專(zhuān)利名稱(chēng)：分選蛋白snx10抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的用途的制作方法
分選蛋白SNX10抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的用途 [技術(shù)領(lǐng)域]
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)涉及人分選蛋白基因、 含有該基因的重組載體、用該載體轉(zhuǎn)化的宿主，以及利用轉(zhuǎn)化體生產(chǎn) 的該基因的表達(dá)產(chǎn)物及其應(yīng)用。
分選蛋白(SNX)是一類(lèi)與膜受體轉(zhuǎn)運(yùn)及胞內(nèi)蛋白分選相關(guān)的蛋 白，主要負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)與分選，參與細(xì)胞膜蛋白內(nèi)吞和蛋 白運(yùn)輸?shù)戎匾^(guò)程。研究表明，SNXs能和多種重要的細(xì)胞膜受體及 酶相互作用，從而影響細(xì)胞的正常功能。SNXs家族蛋白在結(jié)構(gòu)上都 含有一個(gè)保守的PX結(jié)構(gòu)域，包含100-130個(gè)氨基酸，可以與磷脂酰 肌醇磷酸、磷脂酰肌醇一3 —磷酸結(jié)合，使得SNX蛋白定位于細(xì)胞內(nèi) 吞途徑的膜上。SNX家族的基因存在于酵母和多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞中， 其中在人和小鼠中已經(jīng)査明共有30多個(gè)不同的SNXs。有研究表明， SNXs家族蛋白可參與表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、血小板源生長(zhǎng)因子、 胰島素及瘦素受體(L印tin Rec印tor)等蛋白的內(nèi)吞、轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程， 因此預(yù)計(jì)可以影響癌癥、血液系統(tǒng)疾病、肥胖(醫(yī)源性或遺傳性)的 發(fā)生、發(fā)展和治療。目前，大部分SNXs蛋白功能還不清楚，大部分
是未知功能的基因，這些蛋白的結(jié)構(gòu)和生理功能的研究還有待于進(jìn)一
步的開(kāi)展。申請(qǐng)人對(duì)SNX10在結(jié)構(gòu)和功能方面進(jìn)行了全面而系統(tǒng)的 研究(序列結(jié)構(gòu)見(jiàn)序列表)。發(fā)現(xiàn)SNX10的表達(dá)主要集中在血液系 (全血)、神經(jīng)系統(tǒng)(包括腦部、脊髓、神經(jīng)元等)、免疫細(xì)胞(B 細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、骨髓細(xì)胞等)、胰島及直腸腺癌中 表達(dá)量較高(
圖1);同時(shí)，SNX10在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)涵體動(dòng)態(tài)平衡方面起 著重要的作用。截至到2005年底，與SNXs家族蛋白相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道 只有23篇，在中國(guó)未見(jiàn)SNXs相關(guān)研究報(bào)道及專(zhuān)利申請(qǐng)，SNXs家族 蛋白在抑制腫瘤生長(zhǎng)方面的報(bào)道在國(guó)際上也是空白。因此對(duì)SNXs家 族蛋白的研究是一個(gè)全新的研究領(lǐng)域，具有科學(xué)的創(chuàng)新性。
本發(fā)明通過(guò)直接觀察SNX10對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響作用，并結(jié)合 SNX10對(duì)內(nèi)涵體的調(diào)節(jié)機(jī)制，探索其抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)理，并最 終為以SNX10為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)、開(kāi)發(fā)抗腫瘤藥物奠定基礎(chǔ)。
本發(fā)明的技術(shù)方案包括人SNX10基因克隆、載體構(gòu)建；慢病 毒的制備；慢病毒感染腫瘤細(xì)胞及其鑒定；建立穩(wěn)定表達(dá)SNX10的腫 瘤細(xì)胞株；細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)；細(xì)胞對(duì)中性紅染料的吞噬實(shí)驗(yàn) 等。
1、研究SNX10對(duì)內(nèi)涵體的調(diào)節(jié)機(jī)制
利用多種蛋白相互作用研究手段，尋找與SNX10相互作用或密切 相關(guān)的關(guān)鍵蛋白，研究它們?cè)鯓訁⑴c調(diào)節(jié)內(nèi)涵體的調(diào)節(jié)，從而闡明
SNX10調(diào)節(jié)內(nèi)涵體的+幾制。
2、 研究SNX10抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制
利用現(xiàn)有的SNX10穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，深入研究其細(xì)胞周期，細(xì)胞 分裂，細(xì)胞遷移，細(xì)胞貼壁特性，以及利用從裸鼠身上取出的腫瘤快 進(jìn)行的組織培養(yǎng)細(xì)胞以上各方面特性的研究，力圖闡明SNX10在那些 過(guò)程中抑制了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。
3、 以SNX10為耙點(diǎn)，開(kāi)發(fā)腫瘤治療的基因療法和藥物開(kāi)發(fā)
腫瘤治療中存在的最大問(wèn)題是耐藥性。研究表明SNX10蛋白具 有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和增加腫瘤細(xì)胞吞噬能力的功能。SNX10可以 做為抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)基因和腫瘤細(xì)胞藥物增敏基因。因此，將以 SNX10來(lái)開(kāi)發(fā)基因治療的方法，用于多種實(shí)體腫瘤的治療。采用 將SNX10基因構(gòu)建在腺病毒(Adenovirus)載體系統(tǒng)中(包括AV， AVV等)。通過(guò)該載體系統(tǒng)將SNX10導(dǎo)入耐藥的腫瘤組織中，可以 提高該腫瘤部位的化療效果。SNX10基因治療的制備方法，可按照 基因藥物領(lǐng)域的方法進(jìn)行制備。SNX10將通過(guò)直接注射的方法給藥。 SNX10通過(guò)腺病毒載體導(dǎo)入靶向癌細(xì)胞來(lái)減低腫瘤的生長(zhǎng)，提高對(duì) 化合物的敏感性，達(dá)到治療效果。
本發(fā)明在從機(jī)制上闡明分選蛋白SNX10對(duì)內(nèi)涵體的調(diào)節(jié)機(jī)制的 同時(shí)，證實(shí)了 SNX10抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，提供了該分選蛋白 SNX10基因作為腫瘤治療新手段或新藥物的應(yīng)用方式。圖l: SNX10在人體器官中的表達(dá)譜。
圖2: SNX10轉(zhuǎn)染不同的細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)可以在細(xì)胞質(zhì)中引起大的空泡。
圖3: SNX10成的泡狀細(xì)胞器屬于內(nèi)涵體類(lèi)細(xì)胞器。
圖4:
圖4A:利用Western Blot鑒定挑取的單克隆細(xì)胞的蛋白表達(dá)。
圖4B:細(xì)胞有大的泡狀結(jié)構(gòu)。
圖4C: SNX10可以顯著降低MCF7的生長(zhǎng)。
圖4D:腫瘤生長(zhǎng)曲線。
圖4E、圖4F:對(duì)腫瘤塊進(jìn)行稱(chēng)重統(tǒng)計(jì)。
圖5:
圖5A:穩(wěn)定表達(dá)SNX10的MCF7細(xì)胞對(duì)中性紅染料的吞噬作用增加。 圖5B: 0D550實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞裂解液中的中性紅濃度。 一、人SNX10基因克隆、載體構(gòu)建
(1) 基因克隆根據(jù)人SNX10編碼序列(麗_013322.2 )，設(shè)計(jì)引物 (上游弓l物- ACCatgtttccggaacaacagaaagaggaatttgt， 下游弓l物-
ggattcctgcggagctgtatttactUacat),以人外周血細(xì)胞cDNA為模板 用TaKaRa的PyrobestDAN合成酶擴(kuò)增基因，將純化后的PCR產(chǎn)物連 接到真核表達(dá)載體pCR3. 1-uni中，通過(guò)酶切，測(cè)序鑒定為人SNXIO 序列。
(2) 轉(zhuǎn)染與表型將該基因轉(zhuǎn)染不同的細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)可以在細(xì)胞質(zhì)
中引起大的空泡結(jié)構(gòu)(圖2)，進(jìn)一步利用共轉(zhuǎn)染，可發(fā)現(xiàn)SNX10成 的泡狀細(xì)胞器屬于內(nèi)涵體類(lèi)細(xì)胞器(圖3)，從而發(fā)現(xiàn)了一個(gè)可以導(dǎo) 致內(nèi)涵體增大的基因SNXIO。 (3)重組慢病毒載體的構(gòu)建與病毒制備
為了研究高表達(dá)SNX10對(duì)于細(xì)胞的影響，可構(gòu)建重組慢病毒載 體首先將用于siRNA的慢病毒載體pLentiLox3. 7改造成高表達(dá)載 體(改造方法為如下用Notl和Apal酶切(從NEB公司購(gòu)買(mǎi))，去 掉pLentiLox3. 7載體中的U6啟動(dòng)子，并用T4DNA聚合酶(從NEB公 司購(gòu)買(mǎi))將粘性末端補(bǔ)平，并用T4DNA連接酶(從NEB公司購(gòu)買(mǎi))連 接。同時(shí)，合成24個(gè)堿基的DNA小片斷NotI—XhoI (由Takara公 司合成)，用EcoRl酶切后加入，將該載體命名為pLXN。同時(shí)，將BfrBl 位點(diǎn)單切，連接細(xì)胞篩選抗生素Blasticidin的讀碼框，該讀碼框來(lái) 自Invitrogen的pCD貓T/R的EM-7-Blasticidin-SV40Pa —段，將 該載體命名為pLXNB)。使用感受態(tài)菌株HB101 (從Takara購(gòu)買(mǎi))，分 別篩選重組成功的克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)，利用堿裂解法提取病毒的包裝載 體pLPl, pLP2， pLP/VSVG和重新改造的慢病毒載體pLXNB-SNX10的 質(zhì)粒，定量。
二、使用磷酸鈣共沉淀法在293T細(xì)胞中制備慢病毒
本發(fā)明利用293T細(xì)胞作為慢病毒包裝細(xì)胞，293T細(xì)胞生長(zhǎng)于含 10%胎牛血清(Hyclone)、 100mg/L的雙抗(青霉素+鏈霉素)，高糖 DMEM (Hyclone公司)培養(yǎng)基中，每6cm細(xì)胞培養(yǎng)盤(pán)中，加入3. 5ml 的培養(yǎng)基。接種約1.5xl()6個(gè)細(xì)胞，在37。C、含有5%0)2的濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第二天，即可采用標(biāo)準(zhǔn)的磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)染制備慢病毒。
每6cm盤(pán)中，共需加入慢病毒包裝質(zhì)粒(pLPl， pLP2， pLP/VSVG)和 病毒質(zhì)粒(pLXNB)共12ug， 比例為3: 1.5: 1.8: 6。轉(zhuǎn)染24小時(shí) 后即可看到GFP蛋白的綠色熒光，轉(zhuǎn)染后36小時(shí)后可收集慢病毒。 收集293T細(xì)胞上清液，以2000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，收上清，棄去 沉淀。病毒的富集和純化使用超速離心機(jī)(Beckman Coulter)在130， OOOG，離心1. 5小時(shí)，棄去上清，用PBS溶液將沉淀重懸過(guò)夜。病 毒滴度檢測(cè)采用慢病毒感染293T細(xì)胞或3T3細(xì)胞后，使用流式細(xì)胞 儀，通過(guò)細(xì)胞中GFP蛋白的表達(dá)來(lái)檢測(cè)。通過(guò)此法得到的慢病毒滴度 約為108左右。采用本方法制備包裝有慢病毒空載體(pLXNB)和包含 目的基因SNXIO的慢病毒。
三、 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)、慢病毒感染腫瘤細(xì)胞及其鑒定
MCF—7細(xì)胞為乳腺癌細(xì)胞系，采用的培養(yǎng)基成分為RPMI 1640 培養(yǎng)基(Hyclone)培養(yǎng)液，同時(shí)添加10%的胎牛血清(Hyclone)、 100ug/ml的雙抗(青霉素/鏈霉素)；在37。C，含有5% 0)2的濕潤(rùn)培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待用。將己富集和純化的慢病毒感染MCF7細(xì)胞，其中 細(xì)胞的密度為20-30%,使用病毒的量為10724孔。
四、 建立穩(wěn)定表達(dá)SNX10的腫瘤細(xì)胞株
在感染后36小時(shí)，將以上細(xì)胞以1/100的密度接種到10cm培養(yǎng) 盤(pán)中，待細(xì)胞貼壁后，用10ug/ml劑量的Blasticidin篩選10天， 在細(xì)胞培養(yǎng)盤(pán)中可找到肉眼可見(jiàn)單克隆，挑單克隆，分盤(pán)培養(yǎng)，繼 續(xù)用2ug/ml的Blasticidin維持。利用Western Blot鑒定挑取的單
克隆細(xì)胞的蛋白表達(dá)(圖4A);細(xì)胞有大的泡狀結(jié)構(gòu)(圖4B)，將表達(dá) 呈陽(yáng)性的克隆繼續(xù)傳代，凍存?zhèn)溆谩?br>
五、 細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)
為了研究SNX10對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，在2塊24孔板中分別接種 2xl()4個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)7天，每天對(duì)3個(gè)孔的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，繪制細(xì)胞生 長(zhǎng)曲線，可發(fā)現(xiàn)，與空載體細(xì)胞MCF7-pLXNB相比，SNX10可以顯著 降低MCF7的生長(zhǎng)(圖4C)。
六、 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液接種雌性裸 鼠，接種量2xl06個(gè)細(xì)胞/注射點(diǎn)，觀察成瘤率、腫瘤潛伏期及腫瘤 生長(zhǎng)曲線(圖4D)。當(dāng)瘤體直徑達(dá)lcm以上時(shí)，照相后處死，對(duì)腫瘤 塊進(jìn)行稱(chēng)重統(tǒng)計(jì)(圖4E、圖4F)，同時(shí)取出腫瘤塊作病理組織學(xué)檢査， 部分裸鼠對(duì)全身重要臟器進(jìn)行病理學(xué)檢查，注意有無(wú)局部淋巴結(jié)及全 身轉(zhuǎn)移。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SNX10可以顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)。
七、 細(xì)胞對(duì)中性紅染料的吞噬實(shí)驗(yàn)
在穩(wěn)定表達(dá)SNX10蛋白的MCF7乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加入中性 紅染料，共同培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，MCF7—SNX10細(xì)胞對(duì)中性紅染料的吞噬作 用大大增加(圖5A、圖5B)。這提示SNX10蛋白可以提高腫瘤細(xì)胞對(duì) 抗腫瘤藥物的吞噬能力，進(jìn)而可以影響腫瘤細(xì)胞對(duì)于抗腫瘤藥物的敏 感性。
分選蛋白SNX10抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的用途
<110>中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院 <120>分選蛋白SNX10抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的用途 <■ 2
〈170〉 Patentln Version 2. 1
〈210〉 1 <211> 609 〈212〉 DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221〉 CDS
<222> (4)…(609)
<223〉 n =a或g或c或t
<220〉
<221〉 prim—bind <222> (1)…(35) <223> n =a或g或c或t <220>
<221〉 prim—bind <222> (576). . (606) <223> n =a或g或c或t <400> 1
accatgtttc cggaacaaca gaaagaggaa tttgtaagtg tctgggttcg agatcctagg 60 attcagaagg aggacttctg gcattcttac attgactatg agatatgtat tcatactaat 120
agcatgtgtt ttacaatgaa aacatcctgt ctgaggc卿gactccaaag taatgcgttg aacctgtttt tcaacatgaa caatcgccag gatttcctca gaaaagtcct acagaatgca ttcttacaga gccatctgaa ttcaga卿c tactctgtgg aagaagcaat tcacaagttt gatg肪gaag gaaaaaaaga aaatgatat3 cttggacaca gtagtgatga cagcagttca gaatcctga 609
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<210> 2 <211> 201 <212〉 PRT
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Met Phe Pro Glu Gin Gin Lys Glu Glu Phe Val Ser Val Trp Val
1
Arg Asp Asp Tyr Lys Thr Arg Gin Leu Pro Val Asp Leu Gin Leu Gin
Pro Glu Ser Arg Ser Gin Asn Ser
Arg lie Cys Leu Lys Arg Ala His
5
lie 20
Cys
35
Val 50
Gin 65
Asn
80
Arg
95
Leu
110
Leu
Gin lie Arg Ser Leu Gin Leu Asn
Lys His Arg Asn Phe Gly Leu Ser
Glu Thr Arg Ala Phe Leu Ser Glu
Asp Asn Tyr Leu Asn Glu Asp Asp
10
Phe
25
Ser
40
Arg
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Met
85
Asp
100
Ser
115
lie
Trp Met Glu Val Asn Phe Ser Glu
His Cys Phe Gin Asn Leu Ceu Ala
Ser Phe Val Leu Arg Arg His Cys
15
Tyr lie 30
Thr Met
45 Trp Leu
60 Pro Glu
75 Gin His
90
Lys Val 105
Leu Phe 120
Val Ser
Gly Gin Thr Leu Met Asn Glu Asn Asp Gly His Ser Thr Ala Pro
Lys Arg lie Ser Gin
125 Tyr 140 Arg 155 Asp 170 Asp 185 Glu 200
Ser Phe Tyr Asp Ser
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145 150
Pro Glu Glu Asp Glu Glu Gly Lys Lys
160 165
Asp Ser Glu Ser Ser Ser Ser Gly Leu
175 180
Ser Ser Ser His Gly Cys Lys Val Asn
190 19權(quán)利要求
1、分選蛋白SNX10，它具有如下的核苷酸序列accatgtttc cggaacaaca gaaagaggaa tttgtaagtg tctgggttcg agatcctagg 60attcagaagg aggacttctg gcattcttac attgactatg agatatgtat tcatactaat 120agcatgtgtt ttacaatgaa aacatcctgt gtacgaagaa gatatagaga attcgtgtgg 180ctgaggcaga gactccaaag taatgcgttg ctggtacaac tgccagaact tccatctaaa 240aacctgtttt tcaacatgaa caatcgccag cacgtggatc agcgtcgcca gggtctggaa 300gatttcctca gaaaagtcct acagaatgca cttttgcttt cagatagcag ccttcacctc 360ttcttacaga gccatctgaa ttcagaagac attgaggcgt gtgtttctgg gcagactaag 420tactctgtgg aagaagcaat tcacaagttt gccttaatga atagacgttt ccctgaagaa 480gatgaagaag gaaaaaaaga aaatgatata gattatgatt cagaaagttc atcctctggg 540cttggacaca gtagtgatga cagcagttca catggatgta aagtaaatac agctccgcag 600gaatcctga 609。
2、 含有權(quán)利要求1中核苷酸序列的開(kāi)放閱讀框的表達(dá)載體。
3、 含有權(quán)利要求1中核苷酸序列的開(kāi)放閱讀框的表達(dá)載體為慢病 毒載體pLXNB-SNX10。
4、 一種用權(quán)利要求2的載體基因工程化的宿主細(xì)胞。
5、 一種用權(quán)利要求3的載體基因工程化的宿主細(xì)胞。
6、 分選蛋白SNX10在制備抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物中的應(yīng)用。
7、 分選蛋白SNX10在制備抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)涉及人分選蛋白基因、含有該基因的重組載體、用該載體轉(zhuǎn)化的宿主，以及利用轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)的該基因的表達(dá)產(chǎn)物及其應(yīng)用。通過(guò)直接觀察SNX10對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響作用，并結(jié)合SNX10對(duì)內(nèi)涵體的調(diào)節(jié)機(jī)制，探索其抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)理，并最終為以SNX10為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)、開(kāi)發(fā)抗腫瘤藥物奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明在從機(jī)制上闡明分選蛋白SNX10對(duì)內(nèi)涵體的調(diào)節(jié)機(jī)制的同時(shí)，證實(shí)了SNX10抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，提供了該分選蛋白SNX10基因作為腫瘤治療新手段或新藥物的應(yīng)用方式。
文檔編號(hào)A61P35/00GK101113169SQ20061003669
公開(kāi)日2008年1月30日 申請(qǐng)日期2006年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月28日
發(fā)明者秦大江, 秦寶明, 裴端卿 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院廣州分院