專利名稱：富含有機硒的γ－亞麻酸干菌粉及其生產工藝的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種γ-亞麻酸干菌粉及其生產工藝，具體地說，涉及一種利用刺孢小克銀漢霉的誘變菌株發酵生產富含有機硒的γ-亞麻酸干菌粉產品及其工藝。
背景技術：
γ-亞麻酸(Gamma-Linolenic Acid)，簡稱GLA，分子式C18H30O2，是一種十八碳三烯酸，屬于多烯類活性物質。GLA為人體必需的不飽和脂肪酸，是一大類調節人體細胞自身活力的物質。它具有治療高血壓、高血脂、高血糖、糖尿病、糾正脂質代謝紊亂、治療肝硬化和腎病綜合癥、抑制癌細胞繁殖、增強人體免疫功能的功效。
現有技術中一直是從月見草等植物中提取γ-亞麻酸，但由于原料的缺乏，導致γ-亞麻酸的產量受到限制，遠遠滿足不了國內外市場的需求。近年來開發出一種生物合成γ-亞麻酸的方法，采用被孢霉、小克銀漢霉等微生物菌種發酵生產γ-亞麻酸菌粉。生物合成的γ-亞麻酸主要成分，除含有多烯亞油酸(脈通的主要成分)和亞麻酸外，還含有抗突變、抗輻射、抗疲勞、抗衰老的超氧化物歧化酶(SOD)，增強肌體免疫力的高分子多糖，以及蛋白質、多種氨基酸、維生素和微量元素。其多種有效成分的綜合利用，經大量臨床病理試驗證明，療效顯著，無任何毒副作用，而且不含任何激素。
硒元素，是人和動物生命活動不可缺少的微量元素。科學研究表明，四十多種疾病與硒元素有關，缺硒可引起貧血，心腦血管疾病，肝病，糖尿病，癌癥，兒童發育不良，人體過早老化等。硒元素是多種抗氧化酶的活性中心，其抗氧化能力是Ve的400倍。它可有效抑制癌細胞的分裂和增殖，增強人體免疫力。硒的補充可凈化血液、增強心肌動力。目前有人將亞麻酸純品與硒元素采用化學方法合成硒化亞麻酸，得到了抗腫瘤效果明顯的產品。但這種采用化學合成獲得的產品中有化學溶酶殘留，對人體有害，這個問題目前尚未解決。
發明內容
本發明的目的之一是提供一種利用微生物發酵法(工業化)生產富含有機硒的γ-亞麻酸干菌粉的新工藝；目的之二是提供了一種沒有任何化學溶酶殘留的富含有機硒的γ-亞麻酸干菌粉產品；目的之三是提供了一株經誘變得到的高產GLA的耐硒菌株。
本發明采用下述技術方案來解決上述發明目的1.菌株誘變本發明使用的刺孢小克銀漢霉(Cunninghamella echinulata)CGMCC NO.1652，是以中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心提供的AS3.2473刺孢小克銀漢霉為原始菌種，經誘變獲得。具體誘變過程為將幼齡菌絲進行處理獲得原生質體，經過微波、亞硝基胍復合處理，將處理后的菌種懸液涂在含亞硒酸鈉10mg/L-200mg/L的PDA平板上培養，挑出形態明顯差異的菌株，然后經過搖瓶復選而獲得。該菌株與原始菌株相比具有生長速度快，孢子數量多，菌絲粗壯、傳代后遺傳性狀穩定等特點。
該菌株在PDA培養基上，溫度28℃培養。2天菌落直徑為2-5cm，菌絲為灰白色，有部分分生孢子形成；3-4天菌落直徑為4-10cm，分生孢子大量形成，菌落為深灰色。
菌絲初期無分隔，以后形成橫隔。菌絲粗壯多分枝，直徑約11-19微米。孢囊梗直立、分枝呈傘狀。孢子囊單生，呈球形。分生孢子為球形或橢圓形，上有長刺，并且可以脫落。孢子直徑9.5-13.2微米。分生孢子聚傘狀，梅花狀或不規則狀。
2.種液培養將制成的孢子懸液接種于種子罐中進行培養。培養基的組成包括蔗糖(或葡萄糖)3-5％，蛋白胨0.05-0.1％，磷酸二氫鉀0.01-0.03％，硫酸鎂0.01-0.03％，碳酸鈣0.03-0.05％，亞硒酸鈉0.0005-0.001％，PH5.5-6，溫度22-30℃，培養時間24-36小時。
3.發酵罐培養將生長良好的種子液接入發酵罐中。發酵培養基的組成包括蔗糖(或淀粉)8-15％，花生餅粉1-5％，蛋白胨1-5％，磷酸二氫鉀0.01-0.03％，硫酸鎂0.01-0.03％，碳酸鈣0.03-0.05％，亞硒酸鈉0.0005-0.001％，促生長因子微量，PH5.5-6，溫度22-30℃，風量1∶0.05-0.5v/v，攪拌速度150-200rpm，罐壓0.02-0.08mpa，培養時間96-100小時。
4.菌體收集將得到的γ-亞麻酸鮮菌體采用微波真空冷凍升華干燥法進行干燥。反應參數如下真空室直徑1.6m，長13m，真空度30mbar輸入微波頻率2450MHz±50MHz輸入微波功率48KW±2KW使用玻璃增強聚四氟乙烯傳輸帶進行傳送。
將在-5℃下預凍結的γ-亞麻酸鮮菌體放在傳送帶上，80-100T的低壓下輸入微波能量，加熱40分鐘，并保持溫度15-20％的熱風對流，由里向外蒸發水份。干燥時間共4-6小時。
本發明的產品技術指標如下每100g干菌粉中，油脂含量35-39％γ-亞麻酸含量15-18％硒含量139-330μg/g復合氨基酸3.5-6.8g蛋白多糖4-7g超氧化物歧化酶(SOD)543.7μg/g采用上述的技術方案實施本發明，其主要的有益效果如下1.使用誘變的菌株發酵生產γ-亞麻酸，在篩選高產GLA菌株的同時，用含有高濃度硒的培養基對菌株進行培養，篩選出含硒的耐硒菌株(普通的刺孢小克銀漢霉不能耐硒生長)，并在發酵培養中采取了相應的條件，獲得了即含GLA又富含有機硒的γ-亞麻酸干菌粉產品，其中γ-亞麻酸的含量在12-15％，最高可達18％。同時，含有豐富的硒，硒含量高達139-330μg/g。實驗證明，多種具有生理功能物質的協同作用可明顯提高產品的功效。
2.制備過程中，主要原料(碳源、氮源)全部采用天然有機物，不使用無機原料，提高了產品的安全程度，綠色環保。
3.針對產品油脂含量高、易氧化等特點，采用微波真空冷凍升華干燥法對產品進行干燥。該法是將真空微波干燥和真空冷凍升華干燥有機結合到一起，微波在此處主要起到加熱的作用。過去在真空冷凍升華技術中，加熱采用電加熱或熱泵機組等裝置，采用微波后，可以取消上述裝置。冷凍干燥的基本原理，是基于水的三態變化，三種相態既可以相互轉換又可以共存。當水在三相點(溫度0.01℃，水蒸氣壓610.5Pa)時，水、冰、水蒸氣三者可共存且相互平衡。在高真空狀態下，利用升華原理，使預先凍結的γ-亞麻酸菌體中的水分不經過冰的溶化，直接以冰態升華為水蒸氣被除去，從而達到冷凍干燥的目的。凍干的γ-亞麻酸菌體成海綿狀、無干縮、復水性極好、含水分極少，相應包裝后可在常溫下長時間保存和運輸。相對于其他干燥方法，微波真空冷凍升華干燥法的優點如下許多熱敏性物質不會發生變性或失活；在低溫下干燥時，γ-亞麻酸菌體中的一些揮發性成分損失很小；低溫下，微生物的生長和酶的作用無法進行，因此產品能保持原來的狀態；由于在凍結狀態下進行干燥，因此產品體積幾乎不變，保持了γ-亞麻酸菌體原來的結構，不會發生濃縮現象；由于γ-亞麻酸菌體中的水分在預凍以后以冰晶的形態存在，原來溶于水中的無機鹽類物質被均勻的分配在γ-亞麻酸的菌體中。升華時，溶于水中的溶解物質就析出，避免了一般干燥方法中γ-亞麻酸菌體內部水分向表面遷移所攜帶的無機鹽在表面析出而造成表面硬化的現象；干燥后的γ-亞麻酸菌體疏松多孔，呈海綿狀，加水后溶解迅速而完全，幾乎立即恢復原來的狀態；由于干燥在真空下進行，氧氣極少，因此一些易氧化物質得到了保護；干燥能排除95-99％以上的水分，使干燥后的γ-亞麻酸菌體能長期保存而不致變質。
由于上述優點的存在，采用該方法進行干燥可提高γ-亞麻酸干菌粉的各項技術指標1-3個百分點，有效提高γ-亞麻酸干菌粉的附加值。
4.采用生物發酵法獲得的富含有機硒的γ-亞麻酸干菌粉與化學合成的硒化亞麻酸相比，沒有任何化學溶酶殘留，對人體無任何毒副作用，并且多種具有生理功能物質的協同作用可明顯提高產品的功效。
5.生產發酵全過程，設立無菌區并采用全封閉作業，計算機全程監控，能保證γ-亞麻酸干菌粉的質量，降低工業化生產成本。
本發明使用的刺孢小克銀漢霉(Cunninghamellaechinulata)已經于2006年3月16日保藏于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC NO.1652。
具體實施例方式
下列實施例將進一步說明本發明。
實施例11噸發酵罐生產菌體1.將斜面菌種CGMCC NO.1652接種于克氏瓶中擴大培養，溫度22-30℃，培養3-5天。
2.將菌種制成菌懸液接種于種子罐中，種子罐容積為100升，培養基蔗糖4kg，蛋白胨0.4kg，磷酸二氫鉀20g，硫酸鎂20g，碳酸鈣35g，亞硒酸鈉2.1g，PH5.5-6，溫度25-30℃，風量1∶0.5v/v，攪拌速度150-200rpm，培養時間32小時。
3.將種子液轉接到發酵罐中，發酵罐容積1000升。培養基蔗糖72kg，花生餅粉4kg，磷酸二氫鉀200g，硫酸鎂200g，碳酸鈣350g，亞硒酸鈉21g，促生長因子2.3g，PH5.5-6，溫度22-30℃，風量1∶0.25-0.55v/v，攪拌速度150-200rpm，罐壓0.02-0.08mpa，培養96小時。
4.菌體收集，采用微波真空冷凍升華技術，輸入微波頻率2400MHz，輸入微波功率46KW，加熱40分鐘，并保持溫度15-20％的熱風對流，干燥4-6小時。得菌體31.5kg，其中每100g干菌粉中油脂含量35.5％，GLA含量12.5％，硒含量139.2μg/g。
實施例25噸發酵罐生產菌體1.將斜面菌種CGMCC NO.1652接種于克氏瓶中擴大培養，溫度22-30℃，培養3天。
2.將菌種制成菌懸液接種于種子罐中，種子罐容積為500升。培養基蔗糖15kg，蛋白胨3.5kg，磷酸二氫鉀90g，硫酸鎂90g，碳酸鈣150g，亞硒酸鈉12g，PH5.5-6，溫度22-30℃，風量1∶0.3v/v，攪拌速度150-200rpm，罐壓0.02-0.08mpa，培養時間28小時。
3.將種子液轉接到發酵罐中，發酵罐容積5000升。培養基蔗糖400kg，花生餅粉35kg，磷酸二氫鉀900g，硫酸鎂900g，碳酸鈣1500g，亞硒酸鈉120g，促生長因子10.5g，PH5.5-6，溫度22-30℃，發酵至糖含量4％時，補力100kg滅菌后的糖蜜，風量1∶0.1-0.3v/v，攪拌速度150-200rpm，罐壓0.02-0.08mpa，培養100小時。
4.菌體收集，同實施例1。得菌體128kg，其中每100g干菌粉中，油脂含量32.3％，GLA含量18.1％，硒含量142.4μg/g。
實施例35噸發酵罐生產菌體1.將斜面菌種CGMCC NO.1652接種于克氏瓶中擴大培養，溫度22-30℃，培養3-4天。
2.將菌種制成菌懸液接種于種子罐中，種子罐容積為500升。培養基蔗糖15kg，蛋白胨3.5kg，磷酸二氫鉀90g，硫酸鎂90g，碳酸鈣150g，亞硒酸鈉12g，PH5.5-6，溫度25-30℃，風量1∶0.3v/v，攪拌速度150-200rpm，罐壓0.02-0.08mpa，培養時間30小時。
3.將種子液轉接到發酵罐中，發酵罐容積5000升。培養基蔗糖400kg，花生餅粉35kg，磷酸二氫鉀900g，硫酸鎂900g，碳酸鈣1500g，亞硒酸鈉120g，促生長因子10.5g，PH5.5-6，溫度25-30℃，發酵至糖含量10％時，補加80kg滅菌后的糖蜜，風量1∶0.1-0.3v/v，攪拌速度150-200rpm，罐壓0.02-0.08mpa，培養100小時。
4.菌體收集，同實施例1。得菌體120kg，其中每100g干菌粉中油脂含量37.3％，GLA含量16.2％，硒含量168.5μg/g。
實施例45噸發酵罐生產菌體1.將斜面菌種CGMCC NO.1652接種于克氏瓶中擴大培養，溫度22-30℃，培養3-4天。
2.將菌種制成菌懸液接種于種子罐中，其中溫度22℃，罐壓0.05mpa，其余同實施例3。
3.將種子液轉接到發酵罐中，其中溫度30℃，罐壓0.08mpa，攪拌速度180rpm，其余同實施例3。
4.菌體收集，同實施例1。得菌體118kg，其中每100g干菌粉中油脂含量35.2％，GLA含量17.0％，硒含量156.3μg/g。
對比實施例11噸發酵罐生產菌體1.同實施例1。
2.同實施例1。
3.同實施例1。
4.菌體收集，采用硫化床干燥法。干燥時間6-8小時，溫度50-70℃。
結果比較
對比實施例25噸發酵罐生產菌體1.同實施例3。
2.同實施例3。
3.同實施例3。
4.菌體收集，采用硫化床干燥法。干燥時間6-8小時，溫度50-70℃。
結果比較
值得說明的是，本發明可用其他的不違背本發明的精神或主要特征的具體形式來概述。因此，無論從哪一點來看，本發明的上述實施方案都只能認為是對本發明的說明而不能限制本發明。
權利要求
1.一種富含有機硒的γ-亞麻酸的生產方法，其特征在于采用刺孢小克銀漢霉(Cunninghamella echinulata)CGMCC NO.1652為菌株進行富硒發酵，包括以下步驟(1)菌種培養將斜面菌種接入克氏瓶中進行擴大培養；(2)種液培養將孢子懸液接種于種子罐中培養，培養基以葡萄糖和/或蔗糖為碳源，以花生餅粉和/或蛋白胨為氮源，并添加亞硒酸鈉，PH5.5-6，溫度22-30℃，培養時間24-36小時；(3)發酵培養將生長良好的種子液接入發酵罐中培養，培養基以蔗糖、糖蜜、淀粉中任意一種或幾種為碳源，以花生餅粉和/或蛋白胨為氮源，并添加亞硒酸鈉，PH5.5-6，溫度22-30℃，罐壓0.02-0.08mpa，風量10.05-0.5v/v，攪拌速度150-200rpm，培養時間96-100小時；(4)菌體收集采用微波真空冷凍升華干燥法干燥，得富含有機硒的γ-亞麻酸干菌粉。
2.根據權利要求1所述的生產方法，其中所述的菌種培養的條件為PDA培養基，溫度22-30℃，培養3-5天。
3.根據權利要求1所述的生產方法，其中種子培養基包括蔗糖3-5％，蛋白胨0.05-0.1％，磷酸二氫鉀0.01-0.03％，硫酸鎂0.01-0.03％，碳酸鈣0.03-0.05％，亞硒酸鈉0.0005-0.001％。
4.根據權利要求1所述的生產方法，其中發酵培養基包括蔗糖8-15％，花生餅粉1-5％，蛋白胨1-5％，磷酸二氫鉀0.01-0.03％，硫酸鎂0.01-0.03％，碳酸鈣0.03-0.05％，亞硒酸鈉0.0005-0.001％，促生長因子微量，培養時間96小時。
5.根據權利要求1所述的生產方法，其中微波真空冷凍升華干燥的條件為輸入微波頻率2450MHz±50MHz，輸入微波功率48KW±2KW，微波加熱40分鐘，并保持溫度15-20％的熱風對流，干燥時間為4-6小時。
6.根據權利要求1-5任意一項所述的方法生產的γ-亞麻酸干菌粉。
7.刺孢小克銀漢霉(Cunninghamella echinulata)CGMCC NO.1652。
全文摘要
本發明涉及一種富含有機硒的γ－亞麻酸干菌粉及其生產工藝，以及生物合成該菌粉使用的誘變菌株。采用經誘變的刺孢小克銀漢霉CGMCC N0.1652，在含有機碳源、有機氮源、無機鹽、亞硒酸鈉的培養基上進行富硒發酵，獲得富含有機硒的γ－亞麻酸菌體，后采用微波真空冷凍升華干燥技術，獲得油脂含量35－39％，γ－亞麻酸含量15－18％，硒含量139－330μg/g的γ－亞麻酸干菌粉。本發明經多次生產試驗，技術成熟，工藝簡單，綠色環保，適合于大規模工業化生產，具有原料來源廣泛、成本低廉、質量好等特點。其產品，富含有機硒的γ－亞麻酸干菌粉，可廣泛應用于醫藥、食品、飼料添加劑等領域。
文檔編號A61P3/10GK1858216SQ200610065889
公開日2006年11月8日 申請日期2006年3月29日 優先權日2006年3月29日
發明者王景恒, 葛英華 申請人:王景恒, 葛英華