抗eheco157志賀樣毒素ⅱa亞單位單克隆抗體5f3輕、重鏈可變區基因及應用的制作方法

專利名稱：抗ehec o157志賀樣毒素ⅱa亞單位單克隆抗體5f3輕、重鏈可變區基因及應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物制藥領域，涉及抗腸出血性大腸桿菌(EHEC)O157志賀樣毒素II毒素亞單位Stx2A單克隆抗體5F3重鏈和輕鏈可變區基因和多肽，以及所述基因和多肽在制備用于診斷和治療EHEC O157感染及其并發癥方面藥物中的應用。
背景技術：
自EHEC O157于1982年被確認為致病菌以來，其引發的食物中毒在世界各地包括中國均發生了暴發流行。該菌的感染已經成為一個全球性的公共衛生問題，無論在發達國家還是發展中國家，都受到廣泛關注。我國已將腸出血性大腸桿菌列為21世紀可能對國人衛生健康有重大影響的12種病原微生物之一。O157:H7感染可以引發嚴重并發癥如溶血性尿毒綜合征(Hemolyticuremicsyndrom，HUS)、血栓形成性血小板減少性紫癜(Thromboricthromobocytopenicporpura，TTP)，嚴重者可導致死亡，致死率可達5-10％。O157菌培養容易、繁殖迅速、感染力強、感染途徑廣泛，使之極有可能作為未來軍事斗爭中的細菌戰劑和生物恐怖戰劑。美國疾病控制中心(CDC)已將EHEC O157菌列為B類生物恐怖病原體嚴加防范。然而目前對其感染尚缺乏有效的治療方法，臨床上針對O157菌的感染主要采用抗生素治療及相應的對癥治療。新近的研究發現，抗生素使菌體破裂，導致O157菌志賀毒素(Shiga toxin，ST)的釋放水平大大提高，使得抗生素對病程無明顯影響甚至導致病程的延長，從而可能增加發生并發癥的危險并引起死亡。2002年國家衛生部制定的“腸出血性大腸桿菌O157:H7感染性腹瀉應急處理預案(試行)”第5條病人的隔離治療規定對腸出血性大腸桿菌O157:H7病人和疑似病人進行隔離治療。病人的治療以對癥支持療法為主，可以使用微生態制劑，原則上不用止瀉藥和抑制腸蠕動的藥物。腸出血性大腸桿菌O157病人和疑似病人(包括糞便標本O157抗原膠體金方法檢測陽性的腹瀉病人)禁止使用抗生素，疫區內的其他一般腹瀉病人應慎用抗生素。因此，無論從公共衛生還是生物反恐的需要出發，加強EHEC O157:H7的治療研究已顯得非常緊迫。
EHEC O157可以產生兩種毒素，分別稱為志賀毒素I(Stx1)和志賀毒素II(Stx2)。在細菌體內，Stx2為分泌型表達，Stx1為胞內表達。兩種毒素均由1個A亞單位和5個B亞單位組成，A亞單位具有細胞內毒性，能與28SrRNA作用導致蛋白質合成停止，是大腸桿菌O157:H7引起臨床表現的病理基礎；B亞單位具有細胞結合特性，能與具有特定受體(Gb3)的細胞結合，從而引導A亞單位發揮作用。多數O157:H7細菌產生Stx2，Stx2比Stx1與臨床上重癥并發癥的關系更加密切，Stx2比Stx1的毒性大1000倍。Stx2可以進入血液循環，引起目標組織器官，如腎小球和胃腸道內皮細胞的損傷。因此Stx2是該菌致病性的重要物質基礎。
在HUS發生前，一般有3～5d的出血性結腸炎(HC)的前驅癥狀，發生HC后，在Stx結合到腎內皮細胞之前，有一段阻止Stx/Gb3結合的時間。研究證明使用能中和Stx2的特異性抗體可以預防HUS和血栓形成的血小板減少性紫癜等并發癥的出現。因此實踐中要求在未發生并發癥之前對EHEC感染作出迅速診斷，及時使用抗體治療。自1975年Kohler和Milstein創建B淋巴細胞雜交瘤技術以來，各種單克隆抗體相繼出現，這些單克隆抗體不僅在疾病的基礎研究方面發揮了積極的作用，同時也為多種疾病的診治帶來了新的希望。到目前為止，國內外尚無可用于治療O157感染的抗體類藥物，我們經過長期的大量的克隆篩選，獲得了一株針對St×2A的高親和性和高特異性的雜交瘤細胞株，其具有較高的應用價值和開發前景。

發明內容
本發明旨在提供抗志賀樣毒素II(Shiga like toxin 2)毒素亞單位Stx2A單克隆抗體5F3的重鏈和輕鏈可變區基因極其編碼的多肽，其重組后可表達出特異性識別和結合Stx2A的抗體活性片段。
本發明的另一目的在于所述抗體5F3的基因或多肽在制備用于診斷和治療EHEC O157感染及其并發癥方面藥物中的應用。
根據本發明的一個方面，本發明涉及一種抗志賀樣毒素II毒素亞單位Stx2A單克隆抗體5F3的重鏈和輕鏈可變區基因。本發明所述抗Stx2A單克隆抗體5F3的重鏈和輕鏈可變區基因是從能夠穩定分泌高親和性和高特異性的鼠源性抗Stx2A的單克隆抗體的雜交瘤細胞株5F3中克隆獲得的。獲得方式是從抗Stx2A的雜交瘤細胞株5F3中提取總RNA，以oligo(dT)15為隨機引物，逆轉錄生成cDNA，然后采用通用的兼并性引物特異性分別擴增抗體輕、重鏈可變區基因，經過序列測定和在NCBI中BLAST比較分析后，確認5F3重鏈可變區核苷酸序列是序列表<400>1所示的核苷酸序列，其編碼的氨基酸序列是序列表<400>3所示的氨基酸序列。輕鏈可變區基因基因序列是序列表<400>2所示的核苷酸序列，其編碼的氨基酸序列是序列表<400>4所示的氨基酸序列。上述兩個基因經重組后可表達出特異性識別和結合抗志賀樣毒素II毒素亞單位Stx2A蛋白的抗體ScFv活性片段。
對于本發明人成功克隆的抗Stx2A特異性單克隆抗體5F3輕、重鏈可變區基因，分別應用專業性的已知抗體基因序列數據庫(IMGT)和(NCBI)對所得序列進行同源性比較和其胚系基因來源分析表明，所獲得的基因序列的確來自小鼠胚系基因，和現有報道的各種抗體基因序列均不完全一致。所得VH與VL基因可編碼正確的小鼠抗體可變區。
根據本發明的另一個方面，本發明還涉及所述單克隆抗體5F3的基因及其編碼的多肽在制備用于診斷和治療EHEC O157感染及其并發癥方面藥物中的應用。
本發明人采用通用的兼并性引物成功地從培養的一株抗Stx2A特異性單克隆抗體5F3的雜交瘤細胞株中克隆了其對應抗體輕、重鏈可變區基因。基于上述的單克隆抗體5F3的輕、重鏈可變區基因，可以采用基因工程方法，構建和表達多種形式的小分子基因工程抗體，如ScFv抗體、嵌合抗體、抗體融合蛋白等，制備用于診斷和治療EHEC O157感染及其并發癥方面藥物，將對診斷和治療EHEC O157感染及其并發癥提供新的途徑。


圖1為從抗Stx2A的雜交瘤細胞株5F3中提取總RNA的瓊脂糖凝膠電泳圖。
圖2為5F3中提取總RNA逆轉錄生成cDNA的瓊脂糖凝膠電泳圖。
圖3為PCR擴增的抗Stx2A單克隆抗體5F3輕、重鏈可變區基因的瓊脂糖凝膠電泳圖。
圖4為PCR擴增的抗Stx2A單克隆抗體5F3輕、重鏈可變區基因藉LinkerDNA連接后瓊脂糖凝膠電泳圖。
圖5為利用獲得的5F3輕、重鏈可變區基因所構建的ScFv抗體表達載體的測序圖譜。
圖6為Western blot檢測ScFv抗體與抗原結合。
具體實施方案1.鼠抗Stx2A單克隆抗體的制備2.抗Stx2A單克隆抗體5F3輕、重鏈可變區基因的克隆從抗Stx2A雜交瘤細胞株5F3中提取總RNA，以oligo(dT)15為隨機引，RT-PCR逆轉錄生成cDNA，然后采用通用的兼并性引物特異性分別擴增抗體輕、重鏈可變區基因。
3.抗Stx2A單克隆抗體5F3的ScFv形式抗體的構建、表達和純化將抗體輕、重鏈可變區基因用一編碼(G4S)3短肽的DNA片段連接成5’VH-Linker-VL3’片段，PCR擴增該片段。純化后的ScFv片段與已改造的載體pCANTAB6His相連，轉化大腸桿菌HB2151。IPTG誘導表達，采用固相鎳離子親和層析對ScFv進行初步純化。
4.抗Stx2A單克隆抗體5F3輕、重鏈可變區基因及其編碼的多肽在制備用于診斷和治療EHEC O157感染及其并發癥方面藥物中的應用實施例1抗腸出血性大腸桿菌(EHEC)O157志賀樣毒素II毒素亞單位Stx2A單克隆抗體的制備1.免疫Balb/c小鼠目的蛋白Stx2A經過純化后免疫Balb/c小鼠(鼠齡6～8周)，100ug/只，首次免疫，100μL抗原與等量完全福氏佐劑混合，注射小鼠腹部和腹股溝皮下免疫。14d后再次免疫，免疫劑量和途徑同首次免疫，采用不完全福氏佐劑。于第28d追加免疫，150ug/只，腹腔注射。
2.雜交瘤細胞的制備1)收集B淋巴細胞追加免疫后3天，摘除小鼠眼球放血，血清留作陽性對照。無菌操作取出脾臟，并將脾臟放在10ml預溫不完全培養基中，剝去周圍結締組織，置100目不銹鋼網中，用注射器的內芯研磨，邊研磨邊滴加不完全培養基沖洗。收集過濾后的細胞懸液于離心管中，計數，取1×108個細胞，離心，棄上清，置室溫待用。
2)小鼠骨髓瘤細胞的準備融合前10天，將骨髓瘤細胞從液氮中取出，迅速放入37℃水浴中，不斷搖晃，直至冷凍液完全溶解。離心，棄上清，懸浮于8-AG培養基中置37℃，5％CO2培養箱中培養。根據細胞生長狀況，換液，丟棄一部分細胞。融合前2～3天，將一瓶細胞傳至4瓶，并改用完全培養基繼續培養。
3)滋養細胞的準備；取一只6～8周齡的健康BALB/c小鼠，脫臼處死。按無菌操作規程，剪開皮膚(注意不要剪破腹膜)，用一次性的5ml注射器吸取5ml不完全培養基，注入小鼠腹腔，用無菌棉球輕揉腹部，慢慢抽回，如此反復兩次。吸出的細胞懸液置于離心管中，離心，棄上清。加入20ml HAT培養基，混勻，接種至兩塊96孔細胞培養板，100μl/孔。置37℃，5％CO2培養箱培養過夜，若滋養細胞貼壁良好且無污染，即可用于接種融合細胞。
4)細胞融合融合前一天將PEG/DMSO放于CO2培養箱中調整pH值和溫度。將準備好的骨髓瘤細胞和脾臟B淋巴細胞移至一個50ml離心管中，加30ml不完全培養基，離心，吸去上清。將離心管放在掌心搖動，使細胞團成松散的糊狀。將離心管置于37℃水浴中，吸取0.7ml預溫的PEG/DMSO溶液，在離管底約2cm處沿管壁慢慢加入細胞中，邊加邊轉動離心管，1min加完。靜置1min，再吸取25ml不完全培養基，緩慢加入。邊加邊緩慢攪拌，先慢后快，前2min加入2ml，后2min加入剩余的培養基。離心，吸去上清。將細胞團搖散，加入10ml HAT培養基，輕輕吹打，混勻。將融合細胞接種至已鋪有飼養細胞的96孔細胞培養板，100μl/孔，置37℃，5％CO2培養箱中培養。
5)雜交瘤細胞的選擇性培養接種后第一天，加入HAT培養基100μl/孔，在第2，3，5，8和11天，各孔吸出半量培養上清，然后再加入新鮮HAT培養基100μl/孔。同時鏡下觀察細胞克隆生長情況。
6)雜交瘤細胞的篩選融合后2周，ELISA法檢測各細胞培養孔上清液，方法同血清抗體檢測。篩選分泌目的抗體的陽性細胞克隆，以進行克隆化。
7)陽性雜交瘤細胞的克隆化篩選出陽性克隆后，收集細胞并計數，用不完全培養基按105、104、103、102對細胞作系列稀釋，然后取后者用HT培養基稀釋至10個/ml。取一塊96孔細胞培養板，預先按每孔105～106個/100μl HT培養基加好滋養細胞，然后加入10個/ml的細胞懸液，100μl/孔。置37℃，5％CO2培養箱培養7～10天。在第2天和第5天分別加入HT培養基2滴/孔，并在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，對確為只有一個細胞克隆生長的孔作好標記。對抗體陽性的單克隆細胞，經3～4次單細胞分離培養，直至抗體陽性的單克隆細胞培養孔達到100％，即可初步定株并命名。
實施例2抗Stx2A單克隆抗體5F3輕、重鏈可變區基因的克隆1.所用細胞株為本發明人采用上述方法獲得的一株高親和力、高特異性的抗Stx2A單克隆抗體5F3雜交瘤細胞株，其分泌的抗體不與CT、LT等多種大腸桿菌腸毒素抗原結合，其分泌的抗體分子亞型為IgG1k。
2.取對數生長期的5F3雜交瘤細胞(2×106)，采用異硫氰酸胍一步法(TaKaRa公司)提取總RNA，取少量進行紫外分光光度計定量及1％瓊脂糖凝膠電泳檢測。隨后以oligo(dT)15(TaKaRa公司)為隨機引物，逆轉錄生成cDNA。然后采用通用的兼并性引物(Amersham公司)特異性分別擴增單抗5F3的輕、重鏈可變區基因。將含有可變區基因(VH，VL)的擴增產物經1％瓊脂糖凝膠電泳后，切膠分離目的片段。通過膠回收試劑盒(Promega公司)純化目的片段后，1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，參見附圖1-3。之后，將抗體輕、重鏈可變區基因克隆至pMD-18T載體，測序分析。
有關操作具體步驟如下1.總RNA提取(使用TaKaRa公司RNA提取試劑盒)1)取2×106雜交瘤細胞，加入1ml的Catrimox-14TM溶液，充分混勻。離心，3000rpm，5min。
2)除去溶液，加入1ml的DEPC處理H2O，上下顛倒混合數次后，離心，12,000rpm，2min。
3)除去溶液，激烈振蕩使沉淀松動，加入1ml的2M LiCl溶液，激烈振蕩后，離心，12,000rpm，5min。
4)除去溶液，沉淀用70％的冷乙醇洗一次，溶于1ml的DEPC處理H2O中。
2.RT-PCR擴增VH和VL1)以提取的總RNA為模板，oligo(dT)15(TaKaRa公司)為隨機引物，反轉錄合成cDNA第一鏈的方案如下總RNA 2μl10×RT-PCR緩沖液 1μldNTPs(10mmol/L) 1μlMgCl2(0.025mmol/L) 4μloligo(dT)15 Primer(2.5pmol/μl) 0.5μlAMV Reverse Transcriptase(5U/μl) 0.5μlRNase Inhibitor(40U/μl) 25μlRNase Free dH2O至終體積11μl，混合后加入石蠟油3滴。
反應條件30℃，1min；42℃，0.5min；99℃，5min；5℃，5min；1個循環周期。
2)以第一鏈為模板采用如下PCR體系和程序擴增VH和VL模板cDNA 11μl5×PCR緩沖液(含氯化鎂) 10μl輕、重鏈引物(0.025mmol/L)各 1μlEx Taq HS(5u/μl) 0.25μl加去離子水至終體積50μl，混合后加入礦物油3滴。
反應條件94℃預變性2min后，94℃，0.5min；55℃，0.5min；72℃，1min；30個循環周期。
3.PCR產物的克隆采用TA克隆方法克隆PCR產物，方法見文獻(于永利，麻彤輝，楊貴貞TA克隆及雙鏈DNA測序，介紹一種快速克隆及分析PCR產物的方法，中國免疫學雜志，1994，10(1)5)。
4.PCR產物的序列分析將TA克隆轉化菌株送至公司，按常規方法(J.Sambrook，Polyacrylamide gel electrophoresis1.21-1.32，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Molecular cloning，1989)提取質粒，采用雙脫氧末端終止法，對插入片段進行序列測定。測序結果參見附圖5。
進一步對所克隆的抗Stx2A單克隆抗體5F3輕、重鏈可變區基因進行序列分析如下
分別應用下列二個數據庫http://imgt.cines.fr:8104/cgi-bin/IMGTnap.jvhttp://www.ncbi.nim.nih.gov/blast/Blast.cgi對所得序列與現有已報道的其它各種抗體基因進行同源性比較，并分析其胚系基因來源，結果如下1)5F3重鏈的胚系基因來源V-GENEAF304558 IGHVlS137*01；D-GENEIGHD-SP2.8*01；J-GENEIGHJ4*01；通過FR-IGMT and CDR-IGMT分析顯示CDR1GGT TGC TAC ATG CACCDR2TAT ATT AGT TGT TAC AAT GGT GCT ACT AGC TAC AAC CAG AAG TTCAAG GGC AAGCDR3AAG GGC TAC GGT AGT AGT CAT TAC TAT GCT ATG GAC TACNCBI中同源性比較結果顯示Request ID 1132707495-31830-19491971776.BLASTQ1Sequence producing significant alinmentsgi|11611970|gb|AF303832.1|AF303832 540 1e-150gi|38348519|ref|NM_198640.1| 433 3e-118gi|430841|gb|S66092.1| 408 1e-1102)5F3輕鏈的胚系基因來源V-GENEAJ235950 IGKV12-89*01；J-GENEV00777 IGKJ2*01；通過FR-IGMT and CDR-IGMT分析顯示CDR1AGG GCC AGC CAA AGT ATT AGC AAC AAC CTACDR2TAT GCT TCC CAG TCC ATC TCTCDR3CAA CAG AGT AAC AGC TGG CCT CTC ACGNCBI中同源性比較結果顯示Request ID Request ID 1132709610-9086-134297927386.BLASTQ4DatabaseALL GenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences(but no EST，STS，GSS，or phase0，1or2 HTGS sequences)
gi|7529622|emb|AJ277215.1|MMU2772154e-164 585gi|63543416|ref|XM_620323.1| 9e-143 514gi|809057|emb|X86544.1|MMVL1B101e-112 414上述分析結果表明所獲得的抗Stx2A單克隆抗體5F3基因序列的確來自小鼠胚系基因，和現有報道的各種其它己知抗體基因序列均不完全一致，是屬于一種新的有功能的針對Stx2A的抗體基因。
實施例3抗Stx2A單克隆抗體的ScFv形式抗體的構建和表達(使用Pharmacia公司ScFv表達試劑盒)將VH、VL和Linker(G4S)3引物等摩爾混合后，進行聚合和填充反應，使VH和VL藉LinkerDNA連接到一起，形成ScFvDNA。然后加入限制酶切位點引物，擴增聚合的ScFv并在5′端引入Sfi I限制酶切位點，3′端引入Not I限制酶切位點。克隆至改造的分泌性表達載體pCANTAB6His之中，轉化到大腸桿菌HB2151中進行誘導表達。經限制性酶切鑒定及DNA測序分析，證實基因構建正確。親和層析純化表達蛋白后以SDS-PAGE電泳、Westem-blot等方法分析檢測表達產物，參見附圖6。SDS-PAGE電泳和Western-blot分析表明ScFv基因在大腸桿菌中成功表達。表達產物的相對分子質量(Mr)為27KD，與理論預期值相符，并且可與相應的抗原特異結合，成功實現了抗Stx2單鏈抗體的原核分泌表達，為其在診斷和治療EHEC O157感染及其并發癥中的進一步應用奠定了基礎。
有關操作具體步驟如下1.質粒DNA抽提(使用Omega公司質粒抽提試劑盒)1)挑取平板上分隔良好的菌落轉種于帶相應抗生素的LB培養液中，37℃搖床培養過夜。
2)取菌液分裝于1.5mL離心管中，12000g離心3min，留取沉淀。
3)每管加100μL Solution I懸浮，充分振蕩混勻。
4)加入100μL Solution II，輕柔混勻，冰水浴5min。
5)加入250μL Solution III，輕振混勻，室溫放置10min。
6)4℃、12000g離心10min，將上清移至分離管中。
7)12000g離心1min，傾倒收集管中的廢液。
8)加入500μL washing buffer于分離管中，同上離心并棄去收集管中的廢液。重復洗滌一次。
9)12000g離心1min，使乙醇完全揮發。
10)將分離管置于另一干凈EP管中并加入一定量的TE buffer，65℃水浴5min，12000g離心1min。
11)取一定量洗脫液進行電泳，其余置于-20℃保存備用。
2.瓊脂糖凝膠電泳1.0％瓊脂糖凝膠，1×TAE緩沖液，120-150mA，電泳20-40分鐘。
50×TAE儲存液配方2.0mol/L Tris base，1.0mol/L NaAc，0.1mol/L Na2EDTA；用冰醋酸調節pH8.3。
3.質粒DNA的酶切反應1)1μg質粒DNA1μL 10×M緩沖液(見Takara公司產品說明書)1μL 限制性內切酶Sfi I(10u/μL)用雙蒸水補齊至10μL反應條件50℃反應4h。
1)在上述反應體系內依次加入2μL 10×H緩沖液(見Takara公司產品說明書)1μL 限制性內切酶NotI(10u/μL)用雙蒸水補齊至20μL反應條件37℃反應4h。
4.瓊脂糖電泳膠的目的DNA回收純化(Promega公司)在紫外燈下觀察并切下瓊脂糖凝膠上的目的DNA電泳帶，移入1.5mL EP管。加入Omega公司膠回收試劑盒的DNA binding buffer，65℃水浴使凝膠完全溶化并保持溶液pH在5.0～6.0之間。將溶膠液移入分離管，12000g離心1min，棄去收集管中的液體。加入配套的Washing buffer，12000g離心1min，棄去收集管中的液體。重復洗滌1次。12000g離心1min，分離管移置另一干凈1.5mL EP管，加入一定體積的TE buffer，65℃孵育10min，12000g離心1min，取一定量電泳，UVP紫外掃描儀檢測回收純化效果。
5.連接反應(使用Takara公司連接試劑盒)通過紫外分光光度計檢測目的DNA片段和載體片段的濃度，根據外源片段與載體摩爾數比一般為1∶2～10的原則，設計連接反應體系如下目的DNA 1μL質粒載體 1～2μLligation solution 5μLddH2O 2～3μLTotal volume 10μL
16℃連接12-16h。
6.感受態菌的制備(CaCl2法)1)無菌接種環蘸取-70℃凍存的細菌保種液，三線法劃線接種于LB平板，37℃培養12～16小時。
2)挑取單個菌落接種于2mL LB培養液中，37℃搖床培養12～16h。
3)將過夜培養的DH5a按1％比例轉種至LB培養液中，37℃搖床培養至OD600為0.2～0.4時，8000g離心5min收集細菌。
4)加入1mL預冷的0.1M CaCl2重懸沉淀，冰水浴3h。4℃8000g離心5min，棄上清。加入100μL預冷的0.1M CaCl2懸浮沉淀，冰水浴1h，備用。
7.連接產物轉化1)取感受態菌液100μL，加入連接反應產物；冰水浴60min，42℃水浴熱休克100s，迅速放置冰水浴1～2min。
20加100μL LB培養液，37℃搖床培養1h。
3)以8000g離心10min，吸棄100μL上清后混勻沉淀，各取50μL涂布平板，37℃孵箱培養過夜。
2.高效表達融合蛋白工程菌的構建及篩選將含ScFv基因的重組質粒pCANTAB6His轉化大腸桿菌HB2151并提取質粒酶切鑒定。基因工程大腸桿菌HB2151的感受態菌制備、轉化及重組菌的質粒抽提酶切鑒定同前。
取鑒定無誤的重組菌接種于3mL含Amp的LB培養液中，30℃搖床培養過夜。次日將過夜培養的重組工程菌按1％的比例轉種于20mL含Amp的LB培養液中，30℃搖床培養2.5小時，以IPTG誘導24h，SDS-PAGE檢測融合蛋白的表達形式和表達量，篩選高效表達菌株。
實施例4抗Stx2A單克隆抗體5F3輕、重鏈可變區基因及其編碼的多肽在制備用于診斷和治療EHEC O157感染及其并發癥方面藥物中的應用。
1.以本發明所述的輕、重鏈可變基因出發，可以重構并表達多種形式的抗體藥物，可以直接用于診斷和治療EHEC O157感染及其并發癥。例如1)嵌合抗體是用鼠單抗的V區與人IgG的C區連接而成為人-鼠嵌合抗體。由于其完整地保留了鼠單抗的特異性和親和力，同時降低了HAMA等不良反應。
2)人源化抗體是針對可變區基因結構的人源化改造，包括CDR移植、表面氨基酸殘基修飾、骨架區交換、定位保留和表位導向選擇等從而降低了可變區的鼠源性同時又保持了鼠單抗的特異性和親和力。
3)小分子抗體主要有VH-CH1和VL-C1組成Fab抗體、用一多肽(Gly4Ser)3接頭連接VH基因和VL基因而成的單鏈抗體、由VH基因和VL基因以非共價鍵結合而成Fv片段抗體、由VH或VL一個功能結構域組成的單域抗體、由單個CDR構成的最小識別單位等。
多價微型抗體主要有雙鏈抗體、(ScFv)2、(ScFv)4等。由于有多價抗原結合位點，親和力高，分子大小適中等特點而具有較高的臨床應用價值。
5)雙特異性抗體是一類具有雙重特異性和雙重功能的抗體，又稱雙功能抗體。
6)重組抗體融合蛋白把ScFv基因片段，與非抗體的毒素或酶等其它蛋白基因連接形成的具有特定的生物活性導向靶部位的一種重組蛋白。
7)噬菌體抗體把Ig的V區基因與絲狀噬菌體DNA上基因III或基因VIII連接轉染宿主菌后，使其在膜表面外殼蛋白表達ScFv的融合蛋白產物。通過對此產物多輪相關抗原的親和吸附，從中淘選出所需的更高親和力及更特異性的新抗體。
2.以本發明所述的抗Stx2A單克隆抗體5F3，可以用于1)O157菌超聲上清攻毒-抗Stx2A單克隆抗體5F3中和保護實驗以致死劑量(LD100)的O157菌超聲上清液(總蛋白0.05mg)注入小鼠腹腔，同時每組動物經腹腔注射給予如下所示不同劑量的抗體中和液，對照組每只小鼠給予10mmol/L PBS，最后每只小鼠注射的總液體量為0.5ml，動物分組如表1。觀察各組小鼠的死亡情況，在10天的觀察期后計算小鼠的死亡/生存率如表2。
表1

表2 O157菌超聲上清攻毒-抗Stx2A單克隆抗體5F3中和保護效果

結果顯示0.15mg純化后的抗Stx2A單克隆抗體5F3對攻毒小鼠的中和保護率達到80％。
結論抗Stx2A單克隆抗體5F3可針對O157菌超聲上清毒素攻毒小鼠產生有效中和保護作用。
2)腸出血性大腸桿菌(EHEC)O157志賀樣毒素相關抗原的基礎研究，或用于發現新的志賀樣毒素相關抗原或已知志賀樣毒素抗原的新表位。這些抗原均可進一步用于臨床血清學檢查，具有一定的臨床診斷意義。
3)由于單克隆抗體有同抗原特異結合的特性，可以對相應抗原進行分離純化。現有的方法從EHEC O157野生菌株中提純天然志賀樣毒素，存在方法煩瑣、得率低等缺陷。可將抗Stx2A單克隆抗體5F3直接連于固相載體上，以親和層析方法對志賀樣毒素Stx2A進行有效的分離和純化。
序列表<110>中國人民解放軍第三軍醫大學<120>抗EHEC O157志賀樣毒素II毒素亞單位單克隆抗體5F3輕、重鏈可變區基因及應用<160>4<210>1<211>378<212>DNA<213>鼠<220>
<221>V-region<222>(1)...(378)
<400>1CCAGCCATGG CCCAGGTCCA ACTGCAGCAG TCAGGACCTG AGCTAGTGAA GACTGGGGCT 60TCAGTGAAGG TATCCTGCAA GGCTTCTGGT TACTCATTCA CTGGTTGCTA CATGCACTGG120GTCAAGCAGA GCCATGGAAA GAGCCTTGAG TGGATTGGAT ATATTAGTTG TTACAATGGT180GCTACTAGCT ACAACCAGAA GTTCAAGGGC AAGGCCACAT TTACTGTAGA CACATCCTCC240AGCACAGCCT ACATGCAGTT CAACAGCCTG ACATCTGAAG ACTCTGCGGT CTATTACTGT300GCAAGAAAGG GCTACGGTAG TAGTCATTAC TATGCTATGG ACTACTGGGG CCAAGGGACC360ACGGTCACCG TCTCCTCA 378<210>2<211>376<212>PRT<213>鼠<220>
<221>V-region<222>(1)...(126)<400>2Pro Ala Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu1 5 10 15Val Lys Thr Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly20 25 30Thr Ser Phe Thr Gly Cys Thr Met His Trp Val Lys Gln Ser His35 40 45Gly Lys Ser Leu Glu Trp Iie Gly Tyr Iie Ser Cys Tyr Asn Gly50 55 60Ala Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thy65 70 75Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Phe Asn Ser Leu80 85 90Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Lys Gly Tyr95 100 105Gly Ser Ser His Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
110 115 120Thr Val Thr Val Ser Ser125<210>3<211>327<212>DNA<213>鼠<220>
<221>V-region<222>(1)...(327)<400>3GACATCGAGC TCACTCAGTC TCCAGCCACC CTGTCTGTGA CTCCAGGAGA TAGCGTCAGT 60CTTTCCTGCA GGGCCAGCCA AAGTATTAGC AACAACCTAC ACTGGTATCA ACAAAAATCA120CATGAGTCTC CAAGGCTTCT CATCAAGTAT GCTTCCCAGT CCATCTCTGG GATCCCCTCC180AGGTTCAGTG GCAGTGGATC AGGGACAGAT TTCACTCTCA GTATCAACAG TGTGGAGACT240GAAGATTTTG GAATGTATTT CTGTCAACAG AGTAACAGCT GGCCTCTCAC GTTCGGTGCT300GGGACCAAGC TGGAGCTGAA ACGGGCG327<210>4<211>109<212>PRT<213>鼠<220>
<221>V-region<222>(1)...(109)
<400>4Asp Iie Glu Leu Tyr Gln Ser Pro Ala Tyr Leu Ser Val Tyr Pro1 5 10 15Gly Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Iie Ser20 25 30Asn Asn Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg35 40 45Leu Leu Iie Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Iie Ser Gly Iie Pro Ser50 55 60Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Iie65 70 75Asn Ser Val Glu Thr Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln80 85 90Ser Asn Ser Trp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu95 100 105Leu Lys Arg Ala
權利要求
1.抗EHEC O157志賀樣毒素II毒素亞單位Stx2A單克隆抗體5F3的重鏈可變區基因和輕鏈可變區基因，其基因序列是序列表1和序列表3所示的核苷酸序列。
2.權利要求1所述的基因編碼的多肽，其具有序列表2和序列4所示的氨基酸序列。
3.權利要求1所述的基因在制備用于診斷或治療EHEC O157感染及其并發癥方面藥物中的應用。
4.權利要求2所述的多肽在制備用于診斷或治療EHEC O157感染及其并發癥方面藥物中的應用。
全文摘要
本發明屬生物制藥領域，涉及抗腸出血性大腸桿菌(EHEC)O157志賀樣毒素II毒素亞單位Stx2A單克隆抗體5F3重鏈和輕鏈可變區基因及其所述基因編碼的多肽，以及所述基因和多肽在制備用于診斷和治療EHEC O157感染及其并發癥方面藥物中的應用。本發明人采用通用的兼并性引物成功地從培養的一株抗Stx2A特異性單克隆抗體5F3的雜交瘤細胞株中克隆了其對應抗體輕、重鏈可變區基因。基于上述的單克隆抗體5F3的輕、重鏈可變區基因，可以采用基因工程方法，構建和表達多種形式的小分子基因工程抗體，如ScFv抗體、嵌合抗體、抗體融合蛋白等，制備用于診斷和治療EHEC O157感染及其并發癥方面藥物，將對診斷和治療EHEC O157感染及其并發癥提供新的途徑。
文檔編號A61K39/395GK1847397SQ200610054048
公開日2006年10月18日 申請日期2006年1月20日 優先權日2006年1月20日
發明者鄒全明, 馬穎, 毛旭虎, 楊珺 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學