“所述DNA的變體或其部分的一個變體”包括了本發明第七方面的“變體”一詞所定義的任何變體。因此，鼠傷寒沙門氏菌的VGC2DNA的變體包括來自其他沙門氏菌，如傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphi)和腸道沙門氏菌(Salmonellaenterica)的相應的基因或其部分，以及來自其他細菌，如其他腸細菌的相應基因或其部分。“相應的基因”包括那些功能上相同的基因和那些其中的突變導致相似表型(如無毒性)的基因。人們會認識到在本發明之前，VGC2或其內所含的基因尚未被鑒定，當然也沒有涉及到毒力的測定。因此，本發明還有的方面提供了一種突變細菌，其中如果這種細菌正常情況下含有一個與VGC2中的基因相同或相應的基因，那么在所述突變細菌中所述基因是突變的或不存在；構建一個突變細菌的方法，其中如果該細菌正常情況下含有一個與VGC2中基因相同或相應的基因，那么在所述突變細菌中所述基因是突變的或不存在。以下是滅活一個VGC2基因的優選的方法。首先，用在雜交實驗中作為一個探針的VGC2的一個片段，從沙門氏菌λDNA文庫或其他DNA文庫中亞克隆DNA片段上的這個基因，對該基因的限制酶位點作圖，并在大腸桿菌中通過DNA片段上的這個基因，對該基因的限制酶位點作圖，并在大腸桿菌中通過DNA測序描述該基因。可能在用限制酶刪去克隆的基因的編碼區一部分之后，用限制性酶然后將編碼抗生素(如卡那霉素)抗性的DNA的一個片段導入該基因的編碼區。可采用一些方法和含抗生素抗性標記的DNA構建體，以保證感興趣基因的滅活優選為非極性的，也就是說，不影響到感興趣基因的下游基因的表達。基因的突變體形成通過噬菌體P22轉導作用從大腸桿菌轉至鼠傷寒沙門氏菌中，并且轉導體通過Southern雜交檢查突變基因同源重組入染色體的情況。這一方法常用于沙門氏菌中(可用于傷寒沙門氏菌)，進一步的詳細內容可見于許多論文中，包括Galan(1992)174，4338-4349的文章。還有的方面提供了所述突變體細菌在疫苗中的應用；含有所述細菌和藥學上可接受載體的藥物組合物；由鼠傷寒沙門氏菌的VGC2DNA或其部分所編碼的一個多肽，或其部分的一個變體；一種鑒定能使細菌在宿主體內感染或導致疾病能力下降的化合物的方法；可用所述方法鑒定的一種化合物；有選擇性地與VGC2中的一個基因或其核酸產物作用，并能實質抑制其功能的一種分子；醫學上用途和其藥物組合物。VGC2DNA含有已用本發明第一和第二方面的方法鑒定的基因，以及通過其位置鑒定的基因(雖然可通過本發明第一和第二方面的方法鑒定)。本發明還有一些方面密切相關于本發明的第四、五、六、七、八、九、十、十一、十二和十三方面，因此，關于這些方面所給的資料和表達的優選直接與這些方面有關。優選為該基因來自VGC2或是來自沙門氏菌另一種，如傷寒沙門氏菌的相應的基因。優選為突變體細菌是鼠傷寒沙門氏菌，或者是沙門氏菌另一個種，如傷寒沙門氏菌的一個突變體。據認為至少VGC2中有些基因傳送細菌，如鼠傷寒沙門氏菌進入細胞的能力。本發明包括項1.一種鑒定對穩定環境適應性下降的微生物的方法，包括步驟(1)將一種核酸導入各種不同的微生物，其中的每種微生物通過一個基因的插入失活而獨立發生突變，其中的核酸含有一段單一標記序列，因而每種突變體含有不同的標記序列，或所述微生物的克隆；(2)提供由步驟(1)生成的每個突變體的單獨保存樣品，提供含有來自每個單獨突變體的單一標記序列的單獨保存核酸；(3)將由步驟(1)產生的各種突變體導入所述的特定環境中，并使那些能導入特定環境的微生物在所述環境中生長；(4)從所述環境中取回微生物或取回所選擇的其中一部分微生物，并從取回的微生物中分離核酸；(5)將步驟(4)中分離的核酸的任何標記序列，與步驟(2)保存的每個單獨突變體的單一標記序列相比較；以及(6)選擇一個單獨的突變體，使其不含步驟(4)所分離的任何標記序列。項2.項1的一種方法，其中步驟(1)限定的微生物的種類由不同種類的微生物，產生而來每一種微生物含有一種核酸，該核酸又包含著單一標記序列，通過從第一種給定的條件改變第二種給定的條件而產生。其中(a)在第一種給定條件下，含有一個單一標記的所述核酸以附加體形式維持，(b)在第二種給定條件下，含有單一標記序列的所述核酸使一個基因插入失活。項3.項1或2的一種方法，還包括步驟(1A)從步驟(1)產生的各種突變體中取出營養型缺陷；或(6A)測定步驟(6)所選的突變體是否為營養缺陷型；或同時含有(1A)和(6A)。項4.一種鑒定使一種微生物適應于特定環境的基因的方法，該方法包括項1-3中任一項的方法，接著的步驟為(7)從步驟(6)所選的單個突變體中分離插入滅活的基因。項5.項4的一種方法，還包括步驟(8)用步驟(7)分離的插入滅活基因作為探針，從野生型微生物中分離相應的野生型基因。項6.如項1-5中任一項的一種方法，其中特定的環境是一個分化的多細胞生物。項7.項6的一種方法，其中的多細胞生物是植物。項8.項6的一種方法，其中的多細胞生物是非人的動物。項9.項8的一種方法，其中該動物是小鼠、大鼠、兔子、狗或猴子。項10.項9的一種方法，其中的動物是小鼠。項11.項6-10中任一項的方法，其中在步驟(4)中，微生物從遠離步驟(3)的導入位點的所述環境中取回。項12.如項8-10中任一項的方法，其中在步驟(3)中，該微生物是以口服或腹膜內途徑導入。項13.項12的一種方法，當依據項8或9時，其中步驟(4)的微生物取自脾臟。項14.上述項任一項中的方法，其中的微生物是一種細菌。項15.項1-13中任一項的方法，其中的微生物是一種真菌。項16.項7的方法，其中的微生物對植物是一種細菌性病原。項17.項7的方法，其中的微生物對植物是一種真菌性病原。項18.項8-10任一項中的方法，其中的微生物對動物是一種細菌性病原。項19.項8-10任一項中的方法，其中的微生物對動物是一種真菌性病原。項20.項18的一種方法，其中的細菌是以下任一種百日咳博德特氏桿菌(Bordetellapertussis)、Campylobacterjejuni、肉毒梭狀芽孢桿菌(Clostridiumbotulinum)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、杜克氏嗜血桿菌(Haemophilusducreyi)、流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)、Helicobacterpylori、肺炎克雷伯氏桿菌(Klebsiellapneumoniae)、Legionellapneumophila、利斯特氏菌(Listeriaspp.)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoeae)、腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)、假單胞菌(Pseudomonasspp.)、沙門氏菌(Salmonellaspp.)、志賀氏菌(Shigellaspp.)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、化膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)、肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)、弧菌(Vibriospp.)和鼠疫耶爾森氏菌(Yersiniapestis)。項21.項19的方法，其中該真菌是曲霉(Aspergillusspp.)、新型隱球菌(Cryptococusneoformans)和莢膜組織胞漿菌(Histoplasmacapsulatum)的任一種。項22.如上述項任一項中的方法，其中步驟(1)的基因是通過轉座子或轉座子相類似的元件或其他帶有單一標記序列的DNA序列的插入滅活而得到的。項23.如上述項任一項中的方法，其中步驟(1)的各個不同的標記序列兩側為各所述核酸中共同的序列。項24.項23的一種方法，其中在步驟(2)中，含有單一標記的核酸是采用DNA擴增技術和與所述的共同序列雜交的寡核苷酸的引物進行分離的。項25.項23或24的方法，其中在步驟(4)中含有各種所述標記序列的核酸是采用DNA擴增技術和與所述共同序列雜交的寡核苷酸引物進行分離的。項26.采用上述項任一項中的方法所得到的微生物。項27.一種微生物，包含基因中的一個突變，該基因是通過項5的方法鑒定的。項28.項26所得的一種微生物，當根據項8或27以用于疫苗時。項29.項26的含有一種微生物的疫苗，當根據項8或項27和一種藥學上可接受的載體。項30.用項4或項5的方法所得的一個基因。項31.項30的一個基因，它從鼠傷寒沙門氏菌基因組中分離，并在嚴格條件下與圖6所示序列雜交。項33.由一個基因編碼的一種多肽，該基因如項30-32中任一項所述。項34.一種鑒定化合物的方法，該化合物能使微生物對特定環境的適應能力下降，該方法包括篩選出干擾如項30-32中任一項中基因或如項33的一種多肽的功能的一種化合物。項35.可用項34的方法鑒定的一種化合物。項36.項35的一種化合物，其中的特定環境為一個宿主生物體。項37.項36的一種化合物，其中的宿主生物為一種值物。項38.項36的一種化合物，其中的宿主生物是一種動物。項39.使用如項36-38中任一項的化合物，用所述微生物治療所述宿主生物的感染。項40.一種分子，它可以有選擇地作用于如項30-32任一項中的一個基因或其核酸產物，并且基本抑制該基因或其核酸產物的功能。項41.項40的一種分子，它是一種反義核酸或核酸的衍生物。項42.項40或41的一種分子，它是一種反義寡核苷酸。項43.項40-42中任一項的一種分子，它用于藥物。項44.治療微生物感染的宿主或對微生物易于感染的宿主的一種方法，該方法包括應用有效量的如項36或40所述的分子或化合物，其中所述基因存在于所述微生物，或所述微生物相似親緣關系的生物中。項45.一種藥物組合物，它含有項38或40的一種分子或化合物，以及一種藥學上可接受的載體。項46.鼠傷寒沙門氏菌VGC2DNA，或其一部分，或者為所述DNA的一種變體或其部分的變體。項47.一種突變體細菌，其中當該細菌正常含有與VGC2中的一個基因相同或相應的基因時，那么所述基因是一個突變體或在所述突變體細菌中不存在。項48.一種制備項47的細菌的方法。項49.將項47的一種突變體細菌用于疫苗。項50.一種藥物組合物，其中含有項47的一種細菌和一種藥物上可接種的載體。項51.由鼠傷寒沙門氏菌的VGC2DNA編碼的一種多肽，或其一部分，或者是所述多肽的一個變體或其一部分的變體。項52.鑒定一種化合物的一種方法，該化合物降低宿主中細菌感染或引起疾病的能力，該方法包括選擇一種化合物，使之干擾如項46的VGC2中的一個基因或如項51的一種多肽的功能。項58.可用項52的方法鑒定的化合物。項54.一種分子，它可選擇性地與鼠傷寒沙門氏菌的VGC2中一個基因或其核酸產物作用，并且基本上抑制該基因或其核酸產物的功能。項55.一種分子或化合物，如項53或54所述用于藥物。項56.公開于此的任何新穎的特征或特征的組合。現參考以下的實施例和圖說明本發明，其中圖1為圖示說明本發明一個特別優選的方法。圖2示來自幾個鼠傷寒沙門氏菌接合后體的DNA經EcoRV消化后的Southern雜交分析。濾膜用微型Tn5轉座子的卡那霉素抗性基因探測。圖3示來自半個微量滴定皿(A1-H6)的48個鼠傷寒沙門氏菌接合后體DNA的菌落印跡雜交分析。濾膜用一個含經標記的擴增標記物的一個探針進行雜交，其中的標記物來自頭24個菌落(A1-D6)的庫中分離的DNA。圖4示一個微量滴定皿(A1-H11)的注入小鼠的95個鼠傷寒沙門氏菌接合后體的DNA菌落印跡雜交分析。影印的濾膜與經標記的擴增的來自庫(接種物模式)標記物雜交，或與經過標記的擴增的、從10000多個集中的菌落中分離的DNA來的標記物雜交，其中這些菌落從感染動物(脾臟模式)的脾中分離。菌落B6、A11和C8在兩套濾膜上都出現弱雜交信號。A3、C5、G3(aroA)和F10的雜交信號出現于接種模式，而在脾臟模式中沒有。圖5示用本發明方法分離的沙門氏菌基因的序列，和該序列與大腸桿菌clp蛋白酶基因組的比較。圖6示用本發明方法分離的進一步的沙門氏菌基因的部分序列(序列8-36)圖7示鼠傷寒沙門氏菌染色體上VGC2的作用。(A)來自VGC2五個區域的DNA探針用于一套鼠傷寒沙門氏菌株裂解物的Southern雜交分析，這些探針位于Mud-P22原噬菌體。圖中顯示了與7.5kbPstI片段(圖8中探針A)雜交的裂解物。其他兩個所用的探針與同一個裂解物雜交。(B)示插入點和噬菌體的包裝方向以及詳細的圖譜位置(第八版，實施例4中的文獻22)。噬菌體的指代相應于下列菌株18P，TT15242；18Q，15241；19P，TT15244；19Q，TT15243；20P，TT15246和20Q，TT15245(實施例4中文獻)，已作出圖的基因位置用水平線段表示，還標明了其他基因的大約位置。圖8示VGC2的物理和遺傳圖譜。(A)16個轉座子插入位置示于線上方。VGC2的范圍以粗線表明。實施例4的正文中所述的ORFs轉錄的位置和方向以線下方箭頭，連同相似基因的名稱表示，只有ORFs12和ORFs13是例外，它們的產物分別相似于許多兩個元件調節系統的傳感物和調節元件。(B)重疊克隆和來自Mud-P22原噬菌體的TT15244菌株的EcoRI/XbaI限制性片段的位置以實心條表示。只有已作圖的部分入克隆示于圖中，并且克隆可能會超出這些限定。(C)限制性位點的位置按如下標記B，BamHI；E，EcoRI；V，EcoRV；H，HindIII；P，PstI和X，XbaI。在圖7中作為探針的7.5kb的PstI片段(探針A)和在圖10中作為探針的2.2kb的PstI/HindIII片段(探針B)的位置示于限制性圖譜下方。序列1(描述于圖11)和序列2(描述于圖12)的位置用細箭頭表示(標記的序列1和序列2)。圖9示VGC2邊界的作圖。(A)位于大腸桿菌K12染色體上的37′-38′的作圖基因位置與鼠傷寒沙門氏菌LT2染色體(30′-31′)的相應區域相比。VGC2區的擴大圖譜與11個鼠傷寒沙門氏菌(S.t.)的DNA片段一起顯示，這些片段用作探針(粗條)，用于產生這些片段的限制性位點有B，BamHI；C，ClaI；H，HindII；K，KpnI；P，PstI；N，NsiI和S，SalI。與大腸桿菌(E.c.)基因組DNA雜交的探針以“+”表示；不雜交的以“-”表示。圖10示VGC2在沙門氏菌中是保守的和特異的。沙門氏菌血清變型和其他病原細菌的基因組DNA有PstI(A)，HindIII或EcoRV(B)進行限制，并用入克隆7的2.2kbPstI/HindIII片段作為探針(圖2的探針B)進行Southern雜交分析。雜交濾膜并在嚴格(A)或非嚴格(B)條件下洗膜。圖11示VGC2從中心至左端的“序列1”的DNA序列(見圖2中箭頭標記的序列1)。DNA翻譯成總共6個讀框和推斷基因的起始和終止位置，還表示了通過STM鑒定的各種突變體的轉座子插入位置(序列37)。通常以“*”表示一個終止密碼子，需要時采用標準核苷酸多義密碼子。圖12示VGC2(C簇)的“序列2”的DNA序列(見圖2中箭頭標示的序列2)。DNA被譯成總共6個讀框和推斷基因的起始和終止位置，還表示了通過STM鑒定的各種突變體的轉座子插入位置(序列38)。通常以“*”表示一個終止密碼子，需要時采用標準核苷酸多義密碼子。圖7-12與實施例4最為相關。實施例1鑒定鼠傷寒沙門氏菌中的毒力基因材料和方法細菌菌株和質粒鼠傷寒沙門氏菌菌株12023(相應于美國典型培養物保藏中心(ATCC)的菌株14028)來自國立典型培養物保藏中心(NCTC)(英國倫敦CalindaleinPublicHealthLaboratoryService)。這一菌株的自發萘啶酮酸抗性突變體(12023Nalr)由本實驗室篩選。菌株12023的另一個衍生株-CL1509(aroATn10)由FredHeffron贈送。大腸桿菌菌株CC118λpir(Δ[ara-leu]，araD，ΔlacX74，galE，galK，phoA20，thi-11，rpsE，rpoB，argE(Am)recA1，λpir噬菌體溶源體)和S17-1λpir(Tpr，Smr，recA，thi，pro，hsdR-M+，RP42-TcMuKmTn7，λpir)由KennethTimmis贈送。大腸桿菌DH5α用于增殖含有鼠傷寒沙門氏菌DNA的pUC18(Gibco-BRL)和Bluescript(Stratagene)質粒。質粒pUTmini-Tn5km2(deLorenzo等，1990)由KennethTimmis贈送。半隨機序列標記物的構建和連接在寡核苷酸合成儀(AppliedBiosystems，型號380B)上合成寡核苷酸庫RT1(5′-CTAGGTACCTACAACCTCAAGCTT-[NK]20-AAGCTTGGTTAGAATGGGTACCATG-3′)(序列1)和引物P2(5′-TACCTACAACCTCAAGCT-3′)(序列2)，P3(5′-CATGGTACCCATTCTAAC-3′)(序列3)，P4(5′-TACCCATTCTAACCAAGC-3′)(序列4)和P5(5′-CTAGGTACCTACAACCTC-3′)(序列5)。雙鏈DNA標記物從100μl體積的PCR的RT1中制備，PCR中含1.5mMgCl2、50mMKCl和10mMTris-Cl(pH8.0)，用200pgRT1作為靶片段；各為250μM的dATP，dCTP，dGTP，dTTP；100PM的引物P3和P5；2.5U的Amplitaq(Perkin-ElmerCetus)。熱循環的條件為95℃30s、50℃40s和72℃10s，循環30次。PCR產物用凝膠純化(Sambrook等，1989)，過elutipD柱(可從Schleicher和Schll獲得)，用KpnI消化然后連接到pUC18或pUTmini-Tn5km2中。用于連接的質粒用KpnI消化，并用牛小腸堿性磷酸酶(Gibco-BRL)去磷酸化。連接前用凝膠純化線性化的質粒分子(Sambrook等，1989)，以去除消化中任何殘留的未切開的質粒DNA。連接反應中含質粒和雙鏈標記物DNA各50ng，反應在含1單位的T4DNA連接酶(Gibco-BRL)的體積為25μl的和酶一起提供的緩沖液中進行。連接反應在24℃下進行2小時。為測定來自質粒DNA自身連接或未切開質粒NDA的細菌菌落所占的比例，進行了一個對照反應，其中連接反應中省去雙鏈標記DNA。在大腸桿菌CC118轉化(Sambrook等，1989)后，不產生氨芐青霉素抗性的細菌菌落，而在含雙鏈標記DNA的連接反應中產生185個菌落。細菌的轉化和交配pUTmini-Tn5km2和雙鏈標記DNA的幾個連接產物同于轉化大腸桿菌CC118(Sambrook等，1989)。將約總共10,300個轉化體積加在一起，并從中提取質粒DNA以轉化大腸桿菌S-17λpir(deLorenzo和Timmis，1994)。在交配實驗中，將約40,000個氨芐青霉素抗性的大腸桿菌S-17λpir轉化體和鼠傷寒沙門氏菌12023Nalr分別進行培養，至光密度(OD)580達到1.0。取每一培養物的子份(0.4ml)與5ml10mMMgSO4混合，并通過微孔濾膜(直徑0.45μm)。濾膜置于含M9鹽(deLorenzo和Timmis，1994)的瓊脂表面上，在37℃下培養16小時。細菌的分離是通過在液體LB培養基中37℃下振震40分鐘，并通過在含100μgml-1萘啶酮酸(以淘汰供體菌株)和50μgml-1卡那霉素(以選擇受體菌株)的LB培養基上涂布懸液以選擇接合后體。通過將萘啶酮酸抗性(nalr)和卡那霉素抗性(Kanr)菌落轉至麥康凱乳糖指示培養基(以區分大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌)和含氨芐青霉素的LB培養基檢查每一接合后體。約有9％的nalr、kanr菌落對氨芐青霉素敏感，表明這些菌落來自真正的轉座作用(deLorenzo和Timmis，1994)。將單個氨芐青霉素敏感的接合后體保存在含LB培養基的96孔微量滴定皿。對于長期的保藏要在-80℃下，培養基中加入7％DMSO或15％的甘油。突變體的表型特征將突變體從微量滴定皿影印涂布于含有M9鹽和0.4葡萄糖的固體培養基(Sambrook等，1989)上，以鑒定營養缺陷型。通過低倍鏡下鏡檢瓊脂平板上的菌落檢測菌落粗糙型的突變體。菌落印跡、DNA提取、PCR、DNA標記和雜交對菌落印跡雜交，用48孔的金屬復制器(Sigma)將接合后體從微量滴定皿轉至HybondN尼龍濾膜(Amersham，UK)上。該膜事先置于含50μgml-1卡那霉素的LB瓊脂表面。經37℃過夜培養，取支持細菌菌落的濾膜在室溫下干燥10分鐘。按濾膜生產廠家的說明，用0.4NNaOH裂解細菌并用0.5NTris-ClpH7.0洗膜。通過用Stratalinker(Stratagene)的紫外線照射，將細菌DNA固定至濾膜上。與32P標記的探針的雜交在如前所述的嚴格條件下進行(Holden等，1989)。對于DNA提取，將鼠傷寒沙門氏菌轉座子突變菌株生長在微量滴定皿的液體LB培養基上，或生長在固體培養基上后重新懸浮于LB培養基中。按照Ausubel等(1987)的溴化十六碳烷基三甲銨(CTAB)方法制備總DNA。簡單地說，將150-1000μl體積的細胞通過離心沉淀，并且重新懸浮于576μl的TE。加入15μl的20％SDS和3μl20mgml-1的蛋白酶K。經37℃下培養1小時，加入3MNaCl166μl并充分混合，然后加入80μl的10％(W/V)CTAB和0.7MNaCl。充分混合后，溶液培養在65℃下10分鐘。經過酚和酚-氯仿提取，加入異丙醇沉淀DNA，用70％乙醇洗沉淀，并重懸于TE中，使濃度為約1μg/μl。DNA樣品進行兩輪PCR以產生標記的探針。第一個PCR在100μl反應中進行，其中含20mMTris-ClpH8.3；50mMkCl；2mMMgCl2；0.01％吐溫80；各200μM的dATP，dCTP，dGTP，dTTP；2.5單位的Amplitaq聚合酶(Perkin-ElmerCetus)；P2和P4引物各770ng；和5μg靶DNA。經過95℃4分鐘的起始變性，熱循環由20循環組成，每一循環為50℃45秒，72℃10秒和95℃30秒。PCR產物用氯仿/異戊醇(24/1)提取并用乙醇沉淀。將DNA重懸于10μlTE中，PCR產物通過1.6％Seaplague(FMCBioproducts)凝膠在TAE緩沖液中電泳純化。切下含有約80bp片段的凝膠條，并用于第二次PCR。這一反應總體積為20μl，其中含20mMTris-ClpH8.3；50mMkCl；2mMMgCl2；0.01吐溫80；各50μM的dATP，dTTP，dGTP；10μl32P-dCTP(3000Ci/mmol，Amersham)；P2和P4引物各150ng；約10ng靶DNA(1-2μl的含第一輪PCR產物的1.6％Seaplaque瓊脂糖)；0.5單位的Amplitaq聚合酶。反應物覆蓋20μl礦物油，按上述方法進行熱循環。放射性標記的摻入以WhatmanDE81紙吸收進行定量(Sambrook等，1989)。感染研究將含有帶標記的轉座子的單個沙門氏菌接合后體，培養在微量滴定板的培養基中，其中含2％胰化蛋白胨、1％酵母浸出膏、0.92％V/V甘油、0.5％Na2PO4、1％KNO3(TYGPN培養基)(Ausubel等，1987)，37℃過夜培養。用一個金屬復制器將少量的過夜培養物轉至新鮮的微量滴定板，培養物在37℃下培養直至OD580值(用TitertekMultiscan微量滴定板讀數儀測定)約為每孔0.2。然后將各孔中的培養物合在一起，用分光光度計測定OD550。培養物用滅菌鹽水稀釋至約5×105cfuml-1。再將稀釋的液體涂布于含萘啶酮酸(100mgml-1)和卡那霉素(50mgml-1)的TYGPN上，以證實接種物中出現的cfu。將三個一組的雌性BALB/c小鼠(20-25g)腹膜內注射0.2ml的細菌懸浮液，其中含約1×105cfuml-1。接種后三天處死小鼠，取脾臟分離細菌。取每個脾臟的一半在含1ml滅菌鹽水的微量離心管中研磨。使細胞碎片沉淀，將1ml在懸浮液中仍含有細菌的鹽水置于一新管中，在微量離心機中離心2分鐘。取去上清液并將沉淀重新懸浮于1ml的滅菌蒸餾水中。用滅菌蒸餾水制備稀釋系列，將每種稀釋液100μl涂布于含萘啶酮酸(100μgml-1)和卡那霉素(50μgml-1)的TYGPN瓊脂上。從含有1000-4000個菌落的平板上分離細菌，將從每一個脾臟中分離的總共1000多個菌落加在一起，用于制備DNA以用于PCR產生探針，篩選菌落印跡。毒力基因克隆和DNA測序從鼠傷寒沙門氏菌接合后體中分離總DNA，分別用SstI，SalI，PstI和SphI消化。消化物通過瓊脂糖凝膠分級，轉至HybondN+膜(Amersham)，并用pUTmini-TnSKm2的卡那霉素基因作為探針進行Southern雜交分析。探針用地高辛配基(Boehringer-Mannheim)標記并按生產廠家的說明進行化學熒光檢測。雜交和洗膜條件如上所述。用產生3-5kb雜交片段的限制性酶消化DNA，以用于制備性瓊脂糖凝膠，將相應于雜交信號大小的DNA片段從凝膠上切除，純化和連接λpUC18。采用連接反應將大腸桿菌DH5α轉化成卡那霉素抗性菌株。抗卡那霉素轉化體的質粒通過elutipD柱純化，并用限制性酶消化檢驗。采用雙脫氧方法(Sanger等，1977)測定質粒插入序列的部分，引用為-40引物和反向測序引物(美國生物化學公司)以及分別與Tn5的I和O末端退火的P6引物(5′-CCTAGGCGGCCAGATCTGAT-3′)(序列6)和P7引物(5′-GCACTTGTGTATAAGAGTCAG-3′)(序列7)。用Macvector3.5軟件包在MacintoshSE/30計算機上運行將核苷酸序列和推斷的氨基酸序列匯編起來。在英國Harrow的人類基因組圖譜項目資源中心用UNIX/SUN計算機系統比較這些與序列與EMBL和GenbankDNA數據庫。結果標記物設計DNA標記物的結構示于圖1a。每個標記由一個可變的中心區域組成，其旁側為不變的序列，即“臂”。設計中心區序列([NK]20)以防止常用的6bp識別限制性酶位點的出現，但這中心區序列為足夠可變，以保證在統計學上相同序列只在2×1011分子中出現一次(12個隨機選擇的標記物DNA測序顯示，沒有一個在可變區有50％以上的相同)。N指任何堿基(A、G、C或T)，而K指G或T。臂含有靠近末端的kpnI位點，這有利于起始克隆步驟，緊接著可變區的HindIII位點用于在雜交分析之前從臂中釋放經放射性標記的可變區。臂也設計成P2和P4各只含一個鳥嘌呤殘基。因此，在采用這些引物的PCR過程中，只有一個胞嘧啶摻入每個新合成的臂中，而在單一序列中平均有10個。當放射性標記的dCTP加入PCR中時，單一序列中比每一臂中平均多10倍標記。當它們從單一序列中通過HindIII消化而釋放時，意在盡可能減少臂的背景雜交信號。將雙鏈標記物連接到裝于質粒pUT(deLorenzo和Timmis，1994)上的mini-Tn5轉座子Kmz的kpnI焦點上。這一質粒的復制依賴于pir基因的R6K一確定的無產物。它帶有PR4質粒的oriT序列，可使其轉至各種細菌(Miller和Mekalanos，1988)中，它還帶有mini-Tn5元件座作用所需的tnp基因。通過接合作用將標記的mini-Tn5轉座子轉至鼠傷寒沙門氏菌，并將轉座作用所得的288個接合后體保存于微量滴定板的孔中。從其中12個孔中分離的總DNA用EcoRV消化，并用mini-Tn5轉座子的抗卡那霉素基因作為探針進行Southern雜交分析。在所有情況下，出現接合后體，結果轉座子單整合入細菌基因組的不同位點(圖2)。特異性和靈敏性研究我們下一步測定了PCR中DNA標記物擴增的效率和均一性，該PCR涉及接合后體DNA庫作為反應的靶物質。為盡可能減少PCR中標記物的不等擴增，我們測定了可用于100μl反應中的最大量DNA靶物質和最少的PCR循環數，以使產物通過瓊脂糖凝膠的溴化乙錠染色而顯現(分別為5μgDNA和20個循環)。將微量滴定皿中已達穩定生長期的鼠傷寒沙門氏菌合在一起，用于提取DNA。用引物P2和P4進行PCR。80bp的PCR產物用凝膠純化并作為第二次PCR的靶片段，所用引物相同位用32P-標記CTP。這導致摻入PCR產物的放射性標記的dCTP超過60％。用HindIII消化放射性標記的產物，并用于探測來自其相應微量滴定皿的菌落印跡的DNA。在用此法試驗的1510個突變體中，其中358個在經過菌落印跡過夜曝光后，在放射自顯影圖上不產生清晰的信號。對此有三種可能的解釋。首先，可能有一部分轉座子不帶標記。然而，通過比較轉座子存在或不存在標記下連接反應引起的轉化頻率，似乎不能說明未標記的轉座子占總量的約0.5多(見材料和方法)。更可能的原因是在一些標記中可變序列被截短了，和/或序列的一部分形成了二級結構，這兩者可能造成了擴增的阻礙。不產生清晰信號的突變體沒有進行進一步的研究。通過從一個微量滴定板的24個菌落中制備一個探針，并用它檢測48個菌落的菌落印跡，這其中的24個用于制備該探針，以此證明可有效擴增的標記的特異性。沒有用于制備該探針的24個菌落中沒有任何雜交信號(圖3)表明所采用的雜交條件足夠嚴格，以防止標記的標記物之間出現交叉雜交，并且表明每個接合后體在微量滴定皿內沒有重復。還需進一步考慮確定可用于動物實驗接種物的最大集合體量。由于每一轉座子標記的標記物量反比于標記物集合的復合度，因此對于集合體量有一個限制，在這量以上放射性自顯影圖曝光過夜后，雜交信號太弱而檢測不出。更重要的是，隨著集合體復合度的增加，在一個感染動物脾臟的集合體中不會出現足夠數量毒性代表以制備足夠數量探針可能性也一定增加。我們沒有測定我們使用的沙門氏菌病的鼠模型中集合體大小的上限，但在96時一定為過量。轉座子突變體的毒力試驗測定總共1152個單一標記的插入突變體(來自兩個微量滴定皿)12個集合體在BALB/c小鼠中的毒力，每個集合體代表一個96孔微量滴定板。動物體接受微量滴定板96個轉座子突變體每種約103細胞的膜腹內注射(總共105個生物體)。注射后三天處在小鼠，通過將脾臟勻漿涂布于實驗室培養基上分離細菌。收集從每個小鼠中分離的約10,000菌落，并提取DNA。擴增這一DNA樣品中的標記物并用PCR標記，檢測菌落印跡，并與接種物擴增的標記的雜交圖(圖37)進行比較。作為對照，將鼠傷寒沙門氏菌的aroA突變體進行標記，并作為接種物中96個突變體之一。預計從脾臟中分離不到這一菌株，因為其毒力已顯著減弱(Buchmeier等，1993)。確定了有41突變體，它們的DNA與接種物的經標記的標記物雜交，但不與從脾臟分離的細菌的經標記的標記物雜交。重復這一實驗，又確定了這相同的41個突變體。如所預料的其中的兩個為aroA突變體(每一集合體一個)。另一個是營養缺陷型突變體(它不能生長在基礎培養基上)，所有突變體菌落形態正常。實施例2克隆和轉座子旁側序列的部分特征從實施例1(庫1，F10)所述的一個突變體中提取DNA，用SstI消化，根據卡那霉素抗性亞克隆。位于轉座子一端的450bp的序列用P7引物測定。這一序列與編碼熱調節蛋白酶的大腸桿菌clp(lon)基因有80％相同。據我們所知，這一基因以前未涉及到毒力決定簇。還有13個鼠傷寒沙門氏菌毒力基因的部分序列示于圖6(序列A2-A9和B1-B5)。推斷的P2D6，S4C3，P3F4，P7G2和P9B7的氨基酸序列與分泌相關蛋白的一族有相似性。這些蛋白從動物的細菌性病原體到植物的細菌性病原體有保守性，這些蛋白在沙門氏菌中即為inv族。在鼠傷寒沙門氏菌中，inv基因是細菌侵入腸道組織所需的。當inv突變體通過口服途徑接種時，其毒力減弱，但通過腹膜內注射時沒有減弱。發現inv相關基因在腹膜內接種時對毒力是必需的，表明了一種新的分泌器官可能對脾臟和其它器官的非吞噬細胞的侵襲可能是需要的。這些新的基因的產物在治療已經產生的感染中可能成為比inv蛋白質更好的藥物目標。本實施例中鑒定的基因的進一步特征描述于實施例4。實施例3LD50測定和小鼠疫苗接種試驗用本發明方法鑒定的突變體弱化毒力。將5個與毒力無關的基因突變，通過P22介導的轉導作用轉至萘啶酮酸敏感的鼠傷寒沙門氏菌12028的親本菌株中。轉導體用限制性圖譜檢驗，然后通過腹膜內途徑注射入BALB/c小鼠實驗組中，以測定其50％致死劑量(LD50)、突變體S4C3、P7G2、P3F4和P9B7的LD50值都比野生型菌株高幾個數量級。突變體P1F10所檢測的LD50沒有差別；然而在由相同比例的P1F10菌株和野生型菌株組成的接種物注射的小鼠脾臟中，分離到的P1F10細胞的比例有統計學上顯然的下降。這表明這一突變體確實減弱了毒力，但到了不能被LD50所檢測的程度。突變體P3F4和P9B7也通過口服途徑，以107細胞/小鼠的接種量應用。所有小鼠都沒出現病癥，表明這些突變體的口服LD50量至少比野生型菌株高一個數量級。在小鼠疫苗接種試驗中，五個一組的質量為20-25g的BALB/C小鼠用10倍系列稀釋的鼠傷寒沙門氏菌突變株P3F4和P9B7，以口服(p.o)或腹膜內注射(i.p.)途徑初始接種。4周之后，小鼠再用500c.f.u的親代野生型菌株接種。四周中記錄死亡情況。將2個一組的，并且與接種突變體菌株的小鼠同樣大小和同一批的小鼠，用500c.f.u的野生型菌株腹膜內接種，作為正對照。兩個未免疫的小鼠如預計的那樣在4周內死亡。結果列表如下1)用突變體菌株P3F4口服初始接種2)用突變體菌株P3F4腹膜內初始接種3)用突變菌株P9B7口服初始接種4)用突變體P9B7腹膜內初始接種從這些實驗中得出結論，突變體P3P4似乎能對隨后的野生型感染產生保護，這種保護似乎在腹膜內免疫的小鼠中作用更強。實施例4鑒定鼠傷寒沙門氏菌中編碼第二種III型分泌系統的毒力焦點本實施例中所用的縮寫為VGC1，1簇毒力基因；VGC2，2簇毒力基因。描述的實驗背景鼠傷寒沙門氏菌是人胃腸炎的主要病原，它在作為人體傷寒模型的小鼠中產生系統性疾病(1)。用鼠傷寒沙門氏菌通過口服接種小鼠后，細菌通過腸細胞或派伊爾結小囊的M細胞(2)從小腸腔穿過腸粘膜。這些細菌隨后侵入巨噬細胞和中性白細胞，進入網狀內皮系統并擴散至其他器官，包括脾和肝，在那里進一步敏殖導致占優勢和致命的菌血癥(3)。為侵入宿主細胞，并在各種生理脅迫的胞內和胞外環境中存活和復制，以及避開免疫系統的特異性抗細菌活性，鼠傷寒沙門氏菌采用了一套完善的毒力因子系統(4)。為更全面了解鼠傷寒沙門氏菌和其他病菌的毒力機理，在實施例1中描述了轉座子誘變系統，它簡便地被稱為“特征標記誘變”(STM)，它結合了突變分析功能和同時跟蹤大量不同突變體在一個動物體內最終結果的能力(5和實施例1；文獻5發表于本發明優先權數目之后)。用這一方法，我們從總共篩選的1152個突變體中鑒定了43個毒力減弱的突變體。在5個這樣的突變體位于轉座子插入位點旁側的DNA核苷酸列表明了它們涉及到編碼各種細菌性病原體的III型分泌系統(6，7)。鼠傷寒沙門氏菌inv/spa基因簇產物是形成III型分泌系統的蛋白質，該系統是介導進入上皮細胞(10)表面附屬部分的裝配所需要的。因此在inv/spa簇中帶有突變的菌株的毒力只有當接種物是口服接種而非腹膜內接種時才減弱(8)。相反通過STM鑒定了5個突變體在腹膜內接種后是無毒性的(5)。在這一實施例中，表明了這5個突變體的轉座子插入位點和通過STM鑒定的另外11個突變體都畫出了鼠傷寒沙門氏菌染色體的同一區域。這一區域的進一步分析顯示了另外一些基因，它們的推斷產物與III型分泌系統的其他組成有相似的序列。我們稱之為毒力基因簇2(VGC2)的染色體該區域在許多其他腸細菌中不出現，它代表了鼠傷寒沙門氏菌毒力的一個重要位點。材料和方法細菌菌株、轉導和生長培養基腸道沙門氏菌(Salmonellaenterica)血清型5791(阿伯丁沙門氏菌)、423180(雞沙門氏菌)、7101(古巴沙門氏菌)和12416(鼠傷寒沙門氏菌LT2)來自國立典型培養物保藏中心(PubbicHealthLaboratoryService，UK)。傷寒沙門氏菌BRD123基因組DNA由G.Dougan贈送，腸道病原性的大腸桿菌(EPEC)、腸出血性大腸桿菌(EHEC)、霍亂弧菌E1Tor生物型、弗氏志賀氏菌血清型2和金黃色葡萄球菌為臨床分離株，來自英國皇家醫學研究生院傳染病和細菌學系。鼠疫桿菌(Yersiniapestis)的基因組DNA由J.Heesemann贈送。然而基因組DNA可采用標準方法分離。以前已描述了用于產生鼠傷寒沙門氏菌NCTC12023株的特征標記的mini-Tn5轉座子突變體的細菌菌株和方法(5，11)。常規的增殖質粒是在大腸桿菌DH5α進行。將細菌培養于補加了適當抗生素的LB肉湯(12)中。在測定單個突變體菌株毒力水平之前，首先通過噬菌體P22介導的轉導作用(12)將突變轉至對萘啶酮酸敏感的鼠傷寒沙門氏菌12023的親代菌株中。轉導體在用作接種物前用限制性酶消化和Southern雜交進行分析。λ文庫篩選覆蓋VGC2的重疊插λDNA的入克隆通過標準方法(13)獲得，它來自鼠傷寒沙門氏菌LT2基因組DNA部分San3A消化物插入片段的入1059文庫(14)。該文庫由K.Sanderson從加拿大Calgary的沙門氏菌遺傳保藏中心(SGSC)獲得。Mud-P22溶源體將放射性標記的DNA探針與結合DNA的HybondN(Amersham)濾膜雜交，該DNA從一套鼠傷寒沙門氏菌菌株的裂解物制備而來，這些菌株在鼠傷寒沙門氏菌基因組已知位置含有Mud-P22原噬菌體。絲裂霉毒誘導的Mud-P22裂解物的制備見描述(12，15)。這套Mud-P22原噬菌體最先由Benson和Goldman(16)裝配，從SGSC所得。凝膠電泳和Southern雜交凝膠電泳在1％或0.6％瓊脂糖凝膠。0.5×TBE中進行。將凝膠分離的DNA轉至Hybond或N或N+膜(Amersham)，按Holden等所述進行嚴格雜交和洗膜步驟(使核苷酸序列之間的雜交錯配在10％或10％以下)。對于非嚴格條件(使序列之間雜交的錯配在50％)，將濾膜在10％甲酰胺/0.25MNa2HPO4/7％SDS中42℃下雜交過夜，最嚴格的雜交步驟是用20mMNa2HPO4/1％SDS在42℃下進行。用作探針的DNA片段按生產廠家說明用Radprime系統(Gibco-BRL)的[32P]dCTP或[地高辛配基-11]dUTP標記，并用地高辛配基系統(BoehringerMannheim)檢測，只是雜交用的溶液與放射性標記探針的溶液相同。如前述方法(13)制備基因組DNA的用于Southern雜交。分子克隆和核苷酸測序限制性內切酶和T4DNA連接酶來自Gibco-BRL。一般的分子生物學技術如Sambrook等所述(18)。用T7測序試劑盒(Pharmacia)通過雙脫氧鏈終止法(19)進行核苷酸測序。序列有Macvector3.5軟件或AssemblyLLGN程序包匯編。將核苷酸和其衍生的氨基酸序列與歐洲分子生物學實驗室(EMBL)和SwissProt數據庫中資料比較，采用威斯康星大學的GCG程序包的BLAST和FASTA程序，在英國Hinxton的人類基因組圖譜項目資源中心的網絡服務處進行。毒力試驗5個一組的雌性BALB/C小鼠(20-25g)用懸浮于生理鹽水的細菌的10倍稀釋液口服或腹膜內接種。制備接種物時，將細菌搖床(50rpm)培養于LB肉湯中，37℃過夜，然后用于接種新鮮培養基，經過不同時間至560nm處的光密度達到0.4-0.6。將培養物通過離心濃縮和重懸于鹽水使細胞密度達每5×108菌落形成單位(cfu)或大于此濃度。通過在LB瓊脂平板上上涂布接種物稀釋系列檢查每ml中cfu濃度。小鼠用0.2ml體積的相同量腹膜內接種和通過口腔的管飼法接種小鼠。經過28天，用Reed和Meunch(21)的方法計算LD50的值。結果轉座子插入的定位前面已描述了鼠傷寒沙門氏菌微型Tn5轉座子突變體庫的制備和用于鑒定43個減毒的突變體的篩選方法(5)。通過選擇卡那霉素抗性或反向PCR，從接合后體克隆轉座子和旁側的DNA區。在33個突變體中獲得轉座子旁側DNA的300-600bp的核苷酸序列。通過將這些序列與DNA和蛋白質數據比較，結果表明14個突變體來自轉座子插入以前已知的毒力基因，7個是由于插入與腸細菌的已知基因相似的新基因，12個是由于插入與DNA和蛋白質數據庫記錄沒有相似性的序列(實施例1和本實施例中的文獻5)。有三方面的證據表明，進入新序列的19個轉座子插入中有16個集中于基因組的三個區域，最初定名為A、B和C。首先，將轉座子插入點旁側區域的核苷酸序列之間相互比較和將這些序列與數據庫比較，結果顯示有些序列相互重疊或與同一基因不同區域有很大的相似性。第二，通過用九種限制性酶消化和用位于轉座子插入點旁側的限制性片段探測基因組DNA的Southern雜交分析表明，有些轉座子插入位于同樣限制性片段上。第三，當同樣DNA探針與來自鼠傷寒沙門氏菌λDNA文庫的的噬斑雜交時，發現前面兩個步驟已表明可能是相連的突變體探針與同樣的λDNA克隆雜交。因而兩個突變體(P9B7和P12F5)被指定為A簇，五個突變體(P2D6，P9B6，P11C3，P11D10，P11和H10)為B簇而九個突變體(P3F4，P4F8，P7A3，P7B8，P7G2，P8G12，P9G4，P10E11和P11B9)C簇(圖8)。這三簇DNA探針與一套含有鎖住的Mud-P22原噬菌體(15，16)的鼠傷寒沙門氏菌雜交，表明了這三個基因座都位于30′至31′域(第八版，參考文獻22)(圖7)，表明這三個基因座密切相連或構成了一個大的毒力位點。用每個克隆末端區的DNA片段作為其他λ克隆的Southern雜交分析的探針，以測定覆蓋A、B和C簇的任何λ克隆是否含有重疊DNA插入片段。DNA片段雜交顯示有n個λ克隆重疊，并且A、B、C簇含有一個鄰連區(圖8)。這一區末端的DNA片段然后用于探測λ文庫，以進一步鑒定含有代表鄰接區的插入序列的克隆。確定沒有一個λ克隆含有這一基因座的最右端，因此這一區域是通過從Mud-P22原噬菌體菌株TT15244(16)的裂解液中克隆一個6.5kb的EωRI/XbaI片段而獲得。然后采用限制性圖譜和Southern雜交分析作出這一基因座的物理圖譜(圖8)。為區分這一基因座和已被詳細說明的位于63′的inv/spa基因簇(第八版，參考22)(8，9，23，24，25，26)，我們把后者稱為毒力基因簇1(VGC1)，并定名新的毒力基因座為VGC2。圖2示核苷酸序列(序列1和序列2)已被測定的DNA的兩個部位位置。核苷酸序列示于圖11和圖12。對鼠傷寒沙門氏菌染色體上VGC2邊界的作圖位于VGC2左側的λ克隆7的核苷酸測序顯示，有一個開讀框(ORF)，其推斷的氨基酸序列與大腸桿菌ydhE≠基因的一個片段的衍生產物有90％以上的相同，對VGC2右側的6.5kbEcoRI/XbaI克隆的片段測序表明，有一個ORF存在，其推斷的氨基酸序列與pykF基因編碼的大腸桿菌的丙酮酸激酶I有90％以上的相同(27)。在大腸桿菌染色體上，ydhE和pykF相互靠近，位于37′-38′(28)。沿著VGC2長度分布的11個非重疊DNA片段作為探針，用于大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌基因組DNA的非嚴格Southern雜交分析。DNA片段雜交顯示包含VGC2的約40kb的區域在大腸桿菌基因組中不存在，并且VGC2邊界局限于1kb之內(圖9)。將靠近VGC2(圖8)右端的XbaI位點的位置與染色體(22)30′區的已知XbaI位點的圖譜比較，可推斷出VGC2的30.7′的圖譜位置。VGC2的結構VGC2的部分核苷酸序列顯示有19個ORF(圖8)。VGC2內的約26kb的核苷酸序列的G+C含量為44.6％，而VGC1(9)為47％，整個沙門氏菌基因組(30)的G+C含量估計為51-53％。ORF1-11的推斷的完整的氨基酸序列與III型分泌系統(6，7)的蛋白質序列相似，已知這對于各種植物和動物的細菌性病原體中毒力決定簇的輸出是必需的(7)。推斷的ORF1-8(圖8)的蛋白質在結構上和序列上與假結核耶爾森氏菌(Yersiniapsendotuberculosis)(31)yscN-U基因、鼠傷寒沙門氏菌VGC1中inv/spa簇的invC/spaS和弗氏志賀氏菌(32，33，34，35)spa/mxi簇的spa47/spa40的產物相似。例如，推斷的ORF3(圖8)的氨基酸序列與假結核耶爾森氏菌(31)的YscS50％相同，與弗氏志賀氏菌的Spa9有34％相同，與鼠傷寒沙門氏菌(9)VGC1的SpaQ有37相同。預計的ORF9的蛋白質產物與LcrD族蛋白質密切相關，它與小腸結腸炎耶爾森氏菌(Y.enterocolitica)(36)的LcrD有43％相同，與弗氏志賀氏菌(32)的MxiA有39％相同，與VGC1(23)的InvA有40％一致。示于圖8的剩余的ORF的部分核苷酸序列表明了預計的ORF10的蛋白質與小腸結腸炎耶爾森氏菌的YscJ(37)最相近，后者是位于細菌外膜的脂蛋白，而ORF11則相似于鼠傷寒沙門氏菌的InvG，鼠傷寒沙門氏菌的InvG是轉位酶PulD族中的一個(38)。ORF12和ORF13與含有兩個組分調節系統(39)的各種蛋白質的傳感和調節亞基分別有顯著的相似性。對位于ORF9和10、ORF10和11以及ORF19和VGC2的右側末端之間的其他的基因有很大的編碼容量。VGC2在沙門氏菌中具保守性和特異性將位于VGC2中心(圖8，B探針)、與DNA和蛋白質數據庫的內容缺少序列相似性的一段2.2kb的PstI/HindIII片段，作為沙門氏菌血清變型和其他病原細菌基因組DNASouthern雜交分析的探針(圖10A)。在非嚴格條件下的DNA片段雜交顯示VGC2出現于阿伯丁沙門氏菌、雞沙門氏菌、古巴沙門氏菌、傷寒沙門氏菌，而在EPEC、EHEC、鼠疫桿菌、弗氏志賀氏菌、霍亂弧弧菌和金黃色葡萄球菌中不存在。因此，VGC2在沙門氏菌具保守性，并且VGC2對沙門氏菌可能具特異性。為確定在所試驗的沙門氏菌血清變型中基因座的結構是否保守，用兩種另外的限制性酶消化基因組DNA而進行嚴格的Southern雜交。DNA片段雜交顯示在鼠傷寒沙門氏菌LT2和雞沙門氏菌、古巴沙門氏菌和傷寒沙門氏菌之間存在著限制性位點安排的一定異質性(圖10B)。而且，雞沙門氏菌和傷寒沙門氏菌含有與所測定的其他沙門氏菌中出現的片段相雜交的片段，這表明VGC2的區域已在這些種中被復制了。VGC2是小鼠中毒力所需的。前面的實驗表明，腹膜內接種轉座子突變體P3F4、P7G2、P9B7和P11C3和LD50值至少比野生型菌株大100倍(5)。為理解在感染過程中VGC2的重要性，測定突變體P3F4和P9B7的口服腹膜內接種的LD50值(表1)。通過任何一種途徑接種的兩個突變體與其親代菌株相比，其毒力至少降低與個數量級。通過這兩種接種途徑毒力的極大降低證明了在上皮細胞滲入BALB/C小鼠后，VGC2對感染過程中的活動是需要的。表1鼠傷寒沙門氏菌菌株的LD50值cfu，菌落形成單位討論通過對一組減毒的特征標記轉座子突變體的插入點進行作圖已確定了迄今未知的鼠傷寒沙門氏菌的一個毒力基因座，它位于染色體的30.7′處，約40kb大小(5)。這一基因座被稱為毒力基因簇2(VGC2)，以與63′(第八版，ref.22)處的inv/spa毒力基因相區別，后者我們建議命名為VGC1。VGC1和VGC2兩者都編碼III型分泌系統的組分。然而這些分泌系統功能上不同。在插入新基因(ref.5和本實施例)形成的19個突變體中，其中16個標繪于染色體的相同區域。可能mini-Tn5插入優先出現于VGC2中。或者由于鑒定減毒(5)突變體的負選擇非常嚴格(反映在VGC2突變體有高的LD50值)，可能在以前未知的基因中，只有VGC2未知基因的突變導致在篩選中足以恢復的減毒程度。以前尋找鑒定VGC2的鼠傷寒沙門氏菌毒力決定簇的失敗可能是由于依靠細胞培養試驗，而不是用活的動物感染模型。鑒定沙門氏菌獨特的鼠傷寒沙門氏菌LT2染色體的區域的一項以前的研究(40)將一個這樣的區域(RF333)定位于30.5′32′。因此，RF333與VGC2相關，雖然還不知道RF333與毒力決定有關。比較由耶爾森氏菌和志賀氏菌毒力質粒編碼的III型分泌系統，以及沙門氏菌VGC1表明VGC2編碼分泌器官的基本結構組成。而且，VGC2中的ORF1-8的順序與同源的耶爾森氏菌、志賀氏菌和鼠傷寒沙門氏菌的VGC1的基因順序相同。與相應的耶爾森氏菌基因相比，VGC2分泌系統的組織和結構與VGC1相比并不更為密切相關，連同VGC2的低G+C的含量提示，如同VGC1(40，41，42)一樣，VGC2是由鼠傷寒沙門氏菌通過水平傳播獨立獲得的。由ORF12和13編碼的蛋白質與細菌性兩個組分調節物(39)之間有很強的相似性，并且這些蛋白質能夠調節任何ORF1-11和/或這一系統分泌的蛋白質。VGC1中很多基因已顯示出對于鼠傷寒沙門氏菌進入上皮細胞的重要性。這一過程需要細菌的接觸(2)，并產生細胞骨架的重排，而導致局部的膜邊緣波動(43，44)。VGC1的作用和它局限于感染的這一階段表現在用VGC1突變體口服接種的BALB/C小鼠中毒力減弱約50倍，以及表現為VGC1突變體進行腹膜接種時沒有毒力損失(8)。第二條觀察的結果也解釋了為什么在我們的篩選中沒有得到VGC1突變體(5)。相反，VGC2突變體在口服和腹膜內接種后大大減毒。這一結果顯示，與VGC1不同，VGC2在滲入上皮細胞后對小鼠的毒力是需要的，但這些發現不排除在這一早期感染中VGC1的作用。因此，概括起來，鼠傷寒沙門氏菌染色體上10個特征標民轉座子突變體插入點的作用導致了在30.7′處一個40kb毒力基因簇的確定。這一基因座在所有其他測定的沙門氏菌中是保守的，但在許多其他的病原菌或大腸桿菌k12中不出現。這個基因座一部分核苷酸測序顯示有11個開讀框，其預計的蛋白質編碼III型分泌系統的組分。為區分這一系統和由inv/spa侵襲基因座編碼的III型分泌系統，我們將inv/spa基因座稱為毒力基因簇1(VGC1)，而新的基因座為VGC2。VGC2比沙門氏菌基因組的G+C含量要低，VGC2的旁側是那些產物與大腸桿菌ydhE和pykF基因產物有90％以上相同的基因。因此，VGC2可能是通過插入一個區域水平獲得，該區域相應于大腸桿菌ydhE和pykF基因之間的區域。VGC2突變體的毒力研究已顯示，在口服或腹膜內接種后，突變體與野生型菌株相比毒力減弱至少5個數量級。本實施例的參考文獻1.Carter，P.B.&Collins，F.M.(1974)“實驗醫學雜志”(J.Exp.Med.)139，1189-1203。2.Takeuchi，A.(1967)“美國病理學雜志”(Am.J.Pathol.)50，109-136。3.Finlay，B.B.(1994)“當今微生物學與免疫學論題”(Curr.Top.Microbiol.Immunol.)192，163-185。4.Groisman，E.A.&Ochman，H.(1994)“微生物學動向”(TrendsMicrobiol)2，289-293。5.Hensel，M.，Shea，J.E.，Crleeson，C.，Jones，M.D.，Dalton，E.&Holden，D.W.(1995)“科學”(Science)269，400-403。6.Salmond，G.P.C.&Reeves，P.J.(1993)“生物化學動向”(TrendsBiochem.Sci.)18，7-12。7.VanGijsegem，F.，Genin.，S.&Boucher，C.(1993)“微生物學動向”(TrendsMicrobiol)1，175-180。8.Galan，J.E.&Curtiss，R.(1989)“美國國家科學院院刊”(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)86，6383-6387。9.Groisman，E.A.&Ochman，H.(1993)“歐洲分子生物學協會雜志”(EMBOJ)，12，3779-3787。10.Ginocchio，C.C.，Olmsted，S.B.，Wells，C.L.&Galan，J.E.(1994)“細胞”(Cell)76，717-724。11.deLorenzo，V.&Timmis，K.N.(1994)“酶學方法”(MethodsEnzymol.)264，384-405。12.Davis，R.H.，Botstein，D.&Roth，J.R.(1980)“高級細菌遺傳學”(AdvancedBacterialGenetics)，紐約冷泉港，冷泉港實驗室。13.Ausubel，F.M.Brent，R.，Kingston，R.E.，Moore，D.D.，Seidman，J.G.，Smith，J.A.，和Struhl，K.(1987)“當今分子生物學方案”(CurrentProtocolsinMolecularBiology)Vol.4，紐約JohnWileyandSons公司。14.Maurer，R.，Osmond，B.C.，Shekhtman，E.，Wong，A.Botstein，D(1984)“遺傳學”(Genetics)108，1-23。15.Youderain，P.，Sugiono，P.Brewer，K.L.，Higgins，N.P.&Elliott，T.(1988)“遺傳學”(Genetics)118，581-592。16.Bensen，N.R.&Goldman，B.S.(1992)“細菌學雜志”(J.Bacteriol)174，1673-1681。17.Holden，D.W.，Kronstad，J.W.&Leong，S.(1989)“歐洲分子生物學協會雜志”(EMBOJ)，8，1927-1934。18.Sambrook，J.，Fritsch，E.F.&Maniatis，T.(1989)“分子克隆；實驗室手冊”(Molecularcloningalaboratorymanual(紐約冷泉港，冷泉港實驗室))19.Sanger，F.，Nicklen，S.&Coulson，A.R.(1977)“美國國家研究院院刊”(Proc.Natl.AcadSci.U.S.A.)74，5463-5467。20.Devereux，J.，Hearberli，P.&Smithies.O.(1984)“核酸研究”(Nucl.AcidsRes.)12，387-399。21.Reed，L.J.&Muench，H.(1938)“美國衛生雜志”(Am.J.Hyg)27，493-497。22.Sanderson，K.E.，Hessel，A.&Rudd，K.E.(1995)“微生物學評論”(Microbiol.Rev.)59，241-303。23.Galan，J.E.，Ginocchio，C.&Costeas，P.(1992)“細菌學雜志”(J.Bacteriol.)174，4338-4349。24.Ginocchio，C.，Pace，J.&Galan，J.E.(1992)“美國國家科學院院刊”(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)89，5976-5980。25.Eichelberg，K.，Ginocchio，C.C.&Galan，J.E.(1994)“細菌學雜志”(J.Bacteriol.)176，4501-4510。26.Collazo，C.M.，Zierlaer，M.K.&Galan，J.E.(1995)“分子微生物學”(Mol.Microbiol.)15，25-38。27.Ohara，O.，Dorit.R.L.&Gilbert，W.(1989)“美國國家科學院院刊”(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86，6683-6887。28.Bachman，B.(1990)“微生物學評論”(Micro.Rew)54，130-197。29.Liu，S.L.，Hessel，A.&Sanderson，K.E.(1993)“細菌學雜志”(J.Bacteriol.)175，4104-4120。30.Fasman，G.D.(1976)“CRC生物化學和分子生物學手冊”(CRCHandbookofBiochemistryandMolecularBiology)ClevelandCRC出版社。31.Bergman，T.，Erickson，GalyoV，E.，Persson，C.&WolfWatz，H.(1994)“細菌學雜志”(J.Bacteriol.)176，2619-2626。32.Andrews，G.P.&Maurelli，A.T.(1992)“感染與免疫”(Infect.Immun.)60，3287-3295。33.Allaoui，A.，Sansonetti，P.J.&Parsot，C.(1993)“分子微生物學”(MolMicrobiol.)7，59-68。34.Venkatesan，M.，Buysse，J.M.&Oaks，E.V.(1992)“細菌學雜志”(J.Bacteriol.)174，1990-2001。35.Sasakawa，C.，Komatsu，K.，Tobe，T.，Suzuki，T.&Yoshkawa，M.(1993)“細菌學雜志”(J.Bacteriol)175，2334-2346。36.Plano，G.V.，Barve，S.S.&Straley，S.C.(1991)“細菌學雜志”(J.Bacteriol.)173，7293-7303。37.Michiels，T.，Vanooteghem，J.C.，LambertdeRouvroit，C.，China，B.，Gustin，A.，Boudry，P.&Cornelis，G.R.(1991)“細菌學雜志”(J.Bacteriol)173，4994-5009。38.Kaniga，K.，Bossio，J.C.&Galan，J.E.(1994)“分子微生物學”(Mol.Microbiol.)13，555-568。39.Ronson，C.W.，Nixon，B.T.&Ausubel，F.M.(1987)“細胞”(Cell)49，579-581。40.Groisman，E.A.，Sturmoski，M.A.，Solomon，F.R.，Lin，R.&Ochman，H.(1993)“美國國家科學院院刊”(Proc.Natl.AcadSci.U.S.A.)90，1033-1037。41.Altmeyer，R.M.，McNern，J.K.，Bossio，J.C.，Rosenshine，I.，Finlay，B.B.&Galan，J.E.(1993)“分子微生物學”(Mol.Micr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