以腺病毒為載體乳腺表達生產轉基因蛋白藥物的方法

專利名稱：以腺病毒為載體乳腺表達生產轉基因蛋白藥物的方法
技術領域：
本發明屬于細胞生物學、分子生物學和基因工程技術領域，尤其是一種以腺病毒為載體乳腺表達生產轉基因蛋白藥物的方法。
背景技術：
轉基因動物技術可按照人們的意愿將所需目標蛋白通過動物體表達生產，從而轉基因動物成為活的“藥物工廠”。其中，動物乳腺生物反應器是轉基因蛋白藥物生產中最為熱門的研究之一，其原理是利用哺乳動物乳腺特異性表達的啟動子元件構建轉基因動物，指導外源基因在動物乳腺中表達，并從轉基因動物乳腺分泌的乳中獲取需要的重組藥用或保健蛋白。
其常規方法是利用DNA基因重組技術和轉基因技術將表達目標蛋白的基因導入到動物早期受精胚胎中，再經胚胎移植技術，獲得整合有目標基因的乳腺表達個體，轉基因后代再經過進一步繁育，通過檢測篩選獲得穩定表達有目標蛋白的轉基因群體。從而可通過轉基因動物的乳汁，來獲得目的基因表達產物即藥用或保健蛋白。其主要步驟包含(1)構建乳腺特異表達載體，在構建乳腺表達的外源基因時，外源基因在乳腺特異性表達需要乳蛋白基因的一個啟動子和調控區，即要有一個引導泌乳期乳蛋白基因表達的序列，這樣才能將外源基因置于乳腺特異性調節序列控制之下，使其在乳腺中表達，再通過回收乳汁得到目標蛋白。(2)通過各種轉基因方法將乳腺特異表達載體導入原核期胚胎或體細胞，獲得重組胚胎或轉基因細胞；(3)將篩選正確的轉基因胚胎或轉基因體細胞，通過胚胎移植或核移植技術獲得轉基因動物個體；(4)將轉基因動物個體進一步繁育，檢測篩選后代目標基因蛋白表達，獲得穩定遺傳健康的轉基因動物。
目前，乳腺生物反應器的應用主要體現在四個方面一是建立轉基因動物生物反應器模型，如利用轉基因小鼠可為其它轉基因動物生物反應器的研究和應用開辟道路；二是生產藥用珍稀的蛋白或因子，如導入人凝血因子等；三是提高乳汁的營養價值，并降低有害物質的含量，如導入乳鐵蛋白基因以提高乳鐵蛋白在乳中的含量，導入溶菌酶基因以降低乳中細菌的含量。四是改變乳汁的組成成分，使其性質更接近人乳，提高動物乳汁的應用價值，更好的為人類服務。
由此可見，利用乳腺生物反應器原理生產基因工程蛋白藥物是目前國際上的研究熱點，外源基因蛋白可在動物乳腺上皮細胞中表達，并分泌到乳汁中，從而在動物乳汁中獲得重組蛋白藥物。因而，動物乳腺成為生產基因工程蛋白藥物的首選體系，目前通過原核顯微注射或體細胞核移植轉基因技術已成功獲得了表達人類重要藥用蛋白或生物活性因子的轉基因牛、羊、兔、豬等。然而，該技術仍存在不可避免的缺陷(1)是需要復雜的技術程序操作，導致轉基因結果不穩定。(2)該法在大動物上轉基因成功率極低，造成生產成本居高不下。(3)由于轉入的外源目標基因的位置效應，使得目標基因表達水平很低。(4)外源基因在動物體內的異源表達往往給動物健康造成傷害，影響基因工程蛋白藥物的生產。本發明針對上述技術體系缺陷，首次以腺病毒為載體，研制開發了導入動物乳腺生產基因工程蛋白藥物的方法。本技術發明的優勢在于(1)不需要構建乳腺特異表達載體，從而簡化了轉基因蛋白藥物生產程序；(2)以腺病毒為載體直接導入乳腺，可獲得高表達的目標蛋白藥物；(3)乳腺組織可以對人體蛋白質進行正確的修飾和轉錄后加工，蛋白藥物產品的生物學活性接近天然產品(4)目標蛋白藥物在乳腺中高水平短期表達，無需對動物進行長期維持培育，大大降低了生產成本。
腺病毒(adenovirus)是線狀雙鏈DNA病毒，基因組內有14個基因。其形態特征表現為二十面體病毒殼體。其病毒殼體含有3種主要的蛋白六鄰體(II)，五鄰體基底(III)和纖突(IV)，還有多種其他的輔助蛋白VI，VIII，IX，IIIa和Iva2。腺病毒基因組是一個線性的雙鏈DNA，其5′端與一種末端蛋白(TP)共價結合，5′端上還具有末端反向重復序列(ITRS)。病毒DNA與核心蛋白VII和一個稱為mu的小肽緊密結合。另一種蛋白V包被在DNA-蛋白復合物上，并且通過蛋白VI為DNA-蛋白復合物和病毒殼體之間提供了結構上的聯系。病毒含有一種病毒自身編碼的蛋白酶，這種蛋白酶對于加工某些結構蛋白從而產生成熟的具有感染性的病毒是必需的。腺病毒載體的主要特點是(1)宿主范圍較廣，不僅能感染分裂期的細胞，也能感染非分裂期的細胞，如神經細胞。(2)腺病毒載體不會整合進入宿主細胞基因組，而是以附加體形式游離在宿主細胞基因組外，這樣就避免了病毒載體插入宿主細胞基因組可能引起基因突變等后果，因而使用時更安全。
至今，國內外有關腺病毒載體的應用一直側重于基因治療方面，由于腺病毒可將自身的基因組傳遞到細胞核中，并且高效率地復制，所以腺病毒一直成為表達和傳遞治療型基因的主要候選載體。目前國際上有關腺病毒基因治療的臨床實例應用已上千種，而國內近3年來也已批準了3個有關腺病毒載體應用于人類基因治療的基因工程藥物。但是，迄今為止，腺病毒載體在重組藥物蛋白生產方面至今未見到相關應用報道。

發明內容
為了克服目前轉基因蛋白藥物生產種存在的上述技術體系缺陷，本發明提供一種以腺病毒為載體乳腺表達生產轉基因蛋白藥物的方法。該發明首次以腺病毒為載體，將其導入動物乳腺，獲得高質量、高表達的重組基因蛋白藥物，該方法進一步拓展了腺病毒載體的應用，是乳腺生物反應器原理生產轉基因蛋白藥物產品的新應用。該方法無論在轉基因技術理論領域，還是在基因工程藥物生產方面，均具有其創造性和實用性。
本發明的技術方案由以下步驟組成(1)分離、克隆目標藥物蛋白基因序列以pUC18、pUC19、pGEM-3ZF、pShuttle、pcDNA3系列質粒為克隆載體，將目標蛋白或細胞因子hLTF(人乳鐵蛋白基因)hGH(人生長激素基因)、hEPO(人促紅細胞生成素)、t-PA(組織型纖溶酶原激活劑)、IL-15(白細胞介素-15)、human Protein C(人蛋白C)、IL-2(白細胞介素-2)、hVEGF(血管內皮細胞生長因子)、NKSF(自然殺傷細胞刺激因子)、HGF(肝細胞生長因子)10種基因通過分子克隆，分別獲得了含有目標基因的質粒系列載體；(2)將所克隆目標蛋白基因與單標記篩選載體或雙標記選擇載體構成融合真核表達載體，體外真核細胞表達檢測目標蛋白，獲得體外表達正確的藥物蛋白基因以COS7(非洲綠猴腎細胞)、CHO(中國倉鼠卵巢細胞)、HEK293(人胚胎腎細胞)為宿主細胞對所構建的真核融合蛋白表達載體進行體外表達。Western Blotting、ELASA檢測目標基因表達水平，獲得了體外表達正確的所需蛋白藥物基因；(3)將所需目標蛋白基因與腺病毒基因組骨架分子重組，獲得含重組目標藥物蛋白基因的腺病毒載體將所需目標基因接入穿梭載體，再與腺病毒基因組骨架質粒在細菌或真核細胞中重組，并在腺病毒包裝細胞系生產出含有重組目標蛋白基因的復制缺陷型腺病毒載體；(4)將該重組目標藥物蛋白基因腺病毒載體導入動物乳腺以含有重組目標蛋白基因的復制缺陷型腺病毒為載體，直接導入動物乳腺，使目標蛋白基因在乳腺上皮細胞內表達，利用乳腺上皮細胞基本特性，將目標蛋白分泌到動物乳汁中；(5)乳汁中分泌獲得所需目標藥物蛋白，獲得高表達目標蛋白藥物的動物。
其中步驟一中所使用目標蛋白基因主要包括hLTF(人乳鐵蛋白基因)hGH(人生長激素基因)、hEPO(人促紅細胞生成素)、t-PA(組織型纖溶酶原激活劑)、IL-15(白細胞介素-15)、human Protein C(人蛋白C)、IL-2(白細胞介素-2)、hVEGF(血管內皮細胞生長因子)、NKSF(自然殺傷細胞刺激因子)、HGF(肝細胞生長因子)。
其中步驟一中克隆分離的目標蛋白基因大小范圍在0.5kb-10Kb之間，乳汁中均可獲得重組目標蛋白，且具有與天然蛋白相同或相似的生物學功能。
其中步驟二中所用表達載體pCDNA3.1(INVITROGEN)含有NEO(新霉素抗性基因)抗性標記，可進行抗性陽性細胞蛋白表達篩選。所用雙標記選擇載體為pGFP-IRES-NEO(CLONTECH)，增添了綠色熒光表達陽性細胞克隆篩選功能。
其中步驟二中，所使用宿主細胞為COS7(非洲綠猴腎細胞)、CHO(中國倉鼠卵巢細胞)、HEK293(人胚胎腎細胞)，使用轉染方法為用常規磷酸鈣法或脂質體法作瞬時轉染或穩定轉染不同細胞，瞬時轉染48-72h，穩定轉染經G418抗性篩選陽性細胞克隆，分別對轉染細胞上清或細胞沉淀進行免疫印跡檢測基因表達產物。
其中步驟二中，所用表達載體pCDNA3.1含有NEO(新霉素抗性基因)抗性標記，可進行抗性陽性細胞蛋白表達篩選。所用雙標記選擇載體為pGFP-NEO，增添了綠色熒光表達陽性細胞克隆篩選功能。
其中步驟三中，腺病毒骨架序列保留了野生型腺病毒大部分基因組序列，刪除了E1、E3以及IVa2，允許插入最大約14kb的目標蛋白核苷酸序列。
其中步驟三中，所用穿梭載體為pShuttle(STRAGENE)或pshuttle-cmv(STRAGENE)、pDC311(MICROBIX)或pDC315(MICROBIX)，所用腺病毒骨架質粒為pAdeasy(STRAGENE)或pBHGlox(delta)E1.3Cre(MICROBIX)。
其中步驟三中所用腺病毒包裝系細胞為911、HEK293。
其中步驟四中，將獲得的重組腺病毒載體經兩輪氯化銫密度梯度離心純化后，PBS(pH7.2)溶解，滴度范圍106-1012PFU/ml，直接導入動物乳腺。
其中步驟五中所述重組蛋白乳汁，經過常規緩沖液稀釋后，通過常規高速離心方法，從乳清中獲取目標蛋白藥物。
本發明中所述生產重組藥物蛋白在動物乳汁中持續表達時間為10-20天，目標蛋白表達量為0.3g-8g/L。
本發明所使用的技術路線適合于腺病毒為載體進行乳腺表達的牛、羊、豬和兔生產所需目標藥物蛋白。
本發明的有益效果(1)選用乳腺生產蛋白藥物具有優勢動物乳腺是一個封閉系統，乳腺組織內環境表達的蛋白具有接近天然蛋白生物活性，可對外源目標基因蛋白進行復雜修飾功能，且乳腺表達的蛋白大多不會回流到血液循環，避免高表達的外源蛋白對動物造成傷害。(2)選用復制缺陷型腺病毒載體是真核表達載體系統，可正確運載并高效表達目標蛋白藥物基因。由于腺病毒載體不整合進宿主細胞基因組，而是以附加體形式游離在宿主細胞基因組外，這樣就避免了病毒載體插入宿主細胞基因組可能引起基因突變等后果，因而使用時更安全。(3)動物乳腺組織是一種有效的活的“蛋白合成工廠”。例如，一頭奶牛一天可生產乳20-60kg，一只綿羊和山羊一天可產乳2-5kg，如將把百分之一的乳合成藥用蛋白，可產生十分可觀的效益。(4)縮短新藥開發周期，降低新藥研發成本。傳統藥物研發到藥審，直到上市，整個過程需要10-15年，如果利用本發明方法進行新藥研發周期僅需3-5年。大大降低了藥物研發成本，特別是人類昂貴藥物蛋白研發，可產生巨額經濟利潤。


圖1重組hLTF基因腺病毒載體限制性酶切圖譜泳道0為標準DNAMaker λ/EcoR I+Hind III，片斷大小依次為21226bp、5148bp、4973bp、4268bp、3530bp、2027bp、1904bp、1584bp、1357bp、947bp、831bp、564bp、125bp；泳道1、3、5、7、9為腺病毒基因組DNA限制性內切酶切片斷作為對照；所用內切酶分別為EcoR V、KpnI、Sal I、Sph I、Pac I；泳道2、4、6、8、10為重組hLTF腺病毒載體限制性內切酶切片斷；所用內切酶同上分別為EcoR V、KpnI、Sal I、Sph I、Pac I；圖2重組腺病毒基因組瓊脂糖電泳圖泳道M為標準DNAMaker Lambda DNA/Hind III酶切片斷大小依次為27491bp、9416bp、6557bp、2322bp、2027bp、564bp；泳道1、2、3、4均為含重組正確的目標基因腺病毒載體質粒；圖3乳腺表達hLTF羊乳清樣SDS-PAGE蛋白電泳及Western免疫印跡結果左邊泳道為標準蛋白Maker，其大小依次為83KD、62KD；泳道S為hlTF標準品；泳道0為正常未轉病毒的羊乳清，為陰性對照；泳道A為2號產目標蛋白羊乳清樣；圖4乳腺表達hLTF兔乳清樣SDS-PAGE蛋白電泳及Western免疫印跡結果左邊泳道為標準蛋白Maker，其大小依次為25KD、15KD；泳道S為hGH標準品；泳道1、2、3分別為1、2、3號兔表達有hGH的乳清樣；圖5雙標記選擇載體pGFP--neo質粒結構圖pCMV為病毒啟動子，IRES為核糖體內部進入位點序列，Neomycin為Neo-即新霉素抗性基因；GFP基因插入MCS A位點，表達綠色熒光蛋白基因。
圖6腺病毒骨架載體pAdeasy結構圖pBR322ori為原核復制子，AD5為腺病毒骨架基因組DNA，其上下游為2個同源臂序列，即left arm和right arm。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明作進一步說明實施例1以腺病毒為載體導入羊乳腺表達生產人乳鐵蛋白。
(一)分離、克隆目標藥物蛋白基因序列1.人乳腺組織總RNA的提取(1)切取一小塊冷凍的乳腺組織，快速稱量后即移入新鮮配制的裂解緩沖液中，按每50mg組織加裂解緩沖液1ml量。
(2)對乳腺組織進行勻漿破細胞，預過濾離心一次，收集慮出液。
(3)加入等體積氯仿，振蕩混勻，離心后吸取上清。
(4)加入等體積70％乙醇，輕輕混勻，離心獲得總RNA。
(5)用0.01％DEPC處理過的無Rnase的水溶解沉淀，常規方法進行含量測定。
2.反轉錄法合成總cDNA(1)取1-2ug乳腺總RNA，加入DEPC處理的水至9.5ul，70℃，5-10min，放于冰上。
(2)50uL反應體系2.5ul OligodT(20pmol/L)，5uL 10×RNA PCRbuffer，10ul MgCl2(25mmol/L)，5uL dNTP(各10mmol/L)，1.25uL Rnase抑制劑(40U/uL)，2.5uL AMV反轉錄酶(5U/uL)，加入9.5uL處理后的總RNA。
(3)反應條件先放于30℃保溫10min，然后于42℃保溫15min，再于99℃保溫5min，然后于4℃保溫10min，最后將產物保存于-70℃備用。
3.利用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增hLTF cDNA(1)設計如下特異引物用于PCR擴增，使引物終濃度為20uM。
(2)hLTF上游引物atgaaacttgtcttcctcgtcctghLTF下游引物ttacttcctgaggaattcacagg(3)100uL反應體系中連續加入10×PCR buffer 10uL，dNTP(各2.5mmol/L)16uL，上游引物1ul，下游引物1ul，取2中合成的cDNA產物2uL，補加dH2O至100uL。
(4)PCR反應條件94℃預變性5min，97℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸3min，30個循環，72℃再延伸10min。產物保存于-70℃備用。
4.hLTF基因的純化將hLTF PCR產物純化，使用商用試劑盒，如BIOTECH公司或V-GENE公司的PCR產物快速純化KIT。
(1)標準瓊脂電泳分離上述PCR產物，瓊脂糖濃度為1％，100V穩壓狀態，電泳40min。
(2)在紫外燈下，切取凝膠上DNA約2.2K大小的片斷，并稱重。
(3)按試劑盒說明要求，一定比例加入溶膠緩沖液，于37-55℃溶膠，期間不停晃動。
(4)添加溶膠后樣品于吸附柱子上，吸附DNA，用Washing Buffer漂洗2次。
(5)加入dH2O于吸附柱子中，離心洗脫DNA，于-20℃保存。
5.hLTF cDNA的克隆、擴增將PCR純化產物用適當酶切后，同時用將PUC18克隆載體用相同酶切后進行連接反應。
(1)連接反應1uL PCR純化產物，0.5uLPUC18質粒，0.5uL T4DNALigase酶，1uL 10×T4DNA Ligase Buffer，7uL dH2O。16℃過夜孵育。
(2)細菌轉化取5-10ul上述連接反應產物，用常規CaCL2化學法，熱刺激轉化感受態DH5a。
(3)轉化菌鋪板于氨芐抗性(100ug/mLAmp+)的固體細菌培養板，37℃培養。
(4)次日，挑取單菌落，接種于3-5mL液體LB培養液中，37℃保溫10-15h。
(5)常規堿裂解法小提質粒，限制性酶切分析重組質粒。
6.hLTF基因序列測定將限制性酶切分析正確的重組陽性質粒，純化后送至基因測序公司進行基因序列測定。本基因序列在上海INVITROGEN生物公司完成了測序，應用國際上通用BLAST基因序列軟件對測序分析結果表明，所克隆的序列與國際GENE BANK中目標蛋白序列完全一致，其完整的基因序列如下atgaaacttg tcttcctcgt cctgctgttc ctcggggccc tcggactgtg tctggctggccgtaggagaa ggagtgttca gtggtgcacc gtatcccaac ccgaggccac aaaatgcttccaatggcaaa ggaatatgag aagagtgcgt ggccctcctg tcagctgcat aaagagagactcccccatcc agtgtatcca ggccattgcg gaaaacaggg ccgatgctgt gacccttgatggtggtttca tatacgaggc aggcctggcc ccctacaaac tgcgacctgt agcggcggaagtctacggga ccgaaagaca gccacgaact cactattatg ccgtggctgt ggtgaagaagggcggcagct ttcagctgaa cgaactgcaa ggtctgaagt cctgccacac aggccttcgcaggaccgctg gatggaatgt ccctataggg acacttcgtc cattcttgaa ttggacgggtccacctgagc ccattgaggc agctgtggcc aggttcttct cagccagctg tgttcccggtgcagataaag gacagttccc caacctgtgt cgcctgtgtg cggggacagg ggaaaacaaatgtgccttct cctcccagga accgtacttc agctactctg gtgccttcaa gtgtctgagagacggggctg gagacgtggc ttttatcaga gagagcacag tgtttgagga cctgtcagacgaggctgaaa gggacgagta tgagttactc tgcccagaca acactcggaa gccagtggacaagttcaaag actgccatct ggcccgggtc ccttctcatg ccgttgtggc acgaagtgtgaatggcaagg aggatgccat ctggaatctt ctccgccagg cacaggaaaa gtttggaaaggacaagtcac cgaaattcca gctctttggc tcccctagtg ggcagaaaga tctgctgttcaaggactctg ccattgggtt ttcgagggtg cccccgagga tagattctgg gctgtaccttggctccggct acttcactgc catccagaac ttgaggaaaa gtgaggagga agtggctgcccggcgtgcgc gggtcgtgtg gtgtgcggtg ggcgagcagg agctgcgcaa gtgtaaccag
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(2)按照上述方法，將目標基因片斷hLTF cDNA接入pGFP-NEO雙選擇表達載體，獲得質粒載體質粒重組子pGFP-hLTF。
(3)分別將融合表達載體p3.1-hLTF與pGFP-hLTF，脂質體法轉染CHO細胞、Cos7細胞，G418抗性篩選獲得陽性細胞克隆。
(4)Western Blotting檢測分析hLTF在細胞中的表達，驗證了hLTF基因編碼蛋白的正確性。
(三)、將所需目標蛋白基因與腺病毒基因組骨架分子重組，獲得含重組目標藥物蛋白基因的腺病毒載體(1)將hLTF cDNA接入穿梭載體，與含有腺病毒基因組的骨架質粒一起構建獲得重組人乳鐵蛋白腺病毒載體AdhLTF。
(2)用重組人蛋白基因腺病毒載體AdhLTF在HEK293、911細胞系中生產病毒載體以及大量擴增。
(3)重組人蛋白基因腺病毒載體進行兩輪氯化銫密度梯度離心，獲得純化的重組人乳鐵蛋白腺病毒，存于-70℃備用。
(四)將該重組目標藥物蛋白基因腺病毒載體導入羊乳腺實驗用羊只來自附近山海關地方農戶，將重組腺病毒注入羊乳腺，每側乳頭注射量根據羊乳房生理容量。
(五)乳汁中分泌獲得所需目標藥物蛋白，獲得高表達目標蛋白藥物的羊(1)每日收集羊乳，1000rpm離心，15min，取乳清存于-70℃備后面檢測。
(2)常規SDS-PAGE蛋白電泳、Western Blotting蛋白免疫印跡、ELASA酶聯免疫法檢測乳汁中重組hLTF蛋白的表達。所用一抗為鼠抗人乳鐵蛋白單克隆抗體(Sigma公司產品)，二抗為HRP辣根過氧化酶標記抗鼠Ig(北京中山公司)，人乳鐵蛋白標準品為Sigma產品。
(3)人乳鐵蛋白生物活性檢測，根據天然人乳鐵蛋白具有的抗菌、抑菌、抗病等生物活性實驗檢測重組人乳鐵蛋白的與功能。
抑菌圈法檢測抗菌功能菌板制作20mL 2X LB培養基，加入0.2g低融點瓊脂糖，高壓滅菌，待溫度降至37℃左右時加入20mL細菌培養物，充分混勻，倒入平板內使其凝固，用無菌剪頭Tip在膠上打孔。按如下劑量向孔中加入測試物對照人乳鐵蛋白標準品(不含鐵，抽濾除菌)，100uL(0.1ug/uL)。LB培養基，100uL。未轉染乳清(抽濾除菌)，100uL。測試樣品1-7(抽濾除菌)，100uL。37℃培養過夜，觀察抑菌圈。
OD值法測抗菌活性LB液體培養基培養E.Coli JM109菌10h，OD600為1.4。取1mL培養物加到20mL新的LB培養基中，同時按下面劑量加入測試物對照人乳鐵蛋白標準品(不含鐵，抽濾除菌)，100uL(o.1ug/uL)，補加400uL無菌水；LB培養基，500uL；未轉染乳清(抽濾除菌)，500uL。測試樣品1-7(抽濾除菌)，500uL。
37℃、150rpm培養15h。取400uL培養物，以無菌LB培養基為對照，測定OD600值，每個樣品測3次，取平均值。
本發明生產的重組人乳鐵蛋白為711肽，其氨基酸序列如下MKLVFLVLLFLGALGLCLAGRRRRSVQWCAVSQPEATKCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKRDSPIQCIQAIAENRADAVTLDGGFIYEAGLAPYKLRPVAAEVYGTERQPRTHYYAVAVVKKGGSFQLNELQGLKSCHTGLRRTAGWNVPIGTLRPFLNWTGPPEPIEAAVARFFSASCVPGADKGQFPNLCRLCAGTGENKCAFSSQEPYFSYSGAFKCLRDGAGDVAFIRESTVFEDLSDEAERDEYELLCPDNTRKPVDKFKDCHLARVPSHAVVARSVNGKEDAIWNLLRQAQEKFGKDKSPKFQLFGSPSGQKDLLFKDSAIGFSRVPPRIDSGLYLGSGYFTAIQNLRKSEEEVAARRARVVWCAVGEQELRKCNQWSGLSEGSVTCSSASTTEDCIALVLKGEADAMSLDGGYVYTAGKCGLVPVLAENYKSQQSSDPDPNCVDRPVEGYLAVAVVRRSDTSLTWNSVKGKKSCHTAVDRTAGWNIPMGLLFNQTGSCKFDEYFSQSCAPGSDPRSNLCALCIGDEQGENKCVPNSNERYYGYTGAFRCLAENAGDVAFVKDVTVLQNTDGNNNDAWAKDLKLADFALLCLDGKRKPVTEARSCHLAMAPNHAVVSRMDKVERLKQVLLHQQAKFGRNGSDCPDKFCLFQSETKNLLFNDNTECLARLHGKTTYEKYLGPQYVAGITNLKKCSTSPLLEACEFLRK實施例2以腺病毒為載體導入兔乳腺表達生產人生長激素。實驗所用兔來自河北昌黎縣，兔乳腺導入載體量根據動物本身乳房容量計算。其中步驟五中獲得的目標蛋白人生長激素含量高于羊奶中重組蛋白的表達水平，為2-8g/L。其他操作方法同實施例1步驟(一)、(二)、(三)、(四)。
實施例3以腺病毒為載體導入豬乳腺表達生產人生長激素。實驗所用豬來自河北昌黎，豬乳腺導入載體量需要少量多乳頭注入，其他操作方法同實施例1步驟(一)、(二)、(三)、(四)。其中步驟五中所獲的目標蛋白hGH表達量0.3g-0.4g/L。
實施例4以腺病毒為載體導入羊乳腺表達表達生產人生長激素。實驗所用羊來自河北山海關縣，具體操作方法同實施例1步驟(一)、(二)、(三)、(四)、(五)。其中步驟五中所獲的目標蛋白hGH表達量0.5g-3.4g/L。
實施例5以腺病毒為載體導入牛乳腺表達表達生產人乳鐵蛋白。實驗所用牛來自河北昌黎縣，牛乳腺導入載體量5倍于羊的載體量，其他操作方法同實施例1步驟(一)、(二)、(三)、(四)。其中步驟五中所獲的牛乳腺中目標蛋白hGH表達量0.5g-4g/L。
權利要求
1.一種以腺病毒為載體乳腺表達生產轉基因蛋白藥物的方法，其特征在于該方法包括以下步驟(1)、分離、克隆目標藥物蛋白基因序列以pUC18、pUC19、pGEM-3ZF、pShuttle、pcDNA3系列質粒為克隆載體，將目標蛋白或細胞因子hLTF(人乳鐵蛋白基因)、hGH(人生長激素基因)、hEPO(人促紅細胞生成素)、t-PA(組織型纖溶酶原激活劑)、IL-15(白細胞介素-15)、human Protein C(人蛋白C)、IL-2(白細胞介素-2)、hVEGF(血管內皮細胞生長因子)、NKSF(自然殺傷細胞刺激因子)、HGF(肝細胞生長因子)10種蛋白藥物基因通過分子克隆，分別獲得了含有目標基因的質粒系列載體；(2)、將所克隆目標蛋白基因與單標記篩選載體或雙標記選擇載體構成融合真核表達載體，體外真核細胞表達檢測目標蛋白，獲得體外表達正確的藥物蛋白基因以COS7(非洲綠猴腎細胞)、CHO(中國倉鼠卵巢細胞)、HEK293(人胚胎腎細胞)為宿主細胞對所構建的真核融合蛋白表達載體進行體外表達；Western Blotting、ELASA檢測目標基因表達水平，獲得了體外表達正確的所需蛋白藥物基因；(3)、將所需目標蛋白基因與腺病毒基因組骨架分子重組，獲得含重組目標藥物蛋白基因的腺病毒載體將所需目標基因接入穿梭載體，再與腺病毒基因組骨架質粒在細菌或真核細胞中重組，并在腺病毒包裝細胞系生產出含有重組目標蛋白基因的復制缺陷型腺病毒載體；(4)、將該重組目標藥物蛋白基因腺病毒載體導入動物乳腺以重組目標蛋白基因的復制缺陷型腺病毒為載體，直接導入動物乳腺，使目標蛋白基因在乳腺上皮細胞內表達，利用乳腺上皮細胞基本特性，將目標蛋白分泌到動物乳汁中；(5)、乳汁中分泌獲得所需目標藥物蛋白，獲得高表達目標蛋白藥物的動物。
2.根據權利要求1所述的以腺病毒為載體乳腺表達生產轉基因蛋白藥物的方法，其特征是用腺病毒為載體，將目標蛋白基因和腺病毒基因組骨架構成融合基因，將該融合基因導入動物乳腺，從而在動物乳腺中獲得目標蛋白基因高效表達，獲得目標基因藥物蛋白或分離純化出表達的目標藥物蛋白。
3.根據權利1或2所述的以腺病毒為載體乳腺表達生產轉基因蛋白藥物的方法，其特征是所述腺病毒骨架序列包含野生型腺病毒大部分基因組序列，刪除了病毒E1區、E3區及IVa2，允許插入最大約14kb的目標蛋白藥物核苷酸序列。
4.根據權利1或2所述的以腺病毒為載體乳腺表達生產轉基因蛋白藥物的方法，其特征是其中步驟一中克隆分離的上述10種目標蛋白基因大小范圍在0.5kb-10Kb之間，乳汁中獲得的重組目標蛋白具有與天然蛋白相同或相似的生物學功能。
5.根據權利1或2所述的以腺病毒為載體乳腺表達生產轉基因蛋白藥物的方法，其特征是其中步驟二所述具體實施，包含目標蛋白基因在宿主細胞COS7、CHO、HEK293中表達，用常規磷酸鈣法或脂質體法作瞬時轉染或穩定轉染不同細胞，瞬時轉染48-72h，或穩定轉染經G418抗性篩選陽性細胞克隆，分別對轉染細胞上清或細胞沉淀進行免疫印跡檢測基因表達產物。
6.根據權利1或2所述的以腺病毒為載體乳腺表達生產轉基因蛋白藥物的方法，其特征是所用表達載體pCDNA3.1含有NEO(新霉素抗性基因)抗性標記，可進行抗性陽性細胞蛋白表達篩選；所用雙標記選擇載體為pGFP-NEO，增添了綠色熒光表達陽性細胞克隆篩選功能。
7.根據權利1或2所述的以腺病毒為載體乳腺表達生產轉基因蛋白藥物的方法，其特征是其中步驟四所述具體實施，包含將獲得的重組腺病毒載體經兩輪氯化銫密度梯度離心純化后，PBS(pH7.2)溶解，滴度范圍106-1012PFU/ml，直接導入動物乳腺。
8.根據權利1或2所述的以腺病毒為載體乳腺表達生產轉基因蛋白藥物的方法，其特征是其中步驟五所述重組蛋白乳汁通過常規高速離心方法，從乳清中獲得目標蛋白藥物。
9.根據權利1或2所述的以腺病毒為載體乳腺表達生產轉基因蛋白藥物的方法，其特征是所述生產重組藥物蛋白在動物乳汁中持續表達時間為10-20天，目標蛋白表達量為0.3g-8g/L。
10.根據權利1或2所述的以腺病毒為載體乳腺表達生產轉基因蛋白藥物的方法，其特征是所述動物為牛、綿羊、山羊、豬和兔。
全文摘要
本發明公開一種以腺病毒為載體乳腺表達生產轉基因蛋白藥物的方法。其特征是利用復制缺陷型腺病毒骨架質粒載體攜帶不同種目標蛋白基因序列，在含有Ad5型腺病毒基因組E1A區序列的包裝細胞系獲得重組蛋白基因載體，在動物乳腺，獲得瞬時高效表達的各種外源目標基因藥物蛋白。操作步驟如下(1)分離、克隆目標藥物蛋白基因序列；(2)將所克隆目標蛋白基因與單標記篩選載體或雙標記選擇載體構成融合真核表達載體，體外真核細胞表達檢測目標蛋白，獲得體外表達正確的藥物蛋白基因；(3)將所需目標蛋白基因與腺病毒基因組骨架分子重組，獲得含重組目標藥物蛋白基因的腺病毒載體；(4)將該重組目標藥物蛋白基因腺病毒載體導入動物乳腺；(5)乳汁中分泌獲得所需目標藥物蛋白，獲得高表達目標蛋白藥物的動物。該乳汁中表達的重組蛋白可直接開發成各種保健品和藥品，含有重組目標蛋白的動物奶也可直接開發成高附加值的保健奶及奶制品。
文檔編號A61K38/17GK1869217SQ200610081469
公開日2006年11月29日 申請日期2006年5月22日 優先權日2006年5月22日
發明者李青旺, 韓增勝 申請人:李青旺, 秦皇島市科技投資公司, 燕山大學