專利名稱：一種用菜豆間座殼菌真菌代謝的化合物的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種真菌代謝產生的化合物，尤其是一種利用新分離獲得的菜豆間座殼菌HLY2代謝產生的化合物乙酸2-(8-甲基-9-氧雜-雙環[4.2.1]九-2，4-二烯-7-基)-6-氧-3，6-二氫-2H-吡喃-3-基酯(Mycoepoxydiene)在制備抗腫瘤藥物或其他生物活性的先導物中的應用。
背景技術：
菜豆間座殼菌(Diaporhe paseolorum)分離于福建省漳州市九龍江口浮宮鎮草埔頭村紅樹林生態區紅樹植物腐葉，該屬真菌為植物寄生菌(裘緯蕃主編，菌物學大全，北京科學出版社，1998)，該菌株在半海水配方PD(馬鈴薯瓊脂培養基)培養基上，生長良好，菌絲純白，無明顯色素產生，不產孢子，培養10天以后，產生黑色子座。
化合物乙酸2-(8-甲基-9-氧雜-雙環[4.2.1]九-2，4-二烯-7-基)-6-氧-3，6-二氫-2H-吡喃-3-基酯(Mycoepoxydiene)最早見于1999年的報道(Ping Cai，Andrew T et al.Mycoeoxydienerepresents a novel class of fungal metabolites[J].Tetrahedron Letters，1999，401479-1482)，它從一株稀有真菌OS-F66617發酵液中分離得到，但文獻未報道其具有抗腫瘤生理活性。
發明內容
本發明的目的在于提供一種利用新分離獲得的菜豆間座殼菌HLY2代謝產生的化合物乙酸2-(8-甲基-9-氧雜-雙環[4.2.1]九-2，4-二烯-7-基)-6-氧-3，6-二氫-2H-吡哺-3-基酯(Mycoepoxydiene)在制備抗腫瘤藥物或其他生物活性的先導物中的應用。
本發明所采用的真菌為本申請發明人從福建省漳州市九龍江口浮宮鎮草埔頭(地名)紅樹林生態區的紅樹植物腐葉中分離得到的菌株HLY2，經鑒定為菜豆間座殼菌(Diaporhepaseolorum)。該菌株已保藏于中國典型培養物保藏中心，登記入冊的保藏編號為CCTCCNOM 204061，保藏的培養物名稱及注明的鑒別特征為菜豆間座殼菌HLY2 Diaporhe sp.HLY2，保藏日為2004年8月24日。中國典型培養物保藏中心用于專利程序的培養物保藏受理通知書已在本案原申請時(2004.10.1)遞交國家知識產權局。
本發明所述的真菌代謝產生的化合物乙酸2-(8-甲基-9-氧雜-雙環[4.2.1]九-2，4-二烯-7-基)-6-氧-3，6-二氫-2H-吡喃-3-基酯(Mycoepoxydiene)的結構式為 本發明所述的化合物Mycoepoxydiene可通過以下方法制備1)液體培養及發酵液處理取斜面上菌種接種于半海水配方馬鈴薯液體培養基(PD)中培養至發酵，發酵液經過濾，除去菌體，收集發酵液，分裝后(裝瓶量1L/3L))加入體積為發酵液0.8～1.2倍的乙酸乙酯進行萃取，萃取時間為5～15h，收集萃取所得的有機相，在45～55℃減壓濃縮至膏狀；2)化合物的分離取質量為上樣量6～10倍的硅膠(60～100目)，用干法裝柱至硅膠的沉降不再變動，采用真空液相色譜法進行洗脫，洗脫溶劑系統按極性從小到大的順序，由環己烷開始，環己烷與乙酸乙酯不同體積比混合溶劑，乙酸乙酯，乙酸乙酯與甲醇不同體積混合溶劑，最后至甲醇為洗脫溶劑，總共20級洗脫梯度進行洗脫，收集每個梯度的洗脫液，45～55℃減壓濃縮至干，共收集20個回收組分，少量氯仿溶解后(若不溶，可加入適量甲醇至完全溶解)至于小管中自然揮干溶劑；3)選取步驟2)中收集的第8管回收組分，進行進一步硅膠柱分離。取質量為上樣量6～10倍的硅膠(60～100目)，用干法裝柱至硅膠的沉降不再變動，采用真空液相色譜法進行洗脫，洗脫溶劑系統按極性從小到大的順序，由環己烷∶三氯甲烷＝4∶1開始，直至三氯甲烷∶甲醇＝1∶8，總共18個洗脫梯度進行洗脫，收集每個梯度的洗脫液，45～55℃減壓濃縮至干，共收集18個回收組分，少量氯仿溶解后(若不溶，可加入適量甲醇至完全溶解)至于小管中自然揮干溶劑；4)將步驟3)中回收組分的第7管的管壁上出現的透明針狀晶體，用甲醇溶解完全后常溫自然揮發溶劑進行重結晶，得到透明針狀晶體，制得的真菌代謝產物為乙酸2-(8-甲基-9-氧雜-雙環[4.2.1]九-2，4-二烯-7-基)-6-氧-3，6-二氫-2H-吡喃-3-基酯(Mycoepoxydiene)。
在步驟2)中所用的洗脫溶劑系統洗脫梯度為環己烷、環己烷∶乙酸乙酯＝49∶1、環己烷∶乙酸乙酯＝48∶2、環己烷∶乙酸乙酯＝46∶4、環己烷∶乙酸乙酯＝42∶8、環己烷∶乙酸乙酯＝38∶12、環己烷∶乙酸乙酯＝34∶16、環己烷∶乙酸乙酯＝25∶25、環己烷∶乙酸乙酯＝16∶34、環己烷∶乙酸乙酯＝10∶40、乙酸乙酯、乙酸乙酯∶甲醇＝46∶4、乙酸乙酯∶甲醇＝42∶8、乙酸乙酯∶甲醇＝34∶16、乙酸乙酯∶甲醇＝25∶25、乙酸乙酯∶甲醇＝16∶34、乙酸乙酯∶甲醇＝1∶3、乙酸乙酯∶甲醇＝1∶4、乙酸乙酯∶甲醇＝1∶9、甲醇。
在步驟3)中所述的洗脫溶劑梯度為環己烷∶三氯甲烷＝4∶1、環己烷∶三氯甲烷＝3∶1、環己烷∶三氯甲烷＝2∶1、環己烷∶∶三氯甲烷＝1∶1、環己烷∶三氯甲烷＝1∶3、環己烷∶三氯甲烷＝1∶5、環己烷∶三氯甲烷＝1∶6、環己烷∶三氯甲烷＝1∶9、三氯甲烷、三氯甲烷∶甲醇＝30∶1、三氯甲烷∶甲醇＝20∶1、三氯甲烷∶甲醇＝15∶1、三氯甲烷∶甲醇＝10∶1、三氯甲烷∶甲醇＝8∶1、三氯甲烷∶甲醇＝5∶1、三氯甲烷∶甲醇＝1∶1、三氯甲烷∶甲醇＝1∶4、三氯甲烷∶甲醇＝1∶8。
在步驟2)中，所采用的柱的柱高可為8cm，直徑Ф為6cm。
在步驟3)中，所采用的柱的柱高可為6.5cm，直徑Ф為6cm。
化合物的分析進行晶體X-Ray(X衍射)，MS(質譜)，生物活性等測試。
根據X-Ray衍射數據和ESI(電噴霧)質譜數據，對化合物乙酸2-(8-甲基-9-氧雜-雙環[4.2.1]九-2，4-二烯-7-基)-6-氧-3，6-二氫-2H-吡喃-3-基酯(Mycoepoxydiene)進行結構鑒定，可確定化合物結構。根據對化合物Mycoepoxydiene的生物活性測定，利用細胞毒MTT(噻唑藍)法(參見文獻Mosmann F.Rapid colorinetric assay for cellular growth and survivalapplication to proliferation and cytotoxicity assay[J].J.Immunol Methods，1983，6555-63)測定化合物的抗腫瘤活性，發現其對人口腔皮樣癌KB細胞IC50＜6.25μg/mL，對人骨肉瘤MG63細胞IC50＝34.6μg/mL。由此證明，化合物Mycoepoxydiene具有抗腫瘤活性，可將化合物Mycoepoxydiene應用于制備抗腫瘤藥物或其他生物活性的先導物中。
具體實施例方式
以下實施例將對本發明作進一步的說明。
實施例1取斜面上菌種接種于半海水PD中培養至發酵，發酵液經紗布過濾，除去菌體，收集上清，將收集到的上清分裝于3L三角瓶中(1L/瓶)，加入同體積乙酸乙酯攪拌萃取6h；收集有機相，用旋轉蒸發儀50℃減壓濃縮至膏狀。取質量為上樣量的8倍的硅膠(80目)，用干法裝柱，柱內徑選為6cm，柱長為8cm，用真空泵抽吸至硅膠的沉降不再變動；濃縮后的樣品用硅膠(60目)拌樣后壓實平鋪于柱面，然后在樣品面覆蓋厚為1cm的海砂。采用真空液相色譜法進行洗脫。洗脫溶劑系統按極性從小到大的順序，由環己烷開始，環己烷與乙酸乙酯不同體積比混合溶劑，乙酸乙酯，乙酸乙酯與甲醇不同體積混合溶劑，最后至甲醇為洗脫溶劑，總共20級洗脫梯度進行洗脫，每個梯度洗脫溶劑為一個柱床體積，250mL收集每個梯度的洗脫液，50℃減壓濃縮至干，共收集20個回收組分。少量氯仿溶解后(若不溶，可加入適量甲醇至完全溶解)至于小管中自然揮干溶劑。
取上一個步驟中的第8管回收組分，進行進一步硅膠柱分離。取質量為上樣量10倍的硅膠(80目)，用干法裝柱至硅膠的沉降不再變動，柱內徑為6cm，柱長6.5cm，拌樣后的樣品壓實平鋪于柱面，然后在樣品面覆蓋厚為1cm的海砂。采用真空液相色譜法進行洗脫。洗脫溶劑系統按極性從小到大的順序，由環己烷∶三氯甲烷＝4∶1開始，直至三氯甲烷∶甲醇＝1∶8，總共18個洗脫梯度進行洗脫，每個洗脫溶劑為一倍柱床體積200mL。收集每個梯度的洗脫液，50℃減壓濃縮至干，共收集18個回收組分。少量氯仿溶解后(若不溶，可加入適量甲醇至完全溶解)至于小管中自然揮干溶劑。該步驟中回收組分的第7管的管壁上出現大量透明針狀晶體，用適量甲醇溶解完全后常溫自然揮發溶劑進行重結晶，得到透明針狀晶體，制得的真菌代謝產物為乙酸2-(8-甲基-9-氧雜-雙環[4.2.1]九-2，4-二烯-7-基)-6-氧-3，6-二氫-2H-吡喃-3-基酯(Mycoepoxydiene)。
挑取合適晶體進行晶體X-Ray測試，其余取部分進行MS，生物活性等測試，保存。
化合物的結構鑒定采用晶體X-Ray分析測定，根據晶體數據、ESI數據，可確定上述化合物的結構。其晶體參數與文獻報道一致(Ping Cai，Andrew T et al.Mycoeoxydienerepresents a novel class of fungal metabolites[J].Tetrahedron Letters，1999，401479-1482)。
利用細胞毒MTT法(見文獻Mosmann F.Rapid colorinetric assay for cellular growth andsurvivalapplication to proliferation and cytotoxicity assay[J].J.Immunol Methods，1983，6555-63)測定化合物的抗腫瘤活性，發現其對人口腔皮樣癌KB細胞IC50＜6.25μg/mL，對人骨肉瘤MG63細胞IC50＝34.6μg/mL。由此可見，本發明所述的化合物Mycoepoxydiene可作為抗腫瘤藥物或其他生物活性的先導物。
實施例2其制備工藝與實施例1類似，其區別在于將收集到的上清分裝于3L三角瓶中(1L/瓶)，加入體積為發酵液0.8倍的乙酸乙酯攪拌萃取10h；收集有機相，用旋轉蒸發儀45℃減壓濃縮至膏狀。取質量為上樣量的6倍的60目硅膠，用干法裝柱。濃縮后的樣品用100目硅膠拌樣后壓實平鋪于柱面，然后在樣品面覆蓋厚為1cm的海砂。減壓濃縮的溫度為55℃。在進行進一步硅膠柱分離時，取質量為上樣量8倍的60目硅膠。
利用細胞毒MTT法測定化合物的抗腫瘤活性，發現其對人口腔皮樣癌KB細胞IC50＜6.25μg/mL，對人骨肉瘤MG63細胞IC50約為34μg/mL。由此可見，本發明所述的化合物Mycoepoxydiene可作為抗腫瘤藥物或其他生物活性的先導物。
實施例3其制備工藝與實施例1類似，其區別在于將收集到的上清分裝于3L三角瓶中(1L/瓶)，加入體積為發酵液1.2倍的乙酸乙酯攪拌萃取15h；收集有機相，用旋轉蒸發儀55℃減壓濃縮至膏狀。取質量為上樣量的10倍的100目硅膠，用干法裝柱。濃縮后的樣品用80目硅膠拌樣后壓實平鋪于柱面，然后在樣品面覆蓋厚為1cm的海砂。減壓濃縮的溫度為45℃。在進行進一步硅膠柱分離時，取質量為上樣量6倍的100目硅膠。
利用細胞毒MTT法測定化合物的抗腫瘤活性，發現其對人口腔皮樣癌KB細胞IC50＜6.25μg/mL，對人骨肉瘤MG63細胞IC50約為34μg/mL。由此可見，本發明所述的化合物Mycoepoxydiene可作為抗腫瘤藥物或其他生物活性的先導物。
權利要求
1.一種用真菌代謝產生的化合物乙酸2-(8-甲基-9-氧雜-雙環[4.2.1]九-2，4-二烯-7-基)-6-氧-3，6-二氫-2H-吡喃-3-基酯，所述的真菌為菜豆間座殼菌(Diaporhe phaseolorum)HLY2，登記入冊的保藏編號為CCTCC NOM 204061，所述的真菌代謝產生的化合物乙酸2-(8-甲基-9-氧雜-雙環[4.2.1]九-2，4-二烯-7-基)-6-氧-3，6-二氫-2H-吡喃-3-基酯(Mycoepoxydiene)的結構式為 其特征在于所述的化合物乙酸2-(8-甲基-9-氧雜-雙環[4.2.1]九-2，4-二烯-7-基)-6-氧-3，6-二氫-2H-吡喃-3-基酯在制備抗腫瘤藥物或其他生物活性的先導物中的應用。
全文摘要
一種用菜豆間座殼菌真菌代謝的化合物的應用，涉及一種真菌代謝產生的化合物，提供一種利用新分離獲得的菜豆間座殼菌HLY2代謝產生的化合物Mycoepoxydiene在制備抗腫瘤藥物或其他生物活性的先導物中的應用。化合物的分析進行晶體X－Ray，MS和生物活性等測試。根據對化合物Mycoepoxydiene的生物活性測定，利用細胞毒MTT法測定化合物的抗腫瘤活性，發現其對人口腔皮樣癌KB細胞IC
文檔編號A61K31/366GK101024647SQ200610070859
公開日2007年8月29日 申請日期2004年10月1日 優先權日2004年10月1日
發明者林昕, 黃耀堅, 徐慶研, 鄭忠輝, 宋思揚, 蘇文金 申請人:廈門大學