專利名稱：防治血管內再狹窄的成體干細胞血管內支架及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種細胞包被的血管內支架，特別是一種成體干細胞包被的血管內支架。
(二)、背景技術血管支架作為微創手術治療血管狹窄的重要載體，其植入后的短期臨床療效已經獲得廣泛認可，以此為技術基礎的經皮腔內血管成形術(PTA)自八十年代發展以來，已經成為與藥物和其它外科手術治療冠心病并駕齊驅的常規療法。但令人遺憾的是，金屬裸支架的長期置入并未能完全“治愈”血管再狹窄，而且還導致一個新問題的出現——支架內再狹窄(In-stent restenosis；ISR)。根據臨床統計，置入支架后血管再狹窄發生率為15-20％，而合并糖尿病、病變彌漫和血管較小者支架內再狹窄的發生率高達30-50％。為了克服這種局限，增強支架的抗再狹窄能力，最大程度地延長支架的療效期限，人們對支架技術做出多方面的改進。例如，改進支架的使用材料及結構形式；將抗血栓類藥物涂覆于支架；使支架表面具有放射性作用；發展出無鞘支架等。在這些改進努力中，藥物涂層支架似乎正在成為支架技術的一個重要發展方向，新型藥物支架就是在普通金屬裸支架上涂敷一層抗血栓的藥物，能使ISR降低于10％一下。但是，藥物洗脫支架存在著缺點和不足(1)藥物洗脫支架也只是延遲再狹窄的發生，而不是抑制再狹窄；(2)用來裝載藥物的聚合物可誘導慢性炎癥，損傷修復和再內皮化延遲等不良反應；(3)藥物的局限性，目前在支架上涂敷的藥物，在抑制血管平滑肌細胞的增生的同時也抑制了血管內皮細胞的增生，引發血栓的形成及支架置入后中后期再狹窄的發生。
針對上面的問題，有人提出對血管內支架表面進行內皮化修飾。現在普遍認為，抗凝血乃至改善血管移植材料血液相容性最理想的途徑應是在生物材料的表面種植、培養內皮細胞，即內皮細胞固定化。然而，血管內支架內皮化這一設想至今尚沒能成為常規的臨床治療手段，究其原因是在具體操作中會遇到很多實際的問題，主要為種子細胞的來源、細胞的粘附、細胞的生物學功能以及內皮化支架的運輸、儲存等方面的問題，其中最為關鍵的是種子細胞來源的問題。在初期的細胞支架研究中，種子細胞采用的是成熟內皮細胞。但是，在過去30年中，無論體內還是體外試圖在人工移植血管、支架和聚四氟乙烯血管移植物表面種植內皮細胞的方法都沒有獲得預期成功。其原因主要有(1)內皮細胞具有強免疫源性，因而異種或異體內皮細胞的應用基本上不能實現；(2)自體內皮細胞，主要取自自體靜脈或脂肪組織內微血管，來源及數目有限，且難以用于急性和亞急性心血管病患者；(3)內皮細胞種植于支架表面，在球囊擴張后不能有效的保留和存活。由于內皮細胞作為種子細胞存在上述缺陷，因此尋找新的種子細胞成為迫切的問題，而干細胞研究的日益深入可能為我們提供了一種新的細胞來源。
來源于骨髓的內皮祖細胞被認為支持血管內皮內皮化的完整性。Jacob等取得充分證據證實支架內的快速內皮增生部分地與損傷的內皮有關，且這是由EPCs的數量或其功能降低造成的(Jacob George，Itzhak Herz，Emil Goldstein，et al.Number and Adhesiveproperties of circulating endothelial progenitor cells inpatients with in-stent restenosis.Arterioscler Thromb VascBiol，2003，23(12)57-60.支架內再狹窄病人體內循環內皮祖細胞的數量和粘附特性)。接著，Shi等首先發現骨髓CD34(+)造血前體細胞的亞群參與了犬模型血管支架治療的密封的Dacron支架的內皮化(ShiQ，RafiiS，Wu MH，et al.Evidence for circulatingbone marrow-derived endothelial cells.Blood.1998；92362-367.骨髓來源的循環內皮細胞的證據)。隨后，Bhattacharya等研究發現在聚對苯二甲酸乙酯(polyethylene terephthalate，PET)支架上移植自體骨髓可以加速支架的內皮化，同時證實了是骨髓中的CD34+細胞增強了血管支架內皮化程度(Vishwanath Bhattacharya，Peter A.McSweeney，Qun Shi，et al.Enhanced endothelializationand microvessel formation in polyester grafts seeded with CD34+bone marrow cells.Blood.2000，95581-585.加強種植CD34+骨髓細胞聚脂移植物的內皮化和微血管形成)。2005年，Jiro等運用血管造影技術觀察當捕獲EPCs的支架植入冠狀動脈病人體內后，觀察不銹鋼支架是否迅速內皮化，從而抑制支架內血栓的形成和減少再狹窄率，證明EPCs冠狀支架對治療新生冠狀動脈疾病是安全的和可行的(Jiro Aoki，Patrick W.Serruys，Heleen van Beusekom，etal.Endothelial Progenitor Cell Capture by Stents Coated WithAntibody Against CD34.Journal of the American College ofCardiology，2005，45(10)1574-1579.包被CD34抗體支架捕獲內皮祖細胞。)。
上述研究結果表明，盡管加速了支架內皮覆蓋并減少了支架內血栓的形成，但是抗再狹窄的效果沒有達到最初的設想，可能存在的原因包括(1)對EPC的分化特性還未徹底明確，CD34+的EPC可能不具有最佳的內皮分化潛能，甚至可能分化為平滑肌細胞而加重再狹窄。(2)CD34+抗體捕獲的特異性仍待提高，除EPCs外還有成熟的內皮細胞甚至是炎性細胞。盡管仍有許多亟待解決的問題，但是成體干細胞支架結合了干細胞和生物工程的技術，從獨特的角度防治再狹窄的發生，如果將其機制作深入研究并進一步在制作工藝上改進，那該支架將是繼藥物支架后冠心病防治的一項重要進展。
(三)、發明內容本發明的目的之一就是提供一種防治血管內再狹窄的成體干細胞血管內支架，它可以使支架表面迅速內皮化，減少對內皮的損傷，防治經皮冠狀動脈成形術(PTCA)后血管再狹窄或者血管內支架再狹窄，具有顯著的效果。
本發明的目的之二就是提供一種防治血管內再狹窄的成體干細胞血管內支架，它是在上述目的一的基礎上，可以使蛋白質涂層更加容易地均勻穩定地涂敷在金屬裸支架的外表面上。
本發明的目的之三就是相對上述目的一中的支架，提供一種防治血管內再狹窄的成體干細胞血管內支架的制備方法。
本發明的目的之四就是相對上述目的二中的支架，提供一種防治血管內再狹窄的成體干細胞血管內支架的制備方法。
本發明的目的之一是通過這樣的技術方案實現的，它包括有金屬裸支架，其特征在于在金屬裸支架的外表面設置一層促成體干細胞粘附、增殖和定向分化為內皮細胞的蛋白質涂層。
將本發明所述的支架，直接植入患者血管病變處，或者體外培養患者的成體干細胞，由于金屬裸支架的外表面設置有蛋白質涂層，因此，能夠特異性粘附成體干細胞，促進干細胞的增殖和促進干細胞的定向分化，從而使支架表面迅速內皮化，減少對內皮的損傷，防治經皮冠狀動脈成形術(PTCA)后血管再狹窄或者血管內支架再狹窄。所述的蛋白質涂層包括有抗體、細胞因子、多肽、他汀類藥物和雌激素中的一種、或幾種、或者全部。其中抗體是由CD133抗體、CD34抗體及CD14抗體中的一個、或者二個、或者全部構成，其作用是為了特異性粘附成體干細胞；細胞因子是由VEGF因子、bFGF因子及TGF因子中的一個、或者二個、或者全部構成，促進干細胞的分化；多肽即是環狀Arg-Gly-Asp多肽，與他汀類藥物和雌激素作用相同，促進干細胞的增殖。
本發明的目的之二是通過這樣的技術方案實現的，在上述目的一的基礎上，在金屬裸支架的外表面與蛋白質涂層之間設置有便于涂敷蛋白質涂層的聚合物涂層。
由于蛋白質與金屬表面的親和性差，因此，容易導致蛋白質涂層不均勻，穩定性差，極容易從金屬表面脫落。為了解決這個問題，充分利用聚合物既具有與金屬表面結合性強又具有與蛋白質的親和性高的特點，在金屬裸支架的外表面先涂敷一層聚合物，后涂敷蛋白質涂層，這樣不僅能夠使蛋白質涂層分布均勻、穩定性強，而且保證了蛋白質涂層與金屬之間的結合可靠性，從而防止了蛋白質的脫落。所述的聚合物涂層包括有聚合物材料和溶劑，其中，聚合物材料是由聚乳酸、聚四氟乙烯、明膠、高密度聚乙烯、聚氨基甲酸乙酯和聚對苯二甲酸乙酯中的任意一種、或者是其中的二種、或者是其中多種組成；溶劑是丙酮或四氫呋喃。作用是為了使蛋白質涂層更容易地涂敷，維持蛋白質涂層的均勻性和穩定性。
上述目的一的支架的制備方法是先配制促成體干細胞粘附、增殖和定向分化為內皮細胞的蛋白質溶液；然后，將經消毒處理后的金屬裸支架浸泡于蛋白質溶液中，或者將蛋白質溶液以噴涂的方式涂敷于金屬裸支架的外表面上，以制成帶蛋白質涂層的血管內支架；所述蛋白質溶液是按如下方法配制的蛋白質溶液包括有抗體和細胞因子，將抗體和細胞因子分別與PBS緩沖液混合后，再混合在一起制成溶液，或者將抗體和細胞因子一起與PBS緩沖液混合后，制成溶液，即為蛋白質溶液；其中，所述的抗體是由CD133抗體、CD34抗體及CD14抗體中的一個、或者二個、或者全部構成；所述的細胞因子是由VEGF因子、bFGF因子及TGF因子中的一個、或者二個、或者全部構成；抗體與細胞因子的最終濃度比(3～6)∶(2～3)。
蛋白質涂層包括有抗體層、多肽層和細胞因子層，它是按照如下的順序設置在金屬裸支架的外表面的將抗體層、多肽層和細胞因子層隨意地進行組合排列，以構成一個基本單元，將多個這樣的基本單元均勻地分布在金屬裸支架的外表面上，有利于成體干細胞的粘附、增殖和定向分化。該方法的實施有利于在金屬裸支架的外表面設置一層促成體干細胞粘附、增殖和定向分化為內皮細胞的蛋白質涂層，增加干細胞的特異性和保證了定向分化為內皮細胞的能力及內皮分化潛能。
上述目的二的支架的制備方法是按如下步驟進行的(1)、配制便于涂敷蛋白質涂層的聚合物溶液；所述的聚合物溶液包括有聚合物材料和溶劑，其中，聚合物材料是由聚乳酸、聚四氟乙烯、明膠、高密度聚乙烯、聚氨基甲酸乙酯和聚對苯二甲酸乙酯中的任意一種、或者是其中的二種、或者是其中多種組成；溶劑是丙酮或四氫呋喃；聚合物溶液是這樣制備的在室溫20℃-40℃，利用磁力攪拌儀進行攪拌，時間至少15分鐘，充分混合，制備濃度為1mg/ml-5mg/ml的聚合物材料溶液；(2)、將經消毒處理后的金屬裸支架浸泡于聚合物溶液中，或者將聚合物溶液以噴涂的方式涂敷于金屬裸支架的外表面上，以制成聚合物涂層；
(3)、配制促成體干細胞粘附、增殖和定向分化為內皮細胞的蛋白質溶液；所述的蛋白質溶液是按如下方法配制的蛋白質溶液包括有抗體和細胞因子，將抗體和細胞因子分別與PBS緩沖液混合后，再混合在一起制成溶液，或者將抗體和細胞因子一起與PBS緩沖液混合后，制成溶液，即為蛋白質溶液；其中，所述的抗體是由CD133抗體、CD34抗體及CD14抗體中的一個、或者二個、或者全部構成；所述的細胞因子是由VEGF因子、bFGF因子及TGF因子中的一個、或者二個、或者全部構成；抗體與細胞因子的最終濃度比(3～6)∶(2～3)；(4)、將步驟(2)中得到的支架浸泡于蛋白質溶液中，或者將蛋白質溶液以噴涂的方式涂敷于聚合物涂層的外表面上，以制成蛋白質涂層，從而制成血管內支架。
于采用了上述技術方案，本發明具有如下的優點1.細胞來源于患者自體，不會產生異體免疫排斥反應，安全有保證。
2.支架表面迅速內皮化，減少對內皮的損傷。
3.避免聚合物誘導的炎癥反應，有效的降低血管內再狹窄。
4.特異抗體和誘導因子的選擇，增加干細胞的特異性和保證了定向分化為內皮細胞的能力及內皮分化潛能。
國內目前臨床應用藥物洗脫性支架主要是國外血管內支架產品，使得其價格居高不下。而在細胞支架領域，國內外還沒有正式商品上市。因此，通過本發明的開發和應用，可望能縮短我國和發達國家在心血管介入器械領域的差距，將為國產支架走向國際市場和在國內市場爭取相當的份額。
本發明的
如下圖1是本發明的外觀示意圖；圖2是圖1中A-A的第一種實施例的剖視圖；圖3是圖1中A-A的第二種實施例的剖視圖4是圖1中A-A的第三種實施例的剖視圖；圖5是圖4中B-B的第一種實施例的剖視圖；圖6是圖4中B-B的第二種實施例的剖視圖；圖中，1.金屬裸支架；2.蛋白質涂層；3.聚合物涂層；4.抗體層；5.多肽層；6.細胞因子層。
具體實施方式
下面結合附圖和實施例對本發明作進一步說明如圖1、2、3所示，本發明包括有金屬裸支架1，在金屬裸支架1的外表面設置一層促成體干細胞粘附、增殖和定向分化為內皮細胞的蛋白質涂層2。
將本發明所述的支架，直接植入患者血管病變處，或者體外培養患者的成體干細胞，由于金屬裸支架的外表面設置有蛋白質涂層，因此，能夠特異性粘附成體干細胞，促進干細胞的增殖和促進干細胞的定向分化，從而使支架表面迅速內皮化，減少對內皮的損傷，防治經皮冠狀動脈成形術(PTCA)后血管再狹窄或者血管內支架再狹窄。所述的蛋白質涂層包括有抗體、細胞因子、多肽、他汀類藥物和雌激素中的一種、或幾種、或者全部。其中抗體是由CD133抗體、CD34抗體及CD14抗體中的一個、或者二個、或者全部構成，其作用是為了特異性粘附成體干細胞；細胞因子是由VEGF因子、bFGF因子及TGF因子中的一個、或者二個、或者全部構成，促進干細胞的分化；多肽即是環狀Arg-Gly-Asp多肽，與他汀類藥物和雌激素作用相同，促進干細胞的增殖。
如圖1、4所示，在金屬裸支架1的外表面與蛋白質涂層2之間可以設置有便于涂敷蛋白質涂層的聚合物涂層3。
由于蛋白質與金屬表面的親和性差，因此，容易導致蛋白質涂層不均勻，穩定性差，極容易從金屬表面脫落。為了解決這個問題，充分利用聚合物既具有與金屬表面結合性強又具有與蛋白質的親和性高的特點，在金屬裸支架的外表面先涂敷一層聚合物，后涂敷蛋白質涂層，這樣不僅能夠使蛋白質涂層分布均勻、穩定性強，而且保證了蛋白質涂層與金屬之間的結合可靠性，從而防止了蛋白質的脫落。所述的聚合物涂層包括有聚合物材料和溶劑，其中，聚合物材料是由聚乳酸、聚四氟乙烯、明膠、高密度聚乙烯、聚氨基甲酸乙酯和聚對苯二甲酸乙酯中的任意一種、或者是其中的二種、或者是其中多種組成；溶劑是丙酮或四氫呋喃。作用是為了使蛋白質涂層更容易地涂敷，維持蛋白質涂層的均勻性和穩定性。
如圖1、2、3、4、5、6所示，上述的蛋白質涂層2包括有抗體層4、多肽層5和細胞因子層6，它是按照如下的順序設置在金屬裸支架1的外表面的將抗體層4、多肽層5和細胞因子層6隨意地進行組合排列，以構成一個基本單元，將多個這樣的基本單元均勻地分布在金屬裸支架1的外表面上。
如圖2所示，蛋白質涂層可以是組成的所有物質混合均勻后，呈均勻分布的整層。
如圖3所示，蛋白質涂層也可以是由抗體層4、多肽層5和細胞因子層6構成，它們以縱向的形式進行組合排列，以構成一個基本單元，將多個這樣的基本單元均勻地分布在金屬裸支架1的外表面上。
結合圖4、5可知，蛋白質涂層可以是組成的所有物質混合均勻后，呈均勻分布的整層。
結合圖4、6可知，蛋白質涂層也可以是由抗體層4、多肽層5和細胞因子層6構成，它們以橫向的形式進行組合排列，以構成一個基本單元，將多個這樣的基本單元均勻地分布在金屬裸支架1的外表面上。
聚合物涂層3的厚度是1μm～500μm；最佳厚度是10μm～100μm。蛋白質涂層2的厚度是1μm～500μm；最佳厚度是10μm～100μm上述支架的制備方法可以是先配制促成體干細胞粘附、增殖和定向分化為內皮細胞的蛋白質溶液；然后，將經消毒處理后的金屬裸支架浸泡于蛋白質溶液中，或者將蛋白質溶液以噴涂的方式涂敷于金屬裸支架的外表面上，以制成帶蛋白質涂層的血管內支架；所述蛋白質溶液是按如下方法配制的蛋白質溶液包括有抗體和細胞因子，將抗體和細胞因子分別與PBS緩沖液混合后，再混合在一起制成溶液，或者將抗體和細胞因子一起與PBS緩沖液混合后，制成溶液，即為蛋白質溶液；其中，所述的抗體是由CD133抗體、CD34抗體及CD14抗體中的一個、或者二個、或者全部構成；所述的細胞因子是由VEGF因子、bFGF因子及TGF因子中的一個、或者二個、或者全部構成；抗體與細胞因子的最終濃度比(3～6)∶(2～3)。
蛋白質涂層包括有抗體層、多肽層和細胞因子層，它是按照如下的順序設置在金屬裸支架的外表面的將抗體層、多肽層和細胞因子層隨意地進行組合排列，以構成一個基本單元，將多個這樣的基本單元均勻地分布在金屬裸支架的外表面上，有利于成體干細胞的粘附、增殖和定向分化。該方法的實施有利于在金屬裸支架的外表面設置一層促成體干細胞粘附、增殖和定向分化為內皮細胞的蛋白質涂層，增加干細胞的特異性和保證了定向分化為內皮細胞的能力及內皮分化潛能。
上述支架的制備方法也可以是按如下步驟進行的(1)、配制便于涂敷蛋白質涂層的聚合物溶液；所述的聚合物溶液包括有聚合物材料和溶劑，其中，聚合物材料是由聚乳酸、聚四氟乙烯、明膠、高密度聚乙烯、聚氨基甲酸乙酯和聚對苯二甲酸乙酯中的任意一種、或者是其中的二種、或者是其中多種組成；溶劑是丙酮或四氫呋喃；聚合物溶液是這樣制備的在室溫20℃-40℃，利用磁力攪拌儀進行攪拌，時間至少15分鐘，充分混合，制備濃度為1mg/ml-5mg/ml的聚合物材料溶液；(2)、將經消毒處理后的金屬裸支架浸泡于聚合物溶液中，或者將聚合物溶液以噴涂的方式涂敷于金屬裸支架的外表面上，以制成聚合物涂層；(3)、配制促成體干細胞粘附、增殖和定向分化為內皮細胞的蛋白質溶液；所述的蛋白質溶液是按如下方法配制的蛋白質溶液包括有抗體和細胞因子，將抗體和細胞因子分別與PBS緩沖液混合后，再混合在一起制成溶液，或者將抗體和細胞因子一起與PBS緩沖液混合后，制成溶液，即為蛋白質溶液；其中，所述的抗體是由CD133抗體、CD34抗體及CD14抗體中的一個、或者二個、或者全部構成；所述的細胞因子是由VEGF因子、bFGF因子及TGF因子中的一個、或者二個、或者全部構成；抗體與細胞因子的最終濃度比(3～6)∶(2～3)；
(4)、將步驟(2)中得到的支架浸泡于蛋白質溶液中，或者將蛋白質溶液以噴涂的方式涂敷于聚合物涂層的外表面上，以制成蛋白質涂層，從而制成血管內支架。
上述方法中，蛋白質溶液還包括有環狀Arg-Gly-Asp多肽；抗體、環狀Arg-Gly-Asp多肽、細胞因子的最終濃度比(3～6)∶(1～3)∶(2～3)。
上述方法中，蛋白質涂層還包括有他汀類藥物或/和雌激素；抗體、他汀類藥物或/和雌激素、細胞因子的最終濃度比(3～6)∶(1～3)∶(2～3)。
上述方法中，蛋白質涂層還包括有環狀Arg-Gly-Asp多肽；抗體、環狀Arg-Gly-Asp多肽、他汀類藥物或/和雌激素、細胞因子的最終濃度比(3～6)∶(1～3)∶(1～3)∶(2～3)。
實施例1(1)選用材料316L型不銹鋼支架，依次在乙醇、丙酮、蒸餾水中超聲清洗5分鐘，然后在真空干燥箱中干燥60分鐘，干燥溫度為45度，最后利用紫外燈照射30分鐘進行消毒；(2)配制涂層材料，聚合物基質材料為聚乳酸和聚氟乙烯(1∶1)，溶劑為丙酮，聚合物在其溶劑中濃度為2毫克/毫升，在25度室溫下，利用磁力攪拌儀攪拌30分鐘，混合均勻；(3)超聲霧化噴涂制備聚合物涂層，將制好的聚合物基質材料溶液加入噴涂裝置的容液瓶，通過噴涂裝置在支架表面形成均勻的藥物涂層，噴涂時間為1分鐘，在無菌室里操作，最后涂層厚度是20μm；(4)將涂層置于真空干燥箱里，干燥時間24小時，干燥溫度40度；(5)將CD133抗體、環狀Arg-Gly-Asp多肽和VEGF因子三類藥物溶液混合(2∶1∶1)，步驟(4)制備好的支架放入該混合溶液(3-5ml)中，浸泡10min，烘干，相同操作三次，真空干燥，在聚合物層表面形成蛋白質層，厚度是20μm；(6)低溫保存，零下40度，備用。
實施例2(1)選用材料NiTi合金支架，依次在乙醇、丙酮、蒸餾水中超聲清洗5分鐘，然后在真空干燥箱中干燥60分鐘，干燥溫度為45度，最后利用紫外燈照射30分鐘進行消毒；(2)配制涂層材料，聚合物基質材料為高密度聚乙烯和明膠(1∶1)，溶劑為丙酮，聚合物在其溶劑中濃度為3毫克/毫升，在30度溫度下，利用磁力攪拌儀攪拌30分鐘，混合均勻；(3)將裸支架放入步驟(2)制備的聚合物涂層溶液中，浸泡10min，烘干，如此反復三次，形成聚合物涂層，厚度為30μm；(4)將CD34抗體、他汀類藥物和TGF因子三類藥物溶液混合(2∶1∶1)，步驟(4)制備好的支架放入該混合溶液(3-5ml)中，浸泡10min，烘干，相同操作三次，真空干燥，最后的涂層厚度是30μm；(5)低溫保存，零下30度，備用。
實施例3(1)選用不銹鋼支架，依次在乙醇、丙酮、蒸餾水中超聲清洗5分鐘，然后在真空干燥箱中干燥60分鐘，干燥溫度為45度，最后利用紫外燈照射30分鐘進行消毒；(2)配制涂層材料，聚合物基質材料為聚乳酸和聚氨基甲酸乙酯(2∶1)，溶劑為丙酮，聚合物在其溶劑中濃度為4毫克/毫升，在35度溫度下，利用磁力攪拌儀攪拌60分鐘，混合均勻；(3)超聲霧化噴涂制備藥物涂層，將制好的聚合物基質材料溶液加入噴涂裝置的容液瓶，通過噴涂裝置，在支架表面形成均勻的藥物涂層，涂層厚度是20μm；(4)分別制備A、B和C三類混合溶液，其中A類溶液CD133抗體∶CD34抗體∶CD14抗體為1∶1∶1，B類溶液環狀Arg-Gly-Asp多肽∶他汀類藥物∶雌激素為1∶1∶1，C類溶液VEGF因子∶bFGF因子∶TGF因子為1∶1∶1。通過噴涂技術，在步驟(2)制備好的支架上分別涂三類混合溶液的條帶，每條帶寬0.1-0.5mm，厚度是25μm，最后真空干燥；
(5)從病人外周血中分離純化內皮祖細胞，體外擴增，細胞密度達到106，接種細胞到步驟(4)制備好的滅菌的支架上，培養3-4d，細胞完全覆蓋支架表面。
(6)將制備好的干細胞支架，放入儲存液中(培養液∶血清∶甘油＝7∶2∶1)，然后置于液氮罐中保存，備用。
權利要求
1.一種防治血管內再狹窄的成體干細胞血管內支架，包括有金屬裸支架(1)，其特征在于在金屬裸支架(1)的外表面設置一層促成體干細胞粘附、增殖和定向分化為內皮細胞的蛋白質涂層(2)。
2.如權利要求1所述的防治血管內再狹窄的成體干細胞血管內支架，其特征在于在金屬裸支架(1)的外表面與蛋白質涂層(2)之間設置有便于涂敷蛋白質涂層的聚合物涂層(3)。
3.如權利要求1或2所述的防治血管內再狹窄的成體干細胞血管內支架，其特征在于蛋白質涂層(2)包括有抗體層(4)、多肽層(5)和細胞因子層(6)，它是按照如下的順序設置在金屬裸支架(1)的外表面的將抗體層(4)、多肽層(5)和細胞因子層(6)隨意地進行組合排列，以構成一個基本單元，將多個這樣的基本單元均勻地分布在金屬裸支架(1)的外表面上。
4.如權利要求2所述的防治血管內再狹窄的成體干細胞血管內支架，其特征在于聚合物涂層(3)的厚度是1μm～500μm。
5.如權利要求1、2、3或4所述的防治血管內再狹窄的成體干細胞血管內支架，其特征在于蛋白質涂層(2)的厚度是1μm～500μm。
6.如權利要求1所述的防治血管內再狹窄的成體干細胞血管內支架的制備方法，它是先配制促成體干細胞粘附、增殖和定向分化為內皮細胞的蛋白質溶液；然后，將經消毒處理后的金屬裸支架浸泡于蛋白質溶液中，或者將蛋白質溶液以噴涂的方式涂敷于金屬裸支架的外表面上，以制成帶蛋白質涂層的血管內支架；所述蛋白質溶液是按如下方法配制的蛋白質溶液包括有抗體和細胞因子，將抗體和細胞因子分別與PBS緩沖液混合后，再混合在一起制成溶液，或者將抗體和細胞因子一起與PBS緩沖液混合后，制成溶液，即為蛋白質溶液；其中，所述的抗體是由CD133抗體、CD34抗體及CD14抗體中的一個、或者二個、或者全部構成；所述的細胞因子是由VEGF因子、bFGF因子及TGF因子中的一個、或者二個、或者全部構成；抗體與細胞因子的最終濃度比(3～6)∶(2～3)。
7.如權利要求2所述的防治血管內再狹窄的成體干細胞血管內支架的制備方法，它是按如下步驟進行的(1)、配制便于涂敷蛋白質涂層的聚合物溶液；所述的聚合物溶液包括有聚合物材料和溶劑，其中，聚合物材料是由聚乳酸、聚四氟乙烯、明膠、高密度聚乙烯、聚氨基甲酸乙酯和聚對苯二甲酸乙酯中的任意一種、或者是其中的二種、或者是其中多種組成；溶劑是丙酮或四氫呋喃；聚合物溶液是這樣制備的在室溫20℃-40℃，利用磁力攪拌儀進行攪拌，時間至少15分鐘，充分混合，制備濃度為1mg/ml一5mg/ml的聚合物材料溶液；(2)、將經消毒處理后的金屬裸支架浸泡于聚合物溶液中，或者將聚合物溶液以噴涂的方式涂敷于金屬裸支架的外表面上，以制成聚合物涂層；(3)、配制促成體干細胞粘附、增殖和定向分化為內皮細胞的蛋白質溶液；所述的蛋白質溶液是按如下方法配制的蛋白質溶液包括有抗體和細胞因子，將抗體和細胞因子分別與PBS緩沖液混合后，再混合在一起制成溶液，或者將抗體和細胞因子一起與PBS緩沖液混合后，制成溶液，即為蛋白質溶液；其中，所述的抗體是由CD133抗體、CD34抗體及CD14抗體中的一個、或者二個、或者全部構成；所述的細胞因子是由VEGF因子、bFGF因子及TGF因子中的一個、或者二個、或者全部構成；抗體與細胞因子的最終濃度比(3～6)∶(2～3)；(4)、將步驟(2)中得到的支架浸泡于蛋白質溶液中，或者將蛋白質溶液以噴涂的方式涂敷于聚合物涂層的外表面上，以制成蛋白質涂層，從而制成血管內支架。
8.如權利要求6或7所述的防治血管內再狹窄的成體干細胞血管內支架的制備方法，其特征在于蛋白質溶液還包括有環狀Arg-Gly-Asp多肽；抗體、環狀Arg-Gly-Asp多肽、細胞因子的最終濃度比(3～6)∶(1～3)∶(2～3)。
9.如權利要求6或7所述的防治血管內再狹窄的成體干細胞血管內支架的制備方法，其特征在于蛋白質涂層還包括有他汀類藥物或/和雌激素；抗體、他汀類藥物或/和雌激素、細胞因子的最終濃度比(3～6)∶(1～3)∶(2～3)。
10.如權利要求9所述的防治血管內再狹窄的成體干細胞血管內支架的制備方法，其特征在于蛋白質涂層還包括有環狀Arg-Gly-Asp多肽；抗體、環狀Arg-Gly-Asp多肽、他汀類藥物或/和雌激素、細胞因子的最終濃度比(3～6)∶(1～3)∶(1～3)∶(2～3)。
全文摘要
一種防治血管內再狹窄的成體干細胞血管內支架及其制備方法，包括有金屬裸支架，以及在金屬裸支架的外表面設置一層促成體干細胞粘附、增殖和定向分化為內皮細胞的蛋白質涂層。在金屬裸支架的外表面與蛋白質涂層之間可以設置有便于涂敷蛋白質涂層的聚合物涂層。蛋白質涂層包括有抗體層、多肽/藥物層和細胞因子層；本發明可以使支架表面迅速內皮化，減少對內皮的損傷，防治經皮冠狀動脈成形術(PTCA)后血管再狹窄或者血管內支架再狹窄。
文檔編號A61L31/12GK101020087SQ20061009535
公開日2007年8月22日 申請日期2006年12月26日 優先權日2006年12月26日
發明者王貴學, 肖麗 申請人:重慶大學