專利名稱：低聚糖在制備超急性排斥反應藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬糖化合物，涉及低聚糖的用途，主要涉及水蘇糖和毛蕊糖在醫藥領域的應用。
背景技術：
器官移植術后的排斥反應分為超急性、急性和慢性三類。超急性排斥反應從免疫學上來說是由于移植器官細胞膜上的抗原和受者的循環抗體之間發生識別和結合所致。因為這些抗體都是預先存在于受體內，所以，超急性排斥反應在移植術后便迅速發生，一般在術后幾分鐘或幾小時內即出現。由于人體器官的短缺，利用豬的器官代替人體器官是目前研究的熱點。但由于豬的細胞表面抗原Gal-α-1，3-Gal(半乳糖-α-1，3-半乳糖)結構能與人體內預存的天然抗體結合產生超急性排斥反應而無法應用到臨床。針對此問題，目前，國內外主要有以下幾種方法第一種方法是轉基因豬，主要是通過把豬身上表達此抗原的基因除去，從而使生產出來的豬不帶有此抗原(例如日本已克隆出8只次類小豬)，一旦得到了轉基因豬，通過常規的繁殖傳代就可以得到大量的轉基因豬，理論上應該說這是一種非常理想的解決途徑，但是目前還因為一些問題而無法應用到臨床。總的來說克隆和轉基因還不是一種完全成熟的技術，許多通過此途徑生產出的動物都存在著或多或少的生理上的不正常，容易夭折。其次，還要考慮由于轉基因動物的某些未知的基因變異而對受移植者帶來損害的可能性。第二種方法是通過對免疫抑制劑的開發和改良來解決問題，這是一種常規的思路。目前的免疫抑制劑有環孢素A、糖皮質激素、硫唑嘌呤、抗淋巴細胞球蛋白、環磷酰胺等，但遺憾的是不能解決超急性排斥反應問題，并且有各種各樣的副作用，比如常見的就有骨髓抑制、肝腎毒性、上消化道出血、脫發等等。雖然有報道某些研發機構在進行新的免疫抑制劑的開發，但前景不明。
水蘇糖是天然存在的一種四糖，分子式為C24H42O21，相對分子質量為666.59，簡單的結構表示式為果糖-葡萄糖-半乳糖-半乳糖。同樣，毛蕊糖也是天然存在的五糖，分子式為C30H52O26，相對分子質量為828.7，簡單的結構表示式為果糖-葡萄糖-半乳糖-半乳糖-半乳糖，兩者均屬于低聚半乳糖，無毒，可直接食用，屬易溶類物質。目前國內制備工藝成熟，商業上主要作為促進腸道雙歧桿菌增殖的功能性低聚糖。
發明內容
本發明的目的是提供低聚糖在制備抗豬→人異種器官移植引起的超急性排斥反應藥物中的應用，所說的低聚糖主要選用水蘇糖或毛蕊糖，所制備的藥物還含有制劑允許的藥物賦形劑或載體，所說的水蘇糖具有以下分子結構圖 所說的毛蕊糖具有以下分子結構圖 所制備的藥物的制劑形式包括液體制劑、顆粒劑、片劑或膠丸。所制備藥物的給藥方式包括口服給藥或注射給藥。
由于人體內預存的天然抗體與豬細胞表面抗原Gal-α-1，3-Gal的結合是產生超急性排斥反應的主要原因(David L，Kooyman，Steven B，et al.Identificationand characterization of a galactosyl peptide mimetic[J].Transplantation，1996，61(6)851-855)，為了解決這一難題，我們希望能開發出一種可以模擬Gal-α-1，3-Gal結構的小分子化合物。目前已知蜜二糖由于有α-Gal的空間結構，從而具有與人體內預存的天然抗體結合的能力，但它對人的肝腎有毒性，限制了它在這一方面的進一步開發和利用。本發明研究發現水蘇糖和毛蕊糖也具有α-Gal的空間結構，通過抑制GS-I-B4(西非單葉豆凝集素，它能與Gal-α-1，3-Gal特異性結合)與豬紅細胞凝集試驗(實施例圖1)和抑制人血清與豬紅細胞凝集試驗(實施例圖2)，說明這兩種糖也能預先與人血清中預存的抗Gal-α-1，3-Gal抗體或GS-I-B4特異性結合并使其失活，從而可以抑制超急性排異反應的發生，同時，這兩種糖無毒，可直接食用，屬易溶類物質，有望開發成抗豬器官異種移植超急性排斥反應的新藥。
本發明的優點是(1)兩個低聚糖的序列結構清楚，并且生產技術完全成熟(已經商品化)，此糖化合物能在工業上大量合成或自然界提取，從制備的成本上遠遠低于轉基因方法，故可以大量合成滿足市場需求。(2)兩個低聚糖與人體內預存的天然抗體的結合位點是特異性的，正好是我們要求它結合上去起到封閉人類天然抗體作用的位點。從而避免了由于作用位點特異性不強而帶來的副作用。(3)這兩種低聚糖無毒，可直接食用，屬易溶類物質。(4)由于均為低聚糖，分子量較小，開發成藥物后容易被機體利用而起效。
本發明選用小分子化合物低聚糖，使它能預先與人體內預存的抗體結合，從而使抗體不能與豬細胞表面的抗原結合而引起超急性排斥反應；在控制超急性排斥反應的基礎上，采用相應的對策，誘導免疫耐受，使得動物組織在人體中存活。與第一種轉基因方法相比，本發明選用的此糖化合物能在工業上大量合成或自然界提取，從制備的成本上遠遠低于轉基因方法；并且糖化合物本身就是作用于抗體，針對性強。同時沒有由于基因變異而對受移植者帶來損害的顧慮。與第二種方法相比，在理論上本發明不僅能抑制超急性排斥反應的發生，也不會存在上述的骨髓抑制、肝腎毒性、上消化道出血等等嚴重副作用；同時，也不會降低人體整體的免疫功能。
圖1為蜜二糖，水蘇糖和毛蕊糖抑制GS-I-B4凝集豬紅細胞的反應結果圖。
圖2為蜜二糖和水蘇糖抑制人血清凝集豬紅細胞結果圖。
具體實施例方式
本發明結合以下實施例及附圖作進一步說明。
實施例1蜜二糖，水蘇糖，毛蕊糖能抑制GS-I-B4引起的豬紅細胞凝集反應試驗方法先把制備好的新鮮2％豬紅細胞懸浮在PH＝7.4的磷酸緩沖液中備用。在V型血凝板的孔里，先加入40μl用磷酸緩沖液依次逐孔倍比稀釋后的糖溶液，然后依次每孔分別加入40μl的GS-I-B4(0.042mM)和40μl 2％的豬紅細胞。然后把此120μl混合液在室溫下先用震蕩器震蕩1分鐘，再靜置1小時后觀察凝集結果。如果紅細胞沉淀到孔的底部，呈一邊緣光滑的圓點，則此為沒有凝集。如果紅細胞形成一網絡，并不下沉到孔底呈一邊緣光滑的圓點，此為出現凝集。試驗必須設空白、陽性對照。
試驗結果參見圖1，其中A1-A3孔是豬紅細胞用PBS稀釋的結果，為空白對照可以看出，沒有出現凝集；A4-A9孔是GS-I-B4和豬紅細胞混合后的結果，為陽性對照，出現凝集；B1-B9、C1-C9孔為蜜二糖抑制GS-I-B4引起的豬紅細胞凝集(兩條為重復實驗，蜜二糖濃度從12mM開始，1-9孔倍比稀釋)；D1-D9、E1-E9孔為水蘇糖抑制GS-I-B4引起的豬紅細胞凝集(兩條為重復實驗，水蘇糖濃度從12mM開始，1-9孔倍比稀釋)；F1-F9、G1-G9孔為毛蕊糖抑制GS-I-B4引起的豬紅細胞凝集(兩條為重復實驗，毛蕊糖濃度從12mM開始，1-9孔倍比稀釋)。
參見圖1三個糖均在低至12/26mM濃度(倍比稀釋第7孔)的時候就能抑制GS-I-B4引起的豬紅細胞凝集。說明它們預先均能與GS-I-B4結合，使它失活。這樣GS-I-B4就不能再與豬紅細胞上的Gal-α-1，3-Gal抗原結合，從而使豬紅細胞凝集起來。
本實驗用形象而直接的方式說明了低聚糖與GS-I-B4的結合位點是特異性的，正好是我們要求它結合上去起到封閉GS-I-B4作用的位點(即是α-Gal結構位點)，從而避免了由于作用位點特異性不強而帶來的副作用。
實施例2蜜二糖和水蘇糖能抑制人血清凝集豬紅細胞的反應試驗方法先把制備好的新鮮2％豬紅細胞懸浮在PH＝7.4的磷酸緩沖液中備用。在V型血凝板的孔里，先加入40μl用磷酸緩沖液依次逐孔倍比稀釋后的糖溶液，然后每孔分別加入40μl適當稀釋的A型血人血清和40μl 2％的豬紅細胞。然后把此120μl混合液在室溫下先用震蕩器震蕩1分鐘，再靜置1小時后觀察凝集結果。同實施例1，如果紅細胞沉淀到孔的底部，呈一邊緣光滑的圓點，則此為沒有凝集。如果紅細胞形成一網絡，并不下沉到孔底呈一邊緣光滑的圓點，此為出現凝集。試驗必須設空白、陽性對照。
試驗結果在圖2中，A1-A3孔是豬紅細胞用PBS稀釋的結果，為空白對照，可以看出，沒有出現凝集；A4-A9孔是GS-I-B4和豬紅細胞混合后的結果，為陽性對照，出現凝集；B1-B12、C1-C12孔為蜜二糖抑制人血清引起的豬紅細胞凝集(兩條為重復實驗，蜜二糖濃度從1mg/ml開始，1-9孔倍比稀釋)；D1-D12、E1-E12孔為水蘇糖抑制人血清引起的豬紅細胞凝集(兩條為重復實驗，水蘇糖濃度從1mg/ml開始，1-9孔倍比稀釋)。
從圖2中可以看出，蜜二糖，水蘇糖分別在低至0.125mg/ml和0.5mg/ml濃度的時候就能抑制A型血人血清引起的豬紅細胞凝集。說明它們預先均能與A型血人血清特異性結合，使它失活。這樣A型血人血清就不能再與豬紅細胞上的Gal-α-1，3-Gal抗原結合，從而使豬紅細胞凝集起來。
本實驗用形象而直接的方式說明了低聚糖與人體內預存抗體的結合位點是特異性的，正好是我們要求它結合上去起到封閉抗體作用的位點(即是α-Gal結構位點)。從而避免了由于作用位點特異性不強而帶來的副作用。
權利要求
1.一種低聚糖在制備超急性排斥反應藥物中的應用，其特征是在制備抗豬→人異種器官移植引起的超急性排斥反應藥物中的應用，所制備的藥物還含有制劑允許的藥物賦形劑或載體，所述低聚糖選用水蘇糖或毛蕊糖，水蘇糖具有以下分子結構 毛蕊糖具有以下分子結構
2.根據權利要求1所述的低聚糖在制備超急性排斥反應藥物中的應用，其特征是所述藥物的制劑形式包括液體制劑、顆粒劑、片劑或膠丸。
3.根據權利要求2所述的低聚糖在制備超急性排斥反應藥物中的應用，其特征是所述藥物的給藥方式包括口服給藥或注射給藥。
全文摘要
本發明提供一種低聚糖在制備抗豬→人異種器官移植引起的超急性排斥反應藥物中的應用，所述低聚糖選用水蘇糖或毛蕊糖，所制備的藥物還含有制劑允許的藥物賦形劑或載體。本發明選用小分子化合物低聚糖，使它能預先與人體內預存的天然抗體結合，從而使天然抗體不能與豬細胞表面的抗原結合而引起超急性排斥反應。本發明選用的低聚糖能在工業上大量合成或自然界提取，制備成本低；并且該低聚糖本身就是作用于抗體，針對性強；同時克服由于基因變異而對受移植者帶來損害的顧慮，不僅能抑制超急性排斥反應的發生，也不會存在骨髓抑制、肝腎毒性、上消化道出血等嚴重副作用，也不會降低人體整體的免疫功能，開發成藥物后容易被機體利用而起效。
文檔編號A61K9/16GK1879636SQ20061005068
公開日2006年12月20日 申請日期2006年5月11日 優先權日2006年5月11日
發明者詹金彪, 張暉, 許林海, 嚴志焜 申請人:浙江大學