專利名稱：Poloxamer化胸腺肽α1長效溫度敏感凝膠的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種Poloxamer化胸腺肽α1長效溫度敏感凝膠及其制備方法，其特征在于該凝膠由Poloxamer化胸腺肽α1和溫度敏感凝膠組成。
背景技術：
胸腺肽α1(又名胸腺素)是胸腺組織分泌的具有生理活性的一組乙酰化的多肽，有如下的氨基酸組合Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH，分子量是3108，PI是3.8。可使由骨髓產生的干細胞轉變成T細胞，有增強細胞免疫功能的作用。其作用可能是①能連續誘導T細胞分化發育的各個階段。②具有調節機體的免疫平衡的作用。③能增強成熟T細胞對抗原或其他刺激的反應。胸腺肽α1用于胸腺發育不全綜合征、運動失調性毛細血管擴張癥、慢性皮膚黏膜真菌病等免疫缺陷病。對全身性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎等自身免疫性疾病有一定療效。在用于治療復發性口瘡、麻風、重癥感染、慢性腎炎等伴有細胞免疫功能低下的患者時，發現對麻風和重癥感染的效果最為滿意，對病毒性肝炎、惡性腫瘤、某些眼病也有一定療效。
市場上的胸腺肽α1產品主要有片劑、膠囊、注射液和注射用凍干粉針，但口服胸腺肽α1，在胃腸道易受到酶作用而失活，導致療效不理想；注射制劑能夠快速起效，但半衰期短，而胸腺肽的治療需要較長周期，需要頻繁注射給藥，增加了用藥的不便和病人的痛苦。
在體凝膠是指以溶液狀態給藥后，在給藥部位迅速發生相轉變，形成半固體凝膠的一類液體制劑。根據凝膠化機制，在體凝膠可分為溫度敏感型、離子敏感型和pH敏感型等。溫度敏感型在體凝膠，亦稱溫敏在體凝膠，其凝膠化機制是通過環境溫度的變化而形成在體凝膠，該系統一般含有溫度敏感的高分子聚合物，給藥后聚合物溶液因體內外溫度的變化而形成非化學交聯的凝膠。應用于在體凝膠的幾種溫敏高分子聚合物主要包括N-異丙基丙烯酰胺類聚合物、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物、聚氧乙烯-聚乳酸羥基乙酸共聚物和多糖類衍生物等。
Poloxamer修飾是20世紀70年代后期逐漸發展起來的一項技術，它可以解決多肽和蛋白質類藥物在臨床應用過程中存在的諸多問題。多肽經Poloxamer修飾后不僅可較好地保留其生物活性，而且還增加了穩定性，顯著延長體內半衰期。與原型藥物相比，其優勢在于1)延長半衰期；2)提高溶解性；3)減小免疫原性；4)血藥濃度波動較小；5)減少用藥頻率，提高病人順應性，降低治療費用等。
泊洛沙姆(Poloxamer)是一種聚氧乙烯與聚氧丙烯嵌段共聚物，根據組成不同具有不同的類型，如F68是一種含81％聚乙二醇和19％丙二醇的嵌段共聚物，其平均分子量為8600；F127由聚氧乙烯與聚氧丙烯以7∶3的比例構成分子量為11500的高分子化合物。泊洛沙姆(Poloxamer)物理化學性質穩定，可因表面活性劑形成膠團增加多種難溶性藥物的表觀溶解度，用作增溶劑。
采用泊洛沙姆(Poloxamer)對蛋白質進行結構修飾具有聚乙二醇修飾所不及的優點，如根據Poloxamer分子結構中聚氧乙烯與聚氧丙烯的不同聚合度可具有更多的結構組成和比例，能夠滿足藥物不同釋放行為的需要。
在此情況下，如能將胸腺肽α1制備成溫度敏感型緩釋凝膠制劑，一次皮下注射給藥可緩慢釋藥，維持數周或數月的藥效，必然能夠減輕病人的痛苦，增加臨床使用的順應性。而胸腺肽α1為蛋白質多肽類藥物，遇酸、堿、熱、酶等容易失活，并且其水溶解性不夠理想，因此擬將胸腺肽α1進行Poloxamer化修飾改性，以增強其穩定性和水溶性。
發明內容
鑒于胸腺肽α1制劑在臨床應用的上述問題，結合胸腺肽α1的物理化學性質，本發明將其制成新型溫度敏感型緩釋凝膠制劑，采用蛋白質多肽的Poloxamer修飾技術和溫度敏感凝膠化技術，首先將胸腺肽α1以Poloxamer進行修飾以增加水溶性和穩定性，然后以生物可降解高分子材料包被，制成皮下注射的長效緩釋溫度敏感凝膠。該制劑用于皮下注射，可立即形成半固體的凝膠，滯留于注射部位，隨著時間延長和生物可降解材料的降解，緩慢釋放藥物，從而發揮藥理藥效。本制劑可精確定位注射，緩慢靶向釋放，在機體內長期起效，適用于大量長期使用的藥物給藥系統。Poloxamer化胸腺肽α1長效溫度敏感凝膠具有載藥量大、定位靶向釋藥、安全性及穩定性好、用藥方便、病人順應性好等特點，具有重要的理論意義與實際應用價值。在研究該產品的同時，解決蛋白質多肽類藥物凝膠制劑的關鍵技術，積累新型凝膠給藥系統新產品的開發經驗，豐富藥物劑型新品種，為凝膠給藥制劑的工業化生產奠定基礎，為形成新型凝膠給藥系統的技術平臺奠定基礎，從而推動蛋白質多肽類藥物的產業化進程。
胸腺肽α1的結構中含有5個氨基，包括1個N端氨基和4個賴氨酸側鏈氨基，本發明的Poloxamer化修飾正是建立在活化的Poloxamer與N端氨基上的麥克爾加成反應，通過Poloxamer的空間位阻并控制反應的溫度、時間、溶劑、催化劑等參數，該反應可專一性地發生在N端氨基上。
該反應基本方法如下首先是Poloxamer的活化，制備可用于胸腺肽α1修飾的活化Poloxamer分子，包括Poloxamer-醛(Poloxamer-aldehyde)、Poloxamer-三氟乙磺酸(tresylated-Poloxamer)、Poloxamer-環氧化物(Poloxamer-epoxide)等，然后再按照一定摩爾比與胸腺肽α1混合，于37℃攪拌(300r/min)反應45min，制備得到不同修飾率的Poloxamer化的胸腺肽α1。以超濾法(切割分子量20000)的超濾膜于4℃的PBS液中透析1h，10％甘油-PBS透析2h即得。
Poloxamer化胸腺肽α1長效溫度敏感凝膠的制備工藝研究主要涉及載藥基質、成型工藝等方面。
溫度敏感性材料選擇生物可降解材料如聚異丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)、聚(氧化乙烯-氧化丙烯-氧化乙烯)體系(PEO-PPO-PEO)、聚乙二醇-聚(D，L-乳酸-co-乙醇酸)(PEG-PLGA)共聚物體系、PLGA-PEG-PLGA，PEG-PLGA、PEG-PLGA-PEG、PEG-PLGA-PEG接枝聚合物等。
為保持蛋白質多肽類藥物的穩定性和活性，通常在凝膠制劑中加入適當的穩定劑，穩定劑可以選擇蔗糖、乳糖、甘露醇、海藻酸鈉以及低分子右旋糖苷中的一種或一種以上。
實施例一聚丙交酯-乙交酯-聚乙二醇嵌段共聚物(PLGA-PEG-PLGA)作為載體材料制備注射用Poloxamer修飾的胸腺肽α1敏感型緩釋凝膠制劑。
制備方法是取聚合物適量(比例關系需要考察，如10％，15％，20％，25％，30％等)置于容器中，加注射用水攪拌溶解。另取處方量的Poloxamer修飾的胸腺肽α1，與聚合物水溶液混勻，待溶解后微孔濾膜過濾即得。
實施例二聚(氧化乙烯-氧化丙烯-氧化乙烯)體系(PEO-PPO-PEO)作為載體材料制備注射用Poloxamer修飾的胸腺肽α1敏感型緩釋凝膠制劑。
制備方法是取聚合物適量(比例關系需要考察，如10％，15％，20％，25％，30％等)置于容器中，加注射用水攪拌溶解。另取處方量的Poloxamer修飾的胸腺肽α1，與聚合物水溶液混勻，待溶解后微孔濾膜過濾即得。
實施例三聚乙二醇-聚(D，L-乳酸-co-乙醇酸)(PEG-PLGA)作為載體材料制備注射用Poloxamer修飾的胸腺肽α1敏感型緩釋凝膠制劑。
制備方法是取聚合物適量(比例關系需要考察，如10％，15％，20％，25％，30％等)置于容器中，加注射用水攪拌溶解。另取處方量的Poloxamer修飾的胸腺肽α1，與聚合物水溶液混勻，待溶解后微孔濾膜過濾即得。
實施例四PEG-PLGA-PEG接枝聚合物作為載體材料制備注射用Poloxamer修飾的胸腺肽α1敏感型緩釋凝膠制劑。
制備方法是取聚合物適量(比例關系需要考察，如10％，15％，20％，25％，30％等)置于容器中，加注射用水攪拌溶解。另取處方量的Poloxamer修飾的胸腺肽α1，與聚合物水溶液混勻，待溶解后微孔濾膜過濾即得。
體外釋放實驗1、Poloxamer修飾的胸腺肽α1敏感型緩釋凝膠制劑的制備取PLGA-POLOXAMER-PLGA共聚物適量，加入10mM的磷酸鹽緩沖液(pH4.6)磁力攪拌下溶解。取Poloxamer修飾的胸腺肽α1溶液(50mg/ml)適量與共聚物溶液混合，共聚物溶液的濃度為20％(w/w)。
2、Poloxamer修飾的胸腺肽α1敏感型緩釋凝膠制劑的體外釋放實驗取載藥共聚物溶液0.4ml置于玻璃試管中，然后將試管放入溶出儀中，水浴溫度為37℃。待溶液完全形成凝膠后，加入3ml釋放介質(含有0.02％NaN3和0.5％肝素的pH 4.6磷酸鹽緩沖液)，轉速為20rpm，釋放面積為0.50cm2。在預定的時間取出全部溶出介質，同時加入同體積新鮮的釋放介質以保證漏槽條件。釋放介質中的藥物濃度稀釋后采用ELISA試劑盒進行測定，以累積藥物釋放量對時間作圖，得到釋放曲線。
3、體外釋放結果Poloxamer修飾的胸腺肽α1敏感型緩釋凝膠制劑的釋放曲線如下圖所示。胸腺肽α1的釋放量隨時間的升高而逐漸升高，在第20d的累積釋放百分數為73％。
本文采用的PLGA-POLOXAMER-PLGA共聚物制備的Poloxamer修飾的胸腺肽α1敏感型緩釋凝膠制劑，在體外獲得了較好的緩釋效果，以比較均勻的速率持續釋放20d左右，累積釋放百分數超過60％，并且沒有明顯的突釋現象，具體見說明書附
圖1Poloxamer修飾的胸腺肽α1敏感型緩釋凝膠制劑的釋放曲線。
權利要求
1.一種Poloxamer化胸腺肽α1長效溫度敏感凝膠及其制備方法，其特征在于該凝膠由Poloxamer化胸腺肽α1和溫度敏感凝膠組成。
2.根據權利要求1中的Poloxamer化胸腺肽α1，其特征在于活化的Poloxamer與N端氨基上的麥克爾加成反應實現胸腺肽α1的Poloxamer化修飾，該反應可專一性地發生在N端氨基上。
3.根據權利要求1中的溫度敏感凝膠，其特征在于選擇生物可降解的材料如聚異丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)、聚(氧化乙烯-氧化丙烯-氧化乙烯)體系(PEO-PPO-PEO)、聚乙二醇-聚(D，L-乳酸-co-乙醇酸)(PEG-PLGA)共聚物體系、PLGA-PEG-PLGA，PEG-PLGA、PEG-PLLA-PEG、PEG-PLGA-PEG接枝聚合物中的一種或一種以上。
4.根據權利要求2中的Poloxamer化胸腺肽α1，其制備方法如下首先將Poloxamer活化，制備可用于胸腺肽α1修飾的活化Poloxamer分子，包括Poloxamer-醛(Poloxamer-aldehyde)、Poloxamer-三氟乙磺酸(tresylated-Poloxamer、Poloxamer-環氧化物(Poloxamer-epoxide)等，然后再按照一定摩爾比與胸腺肽α1混合，于37℃攪拌(300r/min)反應45min，制備得到不同修飾率的Poloxamer化的胸腺肽α1；再通過超濾法(切割分子量20000)的超濾膜于4℃的PBS液中透析1h，10％甘油-PBS透析2h即得。
5.根據權利要求1中的溫度敏感凝膠，其特征在于還可以含有穩定劑，穩定劑可以選擇蔗糖、乳糖、甘露醇、海藻酸鈉以及低分子右旋糖苷中的一種或一種以上。
全文摘要
本發明公開了一種Poloxamer化胸腺肽α1長效溫度敏感凝膠及其制備方法，其特征在于該凝膠由Poloxamer化胸腺肽α1和溫度敏感凝膠組成。
文檔編號A61P37/00GK1903172SQ200610091009
公開日2007年1月31日 申請日期2006年7月10日 優先權日2006年7月10日
發明者張文芳, 仇峰 申請人:張文芳