專利名稱：利用弱極性大孔樹脂制備桔梗總皂苷提取物的方法及用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種利用弱極性大孔樹脂制備桔梗總皂苷提取物的方法及用途。
背景技術：
桔梗(Radix platycodonis)系桔梗科Campanulaceae植物桔梗Platycodon grandiflorum的干燥根。其性味苦、辛、平，歸肺經，有開宣肺氣，祛痰排膿之功效。植物化學研究發現，桔梗中主要含有齊敦果酸型皂苷類成分。現代藥理學試驗表明，桔梗具有鎮咳、祛痰、抗炎、抑制胃酸分泌及抗胃潰瘍、鎮靜、解熱、降血脂、降膽固醇、調節機體免疫力、抗菌及抗癌等多種藥理作用。
大孔吸附樹脂是指由苯乙烯、α-甲基苯乙烯、甲基丙烯酸甲酯、丙腈等為原料加入一定量致孔劑二乙烯苯聚合而成的球狀顆粒，直徑一般在0.3-1.25mm之間。現已廣泛應用提取純化天然植物中的活性成分，如皂苷、黃酮、內脂、生物堿等。根據大孔樹脂化學結構不帶或帶有不同極性的功能基以及樹脂的表面性質，通常將大孔樹脂分為非極性、弱極性和中極性等類型。其中，弱極性大孔樹脂為含酯基的吸附樹脂，其表面兼有疏水和親水兩部分，既可由極性溶劑中吸附非極性物質，又可由非極性溶液中吸附極性物質，因而應用范圍更為廣泛。
專利CN1566137A及專利CN1397560A分別公開利用非極性大孔樹脂D101及HPD-100生產桔梗總皂苷的方法，但是沒有具體公開其中桔梗總皂苷的含量。這兩種樹脂還存在對桔梗總皂苷的吸附量小、解吸率低及制得的桔梗總皂苷的含量低的缺點。
發明內容
本發明的目的是提供一種利用弱極性大孔樹脂制備桔梗總皂苷提取物的方法及用途。
它是將桔梗藥材粉碎或用桔梗飲片，加6～15倍量水或10％-30％乙醇，加熱回流提取2～4次，每次1～3h，過濾，合并提取液，濃縮至0.25～2.0g生藥/ml；過濾或離心后通過填充有弱極性大孔樹脂的層析柱，提取液按桔梗總皂苷含量計與干樹脂的比例為1∶5～10，上柱流速1～4BV/h，樹脂徑高比為1∶3～1∶9；用水洗滌樹脂3～8BV，洗脫流速為2-4BV/h，水洗脫液棄去；用含30～95％含水乙醇洗脫，流速為2～4BV/h，收集乙醇洗脫液；乙醇洗脫液減壓濃縮至相對密度為1.1～1.25，減壓或噴霧干燥，得桔梗總皂苷。
所述的離心的轉速為4000～16000轉/分鐘。弱極性大孔樹脂為聚苯乙烯型弱極性大孔樹脂。
利用弱極性大孔樹脂制備桔梗總皂苷提取物用于制備治療糖尿病的藥物、用于制備抗周圍神經病變的藥物。
本發明采用的弱極性大孔樹脂對桔梗總皂苷的吸附量大，被解吸完全，所得總皂苷的含量高，因此，可以顯著提高桔梗總皂苷的提取率，降低生產成本。
具體實施例方式
本發明針對現有工藝缺陷進行了改進，利用弱極性大孔樹脂來制備桔梗總皂苷提取物，其中桔梗總皂苷含量50％-90％重量，桔梗皂苷D含量不低于1.0％重量，通過與上述兩種樹脂的工藝參數進行比較，結果顯示弱極性大孔樹脂對桔梗總皂苷的吸附量明顯優于非極性大孔樹脂D101及HPD100，解吸率及獲得的桔梗總皂苷的含量也明顯高于利用非極性大孔樹脂D101及HPD100制得的產品。本發明還同時提供了所制備的桔梗總皂苷提取物治療糖尿病以及鎮痛、抗血栓、抗周圍神經病變的藥效學數據。
所制備的桔梗總皂苷提取物，桔梗總皂苷含量不低于50％重量(以桔梗皂苷D計)，優選50％-90％重量，更優選50％-70％重量，該總皂苷對由腎上腺素、葡萄糖、鏈脲佐菌素和四氧嘧啶引起的高血糖均有明顯的降低作用，具有降低血糖的作用。同時，能顯著改善由鏈脲佐菌素引起的大鼠脛神經傳導障礙，提高運動神經的傳導速度(NCV)，明顯縮短蟈窩神經的不應期。此外，桔梗總皂苷有較強的鎮痛作用及抗血小板聚集及抗血栓形成的作用。可以用于制備治療糖尿病以及鎮痛、抗血栓、抗周圍神經病變的藥物。
本發明可以用于制備治療糖尿病以及鎮痛、抗血栓、抗周圍神經病變的藥物中的用途。其特征在于桔梗總皂苷的含量不低于50％(香草醛-冰醋酸，高氯酸顯色，UV法，以桔梗皂苷D計，重量百分比)，桔梗皂苷D含量不低于1.0％(HPLC法，重量百分比)。
弱極性大孔樹脂AB-8與非極性D101、HPD100型大孔樹脂對桔梗總皂苷吸附量、解吸率及所得總皂苷含量的比較樹脂各5克，用水洗至無醇味，減壓抽干，精密稱定，置于250ml具磨塞口的三角瓶中，各加入前期制備的樣品液150ml(相當于45g生藥)，25℃恒溫振蕩24h，分別取吸附前后的藥液，測定總皂苷含量，計算樹脂比吸附量(mg/g干樹脂)。比吸附量(mg·g-1干樹脂)＝(吸附前總皂苷量-吸附后總皂苷量)/樹脂干重。分別將上述飽和吸附的樹脂濾出，用30ml水洗，吸干表面水分后，加入70％乙醇50ml解吸(25℃恒溫振搖24h)，取解吸后溶液測定，計算乙醇對各樹脂的解吸率。解吸率＝(解吸液中總皂苷量/飽和吸附量)×100％。將解吸液濃縮、減壓干燥得總皂苷。計算總皂苷的含量。結果如表1。
表1不同類型樹脂對桔梗總皂苷的吸附量、解吸率及總皂苷含量的比較
結果顯示，利用弱極性大孔樹脂AB-8制備桔梗總皂苷，不僅吸附量大，而且解吸率高，所得產品含量高。
桔梗總皂苷的藥理作用1.降糖作用在低、中、高劑量下，桔梗總皂苷對由腎上腺素、葡萄糖、鏈脲佐菌素和四氧嘧啶引起的高血糖均有明顯的降低作用，量效關系明確。對動物正常血糖無明顯影響。
藥物桔梗總皂苷為自制，陽性對照為消渴丸(廣州中一藥業有限公司)；糖脈康膠囊(成都中匯制藥有限公司)。脲佐菌素和四氧嘧啶均為Sigma公司產品。
動物小鼠，清潔級，體重18g-22g，50只，雌雄各半，由浙江醫學科學院實驗動物中心提供，合格證號SCXK(浙)2003-0001。
試驗結果1.1桔梗總皂苷對小鼠正常血糖的影響取健康正常小鼠70只，雌雄各半，隨機分為5組，分別為空白對照組、模型對照組、消渴丸組(2g/kg)，桔梗總皂苷三個劑量組(40、20和10mg/kg)，于7日內每天灌胃給藥一次，灌胃體積均為10ml/kg，末次給藥前禁食12h，給藥2h后，測定血糖。
表2桔梗總皂苷對小鼠正常血糖的影響(X±S)
注1*P＜0.05；2*P＜0.013*P＜0.0011.2桔梗總皂苷對葡萄糖引起的小鼠高血糖的影響取雌雄各半小鼠60只，按體重隨機分為5組，分別為空白對照組、模型對照組、消渴丸組，桔梗總皂苷三個劑量組(40、20和10mg/kg)，于7日內每天灌胃給藥一次，灌胃體積均為10ml/kg，末次給藥前禁食5h，末次給藥1h后，除空白對照組外，其余各組均腹腔注射葡萄糖2g/kg，于注射葡萄糖后1h，將動物處死，取血，用血糖儀測定血糖。結果表明桔梗總皂苷可明顯降低葡萄糖引起的高血糖。見表3。
表3桔梗總皂苷對對葡萄糖引起的小鼠高血糖的影響(X±S)
注1*P＜0.05；2*P＜0.013*P＜0.0011.3桔梗總皂苷對腎上腺素引起的小鼠高血糖的影響分組與給藥同實驗1.2。不同之處為末次給藥(不禁食)1h后，除空白對照組外，其余各組均腹腔注射腎上腺素250μg/kg，注射腎上腺素后1h，將動物處死，取血，測定血糖。結果表明桔梗總皂苷可明顯降低腎上腺素引起的高血糖。見表4。
表4桔梗總皂苷對腎上腺素引起的小鼠高血糖的影響(X±S)
注1*P＜0.05；2*P＜0.013*P＜0.0011.4桔梗總皂苷對鏈脲佐菌素引起小鼠高血糖的影響在雄性小鼠90只，隨機取10只作為空白對照組，其余小鼠尾靜脈注射鏈脲佐菌素(在4C冰浴中用0.05M檸檬酸pH4.5浴液配制，立即使用)200mg/kg，造成糖尿病模型。注射后72h小鼠眶靜脈取血測血糖，刪除未造成糖尿病模型者(測前禁食12h，血糖值低于11.11mmol/l)，留用小鼠隨機分為5組，每組10只，于7日內按表3所示劑量每天給藥一次，未次給藥后2h，眶靜脈取血，以鄰甲苯胺法(超微量法)測血糖。結果表明桔梗總皂苷中劑量組和高劑量組對鏈脲佐菌素引起小鼠高血糖具有明顯的降低作用，見表5。
表5桔梗總皂苷對鏈脲佐菌素引起小鼠高血糖的影響(X±S)
注*P＜0.05；**P＜0.0l1.5桔梗總皂苷對四氧嘧啶引起小鼠高血糖的影響分組與給藥同實驗1.2。不同之處為末次給藥(不禁食)1h后，除空白對照組外，其余各組均腹腔注射四氧嘧啶，劑量為60mg·kg-1。約1h后，繼續給藥，連續3日。末次給藥1h后，摘眼球放血，測血糖。結果見表6。
表6桔梗總皂對四氧嘧啶引起小鼠高血糖的影響(X±S)
注1*P＜0.05；2*P＜0.013*P＜0.0012.鎮痛作用取小鼠60只，隨機分成5組，分別灌服生理鹽水、3個劑量的桔梗總皂苷、糖脈康顆粒劑0.2ml·10g-1，連續給藥7日，末次給藥1h，各組動物腹腔注射0.9％冰醋酸0.1ml·10g-1，計數20min內小鼠的扭體次數。結果見表7。
表7桔梗總皂苷對醋酸所致小鼠扭體次數的影響
注1*P＜0.05；2*P＜0.01結果桔梗總皂苷有較強的鎮痛作用。
3.桔梗總皂苷對體外血栓形成的影響取小鼠60只，隨機分成5組，分別灌服生理鹽水、3個劑量的桔梗總皂苷、糖脈康顆粒劑1ml·100g-1，連續給藥10日，末次給藥1h后，動物以戊巴比妥鈉麻醉，打開腹腔，由腔靜脈不抗凝精確取血2ml迅速置于塑膠管中，在預先已經預熱的血栓形成儀中旋轉10min，之后輕輕取出血栓，在濾紙上吸干血水，測血栓長度、濕重，再將血栓置于65℃的烘箱中30min，測其干重。
表8桔梗總皂苷體外抗血栓形成試驗結果
注1*P＜0.05結果桔梗總皂苷能顯著的抗血小板聚集及抗血栓形成作用。
4.桔梗總皂苷改善由鏈脲佐菌素引起的大鼠脛神經傳導障礙、提高運動神經傳導速度、明顯縮短蟈窩神經的不應期的試驗取大鼠，隨機分成5組，禁食18h后，用枸櫞酸鈉緩沖液配制2％鏈脲佐菌素溶液，除正常組外，其余各組動物分別腹腔注射60mg·kg-1鏈脲佐菌，約2h后正常飲食。分別灌服生理鹽水、桔梗總皂苷(2個劑量)、糖脈康顆粒劑，容量為1ml·100mg-1，每天1次，連續4周。
4.1神經電生理指標ABR(聽覺腦干誘發電位)記錄電極(正極)置于大鼠兩眼后緣連線中心，無關電極接于同側耳垂，接地電極置于同側前肢，將TDH-39型耳機置于右耳道，給予80dB短聲刺激引導ABR，觀察主波的峰潛伏期，然后衰減刺激強度觀察閾值。
SEP(體感誘發電位)刺激電極置于左前肢掌心正中神經遠端。記錄電極(負極)置于對側眼眶后緣和耳廓前緣的中點及頭顱正中線旁開1/2的顱骨外，無關電極(正極)置于對側耳垂。用3.0mA刺激強度引導體感誘發電感應，測峰潛伏期。
4.2NCV(運動神經傳導速度)刺激電極置蟈窩神經附近，記錄電極置于腓神經遠端，接地電極接于刺激電極和記錄電極連線中點，其中刺激電極的負極朝向肢體的近端，記錄電極的負極朝向肢體的遠端，量刺激與記錄電極的負極間的距離，則NCV＝(刺激電極和記錄電極的兩個負極之間的距離)/峰潛伏期。
4.3不應期電極位置同NCV，用日制SEN-3201電刺激器，雙脈沖刺激，通過調節雙脈沖的時間間隔，觀察運動神經的不應期反應。
表9
注2*P＜0.01結果表明，桔梗總皂苷能顯著改善由鏈脲佐菌素引起的大鼠脛神經傳導障礙，提高運動神經的傳導速度(NCV)，明顯縮短蟈窩神經的不應期。
結論該總皂苷對由腎上腺素、葡萄糖、鏈脲佐菌素和四氧嘧啶引起的高血糖均有明顯的降低作用具有降低血糖的作用。同時，能顯著改善由鏈脲佐菌素引起的大鼠脛神經傳導障礙，提高運動神經的傳導速度(NCV)，明顯縮短蟈窩神經的不應期。此外，桔梗總皂苷有較強的鎮痛作用及抗血小板聚集及抗血栓形成的作用。
實施例1取粉碎后的桔梗藥材2kg，加6倍量水，加熱回流提取2次，每次1h，過濾，合并提取液，濃縮至0.25g生藥/ml；過濾后通過AB-8型大孔樹脂，提取液按桔梗總皂苷含量計與干樹脂的比例為1∶5，上柱流速1BV/h，樹脂徑高比為1∶3；用水洗滌樹脂3BV，洗脫流速為2BV/h，水洗脫液棄去；用含30％含水乙醇洗脫8BV，流速為2BV/h，收集乙醇洗脫液；乙醇洗脫液減壓濃縮至相對密度為1.1，減壓干燥，得桔梗總皂苷。測得桔梗皂苷含量為50％(香草醛-冰醋酸，高氯酸顯色；UV法；以桔梗皂苷D計，重量百分比)，桔梗皂苷D含量為1.0％(HPLC法，重量百分比)。
實施例2將桔梗飲片1kg，加15倍量30％乙醇，加熱回流提取4次，每次3h，過濾，合并提取液，濃縮至2.0g生藥/ml；離心后通過AB-8型大孔樹脂的層析柱，提取液按桔梗總皂苷含量計與干樹脂的比例為1∶10，上柱流速4BV/h，樹脂徑高比為1∶9；用水洗滌樹脂8BV，洗脫流速為4BV/h，水洗脫液棄去；用含95％含水乙醇洗脫，流速為4BV/h，收集乙醇洗脫液；乙醇洗脫液減壓濃縮至相對密度為1.25，減壓或噴霧干燥，得桔梗總皂苷。測得桔梗皂苷含量為77％(香草醛-冰醋酸，高氯酸顯色；UV法；以桔梗皂苷D計，重量百分比)，桔梗皂苷D含量為2.9％(HPLC法，重量百分比)。
實施例3取粉碎后的桔梗藥材5kg，加8倍量水，加熱回流提取2次，每次1h，過濾，合并提取液，濃縮至1.0g生藥/ml；離心(4000轉/分鐘)后通過AB-8型大孔樹脂，藥液按桔梗總皂苷含量計與干樹脂的比例為1∶5，上柱流速2BV/h，樹脂徑高比為1∶5；用水洗滌樹脂3BV，洗脫流速為4BV/h，水洗脫液棄去；用含70％水乙醇洗脫3BV，流速為2BV/h，收集乙醇洗脫液；乙醇液減壓濃縮至相對密度為1.1(50℃熱測)，減壓干燥，得桔梗總皂苷。測得桔梗皂苷含量為72％(香草醛-冰醋酸，高氯酸顯色；UV法；以桔梗皂苷D計，重量百分比)，桔梗皂苷D含量為2.1％(HPLC法，重量百分比)。
實施例4桔梗藥材飲片5kg，加10倍量10％乙醇，加熱回流提取2次，每次1.5h，過濾，合并提取液，濃縮至0.5g生藥/ml；過濾后通過D201型大孔樹脂，藥液按桔梗總皂苷含量計與干樹脂的比例為1∶9，上柱流速3BV/h，樹脂徑高比為1∶7；用水洗滌樹脂5BV，洗脫流速為4BV/h，水洗脫液棄去；用含30％水乙醇洗脫10BV，流速為4BV/h，收集乙醇洗脫液；乙醇液減壓濃縮至相對密度為1.25(50℃熱測)，噴霧干燥，得桔梗總皂苷。測得桔梗皂苷含量為66％(香草醛-冰醋酸，高氯酸顯色，UV法，以桔梗皂苷D計，重量百分比)，桔梗皂苷D含量為1.1％(HPLC法，重量百分比)。
實施例5桔梗藥材飲片5kg，加15倍量水，加熱回流提取2次，每次1h，過濾，合并提取液，濃縮至0.25g生藥/ml；離心(8000轉/分鐘)后通過HPD450大孔樹脂，藥液按桔梗總皂苷含量計與干樹脂的比例為1∶6，上柱流速4BV/h，樹脂徑高比為1∶9；用水洗滌樹脂2BV，洗脫流速為3BV/h，水洗脫液棄去；用含50％水乙醇洗脫5BV，流速為3BV/h，收集乙醇洗脫液；乙醇液減壓濃縮至相對密度為1.2(50℃熱測)，噴霧干燥，得桔梗總皂苷。測得桔梗皂苷含量為70％(香草醛-冰醋酸，高氯酸顯色，UV法，以桔梗皂苷D計，重量百分比)，桔梗皂苷D含量為2.2％(HPLC法，重量百分比)。
權利要求
1.一種利用弱極性大孔樹脂制備桔梗總皂苷提取物的方法，其特征在于將桔梗藥材粉碎或桔梗飲片，加6～15倍量水或10％-30％乙醇，加熱回流提取2～4次，每次1～3h，過濾，合并提取液，濃縮至0.25～2.0g生藥/ml；過濾或離心后通過填充有弱極性大孔樹脂的層析柱，提取液按桔梗總皂苷含量計與干樹脂的比例為1∶5～10，上柱流速1～4BV/h，樹脂徑高比為1∶3～1∶9；用水洗滌樹脂3～8BV，洗脫流速為2-4BV/h，水洗脫液棄去；用含30～95％含水乙醇洗脫，流速為2～4BV/h，收集乙醇洗脫液；乙醇洗脫液減壓濃縮至相對密度為1.1～1.25，減壓或噴霧干燥，得桔梗總皂苷。
2.根據權利要求1所述的一種利用弱極性大孔樹脂制備桔梗總皂苷提取物的方法，其特征在于所述的離心的轉速為4000～16000轉/分鐘。
3.根據權利要求1所述的一種利用弱極性大孔樹脂制備桔梗總皂苷提取物的方法，其特征在于所述的弱極性大孔樹脂為聚苯乙烯型弱極性大孔樹脂。
4.一種利用弱極性大孔樹脂制備桔梗總皂苷提取物的用途，其特征在于桔梗總皂苷提取物用于制備治療糖尿病的藥物。
5.一種利用弱極性大孔樹脂制備桔梗總皂苷提取物的用途，其特征在于桔梗總皂苷提取物用于制備抗周圍神經病變的藥物。
全文摘要
本發明公開了一種運用弱極性大孔樹脂制備桔梗總皂苷提取物的方法及用途。它是將桔梗藥材粉碎或直接用桔梗飲片，加水或10％－30％乙醇，加熱回流提取，過濾，合并提取液，濃縮；過濾或離心后通過填充有弱極性大孔樹脂的層析柱，先用水洗滌樹脂，水洗脫液棄去；再用含水乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液；乙醇洗脫液減壓濃縮，減壓或噴霧干燥，得桔梗總皂苷。桔梗總皂苷含量50％－90％重量、桔梗皂苷D含量不低于1.0％重量的桔梗總皂苷提取物用于制備治療糖尿病以及抗周圍神經病變的藥物。本發明采用的弱極性大孔樹脂對桔梗總皂苷的吸附量大，被解吸完全，所得總皂苷的含量高，因此，可以顯著提高結桔梗總皂苷的提取率，降低生產成本。
文檔編號A61P25/00GK1850851SQ20061005160
公開日2006年10月25日 申請日期2006年5月24日 優先權日2006年5月24日
發明者張琳, 楊壯, 田景奎, 陳波, 李凌軍, 陳赟, 梁波 申請人:浙江大學