專利名稱：一種工程化子宮組織片層的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種工程化子宮組織片層，屬于組織工程領域。
背景技術：
組織工程是應用生命科學和工程學的原理與技術，在正確認識哺乳動物的
正常及病理兩種狀態下結構與功能關系的基礎上，研究、開發用于修復、維護、促進人體各 種組織或器官損傷后的功能和形態生物替代物的科學。子宮作為雌性哺乳動物的重要生殖器 官，在孕育胎兒和各種病理與生殖機制研究中占有重要地位。體外構建出子宮組織具有重要 的理論和現實意義，除子宮組織修復外，還可作為子宮肌瘤和內膜異位癥等病理機制的體外 研究和胚胎植入機制研究提供理想的體外研究模型。鑒于子宮在生殖生理研究中的重要性， 2001年美國華裔科學家劉宏清教授在體外構建子宮內膜并在其上進行人胚胎的培養引起了 世界的關注。但是因為倫理問題沒有報道具體的實施方案，工作也未能進行下去。2003年 Park進行了體外子宮內膜腫瘤侵襲模型的研究，為體外進行相關疾病研究提供了一個借鑒。 但是這些研究都只是構建了子宮內膜組織，沒有平滑肌層，并非完整子宮壁結構，未能完全 再現體內子宮的生理狀態。本發明提供的一種工程化子宮組織片層提供了完整的子宮壁結構 并能有效再現子宮的生理狀態。
發明內容
本發明是一種工程化子宮組織片層，由子宮內膜基質細胞和上皮細胞，子 宮平滑肌細胞與凝膠材料復合而成。細胞與材料復合后孵箱內放置一定時間，使凝膠凝固并 穩定，再加培養液培養。本發明提供的一種工程化子宮組織片層可以用于臨床上子宮內膜的 損傷修復，或體內移植替代缺損子宮組織，也可以用于子宮肌瘤和內膜異位癥等病理機制的 體外研究和胚胎植入機制研究提供理想的體外研究模型。
以下是本發明的完整描述
1、 I型膠原的制備I型膠原參照文獻制備。從大鼠尾跟部切斷鼠尾，置于酒精中沒 泡30-60min:無菌條件下撕下尾腱，剪碎。取尾腱碎片浸入0.1-0.5%的醋酸中，置4"C冰 箱，并用磁力攪拌器進行攪拌。24-72h后離心收集上清即可得膠原溶液。制備的膠原溶液用 電子天平稱出其中的膠原含量約為1. 0-2. 5g/ml.
2、 子宮片層模具的準備將無菌細胞培養皿置于超靜工作臺內，細胞培養皿直徑可以
是35咖，60卿或IOO咖，在培養皿底部鋪一層瓊脂糖凝膠，厚度為1-4鵬。靜置10-30min后， 將自制長方體形小槽置于細胞培養皿中部瓊脂糖凝膠層上，再在細胞培養皿中鋪第二層瓊脂 糖凝膠，厚度為3-5mm，靜置10-30min后，取出長方體后，在四角距邊沿1-3咖處插入四根 無菌玻璃支柱，玻璃支柱的長度為5-8mm,直徑為1-2mm，子宮片層模具準備完成。
3、 子宮內膜上皮細胞和基質細胞以及平滑肌細胞的分離培養取處在增生期的子宮組 織，置入無菌PBS中，再用無菌PBS充分淸洗以去除血污和紅細胞；放入無血淸DMEM培養 液中，用手術刀輕輕刮取內膜，加0.01-0. 25%胰酶37TC消化2-5min,用含血清的咖EM培 養液終止消化，離心，用10ml含血清的DMEM培養液重懸細胞，再以低速離心5-10min,離 心管內上層為富含基質細胞組分，余下的為上皮細胞組分，分別培養在5 tC"， 371C孵箱內 培養，12-36h后用無血清DMEM培養液清洗兩遍去除血細胞，加入新的含血清的DMEM培養液 繼續培養。充分刮除內膜并用無血清DMEM培養液清洗后，子宮肌層用眼科剪充分剪碎，新 鮮的O.Ol-0.25%胰酶3710消化2-5min，吸取消化液加入血清中終止消化，再用0.01-0.25% 膚酶37"消化2-5min,再終止，直到消化完全，離心，用含血淸的DMEM培養液重息細胞， 在5%002， 37r孵箱內培養，12-36h后用無血清DMEM培養液清洗兩遍去除血細胞，加入新含 血清的DMEM培養液繼續培養。5-10d后基質細胞和平滑肌細胞可進行傳代培養，細胞傳2-5 代時狀態最好可用于工程化子宮的構建。
4、 體外構建組織工程化子宮將I型液態膠原與DMEM培養液混合，用0.1-0. 5mol/L NaOH調為中性，將培養到第三代子宮平滑肌細胞與混合物混合，使其終濃度達到1X105- 1 X107ml，接種于自制片層組織構建模具中。5-20min后再將第三代基質細胞與混合物混合, 使其終濃度達到1X105- 1X 107ml接種于混合物上。24h后將獲得的原代子宮內腆上皮細胞 以終濃度為1X10'-1X10S個腺體/ cn^接種于混合物C上。30min后加入含10%胎牛血淸的 DMEM/F12培養基，37"C， 5%(:02培養箱中培養。
5、 組織工程化子宮應用于體外支持胚胎的培養將組織工程化子宮在5%C0， 培養箱中培養一段時間后，即可用于胚胎的培養。取1-細胞期或2-細胞期的正常胚胎，在 組織工程化子宮片層上培養。小鼠胚胎用CZB培養基培養，兔胚胎則用M199培養基培養. 每天統計發育率。
具體實施方式
1 子宮片層組織的構建
將培養到l-5代子宮平滑肌細胞和基質細胞分別與凝膠材料,如液態I型膠原和ECM-gel 混合，終濃度達到lX10'Vml -lX107ml，依次接種于自制片層組織構建模具中。形成下層 為平滑肌層，上層為基質層的雙層子宮壁結構。膠原凝固后將原代培養的子宮內腆腺上皮細 胞以終濃度為IX 107ml- 1X107 ml接種于雙層結構上，形成三層子宮結構。30"60min后 加入10%胎牛血清的DMEM/F12條件培養基，其中含有10-100nM雌激素和l(MOOnM孕激素， 37"C， 5MC02培養箱中培養，每天換液。
本發明中的自制片層組織構建模具設計了靜態力學拉伸效果，更進一步地模仿了正常子 宮自然條件下的狀態。通過力學刺激，工程化子宮組織片層具有典型的子宮壁三層結構，在 形態學上更類似于正常子宮，內部平滑肌細胞和基質細胞排列有序，生長狀態良好。功能分 析顯示工程化子宮組織片層具有正常子宮組織對激素的反應和表達胚胎植入相關分子的功 能。
具體實施方式
2
組織工程化子宮應用于體外支持小鼠胚胎和兔胚胎的培養
將工程化子宮組織片層在37*C， 5%C02培養箱中培養12-36h后，即可用于胚胎的培養。 用經過澉素超排處理后受孕的雌性小鼠或兔取1-細胞期或2-細胞期的正常胚胎，在組織工 程化子宮片層上培養。小鼠胚胎用CZB培養基培養，兔胚胎則用M199培養基培養。每天統
計發育率。結果表明工程化子宮組織片層能夠明顯地提高胚胎體外發育率及胚胎質l:,囊胚
發育率可達85%以上。
圖l組織工程化子宮片層模具示意圖。圖中l為瓊脂糖凝膠；2為玻璃支柱；3為培養皿。 圖2模具中構建的組織工程化子宮片層示意圖。圖中1為體外構建的工程化子宮片層。 圖3構建的組織工程化子宮片層示意圖。圖中l為上皮層；2為基質層3為平滑肌層。
權利要求
1. 一種工程化子宮組織片層，其特點是蟲子宮平滑肌細胞和基質細胞分別與凝膠材料混合 后按順序疊加而成雙層結構，再在其上疊加上皮細胞，進一步形成具有類似于正常子宮 壁的組織結構，包括平滑肌層、SJt層和上皮層。
2. 權利要求1所述的細胞包括子宮平滑肌細胞，基質細胞和上皮細胞，可以是來源于正常 和病理缺損的兔子宮組織，也可以是正常和病理缺損的人子宮組織，也可以是來源于其 他哺乳動物子宮組織。
3. 權利要求1所述的支架材料可以是I型膠原凝膠，ECM-gel，也可以是硫酸軟骨素和殼聚 糖凝膠，其中最優選的是I型膠原凝膠和ECM-gd。
4. 權利要求1所述的一種工程化子宮組織片層，其底層是平滑肌層，中間層是基質層，表 層是上皮層。
5. 權利要求1所述的工程化子宮組織片層，在含血清的DMEM/F12條件培養基中培養， DMEM/F12條件培養基中含有10-100nM雌激素和10-100nM孕激素。
6. 權利要求1所述的工程化子宮組織片層可以用于臨床上子宮內膜的損傷修復，或體內移 植替代缺損子宮組織，也可以作為支持胚胎體外發育及發育生物學機制研究的體外模型, 用于小鼠或兔或其它哺乳動物的正常胚胎或核移植重構胚胎或單精子注射胚胎的支持培 養，提高胚胎的體外發育率和發育質量。
全文摘要
一種工程化子宮組織片層，其特點是由子宮平滑肌細胞和基質細胞分別與凝膠材料混合后按順序疊加而成雙層結構，再在其上疊加上皮細胞，進一步形成具有類似于正常子宮壁的組織結構，包括平滑肌層、基質層和上皮層。本發明可用于子宮組織的修復，作為子宮內膜異位癥的研究模型和子宮腫瘤的研究模型，同時也可以作為支持胚胎體外發育及發育生物學機制研究的體外模型。
文檔編號A61L27/00GK101121043SQ20061007221
公開日2008年2月13日 申請日期2006年8月10日 優先權日2006年8月10日
發明者宋宇軒, 段翠密, 紅 江, 王和平, 王常勇, 王海濱, 郭希民 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院基礎醫學研究所