專利名稱：轉導肽－人源粒細胞集落刺激因子融合蛋白及其藥物組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及具有藥用價值的融合蛋白，具體為轉導肽-人源粒細胞集落刺激因子融合蛋白，編碼該融合蛋白的核酸分子。本發明也涉及含有該融合蛋白的藥物組合物。
背景技術：
概述粒細胞集落刺激因子(Granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)是一種多肽鏈的細胞生長因子，刺激骨髓細胞形成粒細胞集落形成單位，增加中性粒細胞(ANC)、單核細胞、T淋巴細胞數量。G-CSF主要作用于粒系祖細胞、粒系前體細胞增殖、分化，并增強成熟粒細胞的功能活性；增強ANC的吞噬作用，改善ANC活性氧的釋放功能以加強其殺滅病原微生物能力，對機體應激防御系統有重要意義。
G-CSF的生物學性質人G-CSF由單個基因編碼，其基因位于17號染色體的q21-22區，長約2.5kb，有5個外顯子和4個內含子；其蛋白質由174氨基酸組成，其間有2個二硫鍵連接而構成三級結構，分子量為22kD。天然的G-CSF含有糖基，糖基化位點位于Thr133，無N-糖基位點，糖基對G-CSF的生物學活性沒有貢獻，在E.coli中表達的G-CSF無糖基，但其功能與天然G-CSF無明顯差別。
G-CSF的生物學作用是通過與效應細胞表面特異性受體結合而產生的。G-CSF受體是高親和力受體，分布于造血祖細胞、中性粒細胞、內皮細胞、髓系白血病細胞、血小板以及T、B淋巴細胞。某些非造血細胞(如血管內皮細胞、胎盤細胞、小細胞、肺癌細胞及滋養層細胞等)也有G-CSFR存在。但受體密度相差很大，受體密度約37-1000個/細胞。受體與年齡、性別、外周血相中血紅蛋白量、白細胞數、血小板的數量無關，而與骨髓中原始細胞的比例呈顯著負相關，急性白血病患者G-CSF受體表達率明顯低于正常。G-CSF受體的數量隨著細胞的成熟而增加，因此，G-CSF受體的表達在某種程度上反映了細胞的分化程度。體外試驗顯示即使中性粒細胞上有較低水平的G-CSFR表達，解離常數很低(3pmol/L)，也能發揮G-CSF較高的生物活性，因此少量G-CSFR結合即可誘發很大的G-CSF生物效應。
1、G-CSF能特異性地誘導粒系祖細胞的增殖與分化G-CSF作用的主要對象是粒系細胞，不僅可促進粒系祖細胞的增殖，并誘導其向終末分化。G-CSF對CD34+/CD33-的骨髓祖細胞作用較弱，而對骨髓粒系定向細胞(CD34+/CD33+)有明顯的促進集落形成作用。G-CSF刺激造血祖細胞的動力學研究表明G-CSF可誘導較成熟祖細胞(早幼粒細胞)的細胞分裂，但不能促進早期祖細胞進入細胞增殖周期。CD34+的骨髓祖細胞的體外培養發現G-CSF獨自不能維持原始造血祖細胞的自我更新，因此，G-CSF在造血中的作用時相為造血細胞分化晚期。G-CSF與其他細胞因子(IL-3，IL-12，IL-1B，IL-6)共同作用對造血祖細胞的生長有協助作用，同時G-CSF還能影響一些造血調控因子如GM-CSF，IL-3對原始及多能祖細胞的反應。
在體內，G-CSF能促進粒系祖細胞的增殖、分化及成熟，并促進骨髓中中性粒細胞和干祖細胞釋放于外周血中(Tsuruta T，Tani K，Shimane M，et al.Br J Haematol，1996；929)。G-CSF可使外周血中造血干/祖細胞數量增加10倍，這為外周血造血干細胞移植提供了理論依據。G-CSF作為干細胞動員劑，不但使外周血干細胞移植變得更為可能，且避免了細胞毒性干細胞動員劑所帶來的骨髓抑制，目前已被臨床廣泛采用。此外，骨髓移植后G-CSF能明顯加速粒細胞的恢復，增強粒細胞的功能，可縮短發熱天數和抗生素應用時間。單劑量的G-CSF皮下注射，2小時后，可見外周血中中性粒細胞數量增加，這一作用12小時達高峰，持續36小時后逐漸恢復到原有水平；骨髓中同時伴有髓祖細胞的增加，祖細胞集落形成及骨髓S期細胞比例增加，但對單核細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞、血小板、網織紅細胞及血紅蛋白等均無明顯影響。
G-CSF能增強成熟粒細胞的趨化性、吞噬作用及殺菌能力，促進其生存。G-CSF可促進中性粒細胞釋放花生四烯酸和白細胞堿性磷酸酶及髓過氧化物酶，并介導中性粒細胞超氧陰離子的產生及抗體依賴的細胞殺傷活性(ADCC)作用〔Aman MJ，Stockdreher K，Thews A，etal.Ann Hematol，1996；73231；Thomas P.Carsten K，Janet M，et al.Blood，1996；87900]。
2、其他血細胞的作用125I標記G-CSF，通過γ計數儀測定淋巴細胞表面無G-CSF特異性受體存在，Morikawa等〔Morikawa K，Miyawaki T，Oseko F，et al.Eur J Hematol，1993；51144〕用生物素標記G-CSF在流式細胞儀上的測定結果顯示，B-淋巴細胞表面有G-CSF特異性受體存在。體外培養發現G-CSF可促進B-淋巴細胞的增殖，但其促進B-淋巴細胞分泌免疫球蛋白的作用更為顯著，且發現高濃度的G-CSF，才能引起B-淋巴細胞對其產生反應，但G-CSF刺激髓系細胞則無需如此高的濃度，推測在細菌感染情況下，機體可釋放有活性的G-CSF，使體內G-CSF的血液濃度明顯升高，各種細胞包括粒細胞、單核細胞及淋巴細胞均參與炎癥反應，且分泌各種有活性的包括G-CSF在內的可溶性因子，因此在炎癥局部G-CSF的濃度相當高，有可能達到促進B-淋巴細胞增殖及分泌免疫球蛋白的作用。
Shimoda等[Shimoda K，Okamura S，Harada N，et al.J ClinInvest，1993；911310]首次報道血小板上有G-CSF特異性受體存在，且有較高的親合力(解離常數KD300±150pM)。結合位點412±158/細胞，且發現低濃度的G-CSF(0.1ng/ml)即可改變ADP對血小板引起的繼發性凝集反應，也有大劑量G-CSF在體內引起血小板介導中性粒細胞超氧陰離子的產生及抗體依賴的細胞殺傷活性(ADCC)作用數量增加的報告。
3、G-CSF對非造血細胞的作用G-CSF不僅對造血系統細胞有明顯作用，對某些非造血細胞也有一定作用。體外培養發現G-CSF可刺激血管內皮細胞的增生及遷移，刺激H-69，H-128，小細胞肺癌細胞的增殖，對某些大腸癌細胞系也有促進生長的作用。G-CSF與轉染G-CSF受體的肝癌細胞系(Hep 3B)細胞共同孵育，可促使其細胞產生急性期反應蛋白[Mitsuru H，ThomasH，Tsutomu A，et al.Archives Bioche Biophysics，1995；324344]。胎盤滋養層細胞上有G-CSF受體存在，G-CSF對胎盤細胞的生長及生存也有重要作用。
4、G-CSF對白血病細胞的作用體外培養中，G-CSF能顯著增加急性髓細胞性白血病(AML)細胞的集落形成，AML細胞的DNA合成率也明顯增加，能促進白血病細胞進入細胞增殖周期，對G-CSF依賴的細胞系(如NFS-60細胞系)等也有同樣作用。這些作用均與細胞表面表達特異性G-CSF受體有關，其促進增殖的信息傳導過程尚不十分明確〔Baer MR，Bernstein SH，Brunetto VI.，et al.Blood，1996；871484]。
G-CSF不僅促進髓系細胞的增生，也能促進其分化。Fukunage等[Fukunaga R，Etsuko i.shizaka一lkada，Nagata S.Cell，1993；741079]在轉染G-CSF受體的小鼠髓祖細胞FDC-P1細胞系中發現，G-CSF能促進MPD及LE的mRNA的表達。體外培養發現G-CSF使FDC-P1細胞向早幼粒細胞分化。Santini等[Santini V，Colombat PH，DelwelR，et al.Leuk Res，1991；15341]在AML細胞的無血清培養基中加入適量的G-CSF，培養14天發現，成熟中性粒細胞的比例明顯增加，并指出這種分化作用通常是不完全的；但有實驗顯示在體外G-CSF不能使AML細胞向粒細胞終末分化，在體內G-CSF能否誘使白血病向正常細胞的分化，尚待進一步驗證。
近年來研究發現，G-CSF不僅對髓細胞性白血病有作用，對急淋細胞也有作用。CD7+CD3-的ALL，CD10+的B-細胞ALL，T-原始淋巴細胞性淋巴瘤等細胞表面也有G-CSF受體存在；體外培養顯示G-CSF也能促進其細胞的增殖〔Inukai T，Sugita K，lijima K，et al.BrJ Hematol，1995；89623；Morikawa K，Morikawa S，Miyawaki T，et al.Br J Haematol，1996；94250〕。提示人們要注意觀察G-CSF在治療ALL及淋巴瘤的過程中的作用。
5、G-CSF與凋亡有學者認為G-CSF可抑制細胞的凋亡(apoptosis)從而提高依賴G-CSF生長的細胞的增殖及生存能力〔Bin Hu，Kozo Y.Int J Hematol，1997；66179〕，體外培養也表明造血祖細胞在去除G-CSF后，細胞則發生凋亡現象，化療藥物不僅直接引起白血病細胞的壞死，合適濃度也可誘導細胞凋亡。G-CSF與多種細胞毒性藥物同時加入白血病細胞懸液中，共同孵育一定時間后，發現凋亡細胞的比例較單用細胞毒性藥物明顯減低，提示G-CSF有抑制細胞凋亡的作用。然而，Dong等分析G-CSF受體功能區段的實驗中發現轉染G-CSF受體基因后的32D細胞系，在含有G-CSF的培養基中培養時，細胞未出現分化現象，卻出現了典型的細胞凋亡現象，進一步的研究發現轉染野生型G-CSF受體的32D細胞系及大鼠白血病細胞系(LT12細胞)在G-CSF作用下，失去了進一步的分化能力，而以凋亡的形式發生了死亡。Bessho等在表達內源性G-CSF受體的小鼠髓性細胞系也證實了G-CSF誘導細胞凋亡產生的現象，說明無論內源性表達G-CSF受體的細胞或轉染G-CSF受體的細胞，G-CSF均有誘導其發生凋亡的作用，且發現調亡的發生與G-CSF受體胞內區有密切關系。凋亡發生的分子生物學機理，以及與細胞分化的相互關系目前尚不清楚。
G-CSF的臨床應用G-CSF可用于中性粒細胞減少的治療，應用于實體瘤化療或放療后的中性粒細胞減少，療效良好，在白血病化療后的中性粒細胞減少的治療中也有廣泛的應用。治療非腫瘤化療藥導致的粒細胞減少和先天粒細胞減少癥也有明顯的療效，但有研究顯示，長期應用有誘發骨髓異常增生癥(MDS)及AML的可能性。G-CSF用于骨髓及外周血干細胞移植后的粒細胞恢復，治療MDS也有部分療效。G-CSF用于外周血干細胞動員，單用G-CSF或聯合使用阿糖胞苷、環磷酰胺等動員外周造血干細胞，應用G-CSF后可比不用時采集的造血干細胞數量高數十倍。特殊的感染性疾病應用G-CSF可以增加吞噬細胞的數量，釋放炎性介質，促進趨化作用，活化B淋巴細胞促進抗體釋放，全面提升抗感染作用。
1、腫瘤放化療后的ANC大劑量化療可最大限殺死腫瘤細胞，提高化療緩解率和治愈率。但增加劑量會造成細胞增殖活躍的組織如骨髓造血系統、黏膜上皮等嚴重損傷，造成骨髓抑制、繼發感染等并發癥。近年來新藥的不斷問世和化療方案的不斷改進，使AL緩解率有了明顯提高，但提高長期無病存活率還必須反復接受大劑量化療，隨之而來的骨髓毒性又會影響療效。應用rhG-CSF可以起到彌補作用。
2、骨髓移植后的造血恢復骨髓移植分為自體骨髓移植(ABMT)和異基因骨髓移植(alto-BMT)。應用rhG-CSF的目的在于促進移植后的造血恢復，雖不能縮短移植后粒細胞缺乏期，但能顯著加速ANC的恢復。rhG-CSF在2ug/kg/d-22ug/kg/d劑量范圍均有促進造血的作用，并呈劑量依賴性[G Visani，B Gamberi，P Greenbery，et al.The use of GM-CSFas an adjunct to autologous/syngeneic bone marrowtransplanta-tiona prospective randomized controlled trial[J].Bone Marrow Transplant，1991，7(Supply 2)81.)。
3、外周血干細胞動員生理狀態下干細胞在外周血中含量極少，分離困難，不能滿足移植需要，因此常采用環磷酞胺等藥物動員外周血干細胞(PBSC)，經過一段時間的ANC缺乏期，干細胞在外周血中反跳性升高，此時可分離出較多的PBSC用于移植，但因每次分離的PBSC量不穩定，常與骨髓造血細胞聯合移植；化療后應用rhG-CSF，不僅縮短了ANC缺乏期，減少了感染并發癥；而且還使干細胞在外周血中反跳時間提前，幅度提高，通過較少次數的白細胞分離便可獲得大量的PBSC，從而為單獨PBSC移植提供了條件。
4、在抗感染治療中的應用由于rhG-CSF促進粒系祖細胞向粒、巨噬細胞增殖分化，并逐漸成熟為具有吞噬活性的功能細胞，ANC一過性增高且功能增強，因此適用于協同治療合并細菌或霉菌感染者。臨床多用于預防或治療癌癥患者化療后因粒細胞缺乏所合并的感染，劑量范圍100ug/m2-400ug/m2。
5、再生障礙性貧血長期應用rhG-CSF治療5例難治性再障，1--2月后所有患者白細胞明顯上升，ANC平均增加27倍，其中2例患者貧血改善。黎民君報道15例合并感染的再障患者，經rhG-CSF治療后外周血白細胞計數上升3倍-8倍，ANC計數上升2.4倍-6倍，而PLT及Hb無明顯變化；rhG-CSF治療后2d-14d，發熱、感染得到控制。停用G-CSF后3d-10d，外周血白細胞計數基本恢復治療前的水平[23]。
6、系統性紅斑狼瘡在系統性紅斑狼瘡(SLE)的治療中，由于疾病本身或應用環磷酞胺引起的粒細胞減少癥及由此而繼發的感染，常常不得不中斷治療而影響療效。王振剛報道的5例SLE病人在WBC低于3.0×109/L或者出現感染時停用CTX，應用rhG-CSF。在使用后第3d即可出現WBC明顯回升，隨著WBC升高，炎癥消退，CTX得以繼續應用。
7、G-CSF在急性心肌梗死中的治療作用G-CSF是骨髓干細胞的強有力動員劑，能動員骨髓中的兩類干細胞造血干(祖)細胞和基質干細胞進入外周血流。這兩種細胞都具有高度的可塑性，可分化為神經細胞、成骨細胞、干細胞和心肌細胞等。而不同種類的細胞形成心肌細胞和血管內皮細胞的能力并不一樣，用G-CSF動員骨髓中干細胞至外周血使其“募集”到梗死區修復心肌，可能比移植單一種類型的干細胞更為有效。正常生理狀態下，骨髓中造血干細胞(HSC)約占有核細胞的0.1％-1％，而在外周血中僅占0.01％。G-CSF在臨床上已廣泛用于外周血造血干細胞的動員以獲得足夠數量的干細胞，但目前對HSC動員的確切機制尚未完全了解[Kronenwett R，Martin S，Haas R.The role of cytokines andadhesion molecules for mobilization of peripheral blood stemcells.Stem Cells，2000，18(5)320-330]。
8、調節免疫應答rhG-CSF是一種具有多潛能的造血因子，它不但能夠促進骨髓前體細胞的增殖分化，提高外周血細胞的水平；而且可以通過多種機制激活機體的T細胞、內皮細胞等，發揮免疫調節作用。它還能夠增強抗原遞呈細胞(APC)的功能，增加細胞表面MHC分子、協同刺激分子(CM)和黏附分子的表達，促進細胞分泌細胞因子等，參與機體的免疫調節，呈現免疫佐劑的作用PA，rhC-CSF用于病毒性肝炎的治療，能增強抗病毒藥物的治療效果，增強宿主對肝炎疫苗的應答反應，艾滋病人發生機會性感染和腫瘤增多，應用rhG-CSF對HIV相關性疾病的白細胞減少有效。
rhG-CSF的毒副作用大多數患者能耐受G-CSF短期應用的毒副作用。rhG-CSF的主要不良反應表現為關節痛、骨痛、肌肉酸痛、低熱等感冒樣癥狀，肝功ALT(丙氨酸氨基轉移酶)輕度升高，皮疹等等，停藥后會自動緩解。rhG-CSF引起過敏變態反應的發生率很低，發生的遲早不一，但可能出現呼吸窘迫綜合征，不可忽視。某些患者會出現首次劑量反應，表現為缺氧、低血壓綜合征，毛細血管滲出綜合征如水儲留、全身水腫、紅皮病等。
此外，臨床應用時還應注意的是，rhG-CSF可導致特殊的類白血病反應，即外周血出現幼稚細胞，骨髓中原始細胞數量增加，但這種現象呈一過性，應注意結合病史進行判斷分析。髓系惡性白血病患者治療較棘手，因rhG-CSF可以使某些骨髓增生性綜合征(MDS)病例向真正的白血病轉化。
在AMI的病人，對G-CSF的副作用最為關注的莫過于血液高凝狀態，再次引起心絞痛或AMI。對于AMI病人，本身白細胞較發病前升高，加上G-CSF刺激白細胞升高和引起的凝血因子改變可加重血液的高凝狀態。有報道，使用G-CSF時，控制白細胞在70×109/L是安全的。但對于AMI病人，權衡利弊，G-CSF還是極具治療價值的。
目前G-CSF的使用必需是靜脈注射和皮下注射給藥方式，長期采用注射途徑給病人(除血透病人)帶來痛苦和不便，如果改用非創傷性給藥方式如皮膚或粘膜穿透給藥，易被病人接受，而且通過皮膚進入體內還可以提高安全性及延長藥物的半衰期。
為解決以上問題，本發明利用能高效攜帶蛋白質分子穿透生物膜包括皮膚、粘膜、血腦屏障的小分子轉導肽(Protein TransductionDomain，PTD)，將原核表達的重組G-CSF通過非創傷性給藥方式進入體內，從而達到治療貧血的目的。
轉導肽是一種能高效穿過生物膜的蛋白轉導結構域，它能將與其共價連接的多肽、蛋白質及DNA等分子跨膜導入幾乎所有的組織和細胞，還可以穿過血腦屏障。1988年Green發現HIV的Tat蛋白能夠高效地自由進出細胞。1994年Fawell將TAT的36Aa的區域化學交聯到異源蛋白上后，交聯蛋白也可轉導入細胞內。Schwarze SR等人將TAT的PTD區域短肽與大分子半乳糖苷酶在原核細胞中融合表達后，將融合蛋白在小鼠體內注射，發現有活性的酶分子在體內的各組織中都有表達，尤為重要的是可以通過血腦屏障。除TAT肽外，來自果蠅觸角足同源異型轉錄因子Antp的43-58位的多肽序列，來自瘡疹單病毒DNA結合蛋白VP22的267-300序列均具有與TAT肽完全相似的轉導功能和轉導機制，它們被統稱為PTD。
發明內容
本發明一個方面涉及轉導肽-人源粒細胞集落刺激因子融合蛋白。本發明中，用于轉導所述人源粒細胞集落刺激因子的轉導肽可以選自反式激活蛋白TAT的PTD序列、果蠅同源異型轉錄因子ANTP和單純皰疹病毒I型VP22轉錄因子的PTD序列或其功能性類似物或片段。優選的，所述轉導肽具有SEQ ID NO2(YGRKKRRQRRR)所述的氨基酸序列或其功能性片段。實際上，只要能夠轉導本發明所述人源粒細胞集落刺激因子的轉導肽均適用于本發明。
本發明中，所述融合蛋白的人源粒細胞集落刺激因子含有SEQ IDNO4(TPLGPASSLP QSFLLKCLEQ VRKIQGDGAA LQEKLCATYK LCHPEELVLLGHSLGIPWAP LSSCPSQALQ LAGCLSQLHS GLFLYQGLLQ ALEGISPELGPTLDTLQLDV ADFATTIWQQ MEELGMAPAL QPTQGAMPAF ASAFQRRAGGVLVASHLQSF LEVSYRVLRH LAQP)的氨基酸序列或其功能性片段。優選的，人源粒細胞集落刺激因子由SEQ ID NO4組成。
另一方面，本發明涉及轉導肽與人源粒細胞集落刺激因子的融合蛋白，該融合蛋白優選具有SEQ ID NO6(YGRKKRRQRRR GGS TPLGPASSLPQSFLLKCLEQ VRKIQGDGAA LQEKLCATYK LCHPEELVLL GHSLGIPWAPLSSCPSQALQ LAGCLSQLHS GLFLYQGLLQ ALEGISPELG PTLDTLQLDVADFATTIWQQ MEELGMAPAL QPTQGAMPAF ASAFQRRAGG VLVASHLQSFLEVSYRVLRH LAQP)的氨基酸序列。本發明還涉及編碼所述轉導肽-人源粒細胞集落刺激因子融合蛋白的核酸分子。
本發明的再一方面涉及含有上述編碼本發明轉導肽-人源粒細胞集落刺激因子融合蛋白的核苷酸的核酸分子，所述核酸分子優選為SEQ ID NO5(TAC GGC CGC AAG AAA CGC CGC CAG CGC CGC CGC GGTGGTACC actccactgg gtccggcaag cagcctgccg cagagcttcc tgctgaagtgcctggagcaa gtgcgtaaga tccagggcga tggcgcagcg ctgcaggagaagctgtgtgc cacctacaag ctgtgccacc cggaggagct ggtgctgctgggtcacagcc tgggcatccc gtgggcaccg ctgagcagct gcccgagccaggccctgcag ctggcaggct gcctgagcca actgcatagc ggcctgttcctgtaccaggg tctgctgcag gccctggaag gcatcagccc ggagctgggtccgaccctgg acaccctgca gctggacgtc gccgactttg ccaccaccatctggcagcag atggaagaac tgggtatggc cccggccctg cagccgacccagggtgccat gccggccttc gccagcgcgt tccagcgccg tgcaggcggtgtcctggttg ccagccatct gcagagcttc ctggaggtga gctaccgcgttctgcgccac ctggcccagc cgtaa)所示的核苷酸序列。
上述核苷酸序列可以插入表達載體中。優選的，本發明所述表達載體為原核或真核表達載體，其中優選為pGEX、pET、pBV220和pcDNA。
本發明通過將所述核酸分子導入原核表達載體pET28，pGEX-4T-1等中，通過原核細胞培養獲得與轉導肽融合表達的人源G-CSF。
方法易于操作、成本低、轉導效率高。蛋白純化在變性條件下進行，使以包涵體形式存在的融合蛋白的純化過程大大簡化。使變性蛋白的天然構象變成相對靈活的鏈狀結構，擺脫空間構象的限制，具備更高的能量，使轉導效率大大提高。當融合蛋白轉入細胞后，重新折疊，恢復天然構象使G-CSF發揮其生物學活性，而與其共價連接的蛋白轉導域不影響細胞的正常結構或功能。
本發明又一方面涉及含有本發明所述融合蛋白的藥物組合物，用于腫瘤放化療后的中性粒細胞減少、骨髓移植后的造血恢復、外周血干細胞動員、抗感染治療、再生障礙性貧血、系統性紅斑狼瘡、調節免疫應答等的治療。
所述藥物組合物可以含有非注射劑型常用的藥學可接受的載體或賦形劑。優選的，本發明所述劑型為可穿越皮膚、粘膜、角膜、結膜、漿膜、肌膜、血管及淋巴管膜、脈絡膜、神經膜、血腦屏障等一切細胞膜及生物膜的劑型。
借助本發明的融合蛋白，可以經非注射途徑將人源粒細胞集落刺激因子輸入機體，使臨床用藥更為安全、方便。
實施例實施例1 人脾臟單核細胞mRNA的提取取外傷后破裂切除之新鮮脾臟，制備組織懸液，經Ficoll淋巴細胞分離液分離單核細胞，培養2h除去非貼壁細胞，在含LPS(300ug/ml)培養液中繼續培養2.5h后收集細胞，采用Promega公司的RNAgentsRTotal RNA Isolation System提取總RNA，再用Oligo(dt)親和層析柱純化得到Poly(A)+mRNA。
實施例2 hG-CSF cDNA的克隆參考Genebank中hG-CSF cDNA序列設計引物第2個引物作為逆轉錄的引物。
引物15′-GGAATTCACACCATTAGGCCCTGCCAGCTCCCTG-3′(SEQ IDNO7)引物25′-GGGATCCTCAGGGCTGGGCAAGGTGGCGTAGAAC-3′(SEQ IDNO8)以實施例1得到的mRNA作為模板，參照試劑盒廠家推薦方案進行RT-PCR擴增，獲得全長的hG-CSF cDNA，其5′和3′端分別攜帶EcoRI，BamH I位點。
實施例3 重組hG-CSF表達質粒構建與鑒定上述hG-CSF的RT-PCR產物經EcoRI和BamHI雙酶切后，與經同樣酶切回收的表達載體pBV220片段，按4∶1摩爾比連接，轉化感受態大腸桿菌DH5α，篩選陽性重組子pBV hG-CSF。送上海申工公司測序。
實施例4 pBV hG-CSF在大腸桿菌中的誘導表達將過夜培養的實施例3中篩選得到的陽性單菌落接種于LB液體培養基中(含Amp 60mg/L)，于30℃培養至OD600＝0.45后，迅速升溫至42℃，誘導5h左右，至OD600＞1.2。于4℃下6000g離心10min，收集菌體。SDS-PAGE電泳鑒定rhG-CSF的表達水平，并鑒定表達形式。
實施例5 rhG-CSF的復性與純化將上述誘導表達后的菌體超聲破解。12000g離心20min，棄上清。沉淀經洗滌、溶解、復性。上樣于用20mmol/L NaAc-HAC pH4.0平衡的CM-Sepharose FF層析柱，用含1.0mol/L NaCl的該緩沖液線性梯度洗脫，收集各蛋白峰，電泳鑒定rhG-CSF目標蛋白峰后，用相應鹽濃度的系統緩沖液洗脫，并規模制備。
實施例6 生物活性測定采用小鼠白血病細胞株NFS-60依賴性MTT測定法。將NFS-60在含10ng/ml G-CSF的完全培養基RPMI-1640中傳代。檢測當天，NFS-60用RPMI-1640洗3遍(1000r/min離心5min)，用含15％血清的培養基調整為5×104/ml。樣品根據測算蛋白濃度稀釋至10ng/ml，hG-CSF標準品和待測樣品均倍比稀釋。陰性對照不加G-CSF。細胞在50％CO2，37℃飽和濕度環境下培養72h。加MTT顯色液及溶解液二甲基亞砜，用570nm波長濾光片測OD值。
按下式計算rhG-CSF活性單位
根據蛋白濃度計算每毫克rhG-CSF的單位數即為比活性(U/mg)。
序列表<110>中國人民解放軍軍事醫學科學院毒物藥物研究所<120>轉導肽-人源粒細胞集落刺激因子融合蛋白及其藥物組合物<160>8<210>1<211>33<212>DNA<213>編碼PTD的核苷酸序列<400>ITACGGCCGCA AGAAACGCCG CCAGCGCCGC CGC 33<210>2<211>11<212>氨基酸序列<213>PTD的氨基酸序列<400>2YGRKKRRQRR R 11<210>3<211>525<212>DNA<213>編碼人源粒細胞集落刺激因子的核苷酸序列<400>3actccactgg gtccggcaag cagcctgccg cagagcttcc tgctgaagtg cctggagcaagtgcgtaaga tccagggcga tggcgcagcg ctgcaggaga agctgtgtgc cacctacaagctgtgccacc cggaggagct ggtgctgctg ggtcacagcc tgggcatccc gtgggcaccgctgagcagct gcccgagcca ggccctgcag ctggcaggct gcctgagcca actgcatagcggcctgttcc tgtaccaggg tctgctgcag gccctggaag gcatcagccc ggagctgggtccgaccctgg acaccctgca gctggacgtc gccgactttg ccaccaccat ctggcagcagatggaagaac tgggtatggc cccggccctg cagccgaccc agggtgccat gccggccttcgccagcgcgt tccagcgccg tgcaggcggt gtcctggttg ccagccatct gcagagcttcctggaggtga gctaccgcgt tctgcgccac ctggcccagc cgtaa525<210>4<211>174<212>氨基酸序列<213>人源粒細胞集落刺激因子的氨基酸序列<400>4TPLGPASSLP QSFLLKCLEQ VRKIQGDGAA LQEKLCATYK LCHPEELVLL GHSLGIPWAPLSSCPSQALQ LAGCLSQLHS GLFLYQGLLQ ALEGISPELG PTLDTLQLDV ADFATTIWQQMEELGMAPAL QPTQGAMPAF ASAFQRRAGG VLVASHLQSF LEVSYRVLRH LAQP 174
<210>5<211>567<212>DNA<213>編碼PTD-人源粒細胞集落刺激因子融合蛋白的核苷酸序列<400>5tacggccgca agaaacgccg ccagcgccgc cgcggtggta ccactccact gggtccggcaagcagcctgc cgcagagctt cctgctgaag tgcctggagc aagtgcgtaa gatccagggcgatggcgcag cgctgcagga gaagctgtgt gccacctaca agctgtgcca cccggaggagctggtgctgc tgggtcacag cctgggcatc ccgtgggcac cgctgagcag ctgcccgagccaggccctgc agctggcagg ctgcctgagc caactgcata gcggcctgtt cctgtaccagggtctgctgc aggccctgga aggcatcagc ccggagctgg gtccgaccct ggacaccctgcagctggacg tcgccgactt tgccaccacc atctggcagc agatggaaga actgggtatggccccggccc tgcagccgac ccagggtgcc atgccggcct tcgccagcgc gttccagcgccgtgcaggcg gtgtcctggt tgccagccat ctgcagagct tcctggaggt gagctaccgcgttctgcgcc acctggccca gccgtaa 567<210>6<211>188<212>氨基酸序列<213>轉導肽-人源粒細胞集落刺激因子的氨基酸序列<400>6YGRKKRRQRR RGGSTPLGPA SSLPQSFLLK CLEQVRKIQG DGAALQEKLC ATYKLCHPEELVLLGHSLGI PWAPLSSCPS QALQLAGCLS QLHSGLFLYQ GLLQALEGIS PELGPTLDTLQLDVADFATT IWQQMEELGM APALQPTQGA MPAFASAFQR RAGGVLVASH LQSFLEVSYRVLRHLAQP 188<210>7<211>34<212>DNA<213>引物<400>7GGAATTCACACCATTAGGCCCTGCCAGCTCCCTG 34<210>8<211>34<212>DNA<213>引物<400>8GGGATCCTCAGGGCTGGGCAAGGTGGCGTAGAAC 3權利要求
1.一種融合蛋白，其含有轉導肽和人源粒細胞集落刺激因子。
2.權利要求1的融合蛋白，其中所述轉導肽選自反式激活蛋白TAT的PTD序列、果蠅同源異型轉錄因子ANTP和單純皰疹病毒I型VP22轉錄因子的PTD序列或其功能性類似物或片段。
3.權利要求2的融合蛋白，其中所述轉導肽具有SEQ ID NO2的序列或其功能性片段。
4.權利要求1-3中任一項的融合蛋白，其中所述人源粒細胞集落刺激因子具有SEQ ID NO4的序列。
5.權利要求1的融合蛋白，其具有SEQ ID NO6的序列。
6.核酸分子，其編碼權利要求1-5中任一項的融合蛋白。
7.權利要求6的核酸分子，其具有SEQ ID NO5的序列。
8.包含權利要求7的核酸分子的表達載體。
9.藥物組合物，其含有權利要求1-5中任一項的融合蛋白。
10.權利要求9的藥物組合物，其劑型為可穿越皮膚、粘膜、角膜、結膜、漿膜、肌膜、血管及淋巴管膜、脈絡膜、神經膜、血腦屏障等一切細胞膜及生物膜的劑型。
11.權利要求1-5中任一項的融合蛋白在制備藥物中的應用，所述藥物用于治療腫瘤放化療后的中性粒細胞減少、骨髓移植后的造血恢復、外周血干細胞動員、抗感染治療、再生障礙性貧血、系統性紅斑狼瘡、調節免疫應答。
全文摘要
本發明涉及一種轉導肽－人源粒細胞集落刺激因子融合蛋白以及含有編碼所述融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子。本發明還涉及含有上述核酸分子的表達載體。本發明還涉及所述融合蛋白在制備藥物中的應用，所述藥物用于腫瘤放化療后的中性粒細胞減少、骨髓移植后的造血恢復、外周血干細胞動員、抗感染治療、再生障礙性貧血、系統性紅斑狼瘡、調節免疫應答等治療。
文檔編號A61P37/02GK101074266SQ20061008245
公開日2007年11月21日 申請日期2006年5月19日 優先權日2006年5月19日
發明者李前, 孫曼霽 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院毒物藥物研究所