專利名稱：模擬病毒型輪狀病毒基因疫苗及其制備方法
技術領域：
本發明涉及醫藥衛生技術領域，特別是涉及一種模擬病毒型輪狀病毒基因疫苗及其制備方法。
背景技術：
輪狀病毒是引起嬰幼兒病毒性重癥腹瀉的最主要病原。迄今為止，尚無特效的輪狀病毒治療藥物，因此研制安全有效的輪狀病毒預防性疫苗是問題的關鍵。現行的輪狀病毒疫苗主要有以下幾種形式一是減毒活疫苗。減毒活疫苗可模擬輪狀病毒的自然感染過程，誘導有效的免疫保護，但活疫苗的致命缺陷是其本身及病毒毒力回復帶來的安全性問題。如美國的恒河猴輪狀病毒四價重配株RRV-TV(商品名Rotashield)于1998年批準用于臨床，由于發現服用后增加了腸套疊發生的危險性，于1999年被迫停止使用。
二是輪狀病毒亞單位疫苗。主要形式有純化的輪狀病毒結構蛋白的多肽疫苗、病毒樣顆粒、轉基因植物口服疫苗等，但均未獲得理想的結果，其主要缺陷是其免疫原性弱，難以引起有效、持久的粘膜免疫保護反應。
三是基因疫苗。相對其他的疫苗形式，基因疫苗有很大的優勢，如可使機體產生長時間的體液免疫及細胞免疫；DNA質粒含有CpG基序，本身也是一種非常強的佐劑；DNA制備簡單、易于保存。但現行的基因疫苗作為粘膜疫苗形式的效果并不理想，其主要問題在于裸DNA在粘膜的攝取困難及常規的真核表達質粒在體內的表達效率偏低。
到目前為止，尚未見有關模擬病毒型輪狀病毒基因疫苗及其制備方法的研究報道。
發明內容
本發明的目的在于克服現有輪狀病毒疫苗存在的問題，提供一種新型的輪狀病毒基因疫苗及其制備方法。
該疫苗是類似于天然病毒的顆粒性肽-DNA復合物，直徑約幾十納米，包含有1～3個含α-病毒復制酶cDNA的輪狀病毒結構蛋白真核質粒表達載體，該復合物的顆粒性肽為霍亂毒素B亞單位與富含正電荷的18賴氨酸多聚物K18的偶聯物。
霍亂毒素B亞單位cholera toxin B subunit，簡稱CTB本發明的模擬病毒型輪狀病毒基因疫苗依次通過下列步驟合成
(1)用常規方法構建輪狀病毒結構蛋白真核質粒pShame 2a的表達載體；(2)CTB用SPDP修飾；帶正電荷的18賴氨酸多聚物K18先用SPDP修飾，再進一步與DTT作用1h；透析，以去除游離的SPDP與DTT；修飾后的CTB與K18按質量比為1∶2的比例混合，室溫作用18h；最后進行透析，得到CTB-K18耦聯物；(3)理論計算質粒與CTB-K18偶聯物的電荷數，由于CTB-K18偶聯物含有18個K殘基，記為18e+；而每個脫氧核糖核酸的平均分子量為330Da，含1個磷酸根，記為1e-；CTB-K18偶聯物以1∶1或2∶1的電荷比與質粒進行混合；(4)在濃度為150mM或87.5mM的NaCl條件下，將CTB-K18溶液逐滴滴入等體積的渦旋狀態含有500μg/ml DNA的水溶液中，形成電荷比為1或2的CTB-K18-DNA復合物。
上述方法中，輪狀病毒結構蛋白真核質粒pShame 2a含有CMV啟動子和α病毒復制酶cDNA基因；CTB為霍亂毒素B亞單位，SPDP為Sigma公司產品succinimidyl3-(2-pyridyldithio)propionate；二硫蘇糖醇dithiothreitol，簡稱DTT。
本發明具有三個顯著優點1、具有顆粒性及粘膜靶向性，使其更易被腸粘膜細胞有效攝取，克服傳統基因疫苗在粘膜攝取的困難。在正負電荷相互吸引的靜電作用下，CTB-K18偶聯物可結合到質粒DNA上，將質粒由上百納米的松散線性分子壓縮成直徑幾十納米的致密顆粒；另一方面，CTB可通過自身的神經節苷脂結合位點與腸粘膜細胞的相應受體特異性結合，從而促進粘膜細胞對該疫苗的有效攝取。實驗表明，結腸癌細胞株HT-29及Caco-2對顆粒性肽-DNA復合物的攝取效率比裸DNA提高了約3倍以上。
2、輪狀病毒結構蛋白的表達質粒含有α-病毒復制酶cDNA基因，使目的抗原基因在靶細胞得到高效表達。實驗表明，用含有α病毒復制酶cDNA基因的pShame 2a構建的輪狀病毒結構蛋白真核質粒表達載體較常規真核質粒表達載體的轉染效率提高了約5倍以上。
3、能引起強而有效的粘膜免疫保護反應。CTB既具有粘膜靶向性，又是有效的粘膜免疫佐劑。本發明將其巧妙的用于質粒表達載體的包裝肽，極大的提高了粘膜免疫反應水平。實驗結果表明，該新型疫苗能誘導產生有效的粘膜免疫保護反應，其免疫保護率達85％以上。
圖1為模擬病毒型輪狀病毒基因疫苗的結構及合成示意圖。
具體實施例方式
實施例1用常規方法構建輪狀病毒結構蛋白真核質粒pShame 2a的表達載體；CTB用SPDP修飾；帶正電荷的18賴氨酸多聚物K18先用SPDP修飾，再進一步與DTT作用1h；透析，以去除游離的SPDP與DTT；修飾后的CTB與K18按質量比為1∶2的比例混合，室溫作用18h；最后進行透析，得到CTB-K18耦聯物；理論計算質粒與CTB-K18偶聯物的電荷數，由于CTB-K18偶聯物含有18個K殘基，記為18e+；而每個脫氧核糖核酸的平均分子量為330Da，含1個磷酸根，記為1e-，CTB-K18偶聯物以1∶1的電荷比與質粒進行混合；在150mM NaCl條件下，將CTB-K18溶液逐滴滴入等體積的渦旋狀態含有500μg/ml DNA的水溶液中，從而形成電荷比為1∶1的CTB-K18-DNA復合物。
實施例2用常規方法構建輪狀病毒結構蛋白真核質粒pShame 2a的表達載體；CTB用SPDP修飾；帶正電荷的18賴氨酸多聚物K18先用SPDP修飾，再進一步與DTT作用1h；透析，以去除游離的SPDP與DTT；修飾后的CTB與K18按質量比為1∶2的比例混合，室溫作用18h；最后進行透析，得到CTB-K18耦聯物；理論計算質粒與CTB-K18偶聯物的電荷數，由于CTB-K18偶聯物含有18個K殘基，記為18e+；而每個脫氧核糖核酸的平均分子量為330Da，含1個磷酸根，記為1e-，CTB-K18偶聯物以1∶1的電荷比與質粒進行混合；在87.5mM NaCl條件下，將CTB-K18溶液逐滴滴入等體積渦旋狀態含有500μg/ml DNA的水溶液中，從而形成電荷比為1∶1的CTB-K18-DNA復合物。
實施例3用常規方法構建輪狀病毒結構蛋白真核質粒pShame 2a的表達載體；CTB用SPDP修飾；帶正電荷的18賴氨酸多聚物K18先用SPDP修飾，再進一步與DTT作用1h；透析，以去除游離的SPDP與DTT；修飾后的CTB與K18按質量比為1∶2的比例混合，室溫作用18h；最后進行透析，得到CTB-K18耦聯物；理論計算質粒與CTB-K18偶聯物的電荷數，由于CTB-K18偶聯物含有18個K殘基，記為18e+；而每個脫氧核糖核酸的平均分子量為330Da，含1個磷酸根，記為1e-，CTB-K18偶聯物以2∶1的電荷比與質粒進行混合；在150mM NaCl條件下，將CTB-K18溶液逐滴滴入等體積渦旋狀態含有500μg/ml DNA的水溶液中，從而形成電荷比為2∶1的CTB-K18-DNA復合物。
實施例4用常規方法構建輪狀病毒結構蛋白真核質粒pShame 2a的表達載體；CTB用SPDP修飾；帶正電荷的18賴氨酸多聚物K18先用SPDP修飾，再進一步與DTT作用1h；透析，以去除游離的SPDP與DTT；修飾后的CTB與K18按質量比為1∶2的比例混合，室溫作用18h；最后進行透析，得到CTB-K18耦聯物；理論計算質粒與CTB-K18偶聯物的電荷數，由于CTB-K18偶聯物含有18個K殘基，記為18e+；而每個脫氧核糖核酸的平均分子量為330Da，含1個磷酸根，記為1e-，CTB-K18偶聯物以2∶1的電荷比與質粒進行混合；在87.5mM NaCl條件下，將CTB-K18溶液逐滴滴入等體積渦旋狀態含有500μg/ml DNA的水溶液中，從而形成電荷比為2∶1的CTB-K18-DNA復合物。
權利要求
1.一種模擬病毒型輪狀病毒基因疫苗，其特征在于所述疫苗是顆粒性肽-DNA復合物，它包含有1～3個含α-病毒復制酶cDNA的輪狀病毒結構蛋白真核質粒表達載體，該復合物的顆粒性肽為霍亂毒素B亞單位與富含正電荷的18賴氨酸多聚物K18的偶聯物。
2.一種模擬病毒型輪狀病毒基因疫苗制備方法，其特征在于，依次通過下列步驟合成(1)用常規方法構建輪狀病毒結構蛋白真核質粒pShame 2a的表達載體；(2)CTB用SPDP修飾；帶正電荷的18賴氨酸多聚物K18先用SPDP修飾，再進一步與DTT作用1h；透析，以去除游離的SPDP與DTT；修飾后的CTB與K18按質量比為1∶2的比例混合，室溫作用18h；最后進行透析，得到CTB-K18耦聯物；(3)理論計算質粒與CTB-K18偶聯物的電荷數，由于CTB-K18偶聯物含有18個K殘基，記為18e+；而每個脫氧核糖核酸的平均分子量為330Da，含1個磷酸根，記為1e-；CTB-K18偶聯物以1∶1或2∶1的電荷比與質粒進行混合；(4)在濃度為150mM或87.5mM的NaCl條件下，將CTB-K18溶液逐滴滴入等體積的渦旋狀態含有500μg/ml DNA的水溶液中，形成電荷比為1或2的CTB-K18-DNA復合物。上述方法中，輪狀病毒結構蛋白真核質粒pShame 2a含有CMV啟動子和α病毒復制酶cDNA基因；CTB為霍亂毒素B亞單位，SPDP為Sigma公司產品succinimidyl3-(2-pyridyldithio)propionate；二硫蘇糖醇dithiothreitol，簡稱DTT。
全文摘要
一種模擬病毒型輪狀病毒基因疫苗及其制備方法，該疫苗是類似于天然病毒的顆粒性肽－DNA復合物，直徑約幾十納米，包含有1～3個含α－病毒復制酶cDNA的輪狀病毒結構蛋白真核質粒表達載體，該復合物的顆粒性肽為霍亂毒素B亞單位與富含正電荷的18賴氨酸多聚物K
文檔編號A61P1/12GK101057974SQ20061005452
公開日2007年10月24日 申請日期2006年10月25日 優先權日2006年10月25日
發明者魏靜 申請人:西南大學