靶向激活慢性粒細胞白血病蛋白激酶pkr的寡核苷酸及其應用的制作方法

專利名稱：靶向激活慢性粒細胞白血病蛋白激酶pkr的寡核苷酸及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及治療慢性粒細胞白血病的核苷酸序列，特別涉及一種靶向激活慢性粒細胞白血病蛋白激酶PKR的寡核苷酸及其在制備治療慢性粒細胞白血病的藥物中的應用。

背景技術：
慢性粒細胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)的發生是由于t(9；22)(q34；q11)所致的BCR-ABL融合基因編碼產生了具有強烈酪氨酸激酶活性的BCR-ABL融合蛋白，該融合蛋白激活PI3K(Phosphatidylinositol-3kinase)、Ras(Renin-angiotensin system)、STAT(Signal transducer and activatorof transcription)等信號轉導通路，導致細胞惡性轉化。目前治療慢性粒細胞白血病的藥物主要有各種化療藥，這些藥物對全身各個系統的毒副作用較大，病人難以堅持。針對BCR-ABL融合蛋白的治療取得了一些進展，尤其以STI571(商品名Glivec)的作用最為顯著。然而，隨著STI571的使用，臨床出現耐藥和對其先天不敏感的病人，為此，本發明立足對CML治療現狀研究，開發了新的治療手段。
雙鏈RNA依賴性蛋白激酶(Double-stranded RNA-dependent proteinkinase，PKR)是在哺乳動物細胞中表達、雙鏈RNA調節的絲/蘇氨酸蛋白激酶。它是細胞被某些病毒感染后反應性防御機制的一個關鍵性成分，在正常細胞的分化、轉化及凋亡等生理、病理過程中也起著重要的調節作用。它能被干擾素誘導表達而被雙鏈RNA所激活，激活過程包括雙鏈RNA分子對PKR單體的募集及結合、兩分子PKR單體同源二聚化及相互使對方磷酸化等一系列反應。PKR一經激活便具有很強的絲/蘇氨酸蛋白激酶活性，高效地在蛋白合成啟動因子eIF2的α亞單位上加上磷酸基團，并導致GDP-GTP交換因子eIF2B的隱蔽，從而抑制細胞內總體蛋白合成的啟動。同時，活性PKR還激活促凋亡因子NF-κB、Caspase8等，兩種效應共同作用導致細胞的凋亡。有資料表明，激活的PKR可誘導某些病毒感染細胞凋亡和多種正常細胞及病理細胞的凋亡，而被認為是一種抑癌蛋白。在腫瘤細胞中誘導PKR的表達及活性增高是目前腫瘤生物治療研究領域的新動向，目前還沒有通過激活PKR誘導急變期CML癌細胞凋亡，從而達到治療目的基因的報道。


發明內容
本發明的目的是提供一種靶向激活慢性粒細胞白血病蛋白激酶PKR的寡核苷酸序列及攜帶有該寡核苷酸序列的逆轉錄病毒雙表達載體，本發明的目的還在于提供該寡核苷酸序列在制備治療慢性粒細胞白血病的藥物中的應用。
具體技術方案如下一種靶向激活慢性粒細胞白血病蛋白激酶PKR的寡核苷酸，其序列是SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2。
一種載體，其特征是攜帶有如權利要求1所述的寡核苷酸，并引入了增強型綠色熒光蛋白基因。
逆轉錄病毒載體因其轉染效率高而最常使用，也可使用其他的載體，如質粒、腺病毒等。
本發明的核心是通過設定的寡核苷酸序列SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2，利用載體攜帶該寡核苷酸序列，為了能測定該序列、便于追蹤觀察，便于觀察實驗過程中病毒載體的感染效率，載體上還引入增強型綠色熒光蛋白基因(eGFP)，達到雙表達的效果。向急變期慢粒白血病K562細胞株轉入這種特殊設計的重組逆轉錄病毒載體，可以在K562細胞內轉錄并與BCR-ABLmRNA雜交形成足夠長度的雙鏈RNA，特異性激活PKR，PKR一經激活便具有很強的絲/蘇氨酸蛋白激酶活性，高效地在蛋白合成啟動因子eIF2的α亞單位上加上磷酸基團，并導致GDP-GTP交換因子eIF2B的隱蔽，從而抑制細胞內總體蛋白合成的啟動。同時，活性PKR還激活促凋亡因子NF-κB、Caspase8等，兩種效應共同作用導致細胞的凋亡，而對機體內的正常細胞沒有任何影響。最重要的是在設計寡核苷酸序列SEQ ID NO 1和SEQ ID NO2時，為了為防止轉錄過早終止，其中一對核苷酸T-A(斜體下劃線標記)被更換為C-g，實驗證明單個堿基對的誤配不會影響雙鏈RNA對蛋白激酶PKR的激活，相反，如不誤配，轉錄會過早終止，無法進行下一步的制備。同時SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2的長短也必須限制，過長過短都將影響PKR的激活。
應用該策略治療腫瘤有兩個前提條件①靶細胞需有PKR蛋白的表達。②需要有效的手段激活腫瘤細胞內PKR，而正常組織細胞內PKR不受影響。首先，CML細胞中BCR-ABL融合基因的形成及繼發性遺傳學改變并沒有影響PKR的生成。文獻檢索發現，無論是慢性期還是急變期的CML細胞都表達PKR。其次，由于PKR能被雙鏈RNA分子所激活，而雙鏈RNA分子的長度決定了其對PKR的激活能力(要求30-85bp)，太短不能有效結合兩分子PKR，太長也會由于形成空間結構等原因影響對PKR的激活。由于CML細胞內有獨特的BCR-ABL融合基因，會轉錄出BCR-ABL mRNA，因此我們針對此融合部位設計一段SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2(其中20nt針對BCR區，20nt針對ABL區)，在CML細胞內轉錄的反義RNA短片段將可以與BCR-ABLmRNA雜交形成40bp的雙鏈RNA，進而特異性激活PKR；但在正常細胞內只能形成20bp(BCR區或ABL區)的雙鏈RNA，長度不足以激活PKR，故對正常細胞沒有影響。
本發明以慢性粒細胞白血病K562細胞作為實驗模型，應用分子生物學、細胞生物學、實驗血液學、實驗動物學等方法，進行了一系列實驗，實驗證明了靶向激活慢性粒細胞白血病蛋白激酶PKR的逆轉錄病毒雙表達載體對K562細胞的抑制作用。包含特定長度的基因序列，靶向激活慢性粒細胞白血病蛋白激酶PKR的逆轉錄病毒載體的構建和病毒包裝和K562細胞感染。逆轉錄病毒載體因其轉染效率高而最常使用，也可以選擇其他的載體，如質粒、腺病毒等。
構建該寡核苷酸及載體所用的pMSCV-neo逆轉錄病毒載體購于美國BD公司，IRES2-EGFP質粒載體購于美國BD公司，pSilencer3.1-H1載體購自美國Ambion公司。根據BCR-ABL b3a2型mRNA(GenBank登陸號AJ131466)融合位點左右各20bp序列設計互補序列SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2。序列兩端設計酶切位點，為防止轉錄過早終止，其中一對核苷酸T-A(斜體下劃線標記)被更換為C-g(單個堿基對的誤配不會影響雙鏈RNA對蛋白激酶PKR的激活)。該寡核苷酸均由上海生工生物工程技術服務有限公司人工合成，溶解后于-20℃保存備用。
具體來講，制成攜帶特定序列、特定長度寡核苷酸的逆轉錄病毒載體大致可包括以下步驟 1)pH1-BCR-ABL40as重組質粒的構建及鑒定 2)pMSCVeGFP逆轉錄病毒載體的構建及鑒定 3)pMSCVeGFP-H1-BCR-ABL40AS重組逆轉錄病毒雙表達載體的構建及鑒定 4)病毒包裝及滴度測定 通過以上步驟制得病毒毒液命名為RV-GFP(pMSCVeGFP經過細胞包裝獲得的含有熒光蛋白基因的病毒液)、RV-40AS(pMSCVeGFP-H1-BCR-ABL40AS經過細胞包裝獲得的含有熒光蛋白基因和本發明核苷酸序列的病毒液)。
本發明的有益效果是攜帶特定序列、特定長度寡核苷酸的逆轉錄病毒載體，將外源性基因導入慢性粒細胞白血病K562細胞，通過靶向激活慢性粒細胞白血病細胞蛋白激酶PKR，抑制細胞內總體蛋白合成并能激活促凋亡因子NF-κB、Caspase8等，兩種效應共同作用導致細胞的凋亡，而對機體內的正常細胞沒有任何影響。將上述有效活性成分制成臨床上所需的藥物，能有效的治療慢性粒細胞白血病，填補了慢性粒細胞白血病治療上的又一空白。
為了證實攜帶有該核苷酸序列的逆轉錄病毒雙表達載體對慢性粒細胞白血病K562細胞增殖和凋亡的影響進行了如下實驗 實驗分組試驗分為RV-GFP、RV-40AS(本發明組)、RV-40AS+2AP(2AP二氨基嘌呤，是PKR的抑制劑)、polyIC(聚肌苷酸-聚胞啶酸一種RNA雙鏈的類似物，作為PKR非特異性激活組)和未處理組。所做實驗方法如下 1、重組逆轉錄病毒感染實驗 收集RV-GFP和RV-40AS病毒上清，經0.45μm醋酸纖維素膜過濾后，分別以兩種上清重懸提前離心收集的K562細胞，以6×105/孔接種于12孔細胞培養板中，同時加polybrene(聚凝胺，其帶正電可和帶負電的DNA分子結合，使得DNA可以結合在細胞表面，終濃度為4μg/mL)，37℃，5％CO2，飽和濕度的恒溫孵箱中培養；ECV304細胞提前24h接種于12孔細胞培養板中，2×105/孔，以病毒濾液替換板孔中培養基，同時加入polybrene(終濃度為4μg/mL)，轉移入37℃，5％CO2，飽和濕度的恒溫孵箱中培養。感染12h后開始用倒置熒光顯微鏡觀察熒光表達情況，確定重組逆轉錄病毒感染了K562細胞。
2、polyIC的細胞轉染試驗 參照DMRIE-C試劑說明書RNA轉染步驟，分別轉染K562細胞和ECV304細胞。polyIC的轉染濃度為0.5~25μg/ml。
1)polyIC轉染K562細胞 在12孔細胞培養板中加無血清RPMI 1640 400μl/孔，吸取混勻的脂質體DMRIE-C 0.5~5.0μl加入各孔，迅速輕輕的搖蕩，混勻；再吸取一定量poly IC加入各孔，使其終濃度為0.5~20μg/ml，迅速輕輕的搖蕩，使液體混勻；收集對數生長期的K562細胞，計數，使細胞數量達到6×105/孔，800rmp/min×10min離心，棄上清，用無血清RPMI 1640洗滌細胞兩次，棄上清；用上述DMRIE-C/poly IC混和液輕輕重懸K562細胞，并將該細胞懸液，接種于12孔細胞培養板，轉移入37℃，5％CO2，飽和濕度的恒溫培養箱中孵育4小時，加入15％FCS RPMI 1640 800μl/孔，繼續培養。
2)polyIC轉染ECV304細胞 提前24小時在12孔細胞培養板中接種1.5×105個ECV304細胞，吸棄培養基，加入無血清RPMI 1640，沖洗細胞兩次。配制轉染混合液400μl無血清RPMI 1640中加入混勻的脂質體DMRIE-C 0.5~5.0μl，迅速輕輕的搖蕩，混勻；吸取一定量polyIC加入各孔，使其終濃度為0.5~20μg/ml，迅速輕輕的搖蕩，使液體充分混勻；將轉染混合液加入細胞培養板中，轉移入37℃，5％CO2，飽和濕度的恒溫培養箱中孵育4小時，加入15％FCS RPMI 1640800μl/孔，繼續培養。
從以下各個指標來觀察、檢測，證實感染了重組逆轉錄病毒載體的K562細胞的抑制和凋亡 1、細胞形態學檢測 用PBS調整細胞密度至1×106/ml。取潔凈載玻片及有孔濾紙，置于離心杯中。將離心杯置于離心機上，加50~100μL細胞懸液于離心杯中。離心，1000~1500rpm 2min，取出玻片。滴加等量的瑞氏染液和PBS，室溫染色10~15min，流水沖洗。晾干，顯微鏡觀察并照相。
附圖6.逆轉錄病毒對K562細胞增殖的影響瑞氏染色48h后用光學顯微鏡觀察，RV-40AS和polyIC處理組細胞表現明顯的細胞胞體縮小，胞膜皺縮，泡狀突起及不規則凹陷，核固縮，染色質濃聚，成塊并分布于核膜周邊，如附圖6所示AUntreated group.BpolyIC treated group.CRV-40AStreated group.DRV-GFP treated group.ERV-40AS+2AP treated group.。
2、生長曲線實驗 實驗分組RV-GFP、RV-40AS、RV-40AS+2AP、polyIC處理組和未處理組；同時以ECV304細胞為對照細胞株。每組做3個平行孔。K562細胞以1×104/孔的密度接種于24孔板，ECV304細胞鋪板2×103/孔。然后分別加入病毒上清RV-40AS、RV-GFP感染細胞，根據預實驗確定使其終濃度為5×105CFU/mL。同時加入polybrene(終濃度為4μg/mL)，此外，PKR抑制劑處理組(RV-40AS+2AP組)還需加入PKR抑制劑2AP(終濃度5mmol/L)；polyIC處理組用脂質體轉染，根據預實驗確定終濃度為15μg/mL，接種后常規培養，3~5天后給沒計數的孔離心換液，連續7天以臺盼藍染色計數活細胞數目，每次計數重復3次，以平均值繪制細胞生長曲線。
附圖7、8.生長曲線實驗通過生長曲線發現polyIC對K562細胞和ECV304細胞的生長都具有抑制作用，病毒RV-40AS僅對K562細胞的生長具有特異的抑制效應，而2AP能阻斷RV-40AS對K562細胞生長的抑制效應。RV-GFP既不能抑制K562細胞的生長也不能抑制ECV304細胞的生長。細胞生長情況如圖7、8和表1、2所示。
表1不同因素處理后不同時間的K562細胞數(×104) 表2不同因素處理后不同時間的ECV304細胞數(×103) 3、MTT實驗 收集對數生長期的K562細胞，接種于96孔培養板(2×104/孔)，ECV304細胞頭天鋪板4×103/孔。實驗分組同上，每組做3個平行孔。然后分別加入病毒上清RV-40AS、RV-GFP感染細胞，使其終濃度為5×105CFU/mL。同時加入polybrene(終濃度為4μg/mL)，此外，PKR抑制劑處理組(RV-40AS+2AP組)還需加入PKR抑制劑2AP(終濃度5mmol/L)；polyIC處理組用脂質體轉染，終濃度為15μg/mL。每孔總體積200μL，試劑空白以RPMI-1640培養基補足。置37℃，含5％CO2培養箱中培養72h，在每孔中加入20μL四甲基偶氮唑鹽(MTT，濃度5mg/ml)，繼續培養4h，K562細胞1000g離心10min，小心棄去上清，ECV304細胞，直接傾去上清，加入二甲基亞砜150μL，振蕩5min，用酶標儀在570nm處讀取吸光度值(A值)，按以下公式計算細胞增殖抑制率
MTT實驗檢測到不同濃度RV-40AS對K562細胞增殖的抑制率不同，如附圖5所示，可以看出病毒上清RV-40AS感染細胞的終濃度為5×105CFU/mL。
附圖9.MTT實驗結果通過MTT實驗發現polyIC對K562細胞和ECV304細胞的增殖都具有明顯的抑制作用，增殖抑制率分別為59.1％和56.3％，病毒RV-40AS感染K562細胞和ECV304細胞，發現其僅對K562細胞的增殖具有特異的抑制效應，增殖抑制率為73.4％。而2AP能阻斷RV-40AS對K562細胞的抑制效應。RV-GFP對K562細胞和ECV304細胞的增殖都沒有明顯的抑制效應。如表3和圖9所示 表3不同因素處理后對K562細胞和ECV304細胞增殖的抑制效應(抑制率％) 4、克隆形成實驗 實驗分組同上，每組做3個平行孔。將經過病毒上清(終濃度為5×105CFU/mL)處理、polyIC(終濃度為15μg/mL)轉染6h的K562細胞以及空白對照K562細胞，用臺盼藍染色后計數活細胞，用20％的RPMI-1640培養液逐步稀釋成1×103/ml，制成單個細胞懸液，加0.4ml細胞懸液，于24孔板，然后加0.3ml 2.7％甲基纖維素混勻。總體積為1ml，不足以20％的RPMI-1640培養液補足。置37℃，5％CO2培養箱中孵育10天，顯微鏡下計數，取直徑大于75um或細胞數大于50個的為一個集落，計算克隆抑制率
附圖10、11.克隆形成實驗用RV-40AS(C組)、RV-GFP(D組)、RV-40AS+2AP(E組)、polyIC(B組)，處理K562細胞后，A組為未處理組其中只有PolyIC和RV-40AS處理組細胞克隆形成能力受到明顯抑制，抑制率分別為53.1％、75.3％。結果如表4、圖10，圖11所示。
表4不同因素處理后抑制K562細胞克隆的形成(抑制率％) 5、Annexin V-PE/7AAD雙染法檢測凋亡 離心收集1×106經處理的K562細胞和ECV304細胞，冰冷PBS洗滌兩次后重懸于100μl反應緩沖液中，加入5μl Annexin V-PE、10μl7AAD，輕輕混勻，避光保存20min，加入200μl緩沖液，立即上流式細胞儀檢測。檢測結果如附圖12～14 AUntreated group.BRV-40AS treated group.CpolyIC treated group.DRV-40AS+2AP treated group.ERV-GFP treated group 附圖12所示實驗各組K562細胞凋亡的流式細胞儀測定結果圖，橫坐標FL2代表PE標記的Annexin-V熒光強度，縱坐標代表7AAD熒光強度。依據FL2及FL3將FCM分成4個區，LL代表活細胞，LR代表早期凋亡細胞，UR、ML分別代表晚期凋亡和死細胞。未處理組中的K562細胞大部分都是活細胞，24h早期凋亡細胞占3.24±0.66％，polyIC和RV-40AS處理后引起了K562細胞的凋亡，24h早期凋亡率分別為20.56±1.56％和22.70±1.42％，RV-40AS+2AP和RV-GFP處理基本未引起K562細胞凋亡，24h早期凋亡細胞分別為3.16±1.16％和2.98±0.92；而ECV304細胞組只有polyIC引起了凋亡，24h早期凋亡細胞占18.91±2.04％，如圖13所示。結果還發現RV-40AS引起的凋亡效應具有時間依賴性在12h、24h、36h和48h時早期凋亡率分別達到10.43±2.68％、22.70±1.42％、33.50±1.55％和39.51±1.72％，如圖14所示。結果表明polyIC可以誘導K562細胞和ECV304細胞發生凋亡，RV-40AS處理后只引起了K562細胞的凋亡，且隨著作用時間延長凋亡率逐漸升高，但RV-GFP感染對兩種K562和ECV304細胞都沒有明顯的凋亡誘導作用；PKR抑制劑2AP可以有效抑制RV-40AS感染所致的K562細胞凋亡。
6、電鏡檢查細胞凋亡 分別收集1×106經RV-40AS處理的K562細胞以及未處理K562細胞(對照組)，PBS洗滌兩次，轉入1.5mlEP管中，加4％戊二醛1ml，固定60min，1000rpm/min離心10min，PBS洗滌。1％鋨酸固定1h，系列丙酮脫水50％丙酮溶液1次，10min；70％丙酮溶液1次，10min；90％丙酮溶液2次，每次10min；100％丙酮溶液3次，每次10min。618環氧樹脂包埋，光鏡定位，超薄切片做成銅網；經醋酸鈾，枸櫞酸鉛雙重電子染色；在Hitachi-600透射電鏡觀察細胞形態、細胞膜、細胞器及細胞核的變化并照相。
附圖15 K562細胞電鏡檢查結果見附圖15 未處理組(A)組K562細胞體積較大，核膜完整、核仁清楚、染色質豐富，核漿比例大。RV-40AS處理后24h觀察到凋亡細胞，其體積縮小，細胞表面微絨毛結構明顯減少(如B圖)。胞漿電子密度增高，染色質濃集，核固縮、核分裂等形態學改變(如C圖)。并可見凋亡小體(如D圖)。
7、細胞凋亡DNA梯帶的觀察 1)將5×105細胞移人無菌的1.5ml EP管中，4℃2000rpm/min離心5分鐘，棄上清。冰冷PBS洗滌細胞一次，離心，棄上清； 2)加入20μl消化緩沖液，用移液管尖混勻細胞沉淀，68℃水浴1h，4000rpm×5min，收集上清； 3)上清中加入RNA酶A(終濃度100μl/ml)輕彈管尖混勻，56℃水浴2h； 4)繼續加入1蛋白酶K(終濃度20mg/ml)，輕彈管尖混勻，37℃水浴2h； 5)DNA電泳配制1.5％瓊脂糖，加入EB(終濃度為0.5μg/ml)；取DNA樣品20μL加5μl 6×DNA加樣緩沖液(30％甘油，0.25％溴酚藍)混勻，上樣；Marker為TIANGEN公司MD100-MarkerIII，3V/cm電泳3～4h后，凝膠成像儀觀察、照相分析。
附圖16 DNA ladder實驗 檢測結果顯示polyIC(3)及RV-40AS(2)處理48小時后出現典型的“梯狀”條帶，而未處理組(1)、RV-40AS+2AP(4)處理組和RV-GFP(5)處理組細胞DNA電泳相應位置未見條帶出現。
8、細胞周期測定 實驗分組同上，用病毒上清或polyIC處理1×106個K562細胞，24h后收集細胞，PBS洗兩次后，70％乙醇中固定過夜，上機前洗去乙醇，加入PCB溶液低滲處理室溫30分鐘，離心去上清，加入50μg/ml RNAse A消化30分鐘，再加入終濃度為50μg/ml的PI染液室溫避光孵育25分鐘，用FCM檢測。
附圖17.逆轉錄病毒對K562細胞周期的影響K562細胞的細胞周期分析結果如附圖17所示，縱坐標代表細胞數，橫坐標代表PI強度，與細胞DNA含量成正比，依據PI熒光強度可以分為二倍體的G0/G1期，四倍體的G2/M期，及位于兩者之間的S期。各組處理細胞24h后，與未處理(A組)細胞相比，RV-40AS(B)組和polyIC(C)組G0/G1期細胞比例增高，S期細胞比例下降，差別有統計學意義(P＜0.05)，結果如表5所示。提示RV-40AS和polyIC處理后阻滯了細胞周期由G0/G1期向S期推進。RV-GFP(D組)未明顯影響細胞周期進程。2AP(E組)能逆轉RV-40AS對K562細胞周期的影響。
表5不同因素處理對K562細胞周期的影響(％) *P＜0.05，V.s untreated group；**P＜0.05，V.s RV-40AS group 9、統計學分析 所有實驗都獨立重復3次，結果用x±s表示，以SPSS10.0軟件分析，多組數據間用單因素方差分析，兩兩比較用t檢驗。



附圖1 pH1-BCR-ABL40as測序結果圖 附圖2 pMSCVeGFP測序結果圖 附圖3 pMSCVeGFP-H1-BCR-ABL40AS測序結果圖 附圖4 pMSCVeGFP-H1-BCR-ABL40AS經過細胞包裝獲得病毒液(RV-40AS)感染NIH3T3細胞的效率分析結果圖(倒置熒光顯微鏡×200) 附圖5 MTT實驗檢測不同濃度RV-40AS對K562細胞增殖的抑制率 附圖6 實驗各組對K562細胞影響的形態學觀察(普通顯微鏡×1000，瑞氏染色) 附圖7 K562細胞的生長曲線圖 附圖8 ECV304細胞的生長曲線圖 附圖9 MTT實驗分別檢測K562細胞各組和ECV304細胞增殖的抑制率 附圖10 不同因素對K562細胞克隆形成能力抑制的直方圖 附圖11 不同因素對K562細胞克隆形成能力抑制的細胞集落形態圖(倒置顯微鏡×100) 附圖12 實驗各組K562細胞凋亡的流式細胞儀測定結果圖 附圖13 實驗各組K562細胞凋亡的直方圖 附圖14 實驗各組K562細胞凋亡效應與時間的關系圖 附圖15 RV-40AS引起K562細胞凋亡的電鏡檢查結果 附圖16.DNA ladder實驗 附圖17.實驗各組K562細胞周期的流式細胞儀測定結果圖 具體實施例(共5例) 實施例1 pH1-BCR-ABL40as重組質粒的構建及鑒定 1.1 pH1-BCR-ABL40as插入片段的獲得 設計兩端分別含有限制性內切酶BamHI、HindIII位點的SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2。將1OD的各片段溶解于50μL退火緩沖液(10mM Tris，pH7.5～pH8.0，50mM NaCl，1mM EDTA)中，充分顛倒混勻后，SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2各取10μL到40as管，放置于沸水中，自然冷卻退火成雙鏈，放4℃用于連接反應。
1.2.酶切及回收 試劑盒提取質粒pSilencer3.1-H1，按下表6加入試劑酶切質粒。
將反應物混合離心后置37℃水浴過夜。酶切完成后全部進行1％瓊脂糖凝膠電泳，試劑盒膠回收。
1.3.連接 通過SmartSpecTM3000核酸蛋白測定儀檢測核酸含量為pSilencer3.1-H1質粒純化產物110ng/μL。根據外源片段∶載體的摩爾比＝6∶1的原則，按以下公式計算連接反應中外源片段與載體的含量
確定載體與插入片段的體積比為1∶5。按下表加入試劑，置PCR儀16℃連接過夜。
連接反應體系(體積單位μL) 1.4.轉化 ●在無菌1.5mL EP管中加2μL質粒、100μL E.coli DH5α感受態菌液，用吸頭輕輕混勻，冰上靜置30min。
●靜置37℃水浴，熱休克5min。
●立即放冰上靜置，1～2min后加800μL LB培養液。
●放37℃水浴，1h后12,000rpm瞬時離心30sec。
●棄去一半上清，將剩余的菌液混勻后，在含Amp(100μg/ml)的LB瓊脂平板上用無菌“L”玻棒將溶液均勻涂布于整個平板表面，37℃，2～3h，直至所有液體消失。
●隔夜或者12h后，接種環挑取陽性菌落，分區劃線分純陽性克隆菌，再挑取1～3個克隆LB AMP培養基中液體增菌。待提取質粒鑒定后，菌液與50％甘油1∶1混和，-70℃保存，避免反復凍融。
1.5.鑒定 ●PCR鑒定 調取氨芐青霉素LB瓊脂平板上的可疑菌落作PCR鑒定。用無菌牙簽挑取部分菌體到含20μLLB的0.5ml無菌離心管中，再將離心管放入沸水5min后，轉置于冰上，以菌液為PCR模板進行鑒定。以YP1為上游引物、SEQ ID 2為下游引物(表7)，PCR鑒定。 表7合成的寡核苷酸序列 ①PCR反應體系 10×Buffer 3μL 2mM dNTP3μL 25mM MgCl2 1.8μL YP1(10pmol/μL) 3μL 40as2(10pmol/μL) 3μL 模板菌液1ul 1μL pfu Taq(5u/μL) 0.2μL Add ddH2O up to30μL 試劑全部加入到PCR管中，渦旋混勻后，12000rpm瞬時離心30sec，放入PCR儀進行PCR反應。
②PCR熱循環反應條件 94℃ 5min 1cycle 94℃ 1min 54℃ 50sec 30cycles 72℃ 30sec 72℃ 5min 1cycle 熱循環完成后，12000rpm瞬時離心30sec，取4μL反應產物，在2％瓊脂糖凝膠中進行電泳分析。
●酶切鑒定 將可疑菌落細菌增菌后，試劑盒抽提質粒，酶切鑒定，方法同第2個步驟。酶切產物在1.5％瓊脂糖凝膠中進行電泳分析。
●測序鑒定 取陽性重組質粒送上海Sangon公司作DNA測序鑒定。
pH1-BCR-ABL40as測序結果經過比對分析完全正確，測序結果見附圖1。
實施例2 pMSCVeGFP逆轉錄病毒載體的構建及鑒定 2.1以引物Ec-GFP和Xh-GFP(表7)PCR擴增IRES2-EGFP載體eGFP片段 ①PCR反應體系 10×Buffer3μL 2mM dNTP 3μL 25mM MgCl2 1.8μL Ec-GFP(10pmol/μL)3μL Xh-GFP(10pmol/μL)3μL IRES2-EGFP0.2μL pfu Taq(5u/μL) 0.2μL Add ddH2O up to 30μL 試劑全部加入到100μLPCR管中，渦旋混勻后，12,000rpm瞬時離心30sec，放入PCR儀進行PCR反應。
②PCR熱循環反應條件 94℃ 5min 1cycle 94℃ 1min 55℃ 50sec30cycles 72℃ 40sec 72℃ 5min 1cycle 熱循環完成后，12,000rpm瞬時離心30sec，取5μL反應產物，在1.5％瓊脂糖凝膠中進行電泳分析。
2.2 PCR純化產物(eGFP)及pMSCV-neo質粒載體的酶切 按下表加入各反應試劑。
將反應物混合離心后置37℃水浴過夜。酶切完成后全部進行1％瓊脂糖凝膠電泳，試劑盒膠回收。
2.3連接 方法同1.3。
2.4轉化 按實驗方法1.4進行轉化。
2.5鑒定 經PCR、酶切和DNA測序鑒定，方法同前。pMSCVeGFP測序 結果經過比對分析完全正確，測序結果見附圖2。
實施例3 pMSCVeGFP-H1-BCR-ABL40AS重組逆轉錄病毒雙表達載體的構建及鑒定 3.1插入片段的獲取 由重組質粒pH1-BCR-ABL40as PCR擴增短片段RNA表達框H1-40as，引物sa和Hd見表7。
①PCR反應體系 10×Buffer 3μL 2mM dNTP3μL 25mM MgCl2 1.8μL sa(10pmol/μL) 3μL Hd(10pmol/μL) 3μL 各質粒模板 0.2μL Taq(5u/μL) 0.2μL 加ddH2O至 30μL 試劑全部加入到100μLPCR管中，渦旋混勻后，12,000rpm瞬時離心30sec，放入PCR儀進行PCR反應。
②PCR熱循環反應條件 94℃ 5min1cycle 94℃ 1min 55℃ 50sec 30cycles 72℃ 40sec 72℃ 5min1cycle 熱循環完成后，12,000rpm瞬時離心30sec，取5μL反應產物，在1.5％瓊脂糖凝膠中進行電泳分析。
3.2pMSCVeGFP重組質粒的酶切 按下表加入各反應試劑。
將反應物混合離心后置37℃水浴過夜。酶切完成后全部進行1％瓊脂糖凝膠電泳，試劑盒膠回收。
3.3連接 方法同1.3。
3.4鑒定 經PCR、酶切鑒定方法同前。
測序鑒定 因為H140as片段插入位點在pMSCVneo載體的多克隆位點(MCS)之外，無通用引物測序，所以我們另外設計測序引物YP2(表7)，送重慶醫科大學肝炎所測序中心測序。
pMSCVeGFP-H1-BCR-ABL40AS測序結果經過比對分析完全正確，測序結果見附圖3。
實施例4 病毒包裝及滴度測定 按lipofectamin2000陽離子脂質體轉染說明書，將各重組逆轉錄病毒質粒轉染PT67包裝細胞。于轉染48h后，培養基更換成含0.5mg/mL G418(GIBCO公司)的完全DMEM培養液繼續培養，每4d換液1次，篩選7～14d，挑取陽性細胞克隆PT67-MSCV/GFP和PT67-40as，繼續培養至細胞完全融合時吸取培養基，離心取上清，各病毒毒液命名為RV-GFP、RV-40AS，以NIH3T3為靶細胞測定病毒滴度。倒置熒光顯微鏡計數陽性細胞數(綠色熒光)。病毒滴度(colony forming unit，CFU/mL)計算公式如下
將滴度大于5.0×105CFU/mL病毒上清保存于-80℃備用。
pMSCVeGFP-H1-BCR-ABL40AS經過細胞包裝獲得病毒液(RV-40AS)感染NIH3T3細胞的效率分析結果見附圖4(倒置熒光顯微鏡×200)。
實施例5 細胞的培養 K562細胞系由本室常規凍存，復蘇后用含10％FCS的PRMI 1640液培養，培養于含5％CO2的37℃恒溫培養箱中，常規換液傳代，取對數生長期的細胞作實驗。
ECV304細胞系由本校超聲研究所馬芳博士惠贈，復蘇后用含10％FCS的PRMI 1640培養基培養于含5％CO2的37℃恒溫培養箱中，隔日用0.25％胰酶消化換液傳代，取對數生長期細胞做實驗。實驗前24h接種細胞培養板。
序列表
<160>2
<210>1
<211>54
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根據BCR-ABL b3a2型mRNA(GenBank登陸號AJ131466)融合位點左20bp序列設計互補序列，加下劃線的是誤配的堿基
<400>1
gatccactgg ccgctgaagg gcttctgaac tctgcttaaa tccttttttg gaaa 54
<210>2
<211>54
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根據BCR-ABL b3a2型mRNA(GenBank登陸號
AJ131466)融合位點右20bp序列設計互補序列，加下劃線的是誤配的堿基
<400>2
agcttttcca aaaaaggatt taagcagagt tcagaagccc ttcagcggcc agtg 5權利要求
1.一種靶向激活慢性粒細胞白血病蛋白激酶PKR的寡核苷酸，其序列是SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2。
2.一種載體，其特征是攜帶有如權利要求1所述的寡核苷酸。
3如權利要求2所述的載體，其特征是引入了增強型綠色熒光蛋白基因。
4.如權利要求3所述的載體，其特征是用逆轉錄病毒作為載體。
5.如權利要求2所述的載體在制備治療慢性粒細胞白血病的藥物中的應用。
全文摘要
本發明的目的是提供一種靶向激活慢性粒細胞白血病細胞蛋白激酶PKR的寡核苷酸序列及攜帶有該寡核苷酸序列的逆轉錄病毒雙表達載體。根據BCR－ABL b3a2型mRNA融合位點左右各20bp序列設計互補序列SEQ1和SEQ2，序列兩端設計酶切位點，為防止轉錄過早終止，其中一對核苷酸T－A被更換為C－g，向急變期慢粒白血病K562細胞株轉入這種特殊設計的重組逆轉錄病毒載體，可以在K562細胞內轉錄并與BCR－ABL mRNA雜交形成足夠長度的雙鏈RNA，靶向激活PKR，導致K562細胞的凋亡，而對機體內的正常細胞沒有任何影響。將有效成分核苷酸序列制成臨床所需的藥物，能有效的治療慢性粒細胞白血病，填補了醫學方面的又一個空白。
文檔編號A61K48/00GK101054591SQ20061005459
公開日2007年10月17日 申請日期2006年11月13日 優先權日2006年11月13日
發明者馮文莉, 曾建明, 王小中 申請人:重慶醫科大學