載銅硅酸鹽抗菌劑的制備方法和用途的制作方法

專利名稱：載銅硅酸鹽抗菌劑的制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種載銅硅酸鹽抗菌劑的制備方法和用途。
背景技術：
動物消化道中存在著各種各樣的細菌，有些可消耗營養物質，有些則可產生毒素和細菌酶，后者能直接或間接破壞腸粘膜的形態和功能，從而降低畜禽的飼料效率和生長性能。如果腸道病原菌數量超過一定值，輕者消化不良、腹瀉，重者可能會發生腸源性全身感染，甚至危及生命，這使得抗生素和抗菌藥物在畜牧養殖中得到大量使用。而抗生素的大量使用，雖然在一定程度上起到了促進畜禽生長，防病抗病的作用。但長期使用和濫用抗生素，造成諸如細菌抗藥性、耐藥基因轉移、畜產品中藥物殘留、生態平衡失調等不良后果，直接或間接威脅人類健康。近年來，一些國家和地區已制定了相應的法律、法規，以嚴格控制或制止在畜禽養殖中使用抗生素。因此，研發安全無公害的新型抗菌材料已迫在眉睫。
以硅酸鹽類化合物為載體，擔持抗菌金屬離子或金屬氧化物而制成的無機抗菌劑，具有抗菌譜廣、細菌不易產生耐藥性、使用安全等特點，引起了人們的極大關注。目前，國內外在陶瓷、有機纖維、塑料、涂料、食品、醫藥等領域的研究與應用均有報道，但均未見廣泛推廣應用，主要原因是目前所研制的無機抗菌材料，其抗菌活性相對較低，還不能廣泛地應用于預防和臨床治療。因此，如何提高無機抗菌材料的抗菌活性，是研制和開發該類抗菌劑的關鍵所在。
目前普遍使用的無機抗菌劑多為Ag+型，Ag+對各種致病細菌都有強烈的殺滅效果，而且所需濃度極低，一般用量為10-6(質量分數)即可滅菌。但產品成本高，而且Ag+在見光、受熱條件下極易還原成金屬銀；Ag+還能與水介質中的Cl-、HS-、S2-和SO42-等多種陰離子反應，形成不溶于水的AgCl和Ag2S，從而失去抗菌活性。另一方面，銅的無機化合物也是常用的無機殺菌劑，如硫酸銅、氫氧化銅等。與銀相比，銅價格低廉，又由于其半徑小、電價高，若將其載于無機材料基體中，將具有比銀離子更高的穩定性，可克服銀系抗菌劑的缺點。而且，銅是動物機體必需的微量元素，銅具有類似抗生素的作用，飼糧中添加高劑量銅對豬有促生長作用。
蒙脫石是一種雙八面體層狀結構的天然納米級鋁硅酸鹽礦物，具有良好的分散性與陽離子交換能力，十分適合于用作各種無機抗菌劑的載體。而且，蒙脫石層間紋狀的表面結構和非均勻性電荷分布使對消化道內的病毒、病原菌及其產生的毒素等有優良的吸附能力，蒙脫石通過與黏液糖蛋白識別、結合、定位，可在消化道形成膠體保護膜，加強、修復、保護消化道粘膜屏障，提高粘膜屏障對攻擊因子的防御功能。
甲殼素是自然界僅次于纖維素第二大天然生物高聚物，化學名稱為(1，4)-2-乙酰胺基-2-脫氧-β-D-葡萄糖，化學結構是由2-乙酰胺基-2-脫氧-β-D-葡萄糖通過β-1，4糖苷鍵形式連接而成的多糖。甲殼素經濃堿水解脫乙酰基后產物為殼聚糖(2-氨基-2-脫氧-β-D-葡聚糖)。殼聚糖具有獨特的生物活性，能調節動物機體免疫，有較強的抗菌活性，并能調節動物體內膽固醇與脂質代謝。殼聚糖作為飼料添加劑、重金屬螯合劑、吸附劑、藥物緩釋劑等多種功能性材料已應用于農業、工業及醫藥等領域。

發明內容
本發明的目的是提供一種載銅硅酸鹽抗菌劑的制備方法和用途。
載銅硅酸鹽抗菌劑的制備方法包括以下步驟1)將蒙脫石礦物，連同相當于礦物重量5％～15％的氯化鈉，加水攪拌均勻，制成濃度為10％～20％的懸浮液礦漿，室溫鈉化10～15小時，水洗5～7次，用水重新制成濃度為10％～20％的礦漿；2)將相當于蒙脫石礦物重量0.5％～5％的殼聚糖溶解在體積分數為1～5％的醋酸或鹽酸水溶液中，配成殼聚糖含量(按重量比)為0.1～5g/100mL的殼聚糖酸溶液，于攪拌下將殼聚糖酸溶液緩慢加入步驟1)的礦漿中，連續攪拌反應5～10小時，反應溫度為20℃～70℃；3)將含銅量為蒙脫石礦物重量1～6％的銅鹽，于攪拌下緩慢加入步驟2)的礦漿中，檢測并調節礦漿的pH值為3.5～6.5，室溫反應5～10小時；4)檢測步驟3)礦漿的pH值，用堿性溶液調節，使漿液pH值為7.0～8.5；水洗3～7次，過濾或離心脫水；5)將步驟4)所得的濾餅烘干、粉碎至大于300目，得到一種載銅硅酸鹽抗菌劑。
發明中使用的殼聚糖為分子量為2～80kDa、脫乙酰度為80～95％的殼聚糖。使用的銅鹽可為氯化銅、硝酸銅、硫酸銅或者其水合物。使用的堿性溶液為濃度為0.5～10moL/L的氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸氫鈉或者碳酸氫鉀的水溶液。
制備方法的漿液脫水工藝，可因地制宜，選用離心或過濾等方法進行脫水。脫水后所得的濾餅可使用常規烘干設備干燥。烘干后的一種載銅硅酸鹽抗菌劑為塊狀，可選用常規粉碎設備粉碎至粒度大于300目。
載銅硅酸鹽抗菌劑用作畜禽、水產動物、牛羊的飼料添加劑。
本發明通過吸附、離子交換反應，利用蒙脫石殼聚糖復合物負載銅，制成銅～殼聚糖～蒙脫石復合抗菌劑，使用的材料蒙脫石、殼聚糖均為天然物質，屬安全、無毒的環境友好材料，基本不會造成二次污染。
本發明之載銅硅酸鹽抗菌劑具有抗菌作用強、細菌不易產生耐藥性、使用安全等特點，作為動物保健劑和生長促進劑在飼料中應用能有效抑制動物腸道病原菌的增殖，保護腸粘膜免受病原菌的侵襲，使腸粘膜始終處于健康狀態，以益于消化酶的分泌和飼料養分的消化；可提高機體免疫力和抗病力、降低動物腹瀉率、提高生產性能；可替代抗生素和抗菌藥物，生產無抗生素殘留的動物產品，推動養殖業的綠色化進程。
具體實施例方式
本發明結合以下實例作進一步的說明。
實施例11)將浙江安吉產的蒙脫石礦物，連同相當于礦物重量5％的氯化鈉，加水攪拌均勻，制成濃度為10％的懸浮液礦漿，室溫鈉化10小時，水洗5次，用水重新制成濃度為10％的礦漿；2)將相當于蒙脫石礦物重量0.5％的分子量為2kDa、脫乙酰度為80％的殼聚糖溶解在體積分數為1％的醋酸水溶液中，配成殼聚糖含量(按重量比)為0.1g/100mL的殼聚糖酸溶液，于攪拌下將殼聚糖酸溶液緩慢加入步驟1)的礦漿中，連續攪拌反應5小時，反應溫度為20℃；3)將含銅量為蒙脫石礦物重量6％的氯化銅，于攪拌下緩慢加入步驟2)的礦漿中，檢測并調節礦漿的pH值為3.5，室溫反應5小時；4)檢測步驟3)礦漿的pH值，用0.5moL/L的氫氧化鈉水溶液調節，使漿液pH值為7.0；水洗3次，過濾脫水；5)將步驟4)所得的濾餅烘干、粉碎至300目，得到一種載銅硅酸鹽抗菌劑。
采用美國國立臨床實驗室標準化委員會(NCCLS)推薦的肉湯稀釋法測定最小抑菌濃度和最小殺菌濃度的結果表明，載銅硅酸鹽抗菌劑對鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度分別為100，100，50mg/L，最小殺菌濃度分別為300、400、150mg/L。以1日齡AA商品代混合雛雞為試驗動物，飼喂0.05％載銅硅酸鹽抗菌劑的玉米-豆粕型日糧49天，發現載銅硅酸鹽抗菌劑具有明顯促生長和改善飼料利用效率的作用；可使小腸和盲腸大腸桿菌、沙門氏菌和產氣莢膜梭菌數減少；能有效抑制腸道β-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酸酶的活性；能改善小腸絨毛高度和絨毛密度，提高小腸粘膜麥芽糖酶、氨基肽酶N和堿性磷酸酶的活性，使飼料干物質、粗蛋白、粗脂肪等養分的表觀消化率得以提高。上述結果提示載銅硅酸鹽抗菌劑通過抑制腸道病原菌的增殖，降低細菌酶的活性，改善腸道內環境和粘膜形態結構，以益于消化酶的分泌和飼料養分的消化，從而提高肉雞的生長性能。
實施例21)將產自內蒙古的蒙脫石，連同相當于礦物重量15％的氯化鈉，加水攪拌均勻，制成濃度為20％的懸浮液礦漿，室溫鈉化15小時，水洗7次，用水重新制成濃度為20％的礦漿；2)將相當于蒙脫石礦物重量5％的分子量為80kDa、脫乙酰度為95％的殼聚糖溶解在體積分數為5％的鹽酸水溶液中，配成殼聚糖含量(按重量比)為5g/100mL的殼聚糖酸溶液，于攪拌下將殼聚糖酸溶液緩慢加入步驟1)的礦漿中，連續攪拌反應10小時，反應溫度為70℃；
3)將含銅量為蒙脫石礦物重量1％的六水硝酸銅(Cu(NO3)2·6H2O)，于攪拌下緩慢加入步驟2)的礦漿中，檢測并調節礦漿的pH值為6.5，室溫反應10小時；4)檢測步驟3)礦漿的pH值，用10moL/L的氫氧化鉀水溶液調節，使漿液pH值為8.5；水洗7次，離心脫水；5)將步驟4)所得的濾餅烘干、粉碎至400目，得到一種載銅硅酸鹽抗菌劑。
載銅硅酸鹽抗菌劑對嗜水氣單胞菌粘附魚上皮細胞的影響采用魚上皮細胞培養模型，觀察嗜水氣單胞菌對鰓上皮、皮膚上皮、腸上皮細胞的粘附率，研究載銅硅酸鹽抗菌劑對細菌粘附的阻斷作用及其對細菌粘附引起魚上皮細胞膜生物特性變化的影響。結果如下嗜水氣單胞菌對魚上皮細胞的粘附率和載銅硅酸鹽抗菌劑對粘附的阻斷率見表1。嗜水氣單胞菌與魚上皮細胞均有不同程度的粘附作用，其中對鰓上皮細胞的粘附率顯著大于腸上皮細胞(P＜0.05)。與空白組相比，載銅硅酸鹽抗菌劑均顯著降低了嗜水氣單胞菌對鰓、皮膚和腸上皮細胞的粘附率(P＜0.05)，但是對不同上皮細胞的粘附阻斷率無顯著差異。
表1 嗜水氣單胞菌對魚上皮細胞的粘附率和載銅硅酸鹽抗菌劑對粘附的阻斷率

注結果以平均數±標準差表示；n＝3。同一列中肩標小寫字母不同者表示細菌粘附率差異顯著(P＜0.05)；同一列中肩標大寫字母不同者表示粘附阻斷率差異顯著(P＜0.05)。
載銅硅酸鹽抗菌劑對細菌粘附引起魚上皮細胞膜生物特性變化的影響見表2。由表2可見，嗜水氣單胞菌粘附魚上皮細胞后，胞漿游離鈣和細胞膜PLA2濃度顯著上升。與細菌侵入組相比，細菌+載銅硅酸鹽抗菌劑組鰓、皮膚和腸上皮細胞胞漿游離鈣濃度和細胞膜PLA2顯著降低(P＜0.05)，而與正常對照組無顯著差異(P＞0.05)。
表2 載銅硅酸鹽抗菌劑對細菌粘附引起魚上皮細胞膜生物特性變化的影響

注結果以平均數±標準差表示；n＝3。同一列中肩標字母不同者差異顯著(P＜0.05)。
實施例3
1)將產自河北的蒙脫石，連同相當于礦物重量10％的氯化鈉，加水攪拌均勻，制成濃度為15％的懸浮液礦漿，室溫鈉化12小時，水洗6次，用水重新制成濃度為15％的礦漿；2)將相當于蒙脫石礦物重量2.5％的分子量為40kDa、脫乙酰度為85％的殼聚糖溶解在體積分數為2％的醋酸水溶液中，配成殼聚糖含量(按重量比)為2g/100mL的殼聚糖酸溶液，于攪拌下將殼聚糖酸溶液緩慢加入步驟1)的礦漿中，連續攪拌反應7小時，反應溫度為50℃；3)將含銅量為蒙脫石礦物重量3％的硫酸銅，于攪拌下緩慢加入步驟2)的礦漿中，檢測并調節礦漿的pH值為4.5，室溫反應8小時；4)檢測步驟3)礦漿的pH值，用5moL/L的碳酸鈉水溶液調節，使漿液pH值為8.0；水洗7次，過濾脫水；5)將步驟4)所得的濾餅烘干、粉碎至400目，得到一種載銅硅酸鹽抗菌劑。
選取平均體重為4.2g的健康尼羅羅非魚，飼喂0.01％載銅硅酸鹽抗菌劑的日糧56天，發現載銅硅酸鹽抗菌劑顯著提高了羅非魚的生長性能和存活率，顯著降低腸道細菌數量，并明顯改變腸道菌群的組成，使氣單胞菌屬，假單胞菌屬，黃桿菌屬，不動桿菌屬，產堿菌屬，腸桿菌科，弧菌屬的百分比減少；顯著提高白細胞吞噬活性、血清和體表粘液溶菌酶活性、紅細胞C3b受體花環百分率；顯著提高各腸段絨毛和微絨毛高度；顯著提高腸組織蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活性和飼料養分的表觀消化率。與黃霉素組相比，載銅硅酸鹽抗菌劑組羅非魚日增重、特定生長率、腸組織淀粉酶和脂肪酶、中腸微絨毛高度顯著提高，在其他指標上均具一定的優勢，但差異不顯著。結果提示載銅硅酸鹽抗菌劑通過抑制腸道病原菌的增殖，提高機體的非特異性免疫機能，改善腸粘膜形態結構，以益于消化酶的分泌和飼料養分的消化，從而提高羅非魚的生長性能和存活率。
實施例41)將蒙脫石礦物，連同相當于礦物重量7％的氯化鈉，加水攪拌均勻，制成濃度為10％的懸浮液礦漿，室溫鈉化10小時，水洗5次，用水重新制成濃度為20％的礦漿；2)將相當于蒙脫石礦物重量1％的分子量為10kDa、脫乙酰度為90％的殼聚糖溶解在體積分數為5％的鹽酸水溶液中，配成殼聚糖含量(按重量比)為1.5g/100mL的殼聚糖酸溶液，于攪拌下將殼聚糖酸溶液緩慢加入步驟1)的礦漿中，連續攪拌反應6小時，反應溫度為70℃；3)將含銅量為蒙脫石礦物重量4％的五水硫酸銅(CuSO4·5H2O)，于攪拌下緩慢加入步驟2)的礦漿中，檢測并調節礦漿的pH值為5.0，室溫反應5小時；4)檢測步驟3)礦漿的pH值，用1moL/L的碳酸氫鈉水溶液調節，使漿液pH值為7.5；水洗5次，離心脫水；
5)將步驟4)所得的濾餅烘干、粉碎至500目，得到一種載銅硅酸鹽抗菌劑。
將64頭體重7.8kg左右的“杜長大”三元雜交仔豬按飼養試驗要求分成2組，每組設4個重復，每個重復8頭，分別飼喂含0和0.10％載銅硅酸鹽抗菌劑的飼糧，自由采食和飲水，試驗期50天。記錄腹瀉情況、耗料量、空腹始重和終重。飼養試驗結束后，每組選體重相近8頭豬(每個重復2頭，公母各半)屠宰，無菌采取結腸內容物，待進行大腸桿菌分析；取0.5cm×0.5cm的中部空腸一段，用0.9％NaCl將其沖洗干凈，平鋪在濾紙上將液體吸干，爾后浸入甲醛固定液，待光鏡分析用。結果表明，在對照日糧中添加0.10％載銅硅酸鹽抗菌劑使仔豬日增重提高了10.2％(P＜0.01)，料重比下降了7.5％(P＜0.05)，對日采食無顯著影響；顯著降低了仔豬腹瀉率，使仔豬平均腹瀉率比對照組降低了55.8％(P＜0.01)；使結腸內容物中大腸桿菌顯著下降(P＜0.01)；使空腸絨毛高度和絨毛高度/腺窩深度的比率分別提高了21.3％(P＜0.05)和32.5％(P＜0.01)。
權利要求
1.一種載銅硅酸鹽抗菌劑的制備方法，其特征在于方法的步驟如下1)將蒙脫石礦物，連同相當于礦物重量5％～15％的氯化鈉，加水攪拌均勻，制成濃度為10％～20％的懸浮液礦漿，室溫鈉化10～15小時，水洗5～7次，用水重新制成濃度為10％～20％的礦漿；2)將相當于蒙脫石礦物重量0.5％～5％的殼聚糖溶解在體積分數為1～5％的醋酸或鹽酸水溶液中，配成殼聚糖重量比含量為0.1～5g/100mL的殼聚糖酸溶液，于攪拌下將殼聚糖酸溶液緩慢加入步驟1)的礦漿中，連續攪拌反應5～10小時，反應溫度為20℃～70℃；3)將含銅量為蒙脫石礦物重量1～6％的銅鹽，于攪拌下緩慢加入步驟2)的礦漿中，檢測并調節礦漿的pH值為3.5～6.5，室溫反應5～10小時；4)檢測步驟3)礦漿的pH值，用堿性溶液調節，使漿液pH值為7.0～8.5；水洗3～7次，過濾或離心脫水；5)將步驟4)所得的濾餅烘干、粉碎至大于300目，得到一種載銅硅酸鹽抗菌劑。
2.根據權利要求1所述的一種載銅硅酸鹽抗菌劑的制備方法，其特征在于所說的殼聚糖為分子量為2～80kDa、脫乙酰度為80～95％的殼聚糖。
3.根據權利要求1所述的一種載銅硅酸鹽抗菌劑的制備方法，其特征在于所說的銅鹽為氯化銅、硝酸銅、硫酸銅或者其水合物。
4.根據權利要求1所述的一種載銅硅酸鹽抗菌劑的制備方法，其特征在于所說的堿性溶液為濃度為0.5～10moL/L的氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸氫鈉或碳酸氫鉀的水溶液。
5.一種如權利要求1所述的一種載銅硅酸鹽抗菌劑的用途，其特征在于它用作畜禽、水產動物、牛羊的飼料添加劑。
全文摘要
本發明公開了一種載銅硅酸鹽抗菌劑的制備方法和用途。其制備方法的步驟如下1)蒙脫石鈉化；2)鈉化蒙脫石負載殼聚糖；3)蒙脫石殼聚糖復合物負載銅；4)濾餅烘干、粉碎。本發明的載銅硅酸鹽抗菌劑可用作畜禽、水產動物、牛羊的飼料添加劑，具有抗菌作用強、細菌不易產生耐藥性、使用安全等特點，能有效抑制動物腸道病原菌的增殖，保護腸粘膜免受病原菌的侵襲，使腸粘膜始終處于健康狀態，以益于消化酶的分泌和飼料養分的消化，顯著提高動物成活率、降低動物腹瀉、提高生產性能，可替代抗生素和抗菌藥物，生產無抗生素殘留的動物產品，推動養殖業的綠色化進程。
文檔編號A61K33/34GK1826898SQ20061005024
公開日2006年9月6日 申請日期2006年4月7日 優先權日2006年4月7日
發明者夏枚生, 胡彩虹, 趙文艷 申請人:浙江大學