一種姜黃素脂質體及其凍干粉針的制備方法

專利名稱：一種姜黃素脂質體及其凍干粉針的制備方法
技術領域：
本發明屬于中草藥提取物的脂質體及其凍干粉針的制備方法，具體為姜黃素脂質體、其脂質體凍干粉針及相應的制備方法。
背景技術：
廣義的姜黃素通常稱為姜黃色素，是由姜黃屬常用中藥(Curcuma long L.)、郁金(Curcuma wenyujin Y.H.Chen et C.Ling)、廣西莪術(Curcuma kwangsiensisS.G.Lee et C.F.Liang)或蓬莪術(Curcuma phaeocaulis Val.)的干燥塊根中分離提取的有效成分，包括姜黃素(curcumin)、脫甲氧基姜黃素(demethoxycurcumin)和雙脫氧基姜黃素(bisdemethoxycurcumin)。姜黃素有抗炎、抗氧化、降血脂、抗腫瘤等藥理作用，以下未做特殊說明時，姜黃素即指廣義的姜黃素。
姜黃素不溶于水，口服生物利用度低，大部分以原形排出體外(約89％)[劉安昌，婁紅祥，趙麗霞。姜黃素藥理活性及體內代謝.國外醫藥·植物藥分冊。2004；19(1)1-5]。
一般情況下姜黃素的溶液不穩定，在37℃條件下，姜黃素在pH7.2的磷酸鹽緩沖溶液中，約有90％會在30min內降解[Ying-Jan Wang，Min-Hsiung Pan，Ann-Lii Cheng，et a1.Stability of curcumin in buffer solutions and characterization ofits degradation products[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，1997(15)1867-1876.]，其降解呈pH依賴，在中性到堿性環境中降解加快。[中藥材，2002，8(25)585-586]中以DMSO助溶，以Hanks液溶解，制成的姜黃素注射液的有效期為0.2年，并得出不適宜將姜黃素開發成注射液的結論。
鑒于上述原因，制備靜脈注射方式給藥、穩定性好姜黃素制劑，達到提高血藥濃度、更有效地抑制腫瘤細胞增殖，一直是人們長期以來渴望解決的難題。

發明內容
本發明采用薄膜分散-高壓均質法制備的姜黃素脂質體及凍干粉針，適合工業化大生產及臨床應用，解決了姜黃素水溶性差，不穩定，難以制成注射劑的技術難題。本發明的姜黃素脂質體，姜黃素被包裹在磷脂雙分子層中，降低了姜黃素與水分散相及外界環境的接觸，提高了姜黃素的穩定性，同時增加了藥物在肝、肺等組織及腫瘤中的分布，對腫瘤細胞的抑制作用也優于姜黃素注射液。
用于制備脂質體的磷脂主要有蛋黃卵磷脂、大豆卵磷脂以及氫化還原天然磷脂，發明人經研究發現大豆卵磷脂的不飽和脂肪酸含量和脂肪酸的不飽和度高，容易被氧化，因而對姜黃素的穩定性產生較大影響，另外大豆卵磷脂氧化降解產物的具有一定的毒副作用和對血管有刺激性，使得制劑的穩定性降低、不適合靜脈給藥；而蛋黃卵磷脂和氫化還原的天然磷脂則不存在上述問題，因此本發明選用蛋黃卵磷脂和氫化大豆磷脂。
本發明的另一特點在于加入帶電荷的合成磷脂，使脂質體帶負電荷，增加脂質體膠體粒子之間的排斥，大大提高脂質體的穩定性，比單純用卵磷脂穩定，不會產生聚集現象，所得的脂質體凍干粉針加水溶解后放置無結晶析出。
本發明提供如下技術方案一種姜黃素脂質體，它包括姜黃素、天然磷脂、合成磷脂的重量比為1∶10-60∶1-6。
較好的配比為姜黃素、天然磷脂、合成磷脂1∶20-40∶1-4。
所述姜黃素脂質體凍干粉針劑為姜黃素脂質體與藥用輔料凍干賦形劑、pH調節劑制成凍干粉針劑。凍干賦形劑按磷脂重量比計算，1份磷脂加0.5-2份。
本發明的天然磷脂選自蛋黃卵磷脂和氫化還原磷脂中一種或多種；合成磷脂選自磷脂酰甘油(PG)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二棕櫚酰磷脂酰甘油(DOPG)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-PEG2000(DSPE-PEG2000)中的一種或多種；凍干賦形劑選自麥芽糖、甘露醇、葡萄糖、乳糖、蔗糖、海藻糖中的一種或多種；pH調節劑選自鹽酸、丁二酸鹽、檸檬酸、半胱氨酸中的一種或多種。
姜黃素脂質體及凍干粉針的制備方法為按重量比取姜黃素1份、磷脂10-60份、合成磷脂1-6份溶于氯仿和/或甲醇溶劑中，減壓恒溫除去溶劑；加溶有凍干賦形劑的pH4-6.5緩沖液；水合形成多室脂質體(MLV)，勻化，形成粒徑50-200nm的小單室脂質體。過0.22μm無菌過濾器過濾，冷凍干燥。
較好的姜黃素脂質體及其凍干粉針劑的制備方法為按重量比取姜黃素1份、磷脂20-40份、合成磷脂1-4份溶于氯仿和/或甲醇溶劑中，減壓恒溫除去溶劑；加入溶有凍干賦形劑pH4-6.5的緩沖液，水合形成多室脂質體(MLV)，勻化，形成粒徑50-200nm的小單室脂質體(SLV)。經0.22μm過濾器無菌過濾，冷凍干燥。
所述脂質體中優選加入pH調節劑調節pH至4-6.5，可以增加姜黃素的穩定性及在脂質體中的包封率。加入凍干賦形劑有助于脂質體凍干粉的重組及穩定。其中凍干賦形劑以蔗糖、海藻糖和甘露醇為佳。凍干賦形劑與磷脂之重量比以0.5-2∶1為佳。
本發明制備的脂質體，制成凍干粉針，加注射用水復溶后脂質體的包封率為80-95％，粒徑為50nm-1μm。
本發明的有益效果表現在本發明采用薄膜分散-高壓均質法制備姜黃素脂質體，適合工業化大生產及臨床應用；相比乙醇注入法，薄膜分散-高壓均質法大大降低了生產成本及對設備的要求。
本發明制備的姜黃素脂質體凍干粉針與姜黃素注射液相比增加對腫瘤組織的靶向性，能提高藥物的治療指數，有效抑制腫瘤細胞的增殖，增強其抑瘤作用。
選用蛋黃卵磷脂和氫化大豆磷脂的天然磷脂，增加了制劑的穩定性與臨床的安全性。
加入適量量帶負電荷的合成磷脂使藥物帶負電荷，增加脂質體膠體粒子之間的排斥，避免了脂質體的絮凝，大大提高脂質體的穩定性。
本發明脂質體姜黃素脂質體凍干粉針具有良好的水溶性，所得姜黃素脂質體凍干粉針加水溶解后放置無結晶析出，平均粒徑在130nm附近。
本發明姜黃素脂質體凍干粉針劑在加入注射用水重新溶散后，能以任意比例與5％葡萄糖輸液稀釋給藥而不產生沉淀和降解產物，從而最大限度的較少臨床用藥的不安全因素。
對姜黃素脂質體的粒徑，Zeta電位和包封率等指標的評價實驗如下拍攝姜黃素脂質體的透射電鏡(TEM)照片將脂質體凍干粉針加適量蒸餾水稀釋，滴加在覆蓋碳膜的銅網上，用2.0％磷鎢酸鈉負染液染色，用H-7000透射電子顯微鏡拍攝透射電鏡照片。
測定姜黃素脂質體的粒徑分布和Zeta電位將姜黃素脂質體凍干粉針以蒸餾水稀釋，用Zetasizer3000HS激光粒度分析儀測定脂質體混懸液的粒徑和ξ電位。
測定姜黃素脂質體的包封率以Sephadex G50葡聚糖凝膠柱層析方法分離姜黃素脂質體和游離藥物，測定包封率。吸取0.5ml復溶后的脂質體混懸液上柱，以蒸餾水為洗脫介質進行洗脫。收集帶有乳光部分的洗脫液，定量吸取改部分洗脫液，加甲醇溶解脂質體；令吸取0.5ml復溶后的姜黃素脂質體混懸液，加甲醇溶解。HPLC法測定兩樣品中姜黃素的含量，根據包封率計算公式計算包封率。
EN(％)＝C/C0×100％其中EN代表包封率，C和C0分別代表被包裹的藥量和脂質體混懸液中的總藥量。


圖1、姜黃素脂質體的透射電鏡(TEM)照片。
圖2、姜黃素脂質體的粒度分布。
圖3、姜黃素脂質體混懸液的ξ電位。
具體實施例方式
下面實施例用于進一步說明本發明，但不是對本發明保護范圍的限制。
實施例1將姜黃素60mg、0.6g氫化大豆磷脂(純度＞95％)、60mgDSPG，溶解于氯仿/甲醇(1∶1)混和溶劑中使完全溶解成澄明溶液，置40℃恒溫水浴上減壓干燥成膜，置于真空干燥器中進一步過夜干燥。加溶有蔗糖的丁二酸鈉溶液(pH6.5)在55℃下溶解膜，直至形成多室脂質體(MLV)，高壓均質(Niro均質機型號，NS1001L)減小粒徑(1500bar，5次)即得。無菌過濾后(膜濾器孔徑0.22μm)，分裝于西林瓶中，進行冷凍干燥，得姜黃素脂質體凍干粉針。在40℃貯存3個月后，姜黃素含量為93.2％，加入注射用水重建得到脂質體的包封率為89.7％，平均粒徑為168.6nm。
實施例2將60mg姜黃素、1.2g蛋黃卵磷脂(純度＞95％)、120mgDOPG溶于氯仿/甲醇(1∶1)混和溶劑中，置35℃恒溫水浴上減壓干燥成膜，置于真空干燥器中進一步過夜干燥。加溶有海藻糖的PBS溶液(pH6.0)在55℃下溶解膜，直至形成多室脂質體(MLV)，高壓均質(Niro均質機型號，NS1001L)減小粒徑(1500bar，5次)即得。無菌過濾后(膜濾器孔徑0.22μm)，分裝于西林瓶中，進行冷凍干燥，得姜黃素脂質體凍干粉針。在40℃貯存3個月后，姜黃素含量為94.3％，且加入注射用水重建得到的脂質體的包封率為92.5％，平均粒徑為140.2nm。
實施例3將姜黃素60mg、1.8g蛋黃卵磷脂(純度＞95％)、180mgDSPG，溶解于氯仿/甲醇(1∶1)混和溶劑中使完全溶解成澄明溶液，置38℃恒溫水浴上減壓干燥成膜，置于真空干燥器中進一步過夜干燥。加溶有甘露醇的檸檬酸鈉溶液(pH5.5)在55℃下溶解膜，直至形成多室脂質體(MLV)，高壓均質(Niro均質機型號，NS1001L)減小粒徑(1500bar，5次)即得。無菌過濾后(膜濾器孔徑0.22μm)，分裝于西林瓶中，進行冷凍干燥，得姜黃素脂質體凍干粉針。在40℃貯存3個月后，姜黃素含量為95.6％，加入注射用水重建得到脂質體的包封率為94.7％，平均粒徑為120.2nm。
實施例4將姜黃素60mg、2.4g氫化大豆磷脂(純度＞95％)、240mgPG，溶解于氯仿/甲醇(1∶1)混和溶劑中使完全溶解成澄明溶液，置40℃恒溫水浴上減壓干燥成膜，置于真空干燥器中進一步過夜干燥。加溶有葡萄糖的PBS鈉溶液(pH4.5)在55℃下溶解膜，直至形成多室脂質體(MLV)，高壓均質(Niro均質機型號，NS1001L)減小粒徑(1500bar，5次)即得。無菌過濾后(膜濾器孔徑0.22μm)，分裝于西林瓶中，進行冷凍干燥，得姜黃素脂質體凍干粉針。在40℃貯存3個月后，姜黃素含量為96.7％，加入注射用水重建得到脂質體的包封率為94.6％，平均粒徑為131.5nm。
實施例5將姜黃素60mg、3.6g蛋黃卵磷脂(純度＞95％)、360mg DSPE-PEG2000，溶解于氯仿/甲醇(1∶1)混和溶劑中使完全溶解成澄明溶液，置35℃恒溫水浴上減壓干燥成膜，置于真空干燥器中進一步過夜干燥。加溶有乳糖的PBS溶液(pH5.0)在55℃下溶解膜，直至形成多室脂質體(MLV)，高壓均質(Niro均質機型號，NS1001L)減小粒徑(1500bar，5次)即得。無菌過濾后(膜濾器孔徑0.22μm)，分裝于西林瓶中，進行冷凍干燥，得姜黃素脂質體凍干粉針。在40℃貯存3個月后，姜黃素含量為94.1％，加入注射用水重建得到脂質體的包封率為92.5％，平均粒徑為151.3nm。
實施例6姜黃素脂質體凍干粉針的加速試驗考察按實施例3制備方法制備姜黃素脂質體凍干粉針，將該脂質體于40℃，相對濕度75％的條件下放置，分別于0、1、2、3、6個月取樣，檢查凍干脂質體的外觀、凍干脂質體復溶后的粒徑分布、滲漏率、包封率、含量等指標。檢測結果顯示，在上述條件下放置，脂質體的各項檢測指標均未見明顯的變化，說明姜黃素制成脂質體后，穩定性增加。
表1姜黃素脂質體的加速試驗考察

實施例7姜黃素脂質體對腫瘤細胞增殖的抑制作用按文獻[譚俊，蔡卓凡，王詩明.姜黃素制劑穩定性試驗研究.中藥材，2002，8(25)585-586]方法制備姜黃素注射液。
如實施例2制備姜黃素脂質體凍干粉針，加注射用水稀釋至一定濃度后用于實驗中。
HL60細胞、K562細胞、SGC7901細胞、Be17402細胞分別培養于含10％～15％小牛血清的RPMI1640培養基中，培養條件37℃、5％CO2；不同濃度姜黃素注射液和姜黃素脂質體處理細胞24h后，用MTT法觀察藥物對4種細胞株的細胞毒作用，以溶劑對照組作對照，計算抑制率，根據以下公式求出IC50。
LgIC50＝Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)試驗結果見下表表2姜黃素注射液與姜黃素脂質體對不同細胞增殖的影響

試驗結果表明，姜黃素注射液與姜黃素脂質體對幾種腫瘤細胞均有抑制作用。姜黃素脂質體對腫瘤細胞的抑制作用優于姜黃素注射液。
實施例8姜黃素脂質體凍干粉針的抑瘤作用同實施例7制備姜黃素注射液，如實施例3制備姜黃素脂質體凍干粉針。
將H22小鼠肝癌瘤株預先接種于昆明種小鼠腹腔內(每只0.2mL)，1周左右抽出腹水，用三倍無菌生理氯化鈉溶液稀釋，接種于20只小鼠的右側腋下(每只0.2mL)。接瘤后第二天，分別按體重將小鼠隨機分為8組，每組10只。分別為模型組、陽性藥組(環磷酰胺20mg/kg)、姜黃素注射液高(50mg/kg)、中(25mg/kg)、低(12.5mg/kg)劑量組和姜黃素脂質體高(50mg/kg)、中(25mg/kg)、低(12.5mg/kg)劑量組。每天尾靜脈注射給藥一次，連續給藥10天，于末次給藥后24小時處死動物，稱體重，剝取瘤組織稱重，計算各給藥組抑瘤率。采用學生t檢驗對姜黃素注射液與姜黃素脂質體瘤重進行比較。
取于腋下傳代接種后第十天且生長狀態良好的Lewis肺癌瘤組織，加入五倍量的生理鹽水，組織研磨勻漿后過100目篩網，所得瘤細胞懸液接種于80只C57BL/6純系鼠腋下，0.2ml/只。接瘤后第二天，分別按體重將小鼠隨機分為8組，每組10只。分別為模型組、陽性藥組(環磷酰胺20mg/kg)、姜黃素注射液高(50mg/kg)、中(25mg/kg)、低(12.5mg/kg)劑量組和姜黃素脂質體高(50mg/kg)、中(25mg/kg)、低(12.5mg/kg)劑量組。每天尾靜脈注射給藥一次，連續給藥10天，于末次給藥后24小時處死動物，稱體重，剝取瘤組織稱重，計算各給藥組抑瘤率。采用學生t檢驗對姜黃素注射液與姜黃素脂質體瘤重進行比較。
表3姜黃素脂質體的抑瘤作用

與相同劑量注射液組瘤重相比*，P＜0.05；**，P＜0.01由上表可見，姜黃素注射液與姜黃素脂質體均呈劑量依賴性抑制小鼠H22肝癌和Lewis肺癌的生長。但相同劑量的姜黃素脂質體的抑瘤作用優于姜黃素注射液。統計學結果表明高、中、低有顯著性差異。
實施例9姜黃素脂質體的小鼠體內藥代動力學及組織分布同實施例7制備姜黃素注射液，如實施例5制備姜黃素脂質體凍干粉針。
將H22小鼠肝癌瘤株預先接種于昆明種小鼠腹腔內(每只0.2ml)，1周左右抽出腹水，用三倍無菌生理氯化鈉溶液稀釋，接種于20只小鼠的右側腋下(每只0.2ml)。第二天，將小鼠分為2組姜黃素注射液和姜黃素脂質體組。將姜黃素注射液對照溶液、姜黃素脂質體分別于荷瘤小鼠尾靜脈注射(50mg/kg，0.2ml/只)，于不同時間點5、10、15、20、30、45、60min眼眶后靜脈叢取血，10000r·min離心2min取血漿。處死小鼠，精密稱取心、肝、脾、肺、腎、腦、骨髓以及腫瘤各0.1g，置勻漿管中加生理氯化鈉溶液(0.5ml)進行勻漿。分別取血漿以及各組織勻漿液置1.5ml離心管中，加入0.4ml乙腈，渦流振蕩1min，使蛋白沉淀并提取姜黃素。再離溶解，渦流振蕩min，微孔濾膜濾過后，取續濾液20μl，注入液相色譜儀中，在檢測波長425nm下用外標法測定，流動相為乙腈-水(體積比48∶52)，含0.5％(體積分數)磷酸。
表4姜黃素注射液和姜黃素脂質體體內藥動學參數

實驗結果表明，同姜黃素注射液相比，姜黃素脂質體可明顯降低藥物在血液中的清除速率，延長了循環半衰期，增加血中藥物濃度姜黃素脂質體的組織分布見表5。
表5 姜黃素注射液以及姜黃素脂質體后荷瘤小鼠體內各組織分布

與姜黃素射液組相比*，P＜0.05；**，P＜0.01由表看出，脂質體包封后明顯增加了藥物在肝、肺等組織中的分布。與姜黃素注射液相比，姜黃素脂質體降低了藥物在腎中的分布，心、腦中藥物分布沒有明顯增加；而骨髓中藥物濃度略有增加。姜黃素脂質體在腫瘤中的分布也較多。
權利要求
1.一種可供靜脈注射的脂質體，其特征在于該脂質體包括磷脂以及姜黃素。
2.權利要求1的脂質體，其特征在于姜黃素為二苯基庚二酮類化合物，包括姜黃素、去甲氧基姜黃素和雙去氧基姜黃素中的一種或幾種。
3.權利要求1的脂質體，其特征在于所述磷脂為天然磷脂和/或合成磷脂。其中天然磷脂為蛋黃卵磷脂和氫化大豆磷脂中的一種或兩種；合成磷脂為磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二棕櫚酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-PEG2000中的一種或多種。
4.權利要求1-3中任何一項的脂質體，取下述方法制得(1)取姜黃素、天然磷脂、合成磷脂溶于氯仿和/或甲醇溶劑中，恒溫減壓除去溶劑；(2)加入pH4-6.5緩沖液，水合形成多室脂質體，勻化，形成粒徑50-200nm的小單室脂質體。
5.權利要求4的脂質體的制備方法，其特征在于步驟(1)的姜黃素、天然磷脂、合成磷脂的重量比為1∶10-60∶1-6。
6.權利要求5的脂質體的制備方法，其特征在于姜黃素、天然磷脂、合成磷脂的重量比為1∶20-40∶2-4。
7.權利要求1的脂質體，與藥用輔料凍干賦形劑、pH調節劑制成凍干粉針劑。
8.權利要求7的凍干粉針劑，其特征在于凍干賦形劑為選自麥芽糖、甘露醇、葡萄糖、乳糖、蔗糖和海藻糖中的一種或多種，其用量按磷脂重量比計算，1份磷脂加0.5-2份。
9.權利要求7的凍干粉針劑，其特征在于pH調節劑包括鹽酸、丁二酸鹽、檸檬酸、半胱氨酸中的一種或多種，pH調節至pH4-6.5。
10.權利要求1的脂質體，制成凍干粉針，加注射用水復溶后脂質體的包封率為80-95％，粒徑為50nm-1μm。
全文摘要
本發明公開了一種適合臨床及大生產要求的姜黃素脂質體及其凍干粉針劑制備方法，姜黃素與天然磷脂的質量比為10－60份，與合成磷脂的質量比為1－6份，按1份磷脂加入0.5－2份凍干賦形劑的比例，制成凍干粉針劑；本發明提高了姜黃素的穩定性，增強了姜黃素對腫瘤組織的靶向性，其抑瘤作用明顯提高。
文檔編號A61K47/24GK1943566SQ20061009724
公開日2007年4月11日 申請日期2006年10月25日 優先權日2006年10月25日
發明者許向陽, 林巧平, 張安元, 楊士豹, 王冬春 申請人:江蘇先聲藥物研究有限公司