專利名稱：多肽有機化合物及其在異種移植中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬有機化合物，主要涉及多肽類有機化合物，尤其是關于人工合成的多肽有機化合物及其在異種移植中的應用。
背景技術：
醫學技術的進步使人類同種器官移植成為了可能。由于人體器官的來源不足，大量的病人得不到急需的器官，利用豬的器官代替人體器官是目前研究的熱點。但由于豬的細胞表面存在異種抗原表位Gal-α-1，3-Gal能與人體內預存的天然抗體結合產生超急性排斥反應，從而導致異種器官移植的失敗。人們在努力尋找一種方法可以封閉或清除人天然抗α-Gal抗體，為異種器官移植開辟途徑。噬菌體展示技術是一種能夠篩選與靶分子結合的特異性多肽的有力工具，已成功運用于抗原表位，特異性受體激動劑或抑制劑和疫苗的研究。在本實驗中我們利用噬菌體展示技術，對兩種肽庫，線性7肽庫和C7C文庫，進行了親和篩選。線性7肽庫中展示的多肽沒有結構限制，具有相對柔性的結構。C7C肽庫展示的多肽由于有一對二硫鍵的限制而形成環狀，構象相對穩定。同時采用兩種肽庫進行篩選，目的在于比較由于結構不同而造成的篩選出的多肽在氨基酸序列上的差異。由于抗B型血單克隆抗體有結合α-Gal抗原表位的特性，因此我們以抗B型血單克隆抗體為靶分子，篩選出能夠模擬α-Gal抗原表位的多肽，可以特異地阻斷天然抗α-Gal抗體，可以用于異種器官移植超急性排斥反應。
目前臨床常用的免疫抑制劑有環孢素A、糖皮質激素、硫唑嘌呤、環磷酰胺等，可以降低整體的免疫反應，但對異種器官移植超急性排斥反應無效，并且有多種副作用，如常見的就有骨髓抑制、肝腎毒性、上消化道出血、脫發等等。我們篩選到的多肽化合物可以特異地阻斷異種器官移植超急性排斥反應，但不影響人體的整體免疫反應，可避免常用免疫抑制劑引起的副作用。
發明內容
本發明的目的是克服目前臨床上異種器官移植術中出現的排斥反應，設計并提供一種多肽有機化合物。
本發明提供的多肽有機化合物，選自a、b、c、d、e、f、g、h八種中的一種，能與抗B型血單克隆抗體特異性結合，溶于水，各氨基酸之間通過肽鍵相連。
本發明提供的多肽有機化合物a的氨基酸序列為Phe-His-Glu-Asn-Trp-Pro-Ser，分子量為915.96；多肽有機化合物b的氨基酸序列為Phe-His-Glu-Phe-Trp-Pro-Thr，分子量為963.06；多肽有機化合物c的氨基酸序列為Ser-Met-Leu-Asp-Thr-Pro-Thr，分子量為763.86；多肽有機化合物d的氨基酸序列為Cys-Leu-Pro-Thr-Ile-Thr-Asn-Thr-Cys，(其中第1位的Cys與第9位的Cys之間形成二硫鍵)，分子量為963.15；多肽有機化合物e的氨基酸序列為Cys-His-Ile-Leu-Gly-Ser-Thr-Ala-Cys，(其中第1位的Cys與第9位的Cys之間形成二硫鍵)，分子量為902.07；多肽有機化合物f的氨基酸序列為Cys-His-Pro-Thr-Trp-Ser-Ser-Leu-Cys，(其中第1位的Cys與第9位的Cys之間形成二硫鍵)，分子量為1031.18；多肽有機化合物g的氨基酸序列為Cys-His-Gln-Thr-Pro-Leu-Ser-Thr-Cys，(其中第1位的Cys與第9位的Cys之間形成二硫鍵)，分子量為987.13；多肽有機化合物h的氨基酸序列為Cys-Lys-Pro-Thr-Ser-Thr-Leu-Thr-Cys，(其中第1位的Cys與第9位的Cys之間形成二硫鍵)，分子量為951.14。
本發明的第二個目的是提供多肽有機化合物a、b、c、d、e、f、g、h在制備治療器官移植術中控制異種移植中超急性排斥反應的藥物中的應用。
本發明的優點有①本發明的多肽有機化合物，由于分子組成只有7～9個氨基酸，故可以用人工化學合成方法大量合成，可以得到大量較純的小肽。
②能與人體內預存的抗豬抗原的抗體特異性結合，從而封閉它的作用，可以抑制豬器官移植至人體時發生的超急性排斥反應。
③本發明的多肽有機化合物與人體內預存的天然抗α-Gal抗體的結合位點是特異性的，正好起到封閉抗體作用，從而避免了由于作用位點特異性不強而帶來的副作用。
④由于本發明的多肽有機化合物的組成氨基酸數量較少，開發成藥物后容易被機體利用而起效。
圖1為三種線性多肽與水蘇糖競爭性與抗B單克隆抗體結合的ELISA抑制率曲線圖。
圖2為五種C7C環肽與水蘇糖競爭性與抗B單克隆抗體結合的ELISA抑制率曲線圖。
圖3為多肽化合物抑制人天然抗體引起的豬紅細胞的凝集反應結果圖。
具體實施例方式
本發明結合以下實施例及附圖作進一步說明。
實施例1用抗B型血單克隆抗體作為靶蛋白，用噬菌體展示技術篩選得到陽性噬菌體克隆。
噬菌體展示技術是利用分子生物學技術將合成的一組一定長度的隨機序列寡核苷酸片段克隆到特定表達載體中，使其表達產物以融合蛋白的形式呈現在噬菌體表面。由于肽庫中包含了該長度小肽的所有可能的氨基酸排列順序，每一個噬菌體表面蛋白呈現其中的一種肽段，便于篩選；篩選到的噬菌體，可以通過細菌擴增。用噬菌體肽庫感染大腸桿菌，使重組入噬菌體的隨機的寡核苷酸片段在大腸桿菌內復制，并在噬菌體的外殼蛋白中表達出來。然后，把靶蛋白包被在酶標板上。用此噬菌體肽庫與靶蛋白混合后，洗板。如果噬菌體上的外殼蛋白能與靶蛋白結合，就不會被洗掉。最后用酸或親和洗脫液把噬菌體洗脫下來。連續這樣篩3-4輪，就能篩出與靶蛋結合力較強的噬菌體。測此噬菌體的DNA序列得到重組寡核苷酸的序列，亦知道了相應的多肽的序列。然后可通過人工化學合成的方法得到多肽。
本發明提供的多肽有機化合物，包括a、b、c、d、e、f、g、h八種，能與抗B型血單克隆抗體特異性結合，溶于水，各氨基酸之間通過肽鍵相連。
本發明提供的多肽有機化合物a的氨基酸序列為Phe-His-Glu-Asn-Trp-Pro-Ser，分子量為915.96；多肽有機化合物b的氨基酸序列為Phe-His-Glu-Phe-Trp-Pro-Thr，分子量為963.06；多肽有機化合物c的氨基酸序列為Ser-Met-Leu-Asp-Thr-Pro-Thr，分子量為763.86；多肽有機化合物d的氨基酸序列為Cys-Leu-Pro-Thr-Ile-Thr-Asn-Thr-Cys，(其中第1位的Cys與第9位的Cys之間形成二硫鍵)，分子量為963.15；多肽有機化合物e的氨基酸序列為Cys-His-Ile-Leu-Gly-Ser-Thr-Ala-Cys，(其中第1位的Cys與第9位的Cys之間形成二硫鍵)，分子量為902.07；多肽有機化合物f的氨基酸序列為Cys-His-Pro-Thr-Trp-Ser-Ser-Leu-Cys，(其中第1位的Cys與第9位的Cys之間形成二硫鍵)，分子量為1031.18；多肽有機化合物g的氨基酸序列為Cys-His-Gln-Thr-Pro-Leu-Ser-Thr-Cys，(其中第1位的Cys與第9位的Cys之間形成二硫鍵)，分子量為987.13；多肽有機化合物h的氨基酸序列為Cys-Lys-Pro-Thr-Ser-Thr-Leu-Thr-Cys，(其中第1位的Cys與第9位的Cys之間形成二硫鍵)，分子量為951.14。
實施例2水蘇糖競爭性ELISA實驗試驗方法在96孔酶標板中包被100μl抗B型血單克隆抗體4℃過夜，用5％BSA 37℃封閉2小時，然后用TBS洗板3次，加入100μl陽性噬菌體和終濃度分別為100、20、4、0.8、0.16、0.032mM的水蘇糖混合液反應1小時，另設不加水蘇糖的陽性噬菌體液作為空對照。用含0.1％Tween 20的TBS洗板6次，加入100μl辣根過氧化物酶標記抗M13抗體，結合1小時，用含0.1％Tween 20的TBS洗板6次，TMB進行顯色，用酶標儀測定吸光度。計算抑制率按照公式[A450(-s)-A450(+s)]/A450(-s)×100％，A450(-s)為未加水蘇糖的吸光度，A450(+s)為加入水蘇糖的吸光度。
試驗結果水蘇糖能有效的抑制多肽與抗體的結合，說明水蘇糖與多肽結合于抗體的同一位置，即α-Gal抗原表位結合位點。這說明了陽性克隆很可能就結合在水蘇糖與抗B型血單克隆抗體結合的位點。結果參見圖1，2，。實驗發現，總體來說，水蘇糖對環肽比線性多肽抑制率要高，說明篩選的線性多肽比環狀多肽對抗體的親和力強。
以上實例說明了多肽有機化合物與抗B單克隆抗體的結合位點(α-Gal結合位點)是特異性的，正好起到封閉抗B單克隆抗體作用，從而避免了由于作用位點特異性不強而帶來的副作用。
實施例3多肽抑制人血清與豬紅細胞的凝集反應試驗方法先把制備好的新鮮1％豬紅細胞懸浮在pH 7.4的磷酸鹽緩沖液中備用。在U型血凝板的孔里，40μl多肽用磷酸緩沖液依次逐孔倍比稀釋后，每孔分別加入40μl適當稀釋的A型人血清和40μl 1％的豬紅細胞。然后把此的混合液在室溫下先用震蕩器震蕩1分鐘，再靜置1小時后觀察凝集結果。如果紅細胞沉淀到孔的底部，呈一邊緣光滑的圓點，則此為沒有凝集。如果紅細胞形成一網絡，并不下沉到孔底呈一邊緣光滑的圓點，此為出現凝集。試驗設空、陽性和陰性對照。
試驗結果此多肽預先能與A型人血清中的抗α-Gal抗體結合，使其失活。這樣此抗體就不能再與豬紅細胞上的Gal-α-1，3-Gal抗原結合，從而阻斷人抗α-Gal抗體引起的豬紅細胞凝集反應。結果參見圖3。在圖3中，A1～A2，H1～H2，01～02均是空白對照，用40μl 1％的豬紅細胞和80μl磷酸鹽緩沖液混勻后靜置1小時，紅細胞沉于凝集板底部，出現光滑圓點，此結果表明沒有出現凝集。A3～A4，H3～H4，03～04為陽性對照，用40μl 1％的豬紅細胞，40μl1％人血清，和40μl磷酸鹽緩沖液混勻后靜置1小時，紅細胞沒有下沉呈現光滑圓點，而是呈現網絡狀結構，出現凝集。B，B’兩條均為水蘇糖抑制豬紅細胞凝集實驗的結果，在1～4孔中依次加入了40μl用磷酸鹽緩沖液稀釋的不同濃度的水蘇糖(濃度依次為200mM，40mM，8mM，1.6mM)，然后加入40μl 1％的豬紅細胞和40μl 1％人血清，混勻后靜置1小時。B1～B2、B’1～B’2沒有出現凝集，B3、B’3開始有網絡狀結構出現，有明顯凝集的現象，說明水蘇糖能抑制由人天然抗α-Gal抗體誘發的豬紅細胞凝集。C1-4和C’1-4為噬菌體展示肽a抑制豬紅細胞凝集實驗的結果，在1～4孔中依次加入了用磷酸鹽緩沖液稀釋的不同濃度的噬菌體(濃度依次為0.1mM，0.02mM，0.004mM，0.0008mM)40μl，再加入40μl 1％的豬紅細胞和40μl 1％人血清，混勻后靜置1小時。C1，C’1沒有出現凝集，C2，C’2開始有網絡狀結構出現，有明顯凝集的現象。E1-4和E’1-4，I1-4和I’1-4，J1-4和J’1-4，K1-4和K’1-4，L1-4和L’1-4，M1-4和M’1-4，P1-4和P’1-4，Q1-4和Q’1-4，分別是噬菌體展示肽b，h，e，k，d，g，c，f的實驗結果，實驗方法和噬菌體濃度如前。除了噬菌體展示肽k(其氨基酸序列為Ser-Ser-Thr-Ile-Ala-Asn-Thr)，各噬菌體克隆均能在0.1mM濃度下有效地抑制凝血，噬菌體展示肽k可能對抗體結合能力不足，未能明顯抑制凝血。G1-4和N1-4為未經過篩選的野生型噬菌體(陰性對照)，分別來自線性7肽庫和C7C肽庫，均出現凝集。D1-4和D’1-4，F1-4和F’1-4，R1-4和R’1-4分別是化學合成的多肽a，b，f的實驗結果，實驗方法如前，多肽濃度均依次為20mM，4mM，0.8mM，0.16mM，可見多肽a和b在濃度為4mM時可抑制凝血，而多肽f需要的濃度是20mM。S1-4為陰性對照，加入的多肽序列為Cys-Val-Gln-Pro-Ser-His-Ser-Ser-Cys，均出現凝集；上述結果重復3次，呈現良好的一致性。
以上實例用形象而直接的方式說明了多肽有機化合物除了能與抗B單克隆抗體結合外，還能與人體內預存的抗豬抗原的抗體(抗α-Gal抗體)特異性結合，從而封閉它的作用，可以抑制人天然抗體(抗α-Gal抗體)觸發的異種移植超急性排斥反應的發生。
無需進一步詳細闡述，相信采用前面所公開的內容，本領域技術人員可最大限度地應用本發明。因此，前面的優選具體實施方案應理解為僅是舉例說明，而非以任何方式限制本發明的范圍。
權利要求
1.一種多肽有機化合物，其特征是提供的多肽有機化合物選自a、b、c、d、e、f、g、h八種中的一種，能與抗B型血單克隆抗體特異性結合，溶于水，各氨基酸之間通過肽鍵相連，其中多肽有機化合物a的氨基酸序列為Phe-Hi s-Glu-Asn-Trp-Pro-Ser，分子量為915.96；多肽有機化合物b的氨基酸序列為Phe-His-Glu-Phe-Trp-Pro-Thr，分子量為963.06；多肽有機化合物c的氨基酸序列為Ser-Met-Leu-Asp-Thr-Pro-Thr，分子量為763.86；多肽有機化合物d的氨基酸序列為Cys-Leu-Pro-Thr-Ile-Thr-Asn-Thr-Cys，其中第1位的Cys與第9位的Cys之間形成二硫鍵，分子量為963.15；多肽有機化合物e的氨基酸序列為Cys-His-Ile-Leu-Gly-Ser-Thr-Ala-Cys，其中第1位的Cys與第9位的Cys之間形成二硫鍵，分子量為902.07；多肽有機化合物f的氨基酸序列為Cys-His-Pro-Thr-Trp-Ser-Ser-Leu-Cys，其中第1位的Cys與第9位的Cys之間形成二硫鍵，分子量為1031.18；多肽有機化合物g的氨基酸序列為Cys-His-Gln-Thr-Pro-Leu-Ser-Thr-Cys，其中第1位的Cys與第9位的Cys之間形成二硫鍵，分子量為987.13；多肽有機化合物h的氨基酸序列為Cys-Lys-Pro-Thr-Ser-Thr-Leu-Thr-Cys，其中第1位的Cys與第9位的Cys之間形成二硫鍵，分子量為951.14。
2.根據權利要求1所述的多肽有機化合物的應用，其特征是在制備治療器官移植術中控制異種移植中超急性排斥反應的藥物中的應用。
全文摘要
本發明提供一種多肽有機化合物，選自a、b、c、d、e、f、g、h八種中的一種，分子量分別為915.96、963.06、763.86、963.15、902.07、1031.18、987.13、951.14，能與抗B型血單克隆抗體特異性結合，溶于水，各氨基酸之間通過肽鍵相連。本發明的多肽有機化合物能與人體內預存的抗豬抗原的抗體特異性結合，從而封閉它的作用；可以特異地阻斷異種器官移植超急性排斥反應，與人體內預存的天然抗α－Gal抗體的結合位點是特異性的，正好起到封閉抗體作用，但不影響人體的整體免疫反應，可避免常用免疫抑制劑引起的副作用。
文檔編號A61K38/08GK1831003SQ20061005016
公開日2006年9月13日 申請日期2006年3月31日 優先權日2006年3月31日
發明者詹金彪, 郎建社, 許林海, 嚴志焜 申請人:浙江大學