專利名稱：轉導肽－人紅細胞生成素融合蛋白及其藥物組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及具有藥用價值的融合蛋白，具體為轉導肽-人紅細胞生成素融合蛋白，編碼該融合蛋白的核酸分子。本發明也涉及含有該融合蛋白的藥物組合物。
背景技術：
1906年Carnot發現貧血動物血液中存在有調節造血的因子，1948年Bonsdloff等提出這種造血因子是促紅細胞生成素(紅細胞生成素，促紅素，erythropoietin，EPO)。1957年Jacobson等證實EPO來自腎臟，從此EPO這一概念被人們普遍接受。1985年成功地克隆出人EPO基因后，開始基因工程大批量生產重組人EPO，并廣泛用于臨床。EPO治療腎性貧血已為世人公認，隨著EPO臨床應用的研究深入，EPO治療貧血的范圍不斷擴大，并取得較好的療效。
EPO為一種分子量約30500道爾頓的糖蛋白。EPO主要由腎臟的氧感受器受缺氧刺激后產生，在腎皮質腎小管周圍毛細血管內皮細胞或成纖維細胞中合成。肝臟、巨噬細胞及有核紅細胞中也能合成EPO，但這些腎臟外的產生量不足總產生量的10％～15％。
成熟的重組人紅細胞生成素(rhEPO)是由166個氨基酸殘基組成的高度糖基化蛋白，糖基化的程度對其生物活性有很大的影響。重組人紅細胞生成素唾液酸含量高低與其生物比活性具有顯著的相關性，唾液酸含量低，則生物活性低。由于rhEPO的生物活性依賴于分子的糖基化，通過原核細胞生產的rhEPO在體內基本不具生物活性，只有真核細胞生產的糖基化rhEPO在體內具有天然hEPO的生物活性作用。由于真核細胞對目的基因的表達效率較低，近年國內外學者紛紛采用不同方法提高rhEPO在真核細胞內的表達量。
目前關于EPO治療貧血的機制不清楚，可能的機制有1)EPO與紅細胞干細胞上的受體結合并激活，使之發展成為成熟的紅細胞。2)EPO能夠快速啟動原癌基因c-myc表達，發揮抗凋亡并維持細胞存活的作用。實驗表明EPO不能直接促進染色體復制和有絲分裂，所以與其說EPO促進了紅細胞前體的增殖和分化，不如說是EPO強大的抗凋亡作用，使紅系祖細胞得以存活并最終向成熟紅細胞分化。
國內外研究進展人類重組紅細胞生成素(r-hEPO)是利用DNA重組技術人工合成的活性因子，它的生物活性、免疫學特性與自然EPO完全相同，到目前為止尚未發現血中存在這種活性因子的抗體，故使用安全。
r-hEPO治療腎性貧血的效果令人滿意，EPO的臨床應用，使90％以上的腎性貧血患者得到了有效治療，有學者稱之為腎衰貧血治療的一次革命。適用于已做透析和還未做透析的腎衰而貧血的病人，為了使r-hEPO充分發揮作用，應補充其他造血原料，如鐵和葉酸等。EPO每次用量為40u/kg，每周3次。除血透病人靜注較方便外，其他病人均應皮下注射。皮下注射EPO可減量30％而療效相同。可能由于皮下注射其半衰期較長之故。由于EPO促進骨髓內的原始紅細胞變為成熟紅細胞需要一段時間，故判斷EPO的真實療效大都需要4周左右時間。感染和慢性炎癥或體內鋁過多均可影響EPO療效。
EPO的主要副作用有血栓形成、高血壓、偶會發生癲癇。腎衰病人在沒有控制好血壓時，不宜使用EPO。嚴格控制Hct或血紅蛋白(Hb)上升速度和終點水平，可減少甚至避免EPO的副作用。終點水平一般足以維持良好的生活質量，但如不用維持量，EPO停藥后不久，病人會再發生貧血。另外，EPO還可增加血小板計數，但一般不超過正常水平。EPO對白細胞影響不大。
隨著基因工程藥物的發展，國外推出了第二代EPO新產品，2003年在市場上初戰告捷，將逐漸成為第一代EPO的換代產品，勢必瓜分促紅細胞生成素的現有市場份額。
存在的問題(1)EPO的給藥途徑和給藥次數EPO的給藥途徑包括靜脈和皮下注射。皮下注射方法可以減小EPO的劑量。不管是采用靜脈給藥還是皮下注射，EPO最佳的給藥次數是每周2～3次。
EPO治療的原則包括(1)有劑量依賴性；(2)最有效的給藥途徑可能為皮下注射，但對某些患者靜脈注射同樣有效，甚至更佳；(3)給藥頻率依賴于給藥途徑，靜脈注射至少每2～3天1次，皮下給藥可減少次數，如每周1次或隔周1次；(4)除發生高血壓腦病外，不應中斷治療；(5)維持充足的鐵貯備；(6)最常見的EPO抵抗原因為炎癥或感染。其他原因包括鋁過量、甲狀旁腺功能亢進、化療期間發生的骨髓瘤和甲狀旁腺功能亢進合并骨髓纖維化。
(2)生產成本較高由于成熟的重組人紅細胞生成素rhEPO的生物活性依賴于分子的糖基化，通過原核細胞生產的rhEPO在體內不具生物活性，通過真核細胞生產的糖基化rhEPO在體內具有天然hEPO的生物活性作用。因此目前生產的商品EPO均為大規模哺乳動物細胞培養生產，生產成本高。
目前EPO的使用必需是靜脈注射和皮下注射給藥方式，長期采用注射途徑給病人(除血透病人)帶來痛苦和不便，本發明改用非創傷性給藥方式如皮膚或粘膜穿透給藥、易被病人接受、而且通過皮膚進入體內還可以提高安全性及延長藥物的半衰期。為達到此目的，本發明利用能高效攜帶蛋白質分子穿透生物膜包括皮膚、粘膜、血腦屏障的小分子轉導肽(Protein Transduction Domain，PTD)，將原核表達的重組EPO通過非創傷性給藥方式進入體內，從而達到治療貧血的目的。
轉導肽是一種能高效穿過生物膜的蛋白轉導結構域，它能將與其共價連接的多肽、蛋白質及DNA等分子跨膜導入幾乎所有的組織和細胞，還可以穿過血腦屏障。1988年Green發現HIV的Tat蛋白能夠高效地自由進出細胞。1994年Fawell將TAT的36Aa的區域化學交聯到異源蛋白上后，交聯蛋白也可轉導入細胞內。Schwarze SR等人將TAT的PTD區域短肽與大分子半乳糖苷酶在原核細胞中融合表達后，將融合蛋白在小鼠體內注射，發現有活性的酶分子在體內的各組織中都有表達，尤為重要的是可以通過血腦屏障。除TAT肽外，來自果蠅觸角足同源異型轉錄因子Antp的43-58位的多肽序列，來自瘡疹單病毒DNA結合蛋白VP22的267-300序列均具有與TAT肽完全相似的轉導功能和轉導機制，它們被統稱為PTD。
發明內容
本發明一個方面涉及轉導肽-人源紅細胞生成素融合蛋白。本發明中，用于轉導所述人源紅細胞生成素的轉導肽可以選自反式激活蛋白TAT的PTD序列、果蠅同源異型轉錄因子ANTP和單純皰疹病毒I型VP22轉錄因子的PTD序列或其功能性類似物或片段。優選的，所述轉導肽具有SEQ ID NO2(YGRKKRRQRRR)所述的氨基酸序列或其功能性片段。實際上，只要能夠轉導本發明所述人源紅細胞生成素的轉導肽均適用于本發明。
本發明中，所述融合蛋白的人源紅細胞生成素含有SEQ ID NO4(APPRLICDSRVLE RYLLEAKEAE NITTGCAEHC SLNENITVPD TKVNFYAWKRMEVGQQAVEV WQGLALLSEA VLRGQALLVN SSQPWEPLQL HVDKAVSGLRSLTTLLRALG AQKEAISPPD AASAAPLRTI TADTFRKLFR VYSNFLRGKLKLYTGEACRT GDR)的氨基酸序列或其功能性片段。優選的，人源紅細胞生成素由SEQ ID NO4組成。
具體地，本發明的融合蛋白即轉導肽-人源紅細胞生成素具有SEQID NO6(YGRKKRRQRRR GGS APP RLICDSRVLE RYLLEAKEAE NITTGCAEHCSLNENITVPD TKVNFYAWKR MEVGQQAVEV WQGLALLSEA VLRGQALLVNSSQPWEPLQL HVDKAVSGLR SLTTLLRALG AQKEAISPPD AASAAPLRTITADTFRKLFR VYSNFLRGKL KLYTGEACRT GDR)所示的氨基酸序列。本發明還涉及編碼所述轉導肽-人源紅細胞生成素融合蛋白的核酸分子。本發明的再一方面涉及含有上述編碼本發明轉導肽-人源紅細胞生成素融合蛋白的核苷酸的核酸分子，所述核酸分子優選為SEQ ID NO5(TAC GGC CGC AAG AAA CGC CGC CAG CGC CGC CGC GGT GGTACCgcaccaccgc gtctgatttg tgatagccgt gtcctggagc gttacctgctggaggccaaggaggccgaga atatcacgac gggctgtgcg gaacactgcagcctgaatga gaatatcaccgtcccggaca ccaaagttaa tttctatgcctggaagcgca tggaggtcgg tcagcaggccgtggaagtct ggcagggcctggccctgctg agcgaagcgg tcctgcgtgg ccaggccctgctggtcaaca gcagccagcc gtgggagccg ctgcagctgc atgtggataaagccgtcagcggcctgcgca gcctgaccac cctgctgcgc gcgctgggtgcccagaagga agccatcagcccaccggatg cggccagcgc agcgccgctgcgcaccatca ccgcggacac cttccgcaaactgttccgtg tctacagcaatttcctgcgt ggtaagctga agctgtacac cggtgaggcctgccgtaccggtgaccgcta a)所示的核苷酸序列。
上述核苷酸序列可以插入表達載體中。優選的，本發明所述表達載體為原核或真核表達載體，其中優選為pGEX、pET、pBV220和pcDNA。
本發明通過將所述核酸分子導入原核表達載體pET28，pGEX-4T-1等中，通過原核細胞培養獲得與轉導肽融合表達的人源紅細胞生成素。
方法易于操作、成本低、轉導效率高。蛋白純化在變性條件下進行，使以包涵體形式存在的融合蛋白的純化過程大大簡化。使變性蛋白的天然構象變成相對靈活的鏈狀結構，擺脫空間構象的限制，具備更高的能量，使轉導效率大大提高。當融合蛋白轉入細胞后，重新折疊，恢復天然構象使EPO發揮其生物學活性，而與其共價連接的蛋白轉導域不影響細胞的正常結構或功能。
本發明又一方面涉及含有本發明所述融合蛋白的藥物組合物，用于失血性貧血、外科術后貧血、癌癥相關性貧血、人類免疫缺陷病毒感染、骨髓增生異常綜合征、早產兒貧血、腎性貧血、骨髓移植、自體血液收集、孕產婦貧血、血紅蛋白病、再生障礙性貧血等治療。
所述藥物組合物可以含有非注射劑型常用的藥學可接受的載體或賦形劑。優選的，本發明所述劑型為可穿越皮膚、粘膜、角膜、結膜、漿膜、肌膜、血管及淋巴管膜、脈絡膜、神經膜、血腦屏障等一切細胞膜及生物膜的劑型。特別是舌下含服、肺吸入、鼻噴劑、肛栓及皮膚吸收等多種方式用藥。
借助于上述轉導肽技術，可以經非注射途徑將人源紅細胞生成素輸入機體，使臨床用藥更為安全、方便。
實施例實施例1 人胎肝臟總RNA的提取采用Promega公司的RNAgentsR Total RNA Isolation System從引產胎兒肝臟提取總RNA。
實施例2 hEPO基因的克隆參考Genebank中EPO cDNA序列設計引物引物15′-GGAATTCGCACCACCACGCCTAATC-3′(SEQ ID NO7)引物25′-GTCGACTCATCATCTGTCCCCTGTCCT-3′(SEQ ID NO8)以實施例1的RNA作為模板，參照試劑盒廠家推薦方案進行PCR擴增，獲得全長的hEPO cDNA，5′和3′端分別攜帶EcoRI，Sal I位點。
反轉錄與PCR擴增用Perkin ElmerCetus公司生產的反轉錄PCR試劑盒。取提取的細胞總RNA 1-2ug，加人20ul反轉錄體系中，以oligo dT為引物，于42℃作用1h，合成cDNA第一鏈。99℃5min終止逆轉錄反應。將20ul逆轉錄產物加入到100ul的PCR反應體系中，其中含上下游引物。96℃變性10min后加入Taq DNA聚合酶，進行PCR循環，反應參數為94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，30個循環后72℃再延伸7min。
實施例3 重組hEPO表達質粒構建與鑒定實施例2中hEPO的RT-PCR產物經EcoRI和SalI雙酶切后，與經同樣酶切回收的表達載體pBV220片段，按4∶1摩爾比連接，轉化感受態大腸桿菌DH5α，篩選陽性重組子pBV hEPO。送上海申工公司測序。
實施例4 pBV hEPO在大腸桿菌中的誘導表達將過夜培養的實施例3篩選的陽性單菌落接種于LB液體培養基中(含Amp 60mg/L)，于30℃培養至OD600＝0.45后，迅速升溫至42℃，誘導5h左右，至OD600＞1.2。于4℃下6000g離心10min，收集菌體。SDS-PAGE電泳鑒定rhEPO的表達水平，并鑒定表達形式。
實施例5 rhEPO的復性與純化將誘導表達后的菌體超聲破解。12000g離心20min，棄上清。沉淀經洗滌、溶解、復性。以50ml/min流速上樣，柱結合量約5mg蛋白/ml介質。上樣畢，用水平衡反相柱至檢測基線，使用10％-80％乙醇1mol/L鹽酸胍進行線性梯度洗脫，檢測并收集含EPO主峰，ELISA測定結果表明，60％乙醇1mol/L鹽酸胍可洗出EPO。含EPO收集液用10倍體積的10mmolTris·HCl(pH7.5)2％蔗糖緩沖液透析兩次，每次5-6h，其透析過的EPO峰收集液用于DEAE型離子交換柱分離。
用10mmol Tris·HCl(pH7.5)緩沖液平衡DEAE型離子交換柱，取透析處理的收集液上樣，流速為20ml/min，柱結合蛋白量為20mg/ml。上樣完畢，用上述緩沖液平衡色譜柱至基線，隨后在緩沖液中加NaCl，進行截狀梯度洗脫，NaCl濃度分別為50、75和125mmol/L。ELISA檢測結果表明75mmol/L洗脫峰中含EPO。取DEAE離子交換柱收集含EPO峰液體進行Sephacryl S-200色譜。每次上樣體積為80ml，流速2ml/min，使用流動相為20mmol/L檸檬酸鈉100mmol/L NaCl緩沖液，rhEPO保留時間約為45min。該色譜柱收集到的rhEPO樣品比活性約為1.5×108U/g蛋白，經三步純化后產品的SDS PAGE結果呈現一條帶，終產品SDS PAGE掃描結果純度達到98％以上。
純度測定對終產品進行SDS PAGE電泳。
實施例6 生物活性測定EPO酵母表達產物的生物活性測定(in vitro)取8-10周雌性Balb/c小鼠，尾靜脈注射FVA(Friend Virus of Anemia)病毒。14d后，觀察小鼠腹部腫大后，眼球放血，殺小鼠，取脾臟研磨細胞，于Hank′s液中，過200目篩，洗2次，1200Xg離心10min后，用淋巴細胞分離液分離細胞，2000Xg 30min，取界面上白色細胞，按2.5×105接種，加入IMDM培養基(含30％胎牛血清，10mmol/L硫代甘油，1％BSA，1％谷氨酰胺，1％雙抗，3.02g/L碳酸氫鈉)，同時加入待測EPO樣品，于37℃CO2，培養箱中培養。48h后，觀察，收集細胞，用15mg/ml聯苯胺染色，涂片，計數，根據染為藍色的細胞計數便可知是否有活性。
序列表<110>中國人民解放軍軍事醫學科學院毒物藥物研究所<120>轉導肽-人紅細胞生成素融合蛋白及其藥物組合物<160>8<210>1<211>33<212>DNA<213>編碼PTD的核苷酸序列<400>1TACGGCCGCA AGAAACGCCG CCAGCGCCGC CGC 33<210>2<211>11<212>氨基酸序列<213>PTD的氨基酸序列<400>2YGRKKRRQRR R 11<210>3<211>501<212>DNA<213>編碼人源紅細胞生成素的核苷酸序列<400>3gcaccaccgc gtctgatttg tgatagccgt gtcctggagc gttacctgct ggaggccaaggaggccgaga atatcacgac gggctgtgcg gaacactgca gcctgaatga gaatatcaccgtcccggaca ccaaagttaa tttctatgcc tggaagcgca tggaggtcgg tcagcaggccgtggaagtct ggcagggcct ggccctgctg agcgaagcgg tcctgcgtgg ccaggccctgctggtcaaca gcagccagcc gtgggagccg ctgcagctgc atgtggataa agccgtcagcggcctgcgca gcctgaccac cctgctgcgc gcgctgggtg cccagaagga agccatcagcccaccggatg cggccagcgc agcgccgctg cgcaccatca ccgcggacac cttccgcaaactgttccgtg tctacagcaa tttcctgcgt ggtaagctga agctgtacac cggtgaggcctgccgtaccg gtgaccgcta a 501<210>4<211>166<212>氨基酸序列<213>人源紅細胞生成素的氨基酸序列<400>4APPRLICDSR VLERYLLEAK EAENITTGCA EHCSLNENIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQAVEVWQGLALL SEAVLRGQAL LVNSSQPWEP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLG ALGAQKEAISPPDAASAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA CRTGDR 166
<210>5<211>557<212>DNA<213>編碼PTD-人源紅細胞生成素融合蛋白的核苷酸序列<400>5tacggccgca agaaacgccg ccagcgccgc cgcggtggta ccgcaccacc gcgtctgatttgtgatagcc gtgtcctgga gcgttacctg ctggaggcca aggaggccga gaatatcacgacgggctgtg cggaacactg cagcctgaat gagaatatca ccgtcccgga caccaaagttaatttctatg cctggaagcg catggaggtc ggtcagcagg ccgtggaagt ctggcagggcctggccctgc tgagcgaagc ggtcctgcgt ggccaggccc tgctggtcaa cagcagccagccgtgggagc cgctgcagct gcatgtggat aaagccgtca gcggcctgcg cagcctgaccaccctgctgc gcgcgctggg tgcccagaag gaagccatca gcccaccgga tgcggccagcgcagcgccgc tgcgcaccat caccgcggac accttccgca aactgttccg tgtctacagcaatttcctgc gtggtaagct gaagctgtac accggtgagg cctgccgtac cggtgaccgctaa 543<210>6<211>180<212>氨基酸序列<213>轉導肽-人源紅細胞生成素的氨基酸序列<400>6YGRKKRRQRR RGGSAPPRLI CDSRVLERYL LEAKEAENIT TGCAEHCSLN ENITVPDTKVNFYAWKRMEV GQQAVEVWQG LALLSEAVLR GQALLVNSSQ PWEPLQLHVD KAVSGLRSLTTLLGALGAQK EAISPPDAAS AAPLRTITAD TFRKLFRVYS NFLRGKLKLY TGEACRTGDR 180<210>7<211>25<212>DNA<213>引物<400>7GGAATTCGCA CCACCACGCC TAATC 25<210>8<211>27<212>DNA<213>引物<400>8GTCGACTCAT CATCTGTCCC CTGTCCT2權利要求
1.一種融合蛋白，其含有轉導肽和人源紅細胞生成素。
2.權利要求1的融合蛋白，其中所述轉導肽選自反式激活蛋白TAT的PTD序列、果蠅同源異型轉錄因子ANTP和單純皰疹病毒I型VP22轉錄因子的PTD序列或其功能性類似物或片段。
3.權利要求2的融合蛋白，其中所述轉導肽具有SEQ ID NO2的序列或其功能性片段。
4.權利要求1-3中任一項的融合蛋白，其中所述人源紅細胞生成素具有SEQ ID NO4的序列。
5.權利要求1的融合蛋白，其具有SEQ ID NO6的序列。
6.核酸分子，其編碼權利要求1-5中任一項的融合蛋白。
7.權利要求6的核酸分子，其具有SEQ ID NO5的序列。
8.包含權利要求7的核酸分子的表達載體。
9.藥物組合物，其含有權利要求1-5中任一項的融合蛋白。
10.權利要求9的藥物組合物，其劑型為可穿越皮膚、粘膜、角膜、結膜、漿膜、肌膜、血管及淋巴管膜、脈絡膜、神經膜、血腦屏障等一切細胞膜及生物膜的劑型。
11.權利要求9的藥物組合物，其適合于舌下含服、肺吸入、鼻噴劑、肛栓及皮膚吸收用藥。
12.權利要求1-5中任一項的融合蛋白在制備藥物中的應用，所述藥物用于治療失血性貧血、外科術后貧血、癌癥相關性貧血、人類免疫缺陷病毒感染、骨髓增生異常綜合征、早產兒貧血、腎性貧血、骨髓移植、自體血液收集、孕產婦貧血、血紅蛋白病、再生障礙性貧血。
全文摘要
本發明涉及一種轉導肽－人紅細胞生成素融合蛋白以及含有編碼所述融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子。本發明還涉及含有上述核酸分子的表達載體。本發明還涉及所述融合蛋白在制備藥物中的應用，所述藥物用于失血性貧血、外科術后貧血、癌癥相關性貧血、人類免疫缺陷病毒感染、骨髓增生異常綜合征、早產兒貧血、腎性貧血、骨髓移植、自體血液收集、孕產婦貧血、血紅蛋白病、再生障礙性貧血等治療。
文檔編號A61P7/06GK101074268SQ20061008245
公開日2007年11月21日 申請日期2006年5月19日 優先權日2006年5月19日
發明者李前, 孫曼霽 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院毒物藥物研究所