一類抗粘附活性的乳糖簇及其熒光標記物的制作方法

專利名稱：一類抗粘附活性的乳糖簇及其熒光標記物的制作方法
技術領域：
本發明涉及一類新的乳糖簇和其熒光標記物，及其制備方法和在制備抗粘附、抗休克藥物及作為分子探針在生物學研究中的用途。該類化合物能夠有效地抑制內皮細胞和白細胞的粘附，減輕休克的程度，延長存活時間，可作為抗炎、抗休克藥物用于重癥休克病人的搶救和治療。其熒光標記物，可作為分子探針用于粘附位點的研究。
背景技術：
白細胞-內皮細胞的相互作用在許多生理和病理過程中起重要作用，例如，炎癥反應、血栓、動脈粥樣斑塊形成等。而白細胞-內皮細胞的粘附在失血性休克中同樣起著重要作用[1-9]。創傷、燒傷引起的重癥休克是平時和戰常見的病理過程，是造成病人死亡和部隊戰時減員的主要原因之一。目前對休克發生機理的研究已由細胞、亞細胞水平進入分子水平；研究證實，白細胞粘附于微血管不僅會減少組織的器官和血流量而且會游出造成進一步的損傷，是造成休克不可逆的主要原因之一。因此，減少休克時粘附于微血管的白細胞數量，就有可能使休克減輕，為綜合救治創造機會[10-12]。已經有報道表明，乳糖具有抗粘附活性，一些乳糖的衍生物也已被證實有抑制白細胞-內皮細胞黏附的功能。為了進一步研究糖簇效應和連接臂的長短對抗粘附效應的影響，一些多價的乳糖已經合成，另外，熒光標記的多價乳糖衍生物，也已經合成出來并作為熒光性探針用于粘附機理的研究。

發明內容
本發明制備了以不同連接臂綴合的乳糖簇用于抗粘附、抗休克活性研究，這些連接臂包括聚乙二醇、2-氨基-1，3-丙二醇及多元羧酸。在相應的糖簇化合物預留出氨基，綴以熒光素，將其作為小分子探針用于白細胞-內皮細胞粘附位點等作用機制的研究。
合成的化合物可以用下列通式表示 R1選自聚乙二醇、2-氨基-1，3-丙二醇及多元羧酸中的一種或幾種。
其中m為2、4、6。
R1選自聚乙二醇、2-氨基-1，3-丙二醇及多元羧酸中的一種或幾種。
其中m為2、4、6。
溴代-2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖-(1→4)-2，3，6-三-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖與聚乙二醇(PEG，n＝4，5，6)在無水CH2Cl2中，Ag2CO3為催化劑，室溫下反應即得到相應的二價乳糖1，2，3，收率60-70％。
由2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖-(1→4)-2，3，6-三-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖與2-疊氮甘油在無水CH2Cl2中，BF3·OEt2為催化劑，室溫下反應制得二價乳糖4，收率86％。然后在EtOAc-EtOH(1∶1)中用Pd(OH)2/C催化氫化得到化合物5，5作為糖單元用于糖簇的合成。
5與連接臂反應，例如丁二酸，辛二酸，均苯三酸在無水四氫呋喃中，在HOBt和DCC存在下偶聯得到四，六價乳糖6，7，8。收率70-88％。

四價乳糖9由5與Cbz保護的谷氨酸反應制得，化合物9在CH3OH中用Pd/C催化氫化以94％的收率得到10。5或10與FITC(熒光素-5-異硫氰酸)在無水CH2Cl2和DMF中，40℃反應6～8小時，便成功地在糖簇中引入了熒光功能基團，收率95～96％。

將糖簇1，2，3，5，6，7，8，9，10，11和12用CH3ONa/CH3OH處理得到目標化合物13，14，15，16，17，18，19，20，21和22，收率94-98％.


圖1化合物16和20對燒傷休克大鼠白細胞與內皮細胞粘附的影響圖2化合物16和20對燒傷休克大鼠存活時間的影響圖3化合物21的粘附結果圖4化合物22的粘附結果具體實施方式
實施例1.3，6，9-三氧雜-1，11-二O-二-[2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖-(1→4)-2，3，6-三-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基]十二烷-11-溴代-2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖(0.2g，0.29mmol)和PEG(n＝4，0.02g，0.10mmol)溶于無水CH2Cl2(10mL)中，加入Ag2CO3(0.08g)和4分子篩(0.1g)，室溫攪拌20小時。過濾混合物，用CH2Cl2稀釋，水洗，無水Na2SO4干燥，蒸除溶劑。粗產品用柱層析純化，石油醚(60-90℃)∶乙酸乙酯＝1∶3。得無色糖漿。收率70％。[α]D＝+30.3°(c＝0.66，CH3Cl)；1HNMR(CD3Cl)δ5.35(d，1H，H-4′)，5.16(t，1H，H-3)，5.09(dd，1H，H-2′)，4.97(dd，1H，H-3′)，4.86(t，1H，H-2)，4.56(d，1H，J1，2＝7.80Hz，H-1)，4.49(d，1H，J1′，2′＝9.00Hz，H-1′)，4.51，4.22～4.08(m，4H，H-6a，b，H-6a′，b′)，3.90～3.61(m，11H，H-4，5，H-5′，-CH2O-)，2.15～1.97(7s，21H，7CH3CO-)；13CNMR(CD3Cl)δ170.4～169.0(7C，CH3C＝O)，101.0(C-1′)，100.5(C-1)，76.2(C-4)，72.7(C-3)，72.5(C-5)，71.5(C-2)，71.0(C-5′)，70.6(C-3′)，70.5(-CH2O-)，70.1(-CH2O-)，69.9(-CH2O-)69.0(-CH2O-)，68.7(C-2′)，66.5(C-4′)，63.5(C-6′)，60.7(C-6)，20.9～20.4(7C，7CH3CO-).
實施例2.3，6，9，12-四氧雜-1，14-二-O-二-[2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基]十六烷-2化合物2的制備同1，以PEG(n＝5)為連接臂，粗產品用柱層析純化，石油醚(60-90℃)∶乙酸乙酯＝2∶7。得無色糖漿。收率63％。
實施例3.3，6，9，12，15-五氧雜-1，17-二-O-二-[2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基]二十烷-3化合物3的制備同1，以PEG(n＝6)為連接臂，粗產品用柱層析純化，石油醚(60-90℃)∶乙酸乙酯＝1∶4。得無色糖漿。收率60％。
實施例4.2-疊氮基-1，3-二-O-二-[2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2，3，6-三--O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基]丙烷4-2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-1，2，3，6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖(5.1g，7.52mmol)及2-疊氮-1，3-丙二醇(0.4g，3.42mmol)溶于無水CH2Cl2(10mL)中，加入BF3·OEt2(0.2mL)，室溫攪拌24小時。混合物用CH2Cl2(20mL)稀釋后，依次用飽和碳酸氫鈉水溶液和水洗滌，無水Na2SO4干燥，蒸除溶劑。粗產品用柱層析純化，石油醚(60-90℃)∶丙酮3∶2，得無色糖漿。收率86％。
實施例5.2-氨基-1，3-二-O-二-[2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2，3，6-三--O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基]丙烷5——化合物4(1g，0.74mmol)溶于乙酸乙酯-乙醇(1∶1，20mL)，加入Pd(OH)2(100mg)，室溫下催化氫化(0.4MPa)6小時，濾除催化劑，蒸除溶劑。粗產品用柱層析純化，石油醚(60-90℃)∶丙酮2∶3，。得無色糖漿。收率92％。[α]25D-18.65°(c 1.93，CHCl3).1HNMR(CD3Cl)δ5.35(d，1H，H-4′)，5.18(t，1H，H-3)，5.10(dd，1H，H-2′)，4.96(dd，1H，H-3′)，4.89(t，1H，H-2)，4.49(d，2H，J1，2＝8.10Hz，H-1)，4.44(d，1H，J1′，2′＝8.40Hz，H-1′)，4.46，4.12～4.08(m，4H，H-6a，b，H-6a′，b′)，3.91～3.43(m，6H，H-4，5，H-5′，-CH2O-，-CHNH2-)，2.17～1.92(7s，21H，7CH3CO-)；13CNMR(CD3Cl)δ170.2～168.9(7C，CH3C＝O)，100.9(C-1′)，100.7(C-1)，76.0(C-4)，72.6(C-3)，72.1(C-5)，71.5(C-2)，70.8(C-5′)，70.5(C-3′)，69.0(-CH2O-)，68.7(C-2′)，66.5(C-4′)，61.7(C-6′)，60.7(C-6)，50.5(-CHNH2-)，20.7～20.4(7C，7CH3CO-).
實施例6.N-{2-[1，3-二-O-二-[2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2，3，6-三--O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基]丙基}-丁二酰胺6-丁二酸(0.02g，0.17mmol)溶于無水THF(3mL)，冷卻至0℃，然后加入HOBt(0.07g，0.51mmol)和DCC(0.11g，0.51mmol)。0℃下攪拌0.5小時，化合物5(0.4g，0.34mmol)的THF溶液(5mL)用N-甲基嗎啡啉將溶液調至pH＝8～9后加入反應瓶中，混合物在0℃下攪拌2小時后于室溫下攪拌36小時，蒸除溶劑，加入CH2Cl2(10mL)，濾去不溶物，溶液依次用10％的檸檬酸溶液、飽和碳酸氫鈉溶液和水洗滌，無水Na2SO4干燥，蒸除溶劑。粗產品用柱層析純化，石油醚(60-90℃)∶丙酮2∶3。得無色糖漿(0.35g)，收率85％。[α]25D-19.75°(c1.62，CHCl3)；1HNMR(CD3Cl)δ6.14(d，1H，-NHCO)，5.36(d，1H，H-4′)，5.20(t，1H，H-3)，5.13(dd，1H，H-2′)，4.93(dd，1H，H-3′)，4.87(t，1H，H-2)，4.49(d，2H，J1.2＝7.80Hz，H-1)，4.45(d，1H，J1′，2′＝7.80Hz，H-1′)，4.53，4.13～4.05(m，4H，H-6a，b，H-6a′，b′)，3.89～3.49(m，6H，H-4，5，H-5′，-CH2O-，-CHNH2-)，2.16～2.14(s，1H，COCH2-)，2.14～1.97(7s，21H，7CH3CO-)，1.84(t，1H，-CH2-)；13CNMR(CD3Cl)δ171.4～169.0(8C，CH3C＝O，-CONH)，101.0(C-1′)，100.8(C-1)，76.1(C-4)，72.7(C-3)，72.4(C-5)，71.7(C-2)，71.5(C-5′)，70.9(C-3′)，70.6(-CH2O-)，69.0(C-2′)，66.6(C-4′)，61.8(C-6′)，60.7(C-6)，48.3(-CHNHCO-)，30.8(-CH2CO)，20.9～20.5(7C，7CH3CO-，).
實施例7.N-{2-[1，3-二-O-二-[2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2，3，6-三--O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基]丙基}-辛二酰胺7-化合物7的制備同化合物6，用辛二酸作連接臂，粗產品用柱層析純化，石油醚(60-90℃)∶丙酮2∶3，得無色糖漿。收率83％。
實施例8.N-{2-[1，3-二-O-二-[2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2，3，6-三--O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基]丙基}-1，3，5均苯三酰胺8-化合物8的制備同化合物6，用1，3，5-均苯三酸作連接臂，粗產品用柱層析純化，石油醚(60-90℃)∶丙酮2∶3。得無色糖漿。收率70％。
實施例9.N-{2-[1，3-二-O-二-[2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2，3，6-三--O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基]丙基}-2-芐氧羰酰氨基戊二酰胺9-化合物9的制備同化合物6，用芐氧羰基-L-谷氨酸作連接臂。粗產品用柱層析純化，石油醚(60-90℃)∶丙酮＝2∶3，得無色糖漿，收率88％.
實施例10.N-{2-[1，3-二-O-二-[2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2，3，6-三--O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基]丙基}-2-氨基戊二酰胺10-化合物9(0.2g，0.07mmol)溶于MeOH(10mL)，加入Pd/C，室溫下催化氫化(0.4MPa)3小時，濾除催化劑，蒸除溶劑，粗產品用柱層析純化，石油醚(60-90℃)∶丙酮2∶5，得無色糖漿(0.18g)，收率94％。[α]25D-31.58°(c1.14，CHCl3)；1HNMR(CD3Cl)δ6，21(d，1H，-NHCO)，6.18(d，1H，-NHCO)，5.35(d，1H，H-4′)，5.20(t，1H，H-3)，5.12(dd，1H，H-2′)，4.96(dd，1H，H-3′)，4.86(dd，1H，H-2)，4.46(d，2H，J1，2＝J1′2′＝7.50Hz，H-1，H-1′)，4.48，4.13～4.08(m，4H，H-6a，b，H-6a′，b′)，3.90～3.53(m，7H，H-4，5，H-5′，-CH2O-，-COCHNH-，-CHNH2-，)，2.32～1.97(m，23H，7CH3CO-，-COCH2-，-CH2CHNH2)；13CNMR(CD3Cl)δ170.3～169.0(9C，CH3C＝O，-CONH)，101.0(2C，C-1，C-1′)，76.1(C-4)，72.8(C-3)，72.6(C-5)，71.6(C-2)，71.5(C-5′)，70.9(C-3′)，70.6(-CH2O-)，69.0(C-2′)，66.5(C-4′)，61.8(C-6′)，60.7(C-6)，48.6～48.3(2C，-CHNHCO-)，20.8～20.5(9C，7CH3CO-，-CH2CO，-CH2CHNH2).
實施例11.2-FITC-1，3-二-O-二-[-2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2，3，6-三--O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基]丙烷11-FITC(0.06g，0.15mmol)溶于無水DMF(0.2mL)，滴加化合物5(0.2g，0.15mmol)的CH2Cl2(10mL)溶液，40℃攪拌8小時。蒸除溶劑，粗產品用柱層析純化，CHCl3∶MeOH＝10∶1，得到黃色糖漿(0.25g)，收率96％.[α]25D-28.95°(c 1.52，CHCl3)；8.02，7.93，6.72，6.58(m，9H，PhH)，7.15(d，2H，-NHCSNH-)，5.35(d，1H，H-4′)，5.14(t，1H，H-3)，5.10(dd，1H，H-2′)，4.92(dd，1H，H-3′)，4.82(dd，1H，H-2)，4.55(d，2H，J1，2＝J1′，2′＝7.80Hz，H-1，H-1′)，4.53，4.13～4.09(m，4H，H-6a，b，H-6a′，b′)，3.93～3.68(m，6H，H-4，5，H-5′，-CH2O-，-CHNHCS-，)，2.94(1H，PhCH-)，2.18～1.97(m，21H，7CH3CO-)；13CNMR(CD3Cl)δ207.3，180.7，139.9，129.4，110.6(10C，Ph，PhCH-)，171.1～169.0(8C，CH3C＝O，-PhCO)，162.7(C＝S)，102.7(C-1′)，100.8(C-1)，75.9(C-4)，72.9(C-3)，72.6(C-5)，71.5(C-2)，71.3(C-5′)，70.8(C-3′)，70.4(-CH2O-)，68.9(C-2′)，66.5(C-4′)，61.7(C-6′)，60.6(C-6)，52.9(-CHNHCS-)，30.7()，20.9～20.3(7C，7CH3CO-).
實施例12.N-{2-[1，3-二-O-二-[2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2，3，6-三--O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基]丙基}-2-FITC-戊二酰胺12-化合物12的制備同化合物11，粗產品用柱層析純化，CHCl3∶MeOH＝10∶1，得到黃色糖漿，收率95％。
實施例13.3，6，9-三氧雜-1，11-二-O-二-[β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基]十二烷13-化合物1(0.1g)溶于甲醇(10mL)，加入催化量的鈉，室溫攪拌12小時，然后用陽離子交換樹脂中和至中性。濾去樹脂，蒸除溶劑，殘渣溶于20mL水，冷凍干燥，得白色固體(0.06g，97％)。[α]D＝+56.3°(c＝0.71，H2O)；1HNMR(D2O)δ4.33(d，1H，J1′，2′＝8.40Hz，H-1′)，4.26(d，1H，J1，2＝7.50Hz，H-1)，3.85～3.47(m，19H，H-3，4，5，6a，b，H-2′，3′，4′，5′，6a′，b′，-CH2O-)，3.36(m，1H，H-2)；13CNMR(D2O)δ105.7(C-1′)，104.8(C-1)，81.0(C-4)，78.1，77.5，77.0，75.2，74.4，73.8，73.7，72.3，72.2，71.5，71.3，63.8，62.8(C-2，3，5，6，C-2′，3′，4′，5′，6′，-CH2O-).
實施例14.3，6，9，12-四氧雜-1，14-二-O-二-[β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基]十六烷14-化合物14的制備同化合物13，收率97％。
實施例15.3，6，9，12，15-五氧雜-1，17-二-O-二-[β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基]二十烷15-化合物15的制備同化合物13，收率95％。
實施例16.2-氨基-1，3-二-O-二-[β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基]丙烷16-化合物16的制備同化合物13，收率98％。
實施例17.N-{2-[1，3-二-O-二-[O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基]丙基}-丁二酰胺17-化合物17的制備同化合物13，收率97％。[α]25D-46.51°(c 1.29，H2O)；1HNMR(D2O)δ6.10(d，1H，-NHCO)，4.33(d，1H，J1，2＝7.80Hz，H-1)，4.28(d，1H，J1′，2′＝7.80Hz，H-1′)，3.83～3.18(m，13H，H-2，3，4，5，6a，b，H-2′，3′，4′，5′，6a′，b′，-CH2O-，-CHNH2)，2.40(s，1H，-CH2CO)；13CNMR(D2O)δ175.4(-NHC＝O)，103.5(C-1′)，103.1(C-1)，78.9(C-4)，75.9，75.3，74.8，73.3，73.1，72.3，71.5，69.1，(C-2，3，5，C-2′，3′，4′，5′，-CH2O-)，61.6，60.6(C-6，C-6′)，49.5(-CHNH2)，31.5(COCH2).
實施例18.N-{2-[1，3-二-O-二-[O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基]丙基}-辛二酰胺18-化合物18的制備同化合物13，收率95％。
實施例19.N-{2-[1，3-二-O-二-[O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基]丙基}-1，3，5-均苯三酰胺19-化合物19的制備同化合物13，收率94％。
實施例20.N-{2-[1，3-二-O-二-[O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基]丙基}-2-氨基-戊二酰胺20-化合物20的制備同化合物13，收率96％。
實施例21.2-FITC-1，3-二-O-二-[O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基]丙烷21-化合物21的制備同化合物13，收率96％。[α]25D-35.82°(c 1.34，H2O)；1HNMR(D2O)δ7.77，6.68，6.36(m，9H，C6H5)，7.10(d，2H，-NHCSNH-)，4.26(d，2H，J1，2＝J1′，2′＝7.50Hz，H-1，H-1′)，3.75～3.17(m，13H，H-2，3，4，5，6a，b，H-2′，3′，4′，5′，6a′，b′，-CH2O-，-CHNH-)；13CNMR(D2O)δ165.5(C＝S)，155.4，152.7，141.0，131.3，119.9，117.4，113.2(10C，C6H5，C6H5CH)，103.6(C-1′)，103.3(C-1)，79.1(C-4)，78.8，75.9，75.4，74.8，73.4，73.1，71.5，69.1，68.7(C-2，3，5，C-2′，3′，4′，5′，-CH2O-)，61.6，60.8(C-6，C-6′)，49.4(-CHNH).
實施例22.N-{2-[1，3-二-O-二-[O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基]丙基}-2-FITC-戊二酰胺22-化合物22的制備同化合物13，收率94％。
活性試驗結果將上述合成的化合物進行了抗粘附和抗休克活性的測定，均顯出良好的抗粘附和休克保護作用。熒光標記的乳糖綴合物作為生物探針，在粘附靶細胞的研究中得到了明確的結果。具體活性試驗操作及典型化合物的結果如下抗粘附活性試驗(1)血液粒細胞的制備動物麻醉后，分離頸部動脈插管，以肝素抗凝取血3-5ml，并加等量生理鹽水稀釋，混勻后輕輕加到底部裝有5ml淋巴細胞分離液的試管中，2000rpm離心20min，取紅細胞表層的白細胞，加到5ml紅細胞裂解液中搖勻放置8min，再looorpm離心smin，棄上清液，(紅細胞去除不完全可再重復裂解1次)，以DMEM培養基洗2次，計數后，配成1-2XIO6/ml濃度的粒細胞懸液備用。
(2)大鼠肺血管內皮細胞的培養動物放血處死，75％酒精浸泡消毒動物皮膚，無菌條件下開胸取其肺組織，洗去血液后再將肺周邊組織剪下一圈，將其剪碎成1mm3大小的組織塊，加含20％小牛血清DMEM培養液，放入細胞培養箱中37℃、5％CO2中培養60～72小時，換液去掉組織塊，再培養4～7天，培養瓶中長滿鵝卵石樣的肺血管內皮細胞。用0.25％胰蛋白酶消化細胞，將其傳代至載玻片上繼續培養，待其長滿后用于粘附實驗。
(3)細胞液流室制作液流室由兩層透明有機玻璃制成中空液流通道，內徑長6.1cm，寬1.5cm。液流室兩端及兩側各有一通道，用于通入液體及測壓力。其中一端連接蠕動泵用于形成不同流速不同切應力的液體灌流。
(4)粒細胞粘附特性的檢測將已長滿肺血管內皮細胞的載玻片放入液流室中，用橡膠墊圈上下密封玻片四周，蓋好后用螺絲釘旋緊至無液體滲漏。連接好蠕動泵后放入Olympus倒置顯微鏡的觀察室中，觀察室保持37℃恒溫。將視野放大400倍，用MTV彩色攝象機、National監視器和JVC錄像機同步錄像觀察記錄。先用Hanks液灌洗以清除液流室及其連接導管中的氣泡(關鍵步驟)。然后再加入分離的白細胞到液流室中與內皮細胞溫育20～30min。開動蠕動泵，以不同的切應力灌流2min，計數各種切應力灌流后視野中與內皮細胞粘附的白細胞數，計算其粘附率。
兩個代表性化合物16和20的抗粘附活性(flow chamber)如圖1所示結果表明這兩種寡糖具有明顯抑制休克大鼠白細胞與內皮細胞粘附的活性。
燒傷休克保護活性試驗動物模型24只SD大鼠，體重180～220g，雌雄不限，隨機分為3組。用133％烏拉坦+05％氯醛糖(06mL/100g體重，ip)麻醉。一側頸總動脈插入PE-50導管，用于監測血壓和采血。用80℃熱水燙傷腰以下肢體30s(占體表面積35％～40％)造成深II度燒傷，復制大鼠重癥燒傷休克模型。燙傷后20分鐘左右給予寡糖或生理鹽水，只給藥一次。
動物試驗的樣品量40nmol/100g體重。
兩個代表性化合物16和20的抗燒傷休克保護活性(大鼠模型)，如圖2所示結果表明，兩種寡糖均能延長燒傷休克大鼠的存活時間，具有明顯的治療作用。
熒光標記寡糖綴合物用于粘附靶點的確定將寡糖配制成10pmol/ul的工作液，與分離得到的白細胞作用10分鐘后洗去未結合寡糖，在熒光顯微鏡下觀察。
化合物21、22粘附結果分別如圖3、圖4所示結果表明化合物21、22都能與白細胞結合，特別是粒細胞。這可能是其抗粘附和抗休克的細胞學基礎。
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12.Lindhorst，T.，K.，Kieburg，C.，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，1996，35，1953-.195權利要求
1.具有通式(I)的抗粘附活性的乳糖簇化合物， R1選自聚乙二醇、2-氨基-1，3-丙二醇及多元羧酸中的一種或幾種，其中m為2、4、6。
2.權利要求1所述的化合物，其特征在于聚乙二醇的聚合度n為4-6的整數；多元羧酸選自丁二酸、辛二酸、均苯三酸中的一種或幾種。
3.權利要求1所述的化合物，其特征在于該化合物為3，6，9-三氧雜-1，11-二-O-二-[β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基]十二烷；3，6，9，12-四氧雜-1，14-二-O-二-[β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基]十六烷；3，6，9，12，15-五氧雜-1，17-二-O-二-[β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基]二十烷；2-氨基-1，3-二-O-二-[β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基]丙烷；N-{2-[1，3-二-O-二-[O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基]丙基}-丁二酰胺；N-{2-[1，3-二-O-二-[O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基]丙基}-辛二酰胺；N-{2-[1，3-二-O-二-[O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡哺葡萄糖基]丙基}-1，3，5-均苯三酰胺；N-{2-[1，3-二-O-二-[O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基]丙基}-2-氨基-戊二酰胺。
4.具有通式(II)的熒光標記化合物， R1選自聚乙二醇、2-氨基-1，3-丙二醇及多元羧酸中的一種或幾種，其中m為2、4、6。
5.權利要求4所述的化合物，其特征在于聚乙二醇的聚合度n為4-6的整數；多元羧酸選自丁二酸、辛二酸、均苯三酸中的一種或幾種。
6.權利要求4所述的化合物，其特征在于該化合物為2-FITC-1，3-二-O-二-[O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基]丙烷；N-{2-[1，3-二-O-二-[O-β-D-吡哺半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基]丙基}-2-FITC-戊二酰胺。
7.權利要求1至3任意一項所述的化合物在制備抗粘附、抗休克活性藥物中的應用。
8.權利要求4至6任意一項所述的熒光標記化合物作為分子探針的用途。
全文摘要
本發明涉及一類新的乳糖簇和其熒光標記物，及其制備方法和在制備抗粘附、抗休克藥物及作為分子探針在生物學研究中的用途。該類化合物能夠有效地抑制內皮細胞和白細胞的粘附，減輕休克的程度，延長存活時間，可作為抗炎、抗休克藥物用于重癥休克病人的搶救和治療。部分糖簇的熒光標記物，可作為分子探針用于粘附位點的研究。
文檔編號A61P43/00GK1834104SQ20061007866
公開日2006年9月20日 申請日期2006年4月30日 優先權日2006年4月30日
發明者李中軍, 李慶, 趙致輝, 孟祥豹 申請人:北京大學