全靈芝孢子油的制備方法

專利名稱：全靈芝孢子油的制備方法
專利說明全靈芝孢子油的制備方法 本發明涉及一種全靈芝孢子油的萃取工藝，特別涉及一種以靈芝孢子粉、靈芝粉為原料經酶法破壁、超臨界CO2萃取全靈芝孢子油的方法，屬于生物技術領域。靈芝[Ganoderma lucidum(CurtisFr)P.Karst.]，是擔子菌綱非褶菌目靈芝科靈芝屬藥用真菌，是我國傳統的名貴藥材。靈芝孢子是靈芝的種子，在靈芝生長成熟期時從靈芝菌蓋背面彈射而出，具有靈芝的全部遺傳活性物質，是靈芝的精華。大量文獻報導，靈芝孢子具有增強免疫力、護肝、抗病毒、調節血脂以及對神經、心血管和呼吸系統具有調節改善作用。在光學顯微鏡下，靈芝孢子呈卵圓形，大小為5～8μm，孢內有1～2個油滴。靈芝孢子具有雙層細胞壁，其主要成份為幾丁質、木質素和纖維素、Si、Ca、Fe、Mg、Al等，使得孢壁十分結實堅硬，可耐酸、耐堿、耐壓、耐溫，對消化酶也非常穩定，孢內有效物質被包覆而不易提取。為了提高對靈芝孢子的生物利用率，對靈芝孢子進行有效破壁，而后萃取孢子內含物十分必要。目前最常見的靈芝孢子破壁方法是機械方法及酶法，主要是機械方法。通過碾壓、擠壓、噴射粉碎、氣流粉碎、撞擊等機械作用可以破壞靈芝孢子壁，使用的超微粉碎設備有球磨機、高速氣流機、碾壓機、噴射機等。機械破壁方法簡單易行、破壁率高，易于規模化生產，可是機械設備結構復雜、價格及運行成本較高，而且后處理不當時容易氧化變質。另一種破壁方法是酶法，王存雪等人(2002)報導了“一種靈芝孢子酶破壁方法”靈芝孢子在35℃用水浸泡12小時，使孢子吸水膨脹，外部組織軟化后加入1.5％的破壁酶液(纖維素酶、蝸牛酶等)，35℃浸泡酶解3小時、晾干，最后用細砂磨研磨10～12分鐘，可達到95％的破壁率。夏志蘭等(2005)報導的“靈芝孢子粉生物酶破壁方法技術的研究”，單獨使用超聲波處理靈芝孢子5分鐘后，破壁率為40％左右；在3％溶壁酶濃度下38℃處理4小時后再經超聲波處理5分鐘，破壁率可達98％。ZL 00130883.1公開了一種激活靈芝孢子產生生理活性物質的方法，使用水或生物培養液浸泡靈芝孢子0.5～8h；接著在相對濕度65％～98％、溫度20～48℃條件下培養0.5～24h；然后采用幾丁質酶、纖維素酶的酶降解作用使孢子壁失去韌性并脆化；或采用工業超微粉碎、碾壓、磨碎機械進行破壁破壁率可達99％。
破壁靈芝孢子中的主要成分為三萜類化合物及脂肪酸等，均為親脂性的碳氫化合物和類脂有機化合物，能溶于CHCl3、CH3OH等有機溶劑，在超臨界CO2流體中有較佳溶解性。運用超臨界CO2流體萃取工藝，因為CO2無色、無味、無毒，不易燃易爆，避免了有機溶劑提取的危險，使用較安全，而且萃取結束后無溶劑殘留問題；另外萃取溫度較低，可避免常規提取過程可能產生的分解、形成未知化合物沉淀等反應，適合于靈芝孢子有效成分的萃取。專利CN1194079C公開了一種靈芝孢子油超臨界CO2萃取制備方法，將靈芝孢子膨化、制粒后經超臨界CO2萃取孢子油，該方法采用了靈芝孢子膨化過程，其中膨化溫度較高(達80～140℃)，加速了破壁后靈芝孢子內油脂類物質的氧化及酸敗過程，影響了孢子油產品的品質。專利CN1114446C也公開了一種靈芝孢子有效活性物質的萃取方法，涉及將靈芝孢子破壁、超臨界CO2萃取過程。但超臨界CO2流體萃取壓力為5MPa～60MPa、萃取溫度為32～85℃，CO2流體流量為5kg/h～80kg/h，在實際生產中難以在如此寬泛的工藝條件下得到高純度和高出油率的孢子油產品。專利CN 1094766C公開了一種靈芝孢子油的超臨界萃取加工方法，涉及將靈芝孢子與水、明膠或淀粉的混合物為粘合劑制粒成型后進行超臨界萃取。涉及的超臨界萃取溫度、壓力較寬，生產時難以掌握好工藝條件制得高純度孢子油產品，同時萃取時間也長達35小時，難以真正實施工業化。專利CN 1239100C也公開了一種靈芝孢子油及其制備方法和用途，涉及以破壁孢子為原料，用乙醇溶液制粒干燥后經超臨界CO2萃取孢子油。
目前，超臨界CO2萃取孢子油均以機械破壁靈芝孢子為原料，或采用未破壁孢子經高溫膨化后再制粒、萃取，靈芝孢子機械破壁過程就已部分氧化或酸敗，影響萃取后的孢子油的品質，降低其生理活性。本發明的目的是提供一種具有生理活性的全靈芝孢子油的制備方法。
本發明采用的技術方案是按重量百分比取50～100％的靈芝孢子與0～50％的靈芝粉為原料，經酶法破壁、一步制粒、超臨界CO2萃取、離心精制后，得到淡黃色油狀物。
具體的制備過程是1.酶法破壁過程。按重量百分比取50～100％靈芝孢子、0～50％靈芝粉、0～10％小米、0～10％高梁、0～5％CaCO3、0～5％蔗糖、0～1％維生素B1混合，加入1.0～1.5倍水，混合均勻，用HCl或NaOH調節pH至5.0～6.5后，置高壓消毒鍋以0.15MP壓力消毒1.5～2.5小時。然后取出待冷卻后在無菌室操作，接入靈芝固體菌種或液體菌種，在15-35℃條件下培養，至菌絲長滿培養料。利用菌絲生長過程中不斷分泌的纖維素酶、蛋白酶、果膠酶等多種復合酶溫和酶解靈芝孢子壁。待靈芝菌絲長滿培養料后0～60天，取出培養產物，烘干、粉碎。為了進一步提高破壁率，粉碎設備可采用球磨機、研磨混煉機、碾壓機、高速氣流機等超微粉碎設備，使靈芝孢子破壁率達95％以上。
2.制粒。制粒的目的是使物料在超臨界CO2流體萃取過程中不易跑進管道，以防造成設備超壓。以純水作為潤濕劑，用一步制粒機將酶法破壁后靈芝孢子濕法制粒，控制干燥溫度在30～50℃，干燥時間2～4h，獲得水分小于5％顆粒。
3.超臨界CO2萃取。將制粒后的靈芝孢子放入超臨界CO2萃取裝置的萃取釜中，使其與超臨界流體充分接觸、溶解、萃取、分離，其工藝條件設定如下萃取壓力為20～40MPa、萃取溫度為20～50℃、CO2流體流量為60～150L/h、萃取時間0.5～6h；一級分離壓力為8～10MPa、分離溫度為25～45℃；二級分離壓力為5～8MPa、分離溫度為30～50℃；萃取過程還可以加入夾帶劑，如無水乙醇、乙酸乙酯等，加入量為投料量的5～100％。
4.精制。收集萃取物，過濾，除去混入萃取物中的少量孢子粉雜質，并進一步經5000～20000r/min高速離心機離心去除水分，得到澄清、透亮的淡黃色油狀物，出油率10～25％。
將本發明的全靈芝孢子油與常規機械破壁孢子萃取的靈芝孢子油進行抑制腫瘤細胞生長效果比較和過氧化值比較。樣品(1)全靈芝孢子油按上述方法制備；(2)常規機械破壁孢子萃取的靈芝孢子油靈芝孢子用研磨混煉機粉碎30～40分鐘，制粒、萃取、精制過程與全靈芝孢子油相同。
1.全靈芝孢子油與常規機械破壁孢子萃取的靈芝孢子油抑制腫瘤細胞生長效果比較樣品處理全靈芝孢子油及從機械破壁孢子萃取的孢子油分別用甘油溶液乳化至濃度為8uL/mL。人惡性乳腺癌細胞株(MT-1)由加拿大多倫多大學楊柏華教授實驗室提供。腫瘤細胞培養液在DMEM培養基中加入10％已滅活的胎牛血清FBS，以及100IU/mL青霉素和100IU/mL鏈霉素。
實驗方法(1)選用12孔細胞培養板，MT-1細胞用上述腫瘤細胞培養液制成懸液，腫瘤細胞濃度為1.0×105/mL，接種量1mL，于37℃5％CO2濃度培養箱培養5h。(2)將全靈芝孢子油樣品溶液加入MT-1培養板的量為0、40、80、120、160uL，接著37℃ 5％ CO2濃度培養箱培養2天。將普通靈芝孢子油樣品溶液加入MT-1培養板的量為0、40、80、120、160、200、240、280uL，接著37℃ 5％ CO2濃度培養箱培養2天。(3)從CO2培養箱取出培養板，吸去培養液，用Diff-Quik Differential Stainning Set試劑染色，在200倍顯微鏡下觀察活的貼壁腫瘤細胞數量，并進行細胞計數和顯微拍照。
實驗結果見附

圖1及附圖2，隨著靈芝孢子油實驗濃度的升高，腫瘤細胞的生長受抑制，存活腫瘤細胞數量逐漸減少。全靈芝孢子油在160uL實驗量時的抑制腫瘤細胞生長效果與機械破壁孢子萃取的靈芝孢子油在280uL實驗量時的效果相當，可見，本發明的全靈芝孢子油抑制腫瘤細胞生長效果明顯高于常規靈芝孢子油。
2、過氧化值比較過氧化值按GB/T5009.37規定的方法測定。本發明的全靈芝孢子油過氧化值在0.08～0.10(g/100g)，而常規靈芝孢子油過氧化值在0.13(g/100g)以上。全靈芝孢子油過氧化值明顯低于常規機械破壁孢子萃取的靈芝孢子油，顯示本發明的全靈芝孢子油具有更強抗氧化能力。
本發明的全靈芝孢子油還具有增強免疫、護肝作用，可作為保健、藥用、高檔化妝品的原料。下面通過藥效實驗證明本發明所提供的全靈芝孢子油的用途。
樣品以上述工藝獲得的全靈芝孢子油，在符合GMP條件下制備全靈芝孢子油軟膠囊。為了檢測全靈芝孢子油的功效，以成人體重60kg計，推薦量為0.033g/kg BW。
組別與劑量設玉米油對照組和低、中、高三個劑量組，劑量如下低劑量組0.17g/kg BW，相當于推薦日服量的5倍；中劑量組0.33g/kg BW，相當于推薦日服量的10倍；高劑量組1.0g/kgBW，相當于推薦日服量的30倍。
動物SPF級昆明種雌性小白鼠，6～8周齡(體重18～22g)給藥途徑每天按0.1ml/10g BW量灌胃動物給予受試物。
實驗結果1.全靈芝孢子油軟膠囊對小鼠的遲發型變態反應的影響(見表1)表1全靈芝孢子油軟膠囊對小鼠的遲發型變態反應的影響
2.全靈芝孢子油軟膠囊對ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉化反應(見表2)表2全靈芝孢子油軟膠囊對ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉化反應
3.全靈芝孢子油軟膠囊對小鼠NK細胞活性的影響(見表3)表3全靈芝孢子油軟膠囊對小鼠NK細胞活性的影響
4.全靈芝孢子油軟膠囊對受試動物血清谷丙轉氨酶(ALT)及谷草轉氨酶(AST)的影響(見表4、5)表4全靈芝孢子油軟膠囊對血清谷丙轉氨酶水平的影響
注1.空白對照組和CCl4對照組血清谷丙轉氨酶水平經對數轉換后，采用T檢驗，t值＝-27.750，P＜0.01。
2.各劑量組與CCl4對照組血清谷丙轉氨酶水平經對數轉換后，采用方差分析，F值＝21.126，P＜0.01。
3.△△表示CCl4對照組與空白對照比較P＜0.01；**表示各劑量組與CCl4對照組比較P＜0.01。
表5全靈芝孢子油軟膠囊對血清谷草轉氨酶水平的影響
注1.空白對照組和CCl4對照組血清谷草轉氨酶水平經對數轉換后，采用T檢驗，t值＝-15.561，P＜0.01。
2.各劑量組與CCl4對照組血清谷草轉氨酶水平經對數轉換后，采用方差分析，F值＝19.876，P＜0.01。
3.△△表示CCl4對照組與空白對照比較P＜0.01；**表示各劑量組與CCl4對照組比較P＜0.01。
5.全靈芝孢子油軟膠囊對受試動物肝臟病變類型評分的影響(見表6)表6全靈芝孢子油軟膠囊對受試動物肝臟病變類型評分的影響
注1.肝臟氣球樣變、脂肪變性、水樣變性及細胞壞死得分為等級資料，采用秩和檢驗。
2.△△表示CCl4對照組與空白對照比較P＜0.01；*表示各劑量組與CCl4對照組比較P＜0.05，**表示各劑量組與CCl4對照組比較P＜0.01。
6.結論小鼠經口每日分別給予全靈芝孢子油軟膠囊0.17、0.33、1.00g/kg BW，相當于推薦日服量的5、10、30倍，共4周，結果顯示(1)綿羊紅細胞誘導的小鼠遲發性變態反應試驗和ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉化增殖試驗陽性，該樣品具有增強細胞免疫功能作用；(2)受試驗動物NK細胞活性試驗陽性，該樣品具有增強NK細胞活性作用；(3)全靈芝孢子油軟膠囊各劑量組血清谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)水平與CCl4對照組比較降低，差異有顯著性意義，ALT與AST結果陽性。
(4)全靈芝孢子油軟膠囊各劑量組肝臟病理組織學變化與CCl4對照組比較減輕，差異有顯著性意義，實驗動物肝臟病理結果陽性。
依據衛生部《保健食品檢驗與評價技術規范》2003版的判定標準判斷，全靈芝孢子油軟膠囊具有增強免疫力功能，對化學性肝損傷具有輔助保護作用。
靈芝的生長經歷了靈芝孢子、靈芝菌絲體及靈芝子實體三個發育階段，這三個發育階段所含成分及含量各不相同，具備先天的合理性。本發明制得的全靈芝孢子油，以靈芝孢子、靈芝粉為原料經生物酶法破壁處理后，經超臨界CO2萃取技術制得。酶法破壁是通過利用靈芝菌絲生長過程中分泌的多種活性酶酶解靈芝孢子壁，過程溫和，對孢內有效成分損失小，不易氧化變質，而且還增加了靈芝子實體及靈芝菌絲體成分，因此，本發明的全靈芝孢子油與常規機械破壁孢子萃取的靈芝孢子油相比，除了含有靈芝孢子萃取物，還增加了靈芝子實體、靈芝菌絲體的超臨界CO2萃取物，其有效成分三萜類化合物的種類更加齊全，強化了靈芝的功能。因此，本發明的全靈芝孢子油具有明顯增強免疫力功能、對肝損傷具有輔助保護作用、抑制腫瘤細胞生長等多種生理功能；而且其抑制腫瘤細胞生長效果提高一倍，并且明顯降低過氧化值，解決靈芝孢子油容易氧化的問題。附圖1本發明的全靈芝孢子油對人惡性乳腺癌細胞MT-1的生長抑制作用。隨著全靈芝孢子油實驗濃度的升高，腫瘤細胞的生長受抑制，存活腫瘤細胞數量逐漸減少，在160uL實驗量時只有極少腫瘤細胞數存活。
附圖2機械破壁孢子萃取的靈芝孢子油對人惡性乳腺癌細胞MT-1的生長抑制作用。隨著靈芝孢子油實驗濃度的升高，腫瘤細胞的生長受抑制，存活腫瘤細胞數量逐漸減少，在280uL實驗量時只有極少腫瘤細胞數存活。實施例1全靈芝孢子油的制備方法1(1)酶法破壁。取50％靈芝孢子、30％靈芝粉、10％小米、10％高梁混合(小米、高梁預先浸泡過夜、洗凈)，加入1.2倍純水，混合均勻，用HCl調節pH至5.5后置高壓消毒鍋0.15MP壓力消毒2小時。待冷卻后在無菌室操作，接入赤靈芝菌種，在30℃條件下培養。待靈芝菌絲長滿培養料后20天，取出培養產物，烘干、球磨機粉碎10分鐘。
(2)制粒。以純水作為潤濕劑，用一步制粒機將酶法破壁后靈芝孢子制粒，控制干燥溫度40℃，干燥時間2.5h，獲得水分小于5％20目顆粒。
(3)超臨界CO2萃取。將制粒后的靈芝孢子放入超臨界CO2萃取裝置的萃取釜中，使其與超臨界流體充分接觸、溶解、萃取、分離，其工藝條件設定如下萃取壓力為20MPa、萃取溫度為45℃、CO2流體流量為60L/h、萃取時間6h；一級分離壓力為10MPa、分離溫度為25℃；二級分離壓力為8MPa、分離溫度為30℃。
(4)精制。收集萃取物，濾紙過濾，除去混入萃取物中的少量孢子粉雜質，并進一步經5000r/min高速離心機離心，得到澄清、透亮的淡黃色油狀物。
實施例2全靈芝孢子油的制備方法2(1)酶法破壁過程。按重量比將70％靈芝孢子、20％靈芝粉、5％小米(預選浸泡過夜、洗凈)、2％CaCO3、2.5％蔗糖、0.5％的復合維生素B1混合，加入1.2倍純水，混合均勻，用HCl調節pH至5.5后置高壓消毒鍋0.15MP壓力消毒2小時。待冷卻后在無菌室操作，接入赤靈芝菌種，在25℃條件下培養。待靈芝菌絲長滿培養料后40天，取出培養產物，烘干、研磨混煉機粉碎10分鐘，顯微鏡下血球計數板計數，破壁率95％以上。
(2)制粒。以純水作為潤濕劑，用濕法制粒機將酶法破壁后靈芝孢子制粒，控制干燥溫度30℃，干燥時間3.5h，獲得水分小于5％60目顆粒。
(3)超臨界CO2萃取。將制粒后的靈芝孢子放入超臨界CO2萃取裝置的萃取釜中，使其與超臨界流體充分接觸、溶解、萃取、分離，其工藝條件設定如下萃取壓力為25MPa、萃取溫度為45℃、CO2流體流量為80L/h、萃取時間3h；一級分離壓力為8MPa、分離溫度為30℃；二級分離壓力為5MPa、分離溫度為40℃。
(4)精制。收集萃取物，真空抽濾，除去混入萃取物中的少量孢子粉雜質，并進一步經10000r/min高速離心機離心，得到澄清、透亮的淡黃色油狀物。
實施例3全靈芝孢子油的制備方法3(1)靈芝孢子酶法破壁。取90％靈芝孢子、10％靈芝粉混合，加入1.2倍純水，混合均勻，置高壓消毒鍋0.15MP壓力消毒2小時。待冷卻后在無菌室操作，接入靈芝顆料菌種，在20℃條件下培養。待靈芝菌絲長滿培養料后，取出培養產物，烘干、球磨機粉碎20分鐘。
(2)制粒。以純水作為潤濕劑，用濕法制粒機將酶法破壁后靈芝孢子制粒，干燥溫度45℃，干燥時間2h，獲得水分小于5％20目顆粒。
(3)超臨界CO2萃取。將制粒后的靈芝孢子放入超臨界CO2萃取裝置的萃取釜中，使其與超臨界流體充分接觸、溶解、萃取、分離，其工藝條件設定如下萃取壓力為40MPa、萃取溫度為50℃、CO2流體流量為150L/h、萃取時間2h，加入乙酸乙酯作為夾帶劑，加入量為投量料的20％；一級分離壓力為8MPa、分離溫度為45℃；二級分離壓力為8MPa、分離溫度為40℃。
(4)精制。收集萃取物，真空抽濾，除去混入萃取物中的少量孢子粉雜質，并進一步經20000r/min高速離心機離心，得到澄清、透亮的淡黃色油狀物。
實施例4全靈芝孢子油的制備方法4(1)酶法破壁過程。取100％靈芝孢子加入1.15倍純水，混合均勻，用HCl調節pH至6.0，置高壓消毒鍋0.15MP壓力消毒2小時。待冷卻后在無菌室操作，接入赤靈芝液體菌種，在28℃條件下培養。待靈芝菌絲長滿培養料后60天，取出培養產物，烘干、粉碎。
(2)制粒。以純水作為潤濕劑，用濕法制粒機將酶法破壁后靈芝孢子制粒，控制干燥溫度35℃，干燥時間3h，獲得水分小于5％40目顆粒。
(3)超臨界CO2萃取。將制粒后的靈芝孢子放入超臨界CO2萃取裝置的萃取釜中，使其與超臨界流體充分接觸、溶解、萃取、分離，其工藝條件設定如下萃取壓力為28MPa、萃取溫度為40℃、CO2流體流量為90L/h、萃取時間4h；一級分離壓力為9MPa、分離溫度為35℃；二級分離壓力為7MPa、分離溫度為45℃。
(4)精制。收集萃取物，濾紙過濾，除去混入萃取物中的少量孢子粉雜質，并進一步經8000r/min高速離心機離心，得到澄清、透亮的淡黃色油狀物。
權利要求
1.一種全靈芝孢子油的制備方法，其特征在于按重量百分比以50～100％靈芝孢子粉、0～50％靈芝粉為原料，經酶法破壁、以水為溶劑濕法制粒，超臨界CO2萃取、離心精制后，得到淡黃色油狀物。
2.權利要求1所述的全靈芝孢子油的制備方法，其特征在于原料中還加入0～10％小米、0～10％高梁、0～5％CaCO3、0～5％蔗糖、0～1％維生素B1。
3.權利要求1或2所述的全靈芝孢子油的制備方法，其特征在于在靈芝孢子粉、靈芝粉等原料中加入1.0～1.5倍水，混合均勻，置高壓消毒鍋消毒滅菌，待冷卻后在無菌室操作，接入靈芝菌種，在15-35℃條件下培養，待靈芝菌絲長滿培養料后0-60天，取出培養產物，烘干、粉碎。
4.權利要求3所述的全靈芝孢子油的制備方法，其特征在于粉碎設備可采用球磨機、研磨混煉機、碾壓機、高速氣流機等超微粉碎設備。
5.權利要求1所述的全靈芝孢子油的制備方法，其特征在于制粒時采用一步制粒法，以純水作為潤濕劑，用濕法制粒機將酶法破壁后靈芝孢子制粒，控制干燥溫度在30～50℃，干燥時間2～4h，獲得水分小于5％顆粒。
6.權利要求1所述的全靈芝孢子油的制備方法，其特征在于超臨界CO2萃取壓力為20～40MPa、萃取溫度為20～50℃、CO2流體流量為60～150L/h、萃取時間0.5～6h；一級分離壓力為8～10MPa、分離溫度為25～45℃；二級分離壓力為5～8MPa、分離溫度為30～50℃。
7.權利要求1所述的全靈芝孢子油的制備方法，其特征在于超臨界CO2萃取過程中加入無水乙醇、乙酸乙酯等夾帶劑，加入量為投料量的5～100％。
全文摘要
本發明涉及一種全靈芝孢子油的制備方法，屬生物技術領域。本發明選用靈芝孢子粉、靈芝粉為原料，經酶法破壁、濕法制粒，超臨界CO
文檔編號A61K31/51GK1883590SQ20061003557
公開日2006年12月27日 申請日期2006年5月24日 優先權日2006年5月24日
發明者李森柱, 謝意珍, 楊柏華, 李崇, 張智, 吳清平, 陳冠州, 羅彪 申請人:廣東粵微食用菌技術有限公司, 廣東省微生物研究所