一種地烏總皂苷提取物的制作方法

專利名稱：一種地烏總皂苷提取物的制作方法
技術領域：
本發明涉及中藥提取物，更具體地說，涉及從中藥地烏(毛茛科植物林蔭銀蓮花Anemone flaccida Fr.Schmidt)的根莖中提取精制而成的地烏總皂苷提取物。
背景技術：
關節炎及風濕性關節炎是一種常見病、多發病，特別是類風濕性關節炎，系自身免疫性疾病，其病機相當復雜，牽涉面極廣，具有相當的頑固性，我國很早就有關于骨關節疾病的記載，稱之為痹證。西醫認為風濕病是各種原因引起的以骨、關節、肌肉及其附屬組織疼痛為主要表現的一大類疾病。目前美國風濕病學會(ARA)，將風濕病共分為10大類，已被世界衛生組織采納。這些疾病主要有風濕性關節炎、類風濕性關節炎、增生性關節炎、結節性多動脈炎、強直性脊柱炎、系統性紅斑狼瘡、雷特(Reiter)綜合癥，銀屑病性關節炎、痛風及假性痛風、系統性硬皮病、皮肌炎、干燥綜合癥、腸炎性關節炎、白塞氏病、過敏性紫癜、混合性結締組織病等。其中尤其以風濕及類風濕性關節炎、骨性關節炎、痛風、強直性脊柱炎等幾種疾病高發，且預后較差，致殘率較高(尤其是耽誤治療疾病發展至晚期階段)。類風濕關節炎在我國的發病率為0.32％-0.34％。歐美白人發病率為1％-2％。我國局部地區患病率在0.4％-1.0％。其病因及發病機制不明，病程長，治療難，致殘率高，且任何年齡均可發病，估計全國人數達160萬，以25-55歲最常見，女性發病高于男性2-3倍。其臨床病程不一，約15％單次發作后緩解，25％間歇性發作，50％持續性發作，迅速進展成重癥者占10％。
該類疾病往往反復發作，病情控制不夠滿意。就目前來說還沒有令人滿意的治療藥物。很多抗風濕藥物對胃腸均有損傷，如消炎痛、炎痛喜康、布洛芬等。另大多數免疫抑制劑，如環磷酰胺，氨甲喋呤，硫唑嘌呤一類藥物，毒副作用教大，特別對孕婦、嬰兒胎兒尤為嚴重。而皮質激素類藥物，雖起效快但并不能“斷根”，停藥后常有“反跳現象”，而且副作用大。而常用的中藥“雷公藤制劑”其毒副作用大，患者往往難以忍受。
因此，本發明的藥物既能治療類風濕性關節炎，又具有毒副作用小的特點，伴隨中國的“入世”，意義重大。
中藥地烏性溫味辛、微苦。地烏提取物(地烏總皂苷)具有優異的驅風濕、強筋骨，抗炎、調節免疫功能和鎮靜、鎮痛等作用。現有的制備方法是采用水提法、醇提法、水提醇沉法，這些方法得到的地烏總皂苷的雜質多，純度較低，無法達到工業化生產和開發新藥用途的要求。

發明內容
本發明的目的是提供一種能夠滿足工業生產需要和開發新藥用途的地烏總皂苷提取物，這種提取物得到的地烏總皂苷的雜質少，純度高。
本發明的地烏總皂苷提取物，按以下工藝步驟制得(1)、取地烏根莖，篩選，粉碎呈粉末，過20---50目篩；(2)、取地烏粉末，加入6-10倍重量的水，煎煮1-3小時，濾過，重復以上操作2-4次，合并濾液；(3)、將濾液濃縮成浸膏，浸膏密度在40℃-70℃為1.04---1.10g/cm3，放冷至室溫；(4)、向浸膏中加入95％乙醇溶解，使溶液含醇量為50％---70％，將溶液搖勻，靜置8---16小時，濾過，回收乙醇至無醇味；(5)、回收乙醇后的溶液上大孔吸附樹脂柱，用水洗至流出液無色，棄去，再用地烏粉末重量4-7倍的50％---70％乙醇洗脫，流速為8ml/min--10ml/min，收集洗脫液；(6)洗脫液回收乙醇至無醇味，濃縮，于60--100℃、560～760mmHg干燥8-13小時，粉碎，過篩，得地烏總皂苷粉末。
上述制備方法的工藝條件的優選條件為步驟(2)中加入7-8倍水煎煮；步驟(3)中浸膏密度為60℃時1.06---1.08g/cm3；步驟(4)浸膏加乙醇溶解后，溶液含醇量為60％，溶液靜置12小時；步驟(5)用于洗脫的乙醇濃度為70％，用量為地烏粉末重量6倍，洗脫流速為8ml/min--10ml/min；步驟(6)的干燥條件為于80℃、760mmHg、干燥12小時。本發明中的乙醇濃度均指體積百分比。
用本發明所述的地烏總皂苷提取物的提取工藝過程簡單，無特殊設備，安全易于操作，且成本低，得到的地烏總皂苷雜質少、純度高達85％，完全能夠滿足工業生產和藥物開發的需要。本發明先用水提，醇沉最后過樹脂柱的方法，即地烏經過水提取冷卻后進行醇沉，可除去淀粉、多糖、蛋白質等與功能主治無關的雜質，濾液回收乙醇后過D101型大孔吸附樹脂(此類樹脂對非極性有機化合物吸附較強如在分離皂苷類成分非常有效且樹脂可以再生并處理簡單對環境污染少)，最終得到地烏總皂苷的純度高，雜質少，其總皂苷的含量在總提取物的85％以上。
下面通過實施例進一步說明本發明，但不限制本發明
實施例1取地烏藥材1.5kg，加水9kg，煎煮2小時，濾過，重復操作三次，合并濾液，濃縮成浸膏，在60℃時用比重計測得相對密度為1.07(60℃)的浸膏，放冷至室溫，加95％乙醇使含醇量為60％，搖勻，靜置12小時，濾過，回收乙醇至無醇味，濾液置D101型的大孔樹脂柱上，用水洗至流出液無色，棄去水；再用8kg70％乙醇洗脫，流速為9ml/min，收集洗脫液，回收乙醇至無醇味，濃縮成稠膏，放入真空干燥機中，在760mmHg、80℃真空干燥12小時，得到塊狀晶體，粉碎，過篩，即得純度為88％的粉末99.9g。
本發明中采用的地烏總皂苷純度測定方法為照比色法(中華人民共和國藥典2000年版一部 附錄VB)測定。
對照品溶液的制備 精密稱取在五氧化二磷干燥器中干燥至恒重的地烏皂苷W3對照品，加甲醇制成每1ml含5.0mg的溶液。
供試品溶液的制備 取本品約0.05g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入水飽和正丁醇10ml，密塞，精密稱定重量，超聲處理(功率450W頻率59KHz)45分鐘，放冷至室溫，用水飽和正丁醇補足減失的重量，濾過，精密量取續濾液5ml，置蒸發皿中蒸干，殘渣加甲醇溶解并轉移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。
測定法 照分光光度法(中華人民共和國藥典2000年版一部，附錄VB)試驗，以甲醇作空白溶液。精密吸取對照品溶液40μl，供試品溶液50μl，空白溶液50μl，置10ml具塞試管中，熱風吹干，各精密加入5％香草醛冰乙酸溶液-高氯酸(1∶4)1ml，充分振搖，置60℃恒溫水浴中加熱15分鐘，立即置冰水浴中，冷卻5分鐘，取出，立即精密加入冰乙酸5ml，搖勻，在545nm波長處測定吸收度，按紫外分光光度法[中華人民共和國藥典2000年版一部，附錄VA項下(1)]對照品比較法計算式計算，即得。
供試品溶液濃度計算公式Cx＝(Ax/AR)×CRCx為供試品溶液的濃度；Ax為供試品溶液的吸收度；CR為對照品溶液的濃度；AR為對照品溶液的吸收度。
樣品含量計算公式含量＝(Cx×Vx)/M總
Vx為供試品溶液的體積；M總為樣品總的質量。
實施例2取地烏藥材1.5kg，加水12kg，煎煮1小時，濾過，重復操作二次，合并濾液，濃縮成浸膏，在40℃時用比重計測得相對密度為1.04的浸膏，放冷，加95％乙醇使含醇量為50％，搖勻，靜置8小時，濾過，回收乙醇至無醇味，濾液置D101型的大孔樹脂柱上，用水洗至流出液無色，棄去水；再用6kg50％乙醇洗脫，流速為8ml/min，收集洗脫液，回收乙醇至無醇味，濃縮成稠膏，放入真空干燥機中，在700mmHg、60℃真空干燥8小時，得到塊狀晶體，粉碎，過篩，即得純度為86％的粉末100.2g。
實施例3取地烏藥材1.5kg，加水15kg，煎煮3小時，濾過，重復操作四次，合并濾液，濃縮成浸膏，在70℃時用比重計測得相對密度為1.10的浸膏，放冷，加95％乙醇使含醇量為70％，搖勻，靜置16小時，濾過，回收乙醇至無醇味，濾液置D101型的大孔樹脂柱上，用水洗至流出液無色，棄去水；再用10.5kg60％乙醇洗脫，流速為8ml/min，收集洗脫液，回收乙醇至無醇味，濃縮成稠膏，放入真空干燥機中，在560mmHg、100℃真空干燥13小時，得到塊狀晶體，粉碎，過篩，即得純度為85％的粉末99.7g。
實施例4地烏總皂苷的抗炎作用1.實驗材料1.1實驗藥物地烏提取物(地烏總皂苷)，由湖北中醫學院中藥研究所提供，批號9606101.2實驗動物清潔級Wistar大鼠，清潔級昆明種小白鼠，清潔級日本大耳兔。均由同濟醫科大學實驗動物學部提供，合格證號分別為醫動字第19-050號，醫動字第19-052號。
1.3試劑二甲苯，武漢聯堿廠，分析純，批號080112。巴豆油，自制。角叉菜膠，東京化成工業株式會社、東京化成販殼株式會社，批號900360000。伊文思藍，上海化學試劑采購供應站分裝廠，批號90-06-21。冰醋酸，江蘇東臺市試劑廠，分析純，批號910618。卡介苗蘭州生物制品研究所，批號950513。液體石蠟南京化學試劑廠。
1.4儀器足容積測定裝置，千分卡尺，軟尺，751分光光度計，721型分光光度計上海第三分析儀器廠，JN-A型精密扭力天平上海第二天平儀器廠，顯微鏡，心電圖機，二導儀。
1.5對照藥物醋酸潑尼松片，廣州白云山制藥總廠，批號950101。規格5mg/片。
2.實驗方法與結果一、地烏提取物(地烏總皂苷)對大白鼠佐劑關節炎的影響2.1方法(1)觀察地烏提取物(地烏總皂苷)對原發病變的影響取體重180g左右的Wistar大白鼠50只，雌雄各半，按體重隨機分為5組，測其左后跖正常容積(ml)。每鼠左后跖皮內注射Freuneds完全佐劑〔采用液體石蠟和羊毛脂(2∶1)共熱至70℃振搖，高壓滅菌〕然后按每毫升加入卡介苗6毫克制成0.1毫升致炎。自注入佐劑的前1日起開始給藥。觀察該藥對原發病變的影響。
地烏提取物3個劑量組，劑量分別為288、144、72mg/kg；醋酸潑尼松片組20mg/kg；蒸餾水組20ml/kg。均灌胃給藥，每日1次，連續10次。每天測量各鼠左后跖容積，結果與蒸餾水組比較(t檢驗)。
(2)觀察地烏提取物(地烏總皂苷)對繼發病變的預防作用取體重180g左右的Wistar大白鼠50只，雌雄各半，隨機分為5組。分組情況及給藥劑量同(1)。于注射佐劑第7天開始給藥，連續7天，觀察對側的足跖腫脹度，體積變化，耳部、前肢和尾部病變的發生率，結節數或嚴重度，每隔3天測體重1次。結果與蒸餾水組比較t檢驗(確切概率法)。
(2)觀察地烏提取物(地烏總皂苷)對繼發病變的治療作用另取出現繼發病變大白鼠50只，于注射佐劑第19天開始給藥。觀察佐劑注射對測的足跖腫脹度，體積變化，連續給藥觀察至第30天。每隔3天測體重1次。結果與蒸餾水組比較(t檢驗)。
2.2結果(1)地烏提取物(地烏總皂苷)對原發性病變的作用結果見表1。
表1地烏提取物對佐劑關節炎大鼠原發病變的影響(X±S，n＝10)

與蒸餾水組比較(t檢驗)*p＞0.05；**p＜0.05，***p＜0.01，****p＜0.001結果表明地烏提取物各劑量組致炎后，足跖腫脹程度在相同時間與蒸餾水組比較，均具有高度顯著性差異(p＜0.05；p＜0.01，p＜0.001)，提示該藥具有抗佐劑關節炎原發病變的作用。
(2)地烏提取物對繼發性病變的預防作用結果見表2、3、4。
表2地烏提取物對繼發性病變的預防作用(X±S，n＝10)

與蒸餾水組比較(t檢驗)*p＞0.05；**p＜0.05，***p＜0.01，****p＜0.001。
表3地烏提取物對繼發性病變預防用藥時體重經時改變的影響(X±S，n＝10)


與蒸餾水組比較(t檢驗)*p＞0.05；**p＜0.05，***p＜0.01，****p＜0.001。
表4地烏提取物預防用藥對佐劑關節炎大白鼠繼發病變動物數的影響

與蒸餾水組比較(確切概率法)*p＞0.05；**p＜0.05。
結果表明，地烏提取物各劑量組具有抑制注射佐劑對側(右后足跖)因遲發型超敏反應引起的足腫脹，繼發病變的發生率(耳部、前肢和尾部病變的發生率)，結節數及嚴重程度均低于模型組，體重變化與模型組相比較顯著性差異。提示該藥具有抑制佐劑關節炎大白鼠遲發型超敏反應的作用。
(3)地烏提取物對繼發性病變的治療作用結果見表5。
表5地烏提取物對佐劑關節炎大白鼠繼發性病變的治療作用(右后足跖容積，X±S，n＝10)


與蒸餾水組比較(t檢驗)*p＞0.05；**p＜0.05，***p＜0.01，****p＜0.001。
結果表明地烏提取物可使佐劑關節炎大白鼠右后足跖腫脹的嚴重程度降低，與蒸餾水組相比較有顯著性差異。提示該藥具有治療佐劑關節炎的作用。
二、地烏提取物(地烏總皂苷)對二硝基氯苯(DNCB)所致遲發型皮膚過敏反應的影響1.方法取體重18～22克小白鼠50只，雌雄兼用，隨機分為5組，分組及用藥劑量同以上實驗。致敏前一天，用硫化鈉糊脫去頸部毛，致敏之日給藥后即于脫毛的頸部皮膚上滴0.5g/mlDNCB丙酮溶液20μl/只致敏。10天后，在事先用硫化鈉糊脫毛的同一小白鼠腹部皮膚上滴0.025g/mlDNCB丙酮溶液20μl/只進行攻擊。24小時后每鼠尾部靜脈注射1％伊文思藍10ml/kg。30分鐘后處死小白鼠，取小白鼠腹部藍染皮膚，剪碎，置試管中用1∶1丙酮生理鹽水混合液5ml浸泡24小時。將浸泡液過濾，取濾液用751型分光光度計610nm處測定光密度。
2.結果地烏提取物對DNCB所致遲發型皮膚過敏反應的影響實驗結果見表6。
表6地烏提取物對DNCB所致遲發型皮膚過敏反應的影響

與蒸餾水組比較(t檢驗)***p＜0.01，****p＜0.001。
結果表明地烏提取物各劑量組均能明顯降低DNCB所致小鼠遲發型皮膚過敏反應OD值，與蒸餾水相比較具有顯著性差異。提示該藥具有抑制T淋巴細胞轉化為致敏淋巴細胞的作用，降低機體細胞免疫的功能。
三、地烏提取物鎮靜、鎮痛作用1.鎮靜作用方法在25～26℃安靜環境下，取小白鼠100只，體重18～22g，雌雄兼用，隨機分成5組，每組20只。地烏提取物3個劑量組，劑量分別為416、208、104mg/kg，安定片10mg/kg；蒸餾水組20ml/kg。均灌胃給藥，30分鐘后，腹腔注射戊巴比妥鈉溶液28mg/kg。翻正反射小時達1分鐘者，記作發生睡眠，記錄發生睡眠的動物只數，比較各給藥組與對照組動物翻正反射消失的個數。
結果地烏提取物對戊巴比妥鈉閾下催眠劑量的影響見表7。
表7地烏提取物對戊巴比妥鈉閾下催眠劑量的影響


與蒸餾水組比較(t檢驗)***p＞0.05，***p＜0.01。
結果表明地烏提取物能使戊巴比妥鈉的作用增強，使小白鼠的入睡動物數增加，高、中劑量組與蒸餾水組相比較具有高度顯著性差異(P＜0.01。提示該藥與戊巴比妥鈉有協同作用。
2.鎮痛作用方法取小白鼠50只，體重18～22g，雌雄兼用，隨機分成5組，每組10只。地烏提取物3個劑量組，劑量分別為416、208、104mg/kg，哌替啶注射液組25mg/kg(腹腔注射)；蒸餾水組20ml/kg。給藥后30分鐘，均腹腔注射0.6％乙酸溶液0.2ml/只，然后觀察每只小白鼠的疼痛癥狀后肢伸展、腹部貼板扭曲及腹肌收縮內凹，臀部抬高(為一次扭體動作)，以扭體次數為疼痛指標，記錄30分鐘內小白鼠扭體次數。
結果扭體實驗結果見表8。
表7地烏提取物對戊巴比妥鈉閾下催眠劑量的影響

與蒸餾水組比較(t檢驗)***p＜0.01，****p＜0.001。
結果表明地烏提取物各劑量組均能明顯減少乙酸致小白鼠扭體的次數，與蒸餾水組相比較具有高度顯著性差異。提示該藥具有鎮痛作用。
綜上結果顯示本發明方法制備的地烏提取物(地烏總皂苷)在消炎鎮痛，鎮靜安神，調節免疫機能等方面均有良好的效果。
用本發明方法制備的地烏提取物(地烏總皂苷)，可以制成任何一種藥劑學上所說的劑型，如片劑、膠囊劑、顆粒劑、粉針劑、滴丸、注射劑、緩釋劑、控釋劑等。
實施例5地烏提取物(地烏總皂苷)膠囊劑 處方地烏提取物(地烏總皂苷)200g淀粉適量共制成1000粒。
取地烏提取物與淀粉混合均勻，制粒，干燥，粉碎(或取地烏提取物與淀粉混合均勻)過80目篩，填入合適的膠囊中，制成每粒含地烏提取物(地烏總皂苷)0.2g。
實施例6地烏提取物(地烏總皂苷)片劑 處方地烏提取物(地烏總皂苷)200g藥用輔料(包括淀粉、滑石粉、纖維素等)適量共制成1000片。
取地烏提取物與淀粉混合均勻，制粒，干燥，粉碎(或取地烏提取物與淀粉混合均勻)過80目篩，壓制成片，制成每片含地烏提取物(地烏總皂苷)0.2g。
實施例7地烏提取物(地烏總皂苷)粉針劑 處方地烏提取物(地烏總皂苷)200g甘露醇60g蒸餾水5ml上述各組分混合均勻后，冷凍干燥，制成1000支。
權利要求
1.一種地烏總皂苷提取物，按照以下工藝步驟制得(1)、取地烏根莖，篩選，粉碎呈粉末；(2)、取地烏粉末，加入地烏粉末的6-10倍重量的水，煎煮1-3小時，濾過，重復以上操作2-4次，合并濾液；(3)、將濾液濃縮成浸膏，浸膏密度在40℃-70℃為1.04---1.10g/cm3，放冷至室溫；(4)、向浸膏中加入乙醇溶解，使溶液含醇量為50％---70％，將溶液搖勻，靜置8---16小時，濾過，回收乙醇至無醇味；(5)、回收乙醇后的溶液通過大孔吸附樹脂柱，用水洗至流出液無色，棄去，再用地烏粉末重量4-7倍的50％---70％乙醇洗脫，流速為8ml/min--10ml/min，收集洗脫液；(6)洗脫液回收乙醇至無醇味，濃縮，于60--100℃、560～760mmHg干燥8-13小時，粉碎，過篩，得地烏總皂苷粉末。
2.根據權利要求1的地烏總皂苷提取物，其特征在于步驟(2)中加入7-8倍水煎煮。
3.根據權利要求2的地烏總皂苷提取物，其特征在于步驟(3)中浸膏密度在60℃為1.06---1.08g/cm3。
4.根據權利要求3的地烏總皂苷提取物，其特征在于步驟(4)浸膏加乙醇溶解后，溶液含醇量用體積比表示為55％-65％，溶液靜置12小時。
5.根據權利要求3的地烏總皂苷的提取物，其特征在于步驟(5)用于洗脫的乙醇濃度為70％，用量為地烏粉末重量6倍，洗脫流速為9ml/min。
6.根據權利要求3的地烏總皂苷的提取物，其特征在于步驟(6)為洗脫液回收乙醇，濃縮，于80℃、760mmHg干燥12小時，粉碎，過篩，得地烏總皂苷粉末。
全文摘要
本發明公開了一種地烏總皂苷提取物，按以下工藝制成(1)取地烏根莖，篩選，粉碎，過篩；(2)取地烏粉末，加入6－10倍重量的水，煎煮、濾過，重復以上操作2－4次，合并濾液；(3)將濾液濃縮成浸膏(4)、向浸膏中加入95％乙醇溶解，使溶液含醇量為50％－70％，將溶液搖勻，靜置－16小時，濾過，回收乙醇至無醇味；(5)回收乙醇后的溶液上大孔吸附樹脂柱，用水洗至流出液無色，棄去，再用地烏粉末重量4－7倍的50％－70％乙醇洗脫，收集洗脫液；(6)洗脫液回收乙醇至無醇味，濃縮，于60－100℃、560～760mmHg干燥，粉碎，過篩，得地烏總皂苷粉末。該地烏總皂苷提取物可作為治療類風濕性疾病的藥物。
文檔編號A61K31/704GK1843420SQ20061003318
公開日2006年10月11日 申請日期2006年1月23日 優先權日2006年1月23日
發明者黃漫翔 申請人:廣州康和藥業有限公司