專利名稱：一種增強免疫力的藥物組合物及制備方法
技術領域：
本發明涉及一種藥物組合物及其制備方法，特別涉及一種增強免疫力的藥物組合物及其制備方法。
背景技術：
眾所周知，腫瘤對人體的危害極大，目前西醫尚無十分有效的治療方法。祖國醫學對“腫瘤”的治療有豐富的經驗，積累了許多行之有效的驗方，本發明藥物組合物對人體具備較好的保健功能，有抗突變、免疫調節的作用。是通過提高免疫鞏固正氣來抵制邪氣以達到治療的目的，從而達到抑制腫瘤的效果。
發明內容
本發明的第一個目的在于公開一種藥物組合物；本發明的第二個目的在于公開一種增強免疫力的藥物組合物；本發明的第三個目的在于公開該藥物組合物的制備方法。
本藥物組合物的原料組成為靈芝20-50重量份、蜂膠10-40重量份、精氨酸10-40重量份、蛋氨酸5-25重量份、β-胡蘿卜素0.1-0.3重量份、富硒酵母1×10-6～10×10-6重量份。
本藥物組合物的原料組成優選為靈芝36重量份、蜂膠24重量份、精氨酸24重量份、蛋氨酸15.8重量份、β-胡蘿卜素0.2重量份、富硒酵母4×10-6重量份。
本藥物組合物的原料組成優選為靈芝25重量份、蜂膠35重量份、精氨酸15重量份、蛋氨酸20重量份、β-胡蘿卜素0.1重量份、富硒酵母2×10-6重量份。
本藥物組合物的原料組成優選為靈芝45重量份、蜂膠15重量份、精氨酸35重量份、蛋氨酸10重量份、β-胡蘿卜素0.3重量份、富硒酵母8×10-6重量份。
本發明所述的β-胡蘿卜素為β-胡蘿卜素粉10％，可通過市售取得，例如可購自但不限于北京嘉康源化工有限公司；富硒酵母中含硒量為1000PPM，可通過市售取得，例如可購自但不限于北京嘉康源化工有限公司。取上述組合物原料，加入常規輔料，按照常規工藝，制成臨床可接受的劑型，包括但不僅限于濃縮丸劑、膠囊劑、滴丸劑、顆粒劑、片劑、軟膠囊劑、緩釋劑、口服液體制劑或凍干粉針劑。
本發明所述的藥物組合物，貫徹了中醫學中扶正與驅邪雙重調節的思想在扶正方面，各組成成分都具有調節免疫的作用。從細胞水平、基因水平而言，靈芝、蜂膠、精氨酸等組成成分，都能有效的激活T淋巴細胞，巨噬細胞和NK細胞，刺激細胞免疫和體液免疫的應答，從而達到固護正氣的目的；驅邪方面則表現為多靶向、全方位、各階段的每一種成分所具有的抗腫瘤功效。靈芝的提高免疫力，使免疫細胞在早期就能夠將腫瘤殺死、吞噬；提高血小板纖維蛋白的形成能力，將腫瘤腫塊緊緊包裹，切斷其營養來源；蜂膠抗癌則體現在控制癌細胞增殖，防止正常細胞癌變和強化機體免疫；β-胡蘿卜素能消除那些具有高能量、高活性的自由基，減少致癌的危險，并且誘導腫瘤細胞的分化，降低其惡性程度和轉移能力；富硒酵母對不同部位都能起到全程、全方位、廣譜的預防癌癥的效果；精氨酸與蛋氨酸相配，可增加T細胞的有絲分裂，在腫瘤細胞內和外都能積極地殺傷腫瘤細胞。
經臨床實驗證實本發明所述的藥物組合物能夠有效地提高特異性和非特異性細胞免疫；有輔助抑制腫瘤的功效。
(1)動物實驗表明，本發明藥物組合物膠囊劑喂藥2周后，能增強小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬能力；促進小鼠網狀內皮系統的功能；加速碳粒的清除；顯著提高自然殺傷細胞的抗瘤活性；增強機體的非特異性細胞免疫功能。本發明藥物組合物膠囊劑可顯著增強小鼠遲發型超敏反應，表明本發明藥物組合物膠囊劑，對機體特異性細胞免疫功能也有顯著增強作用。在一定程度上，本發明藥物組合物膠囊劑能夠有效地提高特異性和非特異性細胞免疫。
(2)輔助抑制腫瘤的實驗中，發現本發明藥物組合物膠囊劑大劑量組與中劑量組都能顯著延長荷瘤小鼠的平均生存時間，兩次重復實驗中，中劑量組對小鼠生命延長率分別為45.9％和47.1％，均超過30％，且兩次重復試驗瘤重差異有統計學意義，且抑瘤率均超過30％，符合衛生部1999年公布的《抑制腫瘤作用評價和檢驗方法的規定》。本發明藥物組合物膠囊劑確有輔助抑制腫瘤的功效。
(3)本發明藥物組合物膠囊劑不僅可以有效延長小鼠生存時間，改善其生活質量，對于動物體內環境也有一定改變。在對荷瘤小鼠腫瘤表面MHC分子影響的定量檢測中，發現H22荷瘤小鼠灌服本發明藥物組合物膠囊劑后，大劑量組和中劑量組移植瘤表面的MHCI類抗原即H-2Kk分子的表達，與模型組相比，有顯著差異，并且大劑量組與模型組之間有極顯著差異；環磷酰胺組同模型組也有極顯著差異。這種改變與本發明藥物組合物膠囊劑的服用劑量呈正相關。
下述實驗和實施例用于進一步說明但不限于本發明。
實驗例1免疫功能調節作用的實驗研究實驗材料(1)實驗動物NIH小鼠，6～8周齡。雌性，體重(20±2)g，由中國藥品生物制品鑒定所提供。(2)藥品試劑本發明藥物組合物膠囊劑。
實驗方法(1)實驗分組NIH小鼠120只，隨機分為4組，即空白對照組，本發明藥物組合物膠囊劑大劑量組，中劑量組和小劑量組，每組小鼠30只。(2)給藥各組小鼠等體積灌胃0.2ml/天。根據下列公式給出小鼠給藥劑量dB＝dA×(KB/KA)；其中，dB為20g小鼠日給藥劑量(g/kg)，dA為正常成人日給藥劑量(g/kg)，K折算系數(KA0.11，KB1)SBX大劑量為3.0g·kg-1·d，SBX中劑量為1.0g·kg-1·d，SBX小劑量為0.3g·kg-1·d，對照組以生理鹽水灌胃，每日1次，連續2周。于實驗的第15天，每組分別取20只小鼠進行細胞免疫功能調節作用測試，其余10只動物于第15天起停止給予本發明藥物組合物膠囊劑，正常喂養第28天后進行細胞免疫功能測試。
實驗指標(1)NK細胞活性測定采用乳酸脫氫酶法。分別取靶細胞和效應細胞各100μl加入U型96孔培養板中。靶細胞自然釋放孔加靶細胞和培養液各100μl。各項均設復孔。于37度，5％CO2培養箱中培養4h后，將96孔培養板以1500r/min離心5min，吸取上清100μL置平底96孔培養板中，加入LDH基質液100μl，反應3min，每孔加入1mol/L的HCl30μl，在酶標儀490nm處測定光密度值，計算NK細胞活性。
(2)小鼠遲發型變態反應稱取DNFB50mg，按1∶1加入5ml丙酮麻油溶液，混勻。鼠腹部皮膚脫毛，范圍3cm×3cm。用DNFB溶液均勻致敏涂抹。5天后，再用DNFB溶液10μl在小鼠左耳(雙面)均勻涂抹進行攻擊。24h后頸椎脫臼處死小鼠，剪下左右耳殼，打孔器取直徑8mm的耳片，稱重備用。左右耳重量之差表示DTH的程度。
(3)小鼠碳廓清試驗將染料印度墨汁用生理鹽水稀釋5倍。按每10g體重0.1ml計算，小鼠尾靜脈注稀釋的印度墨汁。注入墨汁后2、10min分別從內眥靜脈叢取血20μl，加到2mlNa2CO3溶液中，用分光光度計在600nm波長處測吸光度值，以Na2CO3溶液作空白對照。處死小鼠，取臟器稱重。以吞噬指數表示小鼠碳廓清的能力。
(4)小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞試驗配制生理鹽水、雞紅細胞懸液。小鼠腹腔注射20％雞紅細胞懸液1ml。間隔30min后，頸椎脫臼處死動物。經腹腔注入生理鹽水2ml。吸出腹腔洗液1ml，平均滴于2片載破片上，保持37℃置30min，以生理鹽水漂洗除去末貼片細胞。丙酮甲醇溶液固定。體積比4％磷酸緩沖液染色3min。漂洗晾干。以吞噬百分率或吞噬指數表示小鼠巨噬細胞的吞噬能力。
(5)小鼠脾淋巴細胞轉化試驗無菌手術取脾，將脾撕碎，經200目篩網過濾，用Hank’s液洗滌3次，調整濃度為2×106個/ml。加入培養板中，每孔1ml，一孔加濃度為100μl/ml、50μlConA液，另一孔不加ConA作對照，置5％CO2，37℃培養72h。結束培養前4h，每孔吸去上清夜0.7ml，加入0.7mL不含小牛血清的RPMI 1640培養液，同時加入MTT(5g/L)50μl/孔，培養4h后，加入1ml異丙醇，完全溶解結晶后，分裝到96孔板中。每孔裝4孔作為平行樣，用酶聯免疫檢測儀，以570hm波長測定光密度值。用加ConA孔的光密度值減去不加ConA孔的光密度值代表淋巴細胞的增殖能力。
統計方法采用SPSS12.0統計軟件，實驗指標計量資料組間比較應用成組T檢驗，以P＜0.05為顯著性差異。
實驗結果(1)NK細胞活性測定實驗結果如表1所示，本發明藥物組合物膠囊劑喂飼小鼠2周后，大、中劑量組小鼠NK活性顯著高于空白對照組，P＜0.05喂藥4周后，該實驗結果與空白對照組比較無顯著性差異，P＞0.05。
表1本發明藥物組合物膠囊劑對小鼠脾臟自然殺傷細胞活性的影響
注*與對照組比較有顯著差異，P＜0.05(2)小鼠遲發型變態反應實驗結果如表2所示，本發明藥物組合物膠囊劑喂飼小鼠2周后，中、小劑量組遲發型變態反應顯著高于空白對照組，P＜0.05；喂藥4周后，該實驗結果與空白對照組比較無顯著性差異，P＞0.05。
表2本發明藥物組合物膠囊劑對小鼠遲發型變態反應的影響(mg，
)
注*與對照組比較有顯著差異，P＜0.05**與對照組比較有極顯著差異，P＜0.01
(3)小鼠碳廓清能力的影響實驗繩索果如表3所示，本發明藥物組合物膠囊劑喂飼小鼠2周后，小劑量組碳廓清能力反應顯著高于空白對照組，P＜0.05；喂藥4周后，該實驗結果與空白對照組比較無顯著性差異，P＞0.05。
表3本發明藥物組合物膠囊劑對小鼠碳廓清能力的影響(
)
注*與對照組比較有顯著差異，P＜0.05(4)小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞試驗實驗結果如表4所示，本發明藥物組合物膠囊劑喂飼小鼠2周后，大、中、小三個劑量組巨噬細胞吞噬能力顯著高于空白對照組，P＜0.05；喂藥4周后，該實驗結果與空白對照組比較無顯著性差異，P＞0.05。
表4本發明藥物組合物膠囊劑對小鼠巨噬細胞吞噬能力的影響(
)
注*與對照組比較有顯著差異，P＜0.05(5)小鼠脾淋巴細胞轉化試驗實驗結果如表5所示，本發明藥物組合物膠囊劑喂飼小鼠2周后，大、中、小三個劑量組脾淋巴細胞轉化能力顯著高于空白對照組，P＜0.05；喂藥4周后，該試驗結果與空白對照組比較無顯著性差異，P＞0.05。
表5本發明藥物組合物膠囊劑對小鼠脾淋巴細胞轉化實驗能力的影響(
)
注*與對照組比較有顯著差異，P＜0.05本實驗例1研究發現本發明藥物組合物膠囊劑喂藥2周后，能增強小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬能力.促進小鼠網狀內皮系統的功能；加速碳粒的清除；顯著提高自然殺傷細胞的抗瘤活性增強機體的非特異性細胞免疫功能。本發明藥物組合物膠囊劑可顯著增強小鼠遲發型超敏反應，表明本發明藥物組合物膠囊劑對機體特異性細胞免疫功能也有顯著增強作用。
實驗例2本發明藥物組合物膠囊劑對移植性S180肉瘤小鼠生命延長的實驗研究實驗材料(1)動物及瘤株健康昆明種小鼠，雌性，體重(16±2)g，二級，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。
小鼠S180肉瘤，經小鼠腹腔傳代保種，由廣安門中醫院腫瘤研究中心實驗室提供。
(2)藥品試劑本發明藥物組合物膠囊劑(簡寫為SBX)主要由靈芝、蜂膠、精氨酸、蛋氨酸、β-胡蘿卜素、富硒酵母等組成，由上海高能生物技術有限公司和太原市晉康源生物王程有限公司提供。陽性對照藥選用上海華聯制藥有限公司提供的的環磷酰胺(CTX)，200mg/支，生產批號040607。
(3)儀器離心機LD25-2北京醫用離心機實驗方法(1)動物分組健康昆明種小鼠50只，雌性，體重(16±2)g，適應性飼養三天后，稱重，隨機分為五組SBX膠囊大劑量組、SBX膠囊中劑量組、SBX膠囊小劑量組、陽性對照環磷酰胺組、模型對照組，每組10只。分籠飼養，自由攝食與飲水，室溫24-26℃。
(2)造模前給藥各組小鼠等體積灌胃0.2ml/天。根據下列公式給出小鼠給藥劑量dB＝dA×(KB/KA)；其中，dB為20g小鼠日給藥劑量(g/kg)，dA為正常成人日給藥劑量(g/kg)，K折算系數(KA0.11，KB1)SBX大劑量為3.0g·kg-1·d，SBX中劑量為1.0g·kg-1·d，SBX小劑量為0.3g·kg-1·d，環磷酰胺組和模型對照組灌胃生理鹽水。灌胃10天。
(3)造模腫瘤細胞懸液的制備S180腹水癌細胞在小鼠體內連續傳代后，抽取腹水，呈乳白色，無菌生理鹽水1000rm×5min，洗滌離心3次后，調細胞濃度2.0×106/ml，全程無菌操作，冰浴上進行。
腫瘤動物造模將細胞懸液注射至各組昆明種小鼠右腋皮下，制作腫瘤模型小鼠，每鼠注射0.2ml，至每只小鼠都有瘤塊長出，造模成功。
造模后給藥接種后第二天，環磷酰胺組小鼠灌胃CTX為30mg/kg·d。其余各組繼續灌胃給藥，劑量如前。灌胃7天后，停藥觀察動物存活天數，以平均存活時間計算生命延長率。該實驗重復2次。
實驗指標一般觀察觀察動物體重、進食量、飲水量、活動度、皮毛光澤度、始出現腫瘤時間、腫瘤生長速度和動物存活時間。
生命延長率計算方法為生命延長率(％)(治療組平均存活時間一陰性對照組平均存活時間)/陰性對照組平均存活時間×100％。
統計方法采用SPSS12.0統計軟件，實驗指標計量資料組間比較應用成組T檢驗，以P＜0.05為顯著性差異。
實驗結果(1)一般觀察模型對照組小鼠腫瘤出現早，生長迅速，局部腫脹，淋巴回流障礙，壓迫癥狀明顯，右前肢功能廢退。與對照組比較，本發明藥物組合物膠囊劑中劑量組小鼠飲食、毛發等正常，較活躍，腫瘤生長緩慢，局部壓迫癥狀不明顯。環磷酰胺組形體較中劑量組瘦小，有被毛脫落等現象，腫瘤生長也較緩慢。本發明藥物組合物膠囊劑大劑量組體重與腫瘤生長速度均較快，動物解剖時發現動物腹壁脂肪層較厚，小劑量組體重生長速度較均勻，腫瘤組織生長也較慢。
(2)生命延長率(Increase life Span，ILS)實驗結果如表6和7，SBX中劑量治療組的平均存活時間較對照組顯著延長，P＜0.01；生命延長率為45.9％，與陽性對照藥環磷酰胺治療組平均存活時間相比較，差異不顯著。
表6本發明藥物組合物膠囊劑對小鼠(S180)肉瘤ILS的影響(
)
注*與對照組比較有顯著差異，(P＜0.05)**與對照組比較有極顯著差異，(P＜0.01)表7本發明藥物組合物膠囊劑對小鼠(S180)肉瘤ILS的影響(
)
注*與對照組比較有非常顯著差異，(P＜0.05)**與對照組比較有極顯著差異，(P＜0.01)本實驗通過預防和治療給藥，觀察本發明藥物組合物膠囊劑對S180荷瘤小鼠生存率的影響，發現本發明藥物組合物膠囊劑大劑量組與中劑量組都能顯著延長荷瘤小鼠的平均生存時間，且兩次重復實驗中，中劑量組對小鼠生命延長率分別為45.9％和47.1％，均超過30％，符合衛生部1999年公布的《抑制腫瘤作用評價和檢驗方法的規定》。
實驗例3對H22肝癌小鼠移植瘤輔助抑制作用的實驗研究實驗材料
(1)動物及瘤株健康ICR小鼠，雌性，體重(16±2)g，二級，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。
小鼠H22肝腹水瘤，經小鼠腹腔傳代保種，由北京醫科大學提供。
(2)藥品試劑“本發明藥物組合物膠囊劑”(簡寫為SBX)主要由靈芝、蜂膠、精氨酸、蛋氨酸、β-胡蘿卜素、富硒酵母等組成，由上海高能生物技術有限公司和太原市晉康源生物工程有限公司提供。
陽性對照藥選用上海華聯制藥有限公司提供的的環磷酰胺(CTX)，200mg/支，生產批號040607實驗方法(1)動物分組健康ICR小鼠60只，雌性，體重(16±2)g，適應性飼養三天后，稱重，隨機分為六組SBX膠囊大劑量組、SBX膠囊中劑量組、SBX膠囊小劑量組、陽性對照環磷酰胺組、模型對照組、空白組每組10只。分籠飼養，自由攝食與飲水，室溫24-26℃。
(2)造模前給藥各組小鼠等體積灌胃0.2ml/天。根據下列公式給出小鼠給藥劑量dB＝dA×(KB/KA)；其中，dB為20g小鼠日給藥劑量(g/kg)，dA為正常成人日給藥劑量(g/kg)，K折算系數(KA0.11，KB1)SBX大劑量為3.0g.kg-1·d，SBX中劑量為1.0g·kg-1·d，SBX小劑量為0.3g。kg-1·d，環磷酰胺組、模型對照組以及空白組灌胃生理鹽水。灌胃10天。
(3)造模腫瘤細胞懸液的制備H一22腹水細胞在小鼠體內連續傳代后，抽取腹水，呈乳白色，無菌生理鹽水1000rm×5min，洗滌離心3次后，調細胞濃度2.0×106/ml，全程無菌操作，冰浴上進行。
腫瘤動物造模將細胞懸液注射至各組昆明種小鼠右腋皮下，制作腫瘤模型小鼠，每鼠注射0.2ml，至每只小鼠都有瘤塊長出，造模成功。
造模后給藥接種后第二天起，環磷酰胺組小鼠開始灌胃CTX為30mg/kg。d。其余各組繼續灌胃給藥，劑量如前。灌胃7天后，停藥觀察動物。12天時處死動物，剝離腫瘤、肝、睥及胸腺并稱重。
實驗指標(1)一般情況觀察主要觀察荷瘤小鼠進食量、活動、皮毛光澤。
(2)記錄小鼠體重的變化曲線每日記錄小鼠體重(3)抑瘤率計算方法抑瘤率＝1-治療組腫瘤重量/對照組腫瘤重量(4)臟器/體重比值測定取脾臟和胸腺，去盡筋膜，用濾紙吸干臟器表面血污，稱重，計算脾臟/體重比值和胸腺/體重比值。
(5)光鏡下觀察腫瘤細胞形態結構的變化石蠟切片準備取各組小鼠腫瘤組織，10％甲醛固定，常規脫水，石蠟包埋，連續切片，厚度為6μm，置于56度溫箱中烤片24小時，室溫下保存備用。
組織切片的HE染色主要步驟為1)、切片脫蠟至水，2)、入蘇木精染色液中3分鐘，蒸餾水沖洗，3)、加入1％鹽酸水溶液分色，蒸餾水沖洗，4)、1％氨水反藍，蒸餾水沖洗，5)、加入1％伊紅染液中3分鐘，蒸餾水沖洗，4)、逐級脫水，透明，光學樹脂封片。
統計方法采用SPSS12.0統計軟件，實驗指標計量資料組間比較應用成組T檢驗，以P＜0.05為顯著性差異。
實驗結果(1)一般生理情況觀察SBX大劑量組小鼠體重較其他各組增長均快，被毛有些疏松，行動較遲緩。小鼠腋下第三天出現蓬隆，體重與瘤重均增長較快。
SBX中劑量組小鼠體重增長速度適中，飲食運動均良好，被毛順滑，有光澤。接種后SBX第三天開始出現輕微蓬隆，且瘤塊生長較大劑量組慢。
SBX小劑量組小鼠體重增長較空白對照組不顯，飲食行動尚可，被毛較順滑。接種后第四天開始出現輕微蓬隆。
陽性對照藥小鼠服用CTX后，呆臥少動，被毛疏松，精神差，飲食減少，與對照組比較體重增加緩慢，腋下荷瘤目測體積明顯小于對照組。
模型對照組小鼠接種后第3天開始出現黃豆樣隆起。小鼠飲食、飲水量減少，被毛疏松，精神較差，呆臥少動。
(2)本發明藥物組合物膠囊劑對各組小鼠體重生長曲線的影響如下圖所示，造模前給藥7天后本發明藥物組合物膠囊劑三個劑量組小鼠體重都高于環磷酰胺組、正常組和模型對照組，給藥后第十二天，各組小鼠體重從高到低依次是模型組，大劑量組，小劑量組，中劑量組，環磷酰胺組，正常組.
(3)本發明藥物組合物膠囊劑對小鼠H22腫瘤抑瘤的作用兩次重復實驗中，本發明藥物組合物膠囊劑中劑量組的平均瘤重分別為0.96g和0.91g，與模型組相比較有顯著差異，P＜0.05，中劑量組抑瘤率為43.2％和48.3％，顯示出明顯的抑瘤活性.
表8重復SBX膠囊對荷瘤小鼠(H22)的抑瘤作用(
)
注*與模型組比較有顯著差異，(P＜0.05)**與模型比較有極顯著差異，(P＜0.01)(4)本發明藥物組合物膠囊劑對小鼠H22腫瘤免疫器官的影響本發明藥物組合物膠囊劑各劑量組脾臟指數均較正常組高，但差異不顯著；本發明藥物組合物膠囊劑各組胸腺指數較模型組有顯著差異(P＜0.05)，模型組小鼠胸腺指數較正常組為低，差異不顯著.
表9本發明藥物組合物膠囊劑對荷瘤小鼠胸腺指數的比較(
)
注*與模型組比較有顯著差異，(P＜0.05)**與模型比較有極顯著差異，(P＜0.01)實驗例4對荷瘤小鼠腫瘤表面MHC I類分子影響的實驗研究實驗材料(1)實驗動物健康ICR小鼠，雌性，體重(16±2)g，二級，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。
(2)瘤株小鼠H-22肝腹水瘤，經小鼠腹腔傳代保種，由北京醫科大學實驗室提供。
(3)藥品試劑本發明藥物組合物膠囊劑(簡寫為SBX)主要由靈芝、蜂膠、精氨酸、蛋氨酸、β-胡蘿卜素、富硒酵母等組成，由上海高能生物技術有限公司和太原市晉康源生物工程有限公司提供。
陽性對照藥選用上海華聯制藥有限公司提供的的環磷酰胺(CTX)，200mg/支，生產批號040607異硫氰酸熒光素(FITC)標記抗小鼠一H2KK，購自美國BD Pharmingen公司，陰性對照PBS液。
(4)儀器離心機LD25-2，北京醫用離心機廠。
電子勻漿器DY89-II型電動剝離勻漿器，寧波新芝生物科技股份有限公司。
流式細胞儀(BECTOM TACSCalibur DICKINSON)系美國BD公司產品，北京東直門醫院重點實驗室提供。
實驗方法(1)動物分組健康ICR小鼠50只，雌性，體重(16±2)g，適應性飼養三天后，稱重，隨機分為六組SBX膠囊大劑量組、SBX膠囊中劑量組、SBX膠囊小劑量組、陽性對照環磷酰胺組、空白模型組10只。分籠飼養，自由攝食與飲水，室溫24-26℃。
(2)造模前給藥各組小鼠等體積灌胃0.2ml/天。根據下列公式給出小鼠給藥劑量dBdA×(KB/KA)其中，dB為20g小鼠日給藥劑量(g/kg)，dA為正常成人日給藥劑量(g/kg)，K折算系數(KA0.11，KB1)SBX大劑量為3.0g.kg-1·d，SBX中劑量為1.0g.kg-1·d，SBX小劑量為0.3g.kg-1·d，環磷酰胺組、模型對照組以及空白組灌胃生理鹽水。灌胃10天。
(3)造模腫瘤細胞懸液的制備H22肝腹水癌細胞在小鼠體內連續傳代后，抽取腹水，呈乳白色，無菌生理鹽水1000rm×5min，洗滌離心3次后，調細胞濃度2.0×106/ml，全程無菌操作，冰浴上進行。
腫瘤動物造模將細胞懸液注射至各組昆明種小鼠右腋皮下，制作腫瘤模型小鼠，每鼠注射0.2ml，至每只小鼠都有瘤塊長出，造模成功。
(4)造模后給藥接種后第二天，環磷酰胺組小鼠灌胃CTX為30mg/kg·d。其余各組繼續灌胃給藥，劑量如前。灌胃7天后，停藥觀察動物。
(5)制取單細胞懸液造模后第12天，小鼠脫頸處死，剝離腫瘤。取腫瘤組織約0.2～1.0g，置于電子勻漿器，加入PBS液研磨成單細胞懸液。將該懸液經200目尼龍網過濾沖洗至小試管中，1500轉離心5min，棄上液，加適量PBS液，繼續離心，1000轉5min，棄上液，加PBS液，光學顯微鏡下調濃度為106/ml，備用。
(6)結合抗體將細胞懸液分兩管，每管100μl，其中1管加相應FITC標記抗小鼠H一2KK單抗20μl，室溫避光反應30min，2000轉離心5min，棄上清液，以除去未結合熒光抗體，另一管做陰性對照，加20μlPBS液，與細胞反應，步驟如上。
(7)FCM檢測光源488nm的氬離子激光，FITC受激發后發出綠色熒光。以標準球調整儀器，使變異系數在2％以內。備用樣本以300目尼龍網過濾，上機檢測。上機后計數10000個細胞，熒光強度以對數放大，光散射數據存軟盤，測試完后用Cell Quest軟件分析數據。
統計學處理用Student T檢驗進行統計學處理。
實驗結果H-2KK抗原在各組荷瘤小鼠腫瘤組織表面表達特點由表中可以看出，荷瘤小鼠腫瘤組織表面H-2KK在本發明藥物組合物膠囊劑大劑量組、中劑量組以及陽性對照(環磷酰胺)組中的表達均高于模型組，并且差異顯著(P＜0.01)。
表10 H-2KK抗原在各組荷瘤小鼠腫瘤組織表面表達Tabel Expression ofH-2KK on tumor cells (
)
注*與對照組比較，有顯著差異，P＜0.05**與對照比較，有極顯著差異，P＜0.01通過動物實驗發現，H22荷瘤小鼠灌服本發明藥物組合物膠囊劑后，大劑量組和中劑量組移植瘤表面的MHCI類抗原即H-2KK分子的表達，與模型組相比有顯著差異，并且大劑量組與模型組之間有極顯著差異；環磷酰胺組同模型組也有極顯著差異。這種改變與本發明藥物組合物膠囊劑的服用劑量呈正相關。本發明藥物組合物膠囊劑大劑量組H-2KK抗原表達量與環磷酰胺組接近，中劑量組與小劑量組依次遞減。
下述實施例均能實現上述實驗例的效果。
具體實施例方式
實施例1凍干粉針劑的制備靈芝36kg、蜂膠24kg、精氨酸24kg、蛋氨酸15.8kg、0.2kg β-胡蘿卜素粉10％、4mg富硒酵母(含硒量1000PPM)以上藥物組合物加入常規輔料，經常規工藝。制成凍干粉針劑。
實施例2口服液的制備靈芝25kg、蜂膠35kg、精氨酸15kg、蛋氨酸20kg、0.1kg β－胡蘿卜素粉10％、2mg富硒酵母(含硒量1000PPM)以上藥物組合物加入常規輔料，經常規工藝。制成口服液。
實施例3合劑的制備靈芝45kg、蜂膠15kg、精氨酸35kg、蛋氨酸10kg、0.3kg β-胡蘿卜素粉10％、8mg富硒酵母(含硒量1000PPM)以上藥物組合物加入常規輔料，經常規工藝。制成合劑。
實施例4膠囊劑的制備靈芝36kg、蜂膠24kg、精氨酸24kg、蛋氨酸15.8kg、0.2kg β-胡蘿卜素粉10％、4mg富硒酵母(含硒量1000PPM)以上藥物組合物加入常規輔料，經常規工藝。制成膠囊劑。
實施例5顆粒劑的制備靈芝25kg、蜂膠35kg、精氨酸15kg、蛋氨酸20kg、0.1kgβ-胡蘿卜素粉10％、2mg富硒酵母(含硒量1000PPM)以上藥物組合物加入常規輔料，經常規工藝。制成顆粒劑。
實施例6片劑的制備靈芝45kg、蜂膠15kg、精氨酸35kg、蛋氨酸10kg、0.3kgβ-胡蘿卜素粉10％、8mg富硒酵母(含硒量1000PPM)以上藥物組合物加入常規輔料，經常規工藝。制成片劑。
權利要求
1.一種增強免疫力的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物是由如下原料組成靈芝20-50重量份、蜂膠10-40重量份、精氨酸10-40重量份、蛋氨酸5-25重量份、β-胡蘿卜素0.1-0.3重量份、富硒酵母1×10-6～10×10-6重量份。
2.如權利要求1所述的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物是由如下原料組成靈芝36重量份、蜂膠24重量份、精氨酸24重量份、蛋氨酸15.8重量份、β-胡蘿卜素0.2重量份、富硒酵母4×10-6重量份。
3.如權利要求1所述的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物是由如下原料組成靈芝25重量份、蜂膠35重量份、精氨酸15重量份、蛋氨酸20重量份、β-胡蘿卜素0.1重量份、富硒酵母2×10-6重量份。
4.如權利要求1所述的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物是由如下原料組成靈芝45重量份、蜂膠15重量份、精氨酸35重量份、蛋氨酸10重量份、β-胡蘿卜素0.3重量份、富硒酵母8×10-6重量份。
5.如權利要求1-4任一所述的藥物組合物的制備方法，其特征在于該方法為取該藥物組合物的原料，加入常規輔料，按照常規工藝，制成臨床可接受的濃縮丸劑、膠囊劑、滴丸劑、顆粒劑、片劑、軟膠囊劑、緩釋劑、口服液體制劑或凍干粉針劑。
6.如權利要求1-4任一所述的藥物組合物，其特征在于其中的β-胡蘿卜素為β-胡蘿卜素10％；富硒酵母中含硒量為1000PPM。
7.如權利要求1-4任一所述的藥物組合物在制備治療提高特異性和非特異性細胞免疫的藥物中的應用。
8.如權利要求1-4任一所述的藥物組合物在制備治療抑制腫瘤的藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種增強免疫力的藥物組合物及其制備方法。該藥物組合物由靈芝、蜂膠、精氨酸、蛋氨酸、β－胡蘿卜素、富硒酵母組成。本發明藥物組合物能有效提高小鼠的非特異性和特異性細胞免疫功能，抗突變，在免疫調節方面有重要作用，可用于輔助抑制腫瘤。
文檔編號A61P37/04GK101084933SQ20061008313
公開日2007年12月12日 申請日期2006年6月5日 優先權日2006年6月5日
發明者藥建明 申請人:太原市晉康源生物工程有限公司