專利名稱：具有利膽作用的亮菌甲素琥珀酸單酯及其鹽和藥用組合物的制作方法
技術領域：
本發明屬于醫藥領域，涉及亮菌甲素琥珀酸單酯及其制備方法和用途，同時本發明還涉及亮菌甲素琥珀酸單酯藥學上可接受的鹽及其制備方法和用途，如鉀鹽、鈉鹽、鈣鹽和鎂鹽等，以及與堿性氨基酸形成的鹽包括賴氨酸鹽和精氨酸鹽。藥理實驗表明亮菌甲素琥珀酸單酯具有明顯的利膽作用，以亮菌甲素琥珀酸單酯或其藥學上可接受的鹽為活性成分與相應的藥用敷料組合可制成供口服和靜脈給藥用的制劑，用于急性膽囊炎、慢性膽囊炎急性發作、急性膽道感染(包括結石性、寄生蟲性)和急慢性肝炎的治療。
背景技術：
亮菌甲素是一種香豆素類化合物，是從假密環菌中提取的有效成份之一。研究證實其具有促進膽汁分泌，松弛奧狄氏括約肌，降低十二指腸緊張度，調節膽道系統的壓力，促進膽道內容物排泄，增強吞噬細胞吞噬，促進免疫功能提高，改善肝細胞水腫、壞死和促進受損的肝細胞修復和再生，調節肝功能并促進退黃。臨床研究表明，其對急性膽囊炎的治愈率可達96％，較常規治療更能迅速有效控制膽道感染，減輕病情危重程度，緩解腹痛，減輕患者痛苦，縮短住院時間，在使用過程中未發現其有明顯副作用。在膽道系統感染及胰腺炎的治療中同樣取得滿意的結果(歐新強，臨床薈萃，2002，17(5)282.)。黃疸型肝炎的致病因素很多，包括病毒性肝炎、藥物性肝炎和非嗜肝病毒感染所致的肝損害，其肝功能檢查主要特點是血清膽紅素和轉氨酶升高。黃疽指數越高、病情越重，越易引起肝內膽汁郁積，目前治療的措施為對癥即降低轉氨酶和消退黃疽。亮菌甲素在黃疽型肝炎中降酶、退黃的作用與思美肽(腺苷蛋氨酸)比較，結果表明經過1個月的治療，亮菌甲素和思美膚的降酶、退黃作用相仿，沒有觀察到嚴重的不良反應(周智，賴寧，凌寧等，重慶醫學，2004，33(8)1221-1222.)。亮菌甲素治療黃疽型肝炎，與同期用門冬氨酸鉀鎂比較，發現兩組總療效相似，但顯效亮菌甲素組明顯優于對照組，且降低黃疽幅度亦優于對照組，膽紅素及谷丙轉氨酶復常率亦高于對照組，本組病例未見明顯毒副作用(陳積，海南醫學，2002，13(7)26-27.)。用亮菌甲素治療病毒性肝炎，與一般治療(應用甘利欣、門冬氨酸鉀鎂、還原性谷胱苷肽等)比較，在降低轉氨酶及改善白蛋白方而差別不大，但在消退黃疽和膽汁酸方而有明顯療效，總有效率達78％，比對照組更能改善肝功能，在使用過程中未發現明顯毒副作用(張永紅，何艷，王文龍等，醫學臨床研究，2005，22(11)1634-1635.)。因此，亮菌甲素在臨床應用中表現出較好的療效和安全性，成為一種優良的肝膽用藥。
亮菌甲素在水中幾乎不溶，為滿足臨床用藥需求，常需加丙二醇、聚乙二醇、土溫等增溶劑以提高其在水中的溶解度(鐘桂芳，黑龍江醫藥，2004，17(6)440-441.)。但這些增溶劑的加入或使用不當常會引起毒副作用，降低藥物的安全性。因此，對亮菌甲素進行結構改造，在保持其藥理活性同時，改善水溶性，對提高其臨床用藥的安全性具有重要的意義。
發明內容
本發明的目的是提供一種具有明顯利膽作用且具有一定水溶性的可用于急性膽囊炎、慢性膽囊炎急性發作、急性膽道感染(包括結石性、寄生蟲性)和急慢性肝炎的治療的化合物及這種化合物的制備方法和用途，以及這種化合物藥學上可接受的鹽及其制備方法和用途，如鉀鹽、鈉鹽、鈣鹽和鎂鹽等，以及與堿性氨基酸形成的鹽包括賴氨酸鹽和精氨酸鹽。
本發明具體提供了一種新型的化合物亮菌甲素琥珀酸單酯，化學名為4-(3-乙酰基-7-羥基-2-氧代-2H-色烯-5-基)甲氧基-4-氧代丁酸，其結構式為 分子式為C16H14O8，分子量為334.28。
同時本發明提供了一種上述亮菌甲素琥珀酸單酯的制備方法，其特征在于以亮菌甲素為原料，琥珀酸酐等為酰化劑，在堿存在條件下，于溶劑中進行酰化反應制得，反應式為
酰化反應的溫度為25℃～150℃；亮菌甲素與琥珀酸酐用量摩爾比為1∶1～5；亮菌甲素與堿用量摩爾比為1∶1～5；所用的堿為碳酸鉀、碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、氫氧化鉀或氫氧化鈉等；所用溶劑為N，N-二甲基甲酰胺、乙酸乙酯、四氫呋喃、甲醇、乙醇等或它們的混合溶劑。
本發明所提供的亮菌甲素琥珀酸單酯具有利膽作用，可用于制備用于急性膽囊炎、慢性膽囊炎急性發作、急性膽道感染、急慢性肝炎的治療的藥物。
本發明還提供了上述亮菌甲素琥珀酸單酯的藥學上可接受的鹽，包括鉀鹽、鈉鹽、鈣鹽、鎂鹽、或者與堿性氨基酸形成的鹽包括賴氨酸鹽和精氨酸鹽。
本發明所提供的上述亮菌甲素琥珀酸單酯的藥學上可接受的鹽可以采用如下方法制備，將亮菌甲素琥珀酸單酯與相應的堿進行反應得到；所用的堿為碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、或堿性氨基酸，所用的溶劑為水、乙醇、四氫呋喃、甲醇、丙酮等或它們的混合溶劑。
本發明提供的亮菌甲素琥珀酸單酯的藥學上可接受的鹽同樣具有利膽作用，可以用于制備可用于急性膽囊炎、慢性膽囊炎急性發作、急性膽道感染、急慢性肝炎的治療的藥物。
最后，本發明提供了一種具有利膽作用的藥用組合物，其特征在于以亮菌甲素琥珀酸單酯或其藥學上可接受的鹽為活性成分，與相應的藥用敷料組合制成供口服和靜脈給藥用的制劑，包括片劑、膠囊劑、顆粒劑、口服液以及注射液和凍干粉針劑，單位制劑活性成分的含量為1～50mg。
為解決亮菌甲素水溶性差的問題，本發明采用了前藥的藥物設計方法，用琥珀酸酐將其結構中的羥甲基酰化制成琥珀酸單酯，這樣可有效改善其水溶性，制成相應的鹽可使水溶性進一步提高，從而有效解決了上述問題。另外，文獻報道亮菌甲素在體內的代謝速度較快(姚勤學，山西醫藥雜志，1988，17(1)57-58.)，因此需多次給藥。轉變成前藥后可有效地改善其藥代動力學性質，延長在體內的作用時間，從而減少給藥次數，可為臨床提供一個新型安全有效的藥物。
具體實施例方式實施例1亮菌甲素琥珀酸單酯的制備(方法1)將亮菌甲素20g(0.085mol)、無水碳酸鉀46.9g(0.34 mol)、乙酸乙酯300ml和無水N，N-二甲基甲酰胺100ml加入到500ml圓底燒瓶中，油浴109℃回流1小時。反應液漸有黃色固體析出。將丁二酸酐34g(0.34mol)加入，反應液中固體部分溶解，回流反應30小時，冷至室溫，抽濾，所得固體用少量乙酸乙酯洗滌，濾餅溶于適量水中，用10％鹽酸調至PH3.5，攪拌0.5小時，抽濾得部分產品。濃縮濾液回收乙酸乙酯，濃縮液加水200ml，用10％鹽酸調到PH3.5，攪拌0.5小時，抽濾得部分產品。合并兩次所得產品，室溫自然干燥得粗品24g，收率84％。將24g粗品加入到130ml乙酸乙酯和40ml甲醇的混和溶劑中，加熱回流至全溶，緩慢攪拌下降至室溫，放置過夜，析出淡黃色固體，抽濾，真空50℃干燥4小時得淡黃色粉末狀固體15.6g，mp 173-175℃，收率65％。
ESI-MSm/z 333[M-1]-′H-NMR(CD3COCD3，600MHz)δ2.58(s，3H)，2.63(m，2H)，2.66(m，2H)，5.44(s，2H)，6.76(d，1H)，7.00(d，1H)，8.63(1，1H)。
13C-NMR(CD3COCD3，600MHz)δ29.07，29.60，30.29，63.17，102.92，110.54，115.67，121.01，139.37，144.35，159.25，159.63，164.04，172.43，173.50，195.17。
亮菌甲素琥珀酸單酯的制備(方法2)將亮菌甲素2.34g(0.01mol)、碳酸氫鈉3.36g(0.04mol)、丁二酸酐4g(0.04mol)、乙酸乙酯30ml和無水N，N-二甲基甲酰胺15ml加入到100ml圓底燒瓶中，攪拌下油浴109℃回流反應24小時。將反應液濃縮至剩余五分之一，加入60ml水，抽濾，將濾液用稀鹽酸調PH至3-3.5，析出淡黃色固體，抽濾，水洗濾餅，干燥得產品2.7g，收率80％。
對所得產品進行藥理和藥效學試驗，結果如下藥理試驗(亮菌甲素琥珀酸單酯以代號LMJG表示)一、急性毒性試驗(LD50的測定)實驗材料及方法1.受試藥物LMJG。
2.受試動物KM小鼠，體重18～20g，40只，雌雄各半，由沈陽藥科大學實驗動物中心提供，合格證號碼SCXK(遼)2003-008。實驗開始前一周接收動物使其適應環境，對一般體征進行觀察，選用健康狀況良好的動物供實驗使用。
動物在條件設定為溫度22±2℃，濕度55±10％，照明時間為7時至19時的飼養室飼養，每5只一籠(同性)，固體飼料及飲水自由攝取。
3.給藥方法及給藥量采用灌胃方式給藥，將藥物加到2％羧甲基纖維素鈉溶液中配成0.05g/ml的懸濁液，以最大給藥體積0.4ml/10g給藥。
4.觀察及檢查項目①一般狀態給藥當天頻繁觀察，以后每天至少觀察一次，時間為2周，記錄小鼠死亡情況及一般狀態。
②體重及攝食、攝水量給藥當天及給藥后每天測體重、食量、水重。攝食量、攝水量為每籠飼養的5只小鼠的平均值。
③病理學檢查解剖死亡小鼠，檢查其是否有病理學異常。
實驗結果1.一般狀態及死亡情況給藥后小鼠在10分鐘內出現活動減少現象，很快恢復，無見其它異常情況。40只全部存活。
2.體重及攝食攝水量小鼠給藥后2周內攝食、攝水量正常，體重增加正常，大小便正常，毛色正常，口、鼻、眼、外耳等處無異常分泌物，呼吸均勻，反應正常，活動良好。
3.最大耐受量由以上結果可知，LMJG的LD50＞2g/kg。
提示LMJG安全、低毒。
二、藥效學試驗實驗材料1、受試藥物LMJG；亮菌甲素2、受試動物健康成年雜種家犬，體重8～15kg，雌雄兼用；SD大鼠，體重280～300g，雌雄各半。以上動物均由沈陽藥科大學實驗動物中心提供，合格證號碼SCXK(遼)2003-008。
3、實驗試劑與試藥戊巴比妥鈉北京化學試劑公司，批號020919。
氯化鈉注射液沈陽志英制藥廠產品，批號06050801總膽紅素試劑盒南京建成生物工程研究所，批號20060615。
4、實驗儀器722光柵分光光度計 上海第三分析儀器廠TG-328A電光分析天平上海天平儀器廠T-500型電子天平常熟雙杰測試儀器廠100μL微量進樣器 寧波市鎮海玻璃儀器廠實驗方法與結果1.對膽汁分泌比率的影響將健康雄性大鼠隨機分為五組，每組10只NS對照組，亮菌甲素組(30mg/kg)，LMJG高劑量組(135mg/kg)，中劑量組(45mg/kg)和低劑量組(15mg/kg)。實驗前禁食不禁水12h，實驗時腹腔注射3％戊巴比妥鈉(4ml/kg)進行麻醉后，行腹部手術，在十二指腸降部腸系膜處分離膽管，結扎乳頭部，向肝臟方向插入1mm的塑料導管引流并收集1h內膽汁的流量。按10ml/kg進行十二指腸給藥(對照組給等體積的NS)，收集給藥后1、2、3h的膽汁流量(用100μL微量進樣器測量各大鼠各次所收集的膽汁量并記錄)，計算膽汁分泌比率(給藥后每1小時膽汁分泌量/給藥前1小時膽汁分泌量)。膽汁分泌增加率(％)＝(D-C)/C×100％，D＝給藥組給藥后每1小時膽汁分泌量/給藥組給藥前1小時膽汁分泌量，C＝對照組給藥后每1小時膽汁分泌量/對照組給藥前1小時膽汁分泌量，實驗數據均采用student’s t-test進行統計學處理。
實驗結果表明，LMJG高、中、低劑量組及亮菌甲素組給藥后，肝臟分泌膽汁量均有明顯增加(P＜0.01，P＜0.05)。LMJG高劑量組在各時間點的增加率分別為42.1％、40.3％、31.1％，而亮菌甲素組在各時間點的增加率則為40.2％、33.7％、20.6％，提示LMJG的增加膽汁分泌作用較亮菌甲素強，維持時間較長。結果見表1。
表1 LMJG對大鼠膽汁分泌比率的影響
素
注與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
2．對膽汁膽紅素含量的影響按照總膽紅素試劑盒的方法，于實驗終點分別將末次膽汁與給藥前的膽汁于722分光光度計測定膽汁中總膽紅素的含量，并計算給藥前后膽汁中總膽紅素的比值變化(給藥后的膽紅素含量/給藥前膽紅素的含量)。實驗數據均采用student’st-test進行統計學處理。
實驗結果表明，LMJG高、中、低劑量組及亮菌甲素組給藥后當膽汁分泌量增加時，單位時間排出的膽紅素則有明顯增加(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001)。結果見表2。
表2 LMJG對大鼠膽汁膽紅素含量的影響(
，n＝10)
注與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
3.對麻醉犬總膽管末端括約肌緊張度的影響實驗用犬，體重8～15kg，隨機分為4組，每組6只即亮菌甲素組(9mg/kg)，LMJG高劑量組(45mg/kg)，中劑量組(15mg/kg)和低劑量組(5mg/kg)。3％戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉。開腹，結扎膽囊膽管，引流總膽管內膽汁。通過總膽管至十二指腸灌流0.9％NaCl溶液，記錄單位時間內灌流液流過的滴數，測定總膽管末端括約肌的緊張度。
實驗結果表明，LMJG高、中、低劑量組及亮菌甲素組給藥后均可使流經總膽管末端括約肌的灌流液滴數明顯增加，劑量增加，效應增加，持續時間較長。提示受試藥物對總膽管末端括約肌具有松弛效應。結果見表3。
表3 LMJG對麻醉犬總膽管末端括約肌緊張度的影響
注與亮菌甲素組比較，**P＜0.01。
利膽實驗結果提示，LMJG具有顯著的利膽作用。LMJG給藥后能明顯增加膽汁分泌量，促進膽汁中膽紅素的排泄，降低總膽管末端括約肌(奧狄氏括約肌)的緊張度，且低、中、高劑量之間存在一定的劑量關系。LMJG中劑量組與亮菌甲素組相比較效果相接近，LMJG高劑量組比亮菌甲素組作用更強，持續時間更長。
實施例2亮菌甲素琥珀酸單酯鈉的制備將1.67g(5mmol)亮菌甲素琥珀酸單酯溶于60ml甲醇中，攪拌下于室溫加入0.42g(5mmol)碳酸氫鈉粉末，室溫攪拌20分鐘后析出大量黃綠色固體，繼續攪拌反應3小時，抽濾，濾餅用少量甲醇洗滌，真空干燥后得測得黃綠色粉末狀固體1.44g，mp197-198.5℃，收率81％。
實施例3亮菌甲素琥珀酸單酯賴氨酸鹽的制備將1.67g(5mmol)亮菌甲素琥珀酸單酯溶于30ml四氫呋喃中，攪拌下于室溫加入 0.82g(5mmol)賴氨酸，室溫下攪拌反應12小時，快速抽濾得淡黃色固體，立即轉入真空干燥器，50℃真空干燥4小時得產品 2.2g，mp175-177℃，收率90％。
實施例4亮菌甲素琥珀酸單酯注射液的制備處方亮菌甲素琥珀酸單酯7.5g賴氨酸3.3g氯化鈉18.0g注射用水 加至2000ml------------------------------------------制成1000支制備工藝
稱取處方量的氯化鈉和賴氨酸，加入1800ml注射用水，攪拌使溶解。另稱取處方量的亮菌甲素琥珀酸單酯，加至上述溶液中攪拌使溶解制成澄明溶液，加1.8g活性炭，60℃攪拌吸附20分鐘，過濾脫炭使藥液澄明，加入注射用水至全量，攪拌均勻，0.45m微孔濾膜過濾，分裝于安瓶中每支2ml，封口，100℃流通蒸汽滅菌30分鐘，即得。
實施例5注射用硫普羅寧賴氨酸的制備處方亮菌甲素琥珀酸單酯7.5g賴氨酸3.3g甘露醇100g------------------------------------------------制成1000支制備工藝稱取處方量的主藥、賴氨酸及甘露醇倒入1800mL注射用水中，攪拌至全部溶解。加1.8g活性炭，60℃攪拌吸附20分鐘，過濾脫炭使藥液澄明，加入注射用水至全量，攪拌均勻，0.22um膜過濾。罐裝，凍干，軋蓋即可(2mL/支)。
實施例6亮菌甲素琥珀酸單酯片劑的制備處方亮菌甲素琥珀酸單酯 7.5g乳糖 114g微晶纖維素 142g羧甲基淀粉鈉 24g硬脂酸鎂 5g------------------------------------------制成 1000片包衣液處方歐巴代(03B28796) 21g95％乙醇 適量------------------------------------------制成約430ml制備工藝將已過100目篩的輔料與主藥過60目篩混合，以95％乙醇制軟材，以18目篩制粒，60℃通風干燥，以16目篩整粒后與硬酯酸鎂混合均勻，打片。
包衣溶液的配制在適宜容器中加入適量的95％乙醇，開動攪拌機，將處方量的歐巴代固體粉末均勻地加入到旋渦中，同時盡量避免有粉末飄浮在液體表面，必要時，可以提高轉速以保持適當的旋渦，待所有的歐巴代全部加入后，降低攪拌速度，使旋渦消失，繼續攪拌45min，即得。
薄膜包衣片的制備將片芯置包衣鍋內，保持溫度60℃±5℃，進行包衣，即得。
權利要求
1.亮菌甲素琥珀酸單酯，化學名為4-(3-乙酰基-7-羥基-2-氧代-2H-色烯-5-基)甲氧基-4-氧代丁酸，其結構式為 分子式為C16H14O8，分子量為334.28。
2.一種權利要求1所述亮菌甲素琥珀酸單酯的制備方法，其特征在于以亮菌甲素為原料，琥珀酸酐為酰化劑，在堿存在條件下，于溶劑中進行酰化反應制得，反應式為 酰化反應的溫度為25℃～150℃；亮菌甲素與琥珀酸酐用量摩爾比為1∶1～5；亮菌甲素與堿用量摩爾比為1∶1～5；所用的堿為碳酸鉀、碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、氫氧化鉀或氫氧化鈉；所用溶劑為N，N-二甲基甲酰胺、乙酸乙酯、四氫呋喃、甲醇、乙醇或它們的混合溶劑。
3.權利要求1所述的亮菌甲素琥珀酸單酯用于制備具有利膽作用，可用于急性膽囊炎、慢性膽囊炎急性發作、急性膽道感染、急慢性肝炎的治療的藥物。
4.權利要求1所述亮菌甲素琥珀酸單酯的藥學上可接受的鹽，包括鉀鹽、鈉鹽、鈣鹽、鎂鹽、或者與堿性氨基酸形成的鹽。
5.一種權利要求4所述亮菌甲素琥珀酸單酯的藥學上可接受的鹽的制備方法，其特征在于將亮菌甲素琥珀酸單酯與相應的堿進行反應得到；所用的堿為碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、或堿性氨基酸，所用的溶劑為水、乙醇、四氫呋喃、甲醇、丙酮或它們的混合溶劑。
6.權利要求4所述的亮菌甲素琥珀酸單酯的藥學上可接受的鹽用于制備具有利膽作用，可用于急性膽囊炎、慢性膽囊炎急性發作、急性膽道感染、急慢性肝炎的治療的藥物。
7.一種具有利膽作用的藥用組合物，其特征在于以亮菌甲素琥珀酸單酯或其藥學上可接受的鹽為活性成分，與相應的藥用敷料組合制成供口服和靜脈給藥用的制劑，包括片劑、膠囊劑、顆粒劑、口服液以及注射液和凍干粉針劑，單位制劑活性成分的含量為1～50mg。
全文摘要
本發明涉及亮菌甲素琥珀酸單酯及其制備方法和用途，亮菌甲素琥珀酸單酯可由亮菌甲素與琥珀酸酐進行酰化反應得到；同時本發明還涉及亮菌甲素琥珀酸單酯藥學上可接受的鹽及其制備方法和用途，如鉀鹽、鈉鹽、鈣鹽和鎂鹽等，以及與堿性氨基酸形成的鹽包括賴氨酸鹽和精氨酸鹽。藥理實驗表明亮菌甲素琥珀酸單酯具有明顯的利膽作用，以亮菌甲素琥珀酸單酯或其藥學上可接受的鹽為活性成分與相應的藥用敷料組合可制成供口服和靜脈給藥用的制劑，用于急性膽囊炎、慢性膽囊炎急性發作、急性膽道感染(包括結石性、寄生蟲性)和急慢性肝炎的治療。
文檔編號A61P1/16GK1935802SQ20061004782
公開日2007年3月28日 申請日期2006年9月21日 優先權日2006年9月21日
發明者王紹杰 申請人:王紹杰