專利名稱：敬釗毒素－v的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用作河豚毒素不敏感型鈉通道抑制劑的敬釗毒素-V。
背景技術(shù)：
生物毒素是一種重要的生命現(xiàn)象，是生物界在億萬(wàn)年進(jìn)化過(guò)程中為了生存而形成的，是一個(gè)巨大的潛在發(fā)現(xiàn)新的生物活性分子的重要資源。目前國(guó)際上已經(jīng)成功篩選到一些生物毒素分子用于治療某些相關(guān)疾病或作為新型藥物的設(shè)計(jì)參考。最近疼痛治療的重大突破是發(fā)現(xiàn)了新的河豚毒素不敏感型鈉通道亞型Nav1.8。實(shí)驗(yàn)顯示抑制該通道亞型能夠產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效果卻沒(méi)有類似目前臨床鎮(zhèn)痛藥物的毒副作用，Nav1.8為治療神經(jīng)性和炎癥性疼痛提供了一個(gè)高效專一的分子靶標(biāo)，該通道的高效專一性抑制劑非常有希望開(kāi)發(fā)成為下一代鎮(zhèn)痛新藥。因此如何獲得高效的Nav1.8抑制劑將是世界各大制約公司、科研院所的研究焦點(diǎn)與追逐目標(biāo)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種作為高效河豚毒素不敏感型鈉通道抑制劑的敬釗毒素-V。
本發(fā)明提供的這種敬釗毒素-V(JZTX-V)，其氨基酸序列如下Tyr Cys Gln Lys Trp Met Trp Thr Cys Asp Ser Lys Arg Ala Cys1 5 10 15Cys Glu Gly Leu Arg Cys Lys Leu Trp Cys Arg Lys Ile Ile20 25本發(fā)明敬釗毒素-V的理化性狀為純化凍干樣品為白色或類白色疏松體，無(wú)氣味，極易溶解于水，水溶液近于無(wú)色透明；對(duì)河豚毒素不敏感型以及敏感型鈉離子通道的半數(shù)最大抑制濃度分別為27.6nmol/L和30.23nmol/L，因此是一種很強(qiáng)的趨向于抑制河豚毒素不敏感型鈉通道的抑制劑。JZTX-V不但可以從蜘蛛毒液中提取，還可以通過(guò)多肽化學(xué)合成再經(jīng)氧化還原復(fù)性的途徑獲得，從JZTX-V的一級(jí)化學(xué)結(jié)構(gòu)來(lái)看它的氨基酸殘基很少，非常有利于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)和降低生產(chǎn)成本，可以該分子為模板，通過(guò)分子設(shè)計(jì)與蛋白質(zhì)工程改造，將該分子對(duì)Kv4.2鉀通道與TTX-S型鈉離子通道的關(guān)鍵殘基突變成丙氨酸，從而得到更加高效專一的TTX-R型鈉通道抑制劑。而已有的科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)TTX-R型鈉通道抑制劑具有很好的鎮(zhèn)痛活性而且毒副作用極小。因此本發(fā)明為日后大量生產(chǎn)這種鎮(zhèn)痛藥提供了可靠保障。
圖1是敬釗毒素-V(JZTX-V)的分離純化圖譜。圖1中的A是粗毒的陽(yáng)離子交換層析圖譜，“*”表示目的峰；圖1中的B是目的峰的反相高效液相色譜圖，“→”表示目的峰。
圖2是JZTX-V的質(zhì)譜鑒定圖譜。
圖3是JZTX-V的一級(jí)化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖4是JZTX-V的全長(zhǎng)cDNA序列克隆。
圖5是JZTX-V的三維模建結(jié)構(gòu)。圖中感興趣的堿性氨基酸用藍(lán)色標(biāo)記，酸性氨基酸用紅色標(biāo)記，疏水性氨基酸用紫色標(biāo)記。
圖6-1JZTX-V對(duì)成年鼠DRG細(xì)胞上鈉通道的影響。圖6-1中的A反映的是JZTX-V對(duì)TTX-R和TTX-S型鈉電流的影響；圖6-.1中的C、D分別是JZTX-V抑制TTX-R和TTX-S型鈉電流的濃效曲線。
圖6-2JZTX-V對(duì)DRG細(xì)胞鈉通道激活與失活動(dòng)力學(xué)特征的影響。其中圖6-2中的A反映的是JZTX-V對(duì)TTX-R型鈉電導(dǎo)激活與失活曲線的影響，圖6-2中的B反映的是JZTX-V對(duì)TTX-S型鈉電導(dǎo)激活與失活曲線的影響。有三角形的曲線代表激活曲線，有圓圈的曲線代表失活曲線。
圖7是JZTX-V對(duì)爪蟾卵母細(xì)胞上表達(dá)的電壓門控鉀通道Kv4.2的影響。圖7中A顯示10μM JZTX-V能夠完全抑制Kv4.2鉀通道；圖7中B是JZTX-V抑制Kv4.2鉀通道的濃效曲線；圖7中C是JZTX-V對(duì)Kv4.2鉀通道穩(wěn)態(tài)失活動(dòng)力學(xué)特征的影響。
圖8是JZTX-V與磷脂膜的結(jié)合活性測(cè)定。圖中A～C是JZTX-V在超離心上清中的反相HPLC圖譜。圖8中的A反映的是未加脂質(zhì)體；圖8中的B反映的是加入帶由75％POPE/25％POPG制備的脂質(zhì)體；圖8中的C反映的是加入由100％POPC制備的脂質(zhì)體。
圖9是JZTX-V與磷脂膜相互作用的熒光活性測(cè)定。圖9中的A是加入(虛線)和未加(實(shí)線)由75％POPE/25％POPG制備脂質(zhì)體JZTX-V的熒光譜；圖9中的B是存在75％POPE/25％POPG或100％POPC脂質(zhì)體時(shí)JZTX-V的紅移激發(fā)漂移曲線；圖9中的C是丙烯酰胺對(duì)加入脂質(zhì)體后JZTX-V分子上色氨酸熒光淬滅作用的Stern-Volmer圖譜。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說(shuō)明敬釗毒素-V(JZTX-V)可通過(guò)從敬釗纓毛蛛粗毒中提取，具體操作如下(1)毒液的采集用一個(gè)固定在鐵架臺(tái)上，內(nèi)徑3cm、高5cm的塑料杯作為毒液接收器，持大鑷子從側(cè)面夾住蜘蛛的腹部，讓蜘蛛張開(kāi)螯爪伸入杯中，然后用5～10V的脈沖電流刺激兩螯肢基部外側(cè)3～5s。蜘蛛感受電刺激后，即用觸肢緊緊抱住杯壁，同時(shí)將螫爪有力刺向杯內(nèi)壁并射出毒液。毒液用微量注射器抽取收集后，放入-40℃冷凍干燥機(jī)中經(jīng)真空冷凍干燥成白色或淺黃色粉末即為粗毒。
(2)分離純化根據(jù)蛋白質(zhì)的帶電荷性質(zhì)和蛋白質(zhì)的疏水性，結(jié)合陽(yáng)離子交換和反相HPLC色譜法進(jìn)行兩次分離。將15mg敬釗纓毛蛛粗毒用2mL雙蒸水(ddH2O)溶解，14000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘后棄去沉淀，取上清液進(jìn)樣到事先用0.1M磷酸鹽緩沖液平衡好的Water Protein Pak CM 8HR陽(yáng)離子交換柱(5毫米×50毫米)中，用0-50％氯化鈉線性梯度洗脫，時(shí)間為60分鐘，流速為3mL/min。收集最后一個(gè)峰進(jìn)一步反相HPLC純化(見(jiàn)圖1中的A)。用C18反相分析柱在60min內(nèi)以10-55％的乙腈(含0.1％三氟乙酸)線性梯度洗脫，收集目的峰進(jìn)一步反相HPLC，得到單一目的峰(見(jiàn)圖1的B)，質(zhì)譜儀檢測(cè)為單一組分并測(cè)得準(zhǔn)確分子量為3605.73Da(見(jiàn)圖2)。樣品經(jīng)冷凍干燥成白色粉末，純度可達(dá)99％以上。該毒素的理化性狀為純化凍干樣品為白色或類白色疏松體，無(wú)氣味，極易溶解于水，水溶液近于無(wú)色透明。敬釗毒素-V經(jīng)491-A測(cè)序儀準(zhǔn)確得到該毒素N-端28個(gè)氨基酸的序列(見(jiàn)圖3)。由于該毒素C-末端的疏水性氨基酸殘基在測(cè)序過(guò)程中容易被有機(jī)溶劑洗脫，因此第29個(gè)殘基的測(cè)序得不到信號(hào)。但是根據(jù)該毒素的質(zhì)譜測(cè)定分子量與N-端28個(gè)氨基酸殘基的理論分子量推測(cè)第29位的氨基酸殘基可能是一個(gè)異亮氨酸(Ile)或亮氨酸(Leu)，為了作出正確的判斷，以下通過(guò)獲得敬釗毒素-V全長(zhǎng)cDNA序列使敬釗毒素-V的氨基酸序列得到了確定。
(3)敬釗毒素-V全長(zhǎng)cDNA序列的獲得① 3′RACE首先從敬釗纓毛蛛毒腺中快速抽提總RNA，反轉(zhuǎn)錄總RNA得到總cDNA。根據(jù)已知敬釗毒素-V的氨基酸序列設(shè)計(jì)基因特異性簡(jiǎn)并引物p1-a5′-TA(T/C)TG(T/C)CA(G/A)AA(G/A)TGG ATG TGG-3′和p 1-b5′-AA(G/A)TGG ATG TGGAC(G/A/C/T)TG(T/C)GG-3′。用基因特異性引物和AUAP與少量cDNA鏈進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到大小在300bp左右的一段cDNA鏈，純化后克隆入pGEM Teasy載體(購(gòu)自Promega公司)，進(jìn)行測(cè)序。
② 5′RACE根據(jù)已得到的3′RACE測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)并合成5′RACE的反義引物p2-a5′-TCAATG CAA AAT TGC TTC AG-3′和p2-b5′-ACG TAA GCC TTC GCA GCA TGC-3′。用基因特異性引物和巢氏引物做PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物純化后克隆入pGEM Teasy載體(購(gòu)自Promega公司)進(jìn)行測(cè)序。
③全長(zhǎng) cDNA將3′RACE和5′RACE測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，得到敬釗毒素-V的全長(zhǎng)cDNA序列g(shù)ggggggggg ggggggggac tcagttctta ctgaaacact ggtgctgctcccgaaaagaa 60taattggtga cttgaaactc cagtaggaag atg aag gct tca gtt ttc gct gtcata ttg 120Met Lys Ala Ser Val Phe Ala Val Ile Leu
-53 -50gga ttg gtt gtg ttg tgc gcc tgt tcc ttt gct gaa gat gaa caa gat caattt gtt tca 180Gly Leu Val Val Leu Cys Ala Cys Ser Phe Ala Glu Asp Glu Gln Asp Gln PheVal Ser-40 -30cct aat gaa ctg cta aaa tca atg ttt gtg gag agt aga cat gaa ttc act cctgaa gtg 240Pro Asn Glu Leu Leu Lys Ser Met Phe Val Glu Ser Arg His Glu Phe Thr ProGlu Val-20 -10gaa gga aga tat tgc caa aaa tgg atg tgg acc tgt gat tca aaa aga gcatgc tgc gaa 300Glu Gly Arg Tyr Cys Gln Lys Trp Met Trp Thr Cys Asp Set Lys Arg AlaCys Cys Glu-1 1 10ggc tta cgt tgc aaa ctg tgg tgc aga aag ata ata gga taa 342Gly Leu Arg Cys Lys Leu Trp Cys Arg Lys Ile Ile Gly End20 30ttccgaatta atataccatt ctgaagcaat tttgcattga aattatagttgtgtaaatcc 402gagaaatgtg aatatgtgat atttcccttt gtttaggggt attaaaagaaatcgaaataa 462agtgtattca tcttgaaaaa aaaaaaaaaa aaaa496從該序列可以看出它包括3′非翻譯序列、5′非翻譯序列、編碼分子前體的閱讀框、一個(gè)成熟的毒素序列和一個(gè)插入的pro序列(見(jiàn)圖4)。將JZTX-V的氨基酸序列與該毒素的全長(zhǎng)cDNA序列及其翻譯后氨基酸序列進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，JZTX-V第30位的甘氨酸在成熟肽中已經(jīng)被切除，顯示該毒素的C-末端發(fā)生了酰氨化，同時(shí)也證實(shí)該毒素第29位的氨基酸殘基是一個(gè)異亮氨酸殘基。
(4)JZTX-V化學(xué)合成與氧化還原復(fù)性。
根據(jù)JZTX-V的氨基酸序列，在PS3固相多肽合成儀上，采用Fmoc-氨基酸和HBTU的偶聯(lián)方法合成線性JZTX-V。合成的多肽粗品采用反相HPLC進(jìn)行初步純化，通過(guò)質(zhì)譜分析確定目的峰，并進(jìn)行第二次反相HPLC純化，樣品經(jīng)冷凍干燥后在0.1M的Tris-HCl(pH＝7.5)，1.0mM/0.1mM GSH/GSSG條件下進(jìn)行氧化還原復(fù)性24小時(shí)，復(fù)性產(chǎn)物經(jīng)HPLC純化和MALDI-TOF質(zhì)譜分析顯示其測(cè)定質(zhì)量值與理論值相一致，復(fù)性產(chǎn)物與天然JZTX-V進(jìn)行HPLC共洗脫呈現(xiàn)一個(gè)單峰，進(jìn)一步的電生理活性測(cè)定證實(shí)通過(guò)化學(xué)合成得到的JZTX-V具有與天然毒素同樣強(qiáng)的離子通道抑制活性。采用化學(xué)合成結(jié)合氧化還原復(fù)性的方法可以成功大量得到JZTX-V。
為了揭示該毒素分子的作用，我們利用膜片鉗和電壓鉗技術(shù)測(cè)定了JZTX-V對(duì)電壓門控鈉、鉀離子通道的抑制活性，利用脂質(zhì)體離心共沉淀以及固有色氨酸熒光測(cè)定了該毒素對(duì)磷脂膜的結(jié)合活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明JZTX-V是一種高效的河豚毒素不敏感型鈉通道抑制劑。
1.主要材料和儀器全細(xì)胞膜片鉗系統(tǒng)采用德國(guó)HEKA公司的EPC-9放大器記錄系統(tǒng)，倒置顯微鏡是日本的Olympus IX70；雙極桿電壓鉗放大器為Turbo-Tec 03X。單層小脂質(zhì)體采用寧波新芝科器研究所生產(chǎn)的超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)超聲制備，熒光分光光度計(jì)為日立F-4500，合成儀為美國(guó)安萊公司的PS3多肽合成儀。
2.實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果2.1 JZTX-V的同源結(jié)構(gòu)模建根據(jù)同源毒素PaTxl的三維溶液結(jié)構(gòu)，我們?cè)贗nsightII軟件上模建了JZTX-V的三維結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)JZTX-V的結(jié)構(gòu)特征是有一個(gè)由三個(gè)芳香族氨基酸殘基和二個(gè)脂肪族氨基酸殘基組成的較大疏水斑片，并被一些帶電荷的氨基酸殘基環(huán)繞(見(jiàn)圖5)。
2.2敬釗毒素-V對(duì)電壓門控鈉通道的抑制活性
50nM敬釗毒素-V對(duì)成年大鼠背根神經(jīng)節(jié)DRG細(xì)胞上的河豚毒素不敏感型和河豚毒素敏感型鈉電流都有明顯的抑制作用，這種抑制作用呈劑量依賴性(見(jiàn)圖6-1中的A和B)。敬釗毒素-V對(duì)河豚毒素不敏感型和河豚毒素敏感型鈉電流的半數(shù)最大抑制濃度分別為27.6nmol/L和30.23nmol/L(見(jiàn)圖6-1中C)。
2.3敬釗毒素-V對(duì)鈉通道激活與失活動(dòng)力學(xué)的影響實(shí)驗(yàn)顯示50nM JZTX-V能夠?qū)е潞与喽舅夭幻舾行秃秃与喽舅孛舾行外c電導(dǎo)的半數(shù)最大激活電勢(shì)分別往去極化方向飄移約4.1mV和6.6mV(見(jiàn)圖6-2中的A和B)，能夠?qū)е潞与喽舅夭幻舾行秃兔舾行外c電導(dǎo)的半數(shù)最大穩(wěn)態(tài)失活電勢(shì)分別往超極化方向飄移約6.7mV和5.5mV(見(jiàn)圖6-2中的C和D)。
2.4敬釗毒素-V對(duì)Kv4.2鉀通道的影響實(shí)驗(yàn)顯示10μM的JZTX-V也能夠完全抑制爪蟾卵母細(xì)胞上表達(dá)的Kv4.2鉀電流，這種抑制呈劑量依賴性，其半數(shù)最大抑制濃度(IC50)是604.2±9.3nM(見(jiàn)圖7)。JZTX-V對(duì)Kv4.2鉀電流的抑制也會(huì)引起其電流電壓曲線往去極化方向漂移。然而10μM JZTX-V爪蟾卵母細(xì)胞上表達(dá)對(duì)Kv1.2、Kv1.3和Kv1.4鉀電流沒(méi)有任何影響。
2.5敬釗毒素-V與脂質(zhì)體的結(jié)合活性測(cè)定圖8中的A是在沒(méi)有單層脂質(zhì)體存在的條件下，超離心上清中JZTX-V的高效液相色譜圖，而當(dāng)單層小脂質(zhì)體(75％POPE/25％POPG)與含有JZTX-V的緩沖溶液混合后，通過(guò)超速離心沉降，發(fā)現(xiàn)幾乎所有的JZTX-V都能從離心上清中被刪除(見(jiàn)圖8中的B)。實(shí)驗(yàn)顯示JZTX-V與磷脂膜的結(jié)合需要帶負(fù)電荷的磷脂，因?yàn)楫?dāng)JZTX-V與由中性磷脂(100％POPC)制備的脂質(zhì)體混合并且離心沉降時(shí)，只有極少量的毒素肽能從離心上清中被刪除(見(jiàn)圖8中的C)。
2.6敬釗毒素-V的熒光活性測(cè)定在JZTX-V的溶液中加入由75％ POPE/25％ POPG制備的單層脂質(zhì)體后，其熒光譜的最大發(fā)射波長(zhǎng)經(jīng)歷了5.7nm的藍(lán)移，而熒光強(qiáng)度出現(xiàn)明顯增強(qiáng)(見(jiàn)圖9的A)。當(dāng)加入由75％ POPE/25％ POPG制備的脂質(zhì)體，JZTX-V的最大發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生了5.7nm的紅移激發(fā)漂移。而加入100％POPC的中性脂質(zhì)體時(shí)，JZTX-V的紅移激發(fā)漂移只有2.7nm(見(jiàn)圖9的B)。紅移激發(fā)漂移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)有帶負(fù)電荷的磷脂膜存在時(shí)，JZTX-V分子上的色氨酸殘基處在一個(gè)運(yùn)動(dòng)限制的環(huán)境中。丙稀酰胺熒光淬滅實(shí)驗(yàn)顯示伴隨著丙稀酰胺的加入，JZTX-V的熒光強(qiáng)度會(huì)以濃度依賴的方式進(jìn)行衰減(見(jiàn)圖9的C)，證實(shí)JZTX-V與帶負(fù)電荷的脂質(zhì)體的相互作用會(huì)引起JZTX-V分子疏水面上的色氨酸殘基與水溶液的接觸減少。
權(quán)利要求
1.一種敬釗毒素-V(JZTX-V)，其氨基酸序列如下Tyr Cys Gln Lys Trp Met Trp Thr Cys Asp Ser Lys Arg Ala Cys15 10 15Cys Glu Gly Leu Arg Cys Lys Leu Trp Cys Arg Lys Ile Ile20 2全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種敬釗毒素－V它的一級(jí)化學(xué)結(jié)構(gòu)由29個(gè)氨基酸殘基組成。該毒素的理化性狀為純化凍干樣品為白色或類白色疏松體，無(wú)氣味，極易溶解于水，水溶液近于無(wú)色透明；對(duì)河豚毒素不敏感型以及敏感型鈉離子通道的半數(shù)最大抑制濃度分別為27.6nmol/L和30.23nmol/L，是一種很強(qiáng)的趨向于抑制河豚毒素不敏感型鈉通道的抑制劑。
文檔編號(hào)A61P29/00GK1872878SQ20061003186
公開(kāi)日2006年12月6日 申請(qǐng)日期2006年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月22日
發(fā)明者梁宋平, 曾雄智, 謝錦云, 王賢純 申請(qǐng)人:湖南師范大學(xué)