冬凌草甲素在制藥中的應用的制作方法

專利名稱：冬凌草甲素在制藥中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及冬凌草甲素的用途，尤其涉及其在制藥領域中的應用。
背景技術：
髓性白血病包括急性髓性白血病(AML)和慢性髓性白血病(CML)。急性髓性白血病(Acute Myeloid Leukemia，AML)是一種異質性的惡性血液腫瘤，也是發生在成人中最普遍的急性白血病種類。據資料記載，僅2003年就有大約11,000個美國人被診斷為AML，其中大約75％的病人最終由于該病死亡。而在中國，每年新增急性白血病患者達四萬名之多。AML病人表現為造血細胞的正常分化以及凋亡途徑受阻，骨髓造血祖細胞增殖異常，導致骨髓及外周血中不成熟的原始細胞大量積累，影響了正常血細胞的生成與功能，導致患者出血、貧血并易發感染，而且白血病細胞會在肝、脾等其它臟器浸潤、播散，最終使器官功能衰竭而導致病人死亡。
在過去的二十年間，人們對于AML在生物學、分子生物學和細胞遺傳學等方面的認識取得了很大的進展，尤其是發現染色體易位參與白血病的發生。例如，1982年在M2b型AML病人中發現特異的t(8；21)易位，約10年后，斷裂點及受累基因被發現。而另外一種白血病，急性早幼粒細胞性白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)也是一種常見的血液惡性腫瘤，占急性白血病(acute myeloid leukemia，AML)的10-15％，臨床表現為粒細胞分化被阻滯于早幼粒細胞階段，法-美-英(FAB)分類為M3型。Larson RA及Hogge DE等于1984年發現該型白血病含有特異的t(15；17)染色體易位，并提出該易位與骨髓細胞分化阻滯于早幼粒細胞階段有關，1990-1991年數個研究小組幾乎同時報道了t(15；17)所致的PML-RARα融合基因，隨后又證明了其致白血病潛能。人們對AML取得巨大認識的同時，對于AML病人的治療也取得了長足進步。例如以往對APL的治療一直采用傳統的細胞毒性化療為主，該方法容易導致8-46％的病人發生致死性的顱內出血。直到1988年，全反式維甲酸(all-transretinoid acid，ATRA)分化療法的發現使得該病的治療有了重大突破。上海市血液學研究所的科研小組發現單用ATRA即可使含有t(15∶17)易位的APL病人獲得完全緩解。隨后對其分子機制的研究發現，ATRA可與PML-RARα中的RARα部分結合，使核共抑制物解離，從而恢復了RARα的轉錄功能，下游靶基因得以轉錄，使細胞重新進入分化程序。Raelson等發現，ATRA處理可以特異地降解PML-RARα融合蛋白，從而使PML-RARα對野生型PML和RARα的顯性負的抑制作用被解除。1996-1997年間，我國學者再次令世界醫學界震驚，他們發現三氧化二砷(As2O3)不僅可以誘導APL細胞系NB4細胞凋亡，而且能夠特異地降解PML-RARα融合蛋白。更有意思的是，低劑量As2O3可部分誘導APL細胞分化，而高劑量可誘導凋亡。臨床實驗表明As2O3可使APL初發病人及ATRA治療后復發的APL患者獲得完全緩解。而且ATRA和As2O3聯合使用不但在APL小鼠模型中取得良好效果，而且在臨床上治療APL初發病人也取得了比單獨使用ATRA及As2O3更好的治療效果。ATRA及As2O3作為靶向治療的典型已被廣泛接受。目前，ATRA和蒽環類化合物，或與三氧化二砷的聯合治療應用，使得APL這一含特異的t(15；17)染色體易位的M3型AML在大多數患者可被治愈。雖然阿糖胞苷和含蒽環類化合物化療的應用以及先進的支持治療，使得其它類型AML的預后也逐漸得以改善，并使約75-80％的AML病人得到臨床緩解，但大部分病人仍會復發。干細胞移植過于昂貴且供體有限、移植相關死亡亦達25％-30％，故難以推廣。而且，對年紀大的AML患者而言，大劑量化療的效果仍然不理想。因此，有必要開發新的藥物以治療該類疾病。由于凋亡是多細胞動物用于排除有害細胞的重要機制，并在發育、免疫系統成熟、組織動態平衡和衰老中起著重要作用，因而發展選擇性誘導白血病細胞凋亡的藥物也已成為治療AML的一種可行的途徑。
冬凌草甲素及香茶菜屬二萜類化合物抗腫瘤研究進展香茶菜屬植物是我國民間廣泛使用的草藥，它們大都具有清熱解毒、活血化淤、抗菌消炎，抗腫瘤等功效。特別是河南等省產的冬凌草，除用于抗菌消炎外，還應用于食道癌、賁門癌等癌癥。這類植物富含二萜化合物，特別是結構獨特的對映-貝殼杉烷類二萜化合物。冬凌草甲素(oridonin)是從唇形科香茶菜屬植物中分離出的一種貝殼杉烯二萜類(ent-kau-renediterpenoid)天然有機化合物，該化合物中的α-亞甲基環戊酮結構和抗腫瘤活性相關，也有報道該分子中的7β-OH和14β-OH亦被認為與腫瘤細胞中特殊酶的結合位點而起著增強抗癌活性的作用。冬凌草甲素為無色棱柱狀結晶，不溶于水，可溶于乙醚、甲醇、乙醇等有機溶劑。以前人們對冬凌草甲素多種生物學活性有了初步的認識，如免疫調節、抗病毒、抗炎、抗腫瘤活性。最近的實驗室和臨床前實驗研究數據提示了冬凌草甲素具有強烈的抗腫瘤活性，對多種實體腫瘤有效，如前列腺癌，乳腺癌，非小細胞肺癌以及肝癌、食管癌、胰腺癌等。
M2b型白血病的發病機制概述急性髓系白血病(acute myeloidleukemia，AML)是因轉化的骨髓干、祖細胞增殖而形成的惡性血液疾病，而染色體易位是導致造血祖細胞惡性轉化的最常見的原因。其中t(8；21)(q22；q22)易位的白血病約占10-15％，在M2b型白血病中更是占到了40％-80％以上。在形態學上含有t(8；21)易位的白血病90％以上屬于M2b亞型。另外在部分FAB M4型白血病中也含有t(8；21)。t(8；21)易位所累及的基因AML1和ETO，易位后形成AML1-ETO融合基因，它對M2b型白血病的形成有很重要的作用。大量研究發現，AML1(acute myeloidleukemia 1)也是許多其他類型人類白血病中染色體重排的靶基因，如t(1；21)、t(16；21)、t(12；21)，分別產生融合基因AML1-EVI-1、AML1-MTG16和TEL-AML1。inv(16)通過產生CBFβ-MYH11融合基因，破壞了與AML1形成異源二聚體的伙伴CBFβ，而間接影響了AML1的功能。可見AML1在造血過程中具有非常重要的作用。編碼AML1的基因位于21號染色體長臂22區。AML1在正常情況下只在造血組織和髓系分化時表達，也在神經組織、骨胳肌和再生組織中表達。目前已知AML1蛋白有三種異構體，分別為AML1a(250aa)、AML1b(453aa)和AML1c(480aa)(又稱AML1B)。AML1B有如下重要結構域。1)Runt同源的DNA結合結構域(Runt Homology DNA-binding Domain，RHD)。由AML1中間約118個氨基酸組成，因與果蠅的Runt蛋白同源而得名。它與DNA結合的一致序列為TGT/cGGT。此外，AML1也通過此結構域與CBFβ形成異源二聚體，共同調節基因表達。2)PST區含有可被磷酸化的位點。3)核基質結合位點(Nuclear Matrix Attachment Sequence，NM)可能和AML1的核定位有關。4)兩個轉錄激活結構域(Transcriptional Activation Domain，TA)作用較強的一個位于AML1的C端，較弱的一個則包含PST和NM。5)可能的轉錄抑制結構域(Repression Domain，RD)有兩個，一個緊靠RHD的C端，另一個位于NM和TA之間。此外，在AML1的C末端存在著由5個氨基酸組成的保守序列VWRPY，可與轉錄共抑制物Groucho/TLE1-4結合，抑制靶基因的轉錄。AML1主要通過與CBFβ形成異源二聚體而行使其功能。CBFβ不具有結合DNA的能力，但可穩定AML1與DNA的結合。受AML1調控的造血相關基因很多，如GM-CSFR、M-CSFR、IL-3、MPO、TCRβ、NE以及NP-3等。近年來的研究發現，單有AML1的結合位點還不足以使基因的啟動子有活性，許多基因的啟動子上，與AML1結合位點毗鄰的常有其它轉錄因子的結合位點，如Myb、Ets、AP1以及C/EBP等。因此，有人認為AML1/CBFβ是作為轉錄組織者起作用。AML1/CBFβ通過與一些基因的增強子序列結合后，可募集其它轉錄因子，形成與激活復合物共同起作用，可能通過P300/CBP等共激活因子的組蛋白乙酰化酶活性，使染色質組蛋白乙酰化，從而導致染色質結構松散，以利于轉錄。AML1在造血中的中樞調節作用已被AML1基因敲除鼠證實。AML1-/-鼠是胚胎致死的，首先是死于神經組織出血，其次是造血缺陷。AML1+/-鼠顯示正常的形態，并有卵黃囊來源的原始紅細胞。但在卵黃囊和胎肝中缺乏永久的造血祖細胞。AML1雜合子動物髓系和紅系的祖細胞減少，另一個等位基因的失活占AML的2％。曾有兩例病人的兩個AML1等位基因同時突變，結果產生M0型的AML。
ETO的功能ETO(Eight-Twenty-One)基因位于8號染色體長臂22區，編碼一種604個氨基酸的核磷蛋白。主要在腦和CD34+造血細胞中表達，其具體功能還不十分清楚，只是從序列分析中，發現它與果蠅的Nervy基因同源。目前已知ETO有四個重要的結構域。1)與果蠅TAF110轉錄因子同源區。2)疏水七價重復序列(Hydrophobic Heptad Repeat，HHR)。3)Nervy同源域。4)C端的兩個鋅指結構域，后一個鋅指也稱MYNY結構域。也有人將以上四個結構域命名為NHR1-4，NHR2可形成兩親性螺旋，介導同源或異源二聚化，且這種結合很穩定。NHR4的兩個鋅指結構域可與SMRT和N-CoR作用。包含NHR2及其兩側(236-432aa)的一段稱為CRD(Core Repressor Domain)，與mSin3A有強烈作用。目前還沒有證據表明ETO可以和DNA結合。但已證實ETO可以通過和N-CoR、SMRT、mSin3A等共抑制物結合，募集組蛋白去乙酰化酶(HDAC)，使組蛋白去乙酰化，染色體結構變緊密，從而抑制基因的轉錄。
AML1-ETO融合基因導致白血病的可能機制t(8；21)異位產生的AML1-ETO融合蛋白AML1的N端部分(177aa)和幾乎全長的ETO(C端575aa)，因此可以和CBFβ形成異源二聚體，并可與DNA結合，而且AML1-ETO與CBFβ的親合力比野生型大。據此提出了AML1-ETO融合蛋白是AML1顯性抑制物的假說，而且也有實驗證明了AML1-ETO可以抑制AML1對TCRβ增強子、IL3和GM-CSF啟動子的激活作用，但不影響這些啟動子本底水平的表達。另外，AML1-ETO雜合子小鼠是胚胎致死的，與AML1基因敲除小鼠表型幾乎相同，表現為中樞及外周神經出血及胎肝造血受阻。關于AML1-ETO的轉錄抑制機制也提出了幾種假說，如競爭DNA結合位點、與周圍其它因子作用、與共抑制物作用或與本底轉錄機器作用等。AML1-ETO部分刪除實驗表明，ETO的C端序列(含HHR和MYND domain)是其抑制功能所必需的。且MYND domain中的兩個鋅指結構中任何一個單位點突變都會使其抑制功能喪失，提示AML1-ETO可能通過與其它因子作用，來介導轉錄抑制。如前所述，ETO部分可與N-CoR、SMRT及mSin3A等共抑制物結合，形成一高分子量的抑制復合物，利用其組蛋白去乙酰化酶活性，導致染色質組蛋白去乙酰化，使染色質的結構緊縮，從而使一些與造血細胞增殖、分化密切相關的基因的轉錄被抑制，最終使造血細胞分化受阻、增殖異常而致白血病。HDAC的抑制劑削弱AML1-ETO介導的轉錄抑制，似可支持這一觀點。另外的研究發現，AML1-ETO可和AML1協同作用，激活M-CSFR，已檢測到Kasumi-1細胞系表達M-CSFR比單核細胞系U937高，而M-CSFR是由原癌基因c-fms編碼的受體酪氨酸激酶。來自M2型病人的骨髓也比正常骨髓的M-CSFR水平高。M-CSFR的信號傳導可通過誘導G1/S過渡而促進細胞的增殖。AML1-ETO還可以激活Bc1-2的啟動子，所以它也有可能通過促進細胞增殖、抑制凋亡而致白血病。
然而，在AML1-ETO可誘導性表達的轉基因小鼠，AML1-ETO的表達并不引起白血病；在造血重建實驗中，受致死量照射的小鼠接受表達AML1-ETO的造血干/祖細胞后也不能發生白血病。這些結果提示了AML1-ETO單獨表達不能引起白血病，須與其他的基因突變協同才能引起AML的發生。一些實驗證實了這些推測。在AML1-ETO可誘導性表達的轉基因小鼠，應用化學誘變劑ENU(N-ethyl-N-nitrosourea)誘導產生新突變后使AML1-ETO陽性小鼠發生了AML。有證據顯示t(8；21)白血病的發生是逐步發生的，AML1-ETO融合蛋白的產生是第一步，是基礎的遺傳學的改變，而C-KIT途徑的激活是第二步，也是發展成完全白血病關鍵的一步。在此模型中，前者阻礙了細胞正常的分化途徑，而后者則授予造血細胞增殖和/或抗凋亡的能力，這二者的協同作用可能是白血病形成的原因。
雖然目前關于冬凌草甲素的研究很多，但迄今為止，還沒有關于冬凌草甲素在制備治療急性白血病藥物中的應用的研究報道。
在中國專利申請號2004100168916，公開了一種降解AML1-ETO融合蛋白的方法及所用試劑。在該件專利申請只是概括性地描述了冬凌草甲素可以降解AML1-ETO融合蛋白，沒有記載冬凌草甲素對一些適應癥的動物模型或臨床實驗數據。

發明內容
本發明的目的在于(1)提供冬凌草甲素在制備治療急性白血病藥物中的應用。
(2)提供冬凌草甲素在制備治療慢性粒細胞性白血病藥物中的應用。
本發明的目的是通過以下技術方法來實現的首先，進行冬凌草甲素對具有t(8；21)染色體易位白血病細胞作用的研究，包括對Kasumi-1細胞株、轉染AML1-ETO的U937細胞(稱為U937-A/E細胞)、從M2b型，進行冬凌草甲素對其他白血病細胞作用的研究；然后，建立兩種t(8；21)白血病小鼠模型，再用冬凌草甲素進行治療，以觀察冬凌草甲素在動物水平的抗白血病作用。
冬凌草甲素對具有t(8；21)染色體易位白血病細胞作用的研究分以下幾部分首先，進行冬凌草甲素誘導具有t(8；21)染色體易位白血病細胞凋亡的體外研究。發現冬凌草甲素在體外可以誘導t(8；21)白血病細胞凋亡。
其次，進行冬凌草甲素誘導t(8；21)白血病細胞凋亡分子機制研究。在冬凌草甲素誘導具有t(8；21)染色體易位白血病細胞凋亡的體外研究的基礎上試圖找尋冬凌草甲素是如何在體外誘導t(8；21)白血病細胞凋亡的。結果顯示冬凌草甲素可以誘導Kasumi-1細胞線粒體跨膜電位的崩解和細胞色素C從線粒體中釋放，同時使caspase-3和caspase-9的活化，證明在冬凌草甲素誘導Kasumi-1細胞凋亡的過程中存在內源凋亡通路的激活。同時發現了凋亡過程中存在AML1-ETO融合蛋白降解。
再次，進行AML1-ETO融合蛋白上的caspase-3切割位點的研究。在研究冬凌草甲素誘導Kasumi-1細胞及其他AML1-ETO融合蛋白陽性細胞(U937-A/E)凋亡過程中發現了AML1-ETO融合蛋白的降解這一現象，而AML1-ETO融合蛋白在白血病的發病中起著關鍵的作用。在對AML1-ETO融合蛋白降解機制的研究中發現了AML1-ETO融合蛋白的降解是通過活化的Caspase-3切割的，并且首次確定了一個重要的Caspase-3切割位點Asp188。
最后，進行冬凌草甲素對t(8；21)染色體易位相關移植性白血病小鼠治療作用及其機制研究。在我們建立了截短型AML1-ETO(ΔAE)移植小鼠模型和Kasumi-1細胞裸鼠皮下移植瘤模型后，在這兩個模型中均證明了冬凌草甲素具有治療作用。確認了冬凌草甲素可以延長ΔAE移植小鼠的生存時間，并且可以在體內誘導發病鼠脾臟細胞的凋亡。我們還比較了冬凌草甲素與阿糖胞苷對Δ-AE移植性白血病小鼠模型的療效，發現冬凌草甲素在2.5mg/kg/d的劑量下對Δ-AE移植小鼠治療10天產生的療效與阿糖胞苷25mg/kg/d治療5天(小劑量阿糖胞苷)的療效相當，7.5、15mg/kg/d冬凌草甲素的療效優于小劑量阿糖胞苷；25mg/kg/d阿糖胞苷治療10天(大劑量阿糖胞苷)雖然對部分白血病小鼠(4/9)的療效較冬凌草甲素好，但卻引起其他小鼠(5/9)的早期死亡(生存時間僅為18天)。與大劑量阿糖胞苷不同，冬凌草甲素在2.5-15mg/kg/d的劑量下并不引起小鼠骨髓抑制或體重減輕。因而冬凌草甲素在白血病的治療中有療效確切、毒副作用小的特點。在Kasumi-1細胞裸鼠皮下移植瘤模型，冬凌草甲素可以顯著抑制皮下移植瘤的增長，也顯示了冬凌草甲素的體內抗白血病作用。
上述研究顯示1、冬凌草甲素在制備治療急性白血病藥物中的應用。
2、冬凌草甲素在制備治療含有AML1-ETO融合基因的急性髓性白血病藥物中的應用。
3、冬凌草甲素在制備治療不含有AML1-ETO融合基因的急性髓系白血病藥物中的應用。
4、冬凌草甲素在制備治療急性單核細胞性白血病藥物中的應用。
5、冬凌草甲素在制備治療急性早幼粒細胞性白血病藥物中的應用。
6、冬凌草甲素在制備治療慢性粒細胞性白血病藥物中的應用。
7、冬凌草甲素治療不引起骨髓抑制或體重減輕，因而是一種相對安全的抗白血病藥物。
本發明所公開冬凌草甲素在制藥中的應用，其優點表現在(1)本發明對冬凌草甲素發掘了新的醫療用途，開拓了一個新的應用領域。
(2)本發明的冬凌草甲素安全無毒，藥理作用強，預示著很好的藥用前景。
(3)冬凌草甲素在體外可以誘導t(8；21)白血病細胞凋亡。
(4)冬凌草甲素誘導kasumi-1細胞凋亡的過程中存在內源凋亡通路的激活。同時在凋亡過程中存在AML1-ETO融合蛋白的降解。
(5)我們發現了冬凌草甲素對AML1-ETO融合蛋白的降解是通過活化的caspase-3切割的，并且首次確定了一個重要的caspase-3切割位點Asp188。
(6)我們建立了Δ-AE移植小鼠模型和Kasumi-1細胞裸鼠皮下移植瘤模型。從Δ-AE小鼠脾臟分離出的白血病細胞，在體外培養時加入冬凌草甲素可誘導其凋亡。進一步體內實驗研究顯示冬凌草甲素能延長Δ-AE移植鼠的生存時間，抑制Kasumi-1細胞裸鼠皮下移植瘤的生長，而且在這兩種小鼠模型中可顯著減少肝臟、脾臟及骨髓中白血病細胞的浸潤。提示冬凌草甲素有很強的抗白血病效果。


圖1冬凌草甲素的化學結構(C20H28O6)。
圖2A冬凌草甲素誘導t(8；21)白血病細胞凋亡。用冬凌草甲素處理Kasumi-1細胞后進行瑞氏染液染色，并在顯微鏡下進行形態學觀察，顯示細胞出現了凋亡特征性的改變。
圖2BAnnexin V/PI雙染后流式細胞儀檢測細胞凋亡。
圖2C用冬凌草甲素處理后Kasumi-1細胞發生凋亡的比例(AnnexinV陽性的比例)。
圖3冬凌草甲素可以使Kasumi-1細胞PI(-)Rh123陽性細胞明顯減少，說明其可誘導粒體跨膜電位的崩解，這種作用呈時間和劑量依賴性。
圖4WB中顯示了冬凌草甲素處理的Kasumi-1細胞4小時后就出現了細胞色素C釋放以及Casapse-3，Casapse-9的活化，也顯示了Casapse-3的底物PARP發生了降解，這些變化在24小時最顯著，并且具有時間依賴性。
圖5(A)WB檢測顯示冬凌草甲素可以引起Kasumi-1細胞內的融合蛋白AML1-ETO的降解。(B)WB檢測顯示冬凌草甲素可以引起誘導表達AML1-ETO融合蛋白的U937細胞系(U937-A/E)的AML1-ETO蛋白的降解。
圖6Caspase-3特異抑制劑Z-DQMD-FMK阻止了冬凌草甲素引起的AML1-ETO融合蛋白的降解。箭頭所指為降解片段。
圖7瞬時轉染含有Asp188Ala突變的pFLAG-CMV4-A/E質粒的U937細胞中沒有見到AML1-ETO融合蛋白的降解片段。而在轉染野生型和含有Asp171Ala或Asp192Ala突變的pFLAG-CMV4-A/E質粒的U937細胞，冬凌草甲素仍可引起AML1-ETO融合蛋白存的降解。箭頭所指為降解片段。
圖81％F68(pluronic)進行增溶的冬凌草甲素(ori/P)對Kasumi-1的細胞毒作用和DMSO溶解的冬凌草甲素(ori)一致。
圖9Kasumi-1細胞裸鼠皮下移植瘤病理檢測顯示其中布滿了大小不等的瘤細胞。
圖10Kasumi-1細胞移植瘤小鼠脾臟、肝臟、骨髓在有無冬凌草甲素作用下的病理學檢測。示冬凌草甲素可明顯減輕白血病細胞的浸潤、播散，使受到破壞的脾臟、肝臟、骨髓結構恢復正常。
圖11冬凌草甲素可以抑制Kasumi-1細胞裸鼠皮下移植瘤的生長。
圖12AΔAE移植鼠的外周血及骨髓和正常的C57小鼠相比，充斥著大量不成熟細胞。
圖12BΔ-AE移植鼠的肝、脾有大量異常細胞的浸潤。
圖13體外經冬凌草甲素處理24小時后，Δ-AE移植鼠脾臟分離出來的白血病細胞出現了大量的凋亡細胞。
圖14A組織切片顯示，經冬凌草甲素治療的Δ-AE移植鼠的肝臟、脾臟白血病細胞浸潤情況明顯得到改善。
圖14B與對照組相比，經冬凌草甲素治療的Δ-AE移植鼠的脾臟腫大明顯得到改善。
圖14C外周血涂片顯示，對照組Δ-AE移植鼠中有大量的原始細胞存在，而冬凌草甲素治療組上述細胞明顯減少。
圖15冬凌草甲素治療明顯延長Δ-AE移植鼠的生存時間。其中對照組(control)n＝11，冬凌草甲素2.5mg/kg/d組(ori2.5)組n＝8，冬凌草甲素7.5mg/kg/d組(ori7.5)組n＝12，冬凌草甲素15mg/kg/d組(Ori15)n＝8，大劑量阿糖胞苷組(Ara-C-H)n＝9，小劑量阿糖胞苷組(Ara-C-L)n＝6。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明作進一步描述。
實施例1冬凌草甲素誘導t(8；21)白血病細胞凋亡體外研究一、材料和方法1.試劑和儀器冬凌草甲素純度為98％-99.8％。應用DMSO(Sigma)溶解制備成10-2mol/L濃度的儲存液儲存在-20℃。碘化丙碇(Propidium Iodide，PI)為美國Sigma公司產品，碘化丙碇用三蒸水配成250μg/mL的儲存液，4℃避光保存。胎牛血清購自美國Hyclone公司。Annexin V檢測試劑盒(ApoAlert Annexin-V kit)購自美國BD Biosciences公司。流式細胞儀為美國Beckman Coulter公司產品。熒光顯微鏡(Olympus，BX60)及相差顯微鏡(Olympus，IMT)均購自日本Olympus公司。細胞涂片儀cytospin購自英國Shandon公司。
2.細胞培養和處理，細胞形態學觀察人類t(8；21)白血病細胞株Kasumi-1(購自美國生物資源中心，ATCC)，以2×105/ml的起始濃度接種于含10％胎牛血清的RPMI 1640細胞培養液中，在37℃，5％CO2飽和濕度條件下常規培養。Kasumi-1細胞在指數生長期時，細胞密度調整到3×105/ml，應用冬凌草甲素處理，具體應用0.5μM，2μM，5μM三個濃度，在5μM濃度下選擇0h，4h，8h，12h，24h時間點。對照組加入DMSO，濃度為冬凌草甲素處理組相應的最高DMSO濃度。處理結束后應用Cytopro甩片儀甩片后晾干，瑞氏染色，顯微鏡下觀察細胞形態。
3.Annexin V方法檢測細胞凋亡按照Annexin-V檢測試劑盒說明書進行操作，具體步驟如下(1)收獲10×105Kasumi-1細胞經預冷的1×PBS洗滌兩次后用試劑盒自帶的Binding Buffer洗滌1次，重懸于100μL Binding Buffer中；(2)加入5μL Annexin V FITC試劑和5μL的PI，輕輕混勻，避光室溫孵育15-20分鐘；(3)加入400μL Binding Buffer，1小時內流式細胞儀測定。
二、結果和討論冬凌草甲素可以誘導Kasumi-1細胞凋亡，并且這種作用具有劑量和時間依賴性。冬凌草甲素處理過的Kasumi-1細胞形態學上表現出了顯著的凋亡特征，如染色質凝聚，細胞核破裂而細胞膜保持完整。細胞凋亡過程中，細胞膜雙分子層中的磷脂不平衡分布會被破壞，發生磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)由內層向外層的翻轉，暴露在外表面的磷脂酰絲氨酸可被周圍的吞噬細胞識別、吞噬，從而使凋亡細胞得以被清除。Annexin V為一種磷脂結合蛋白，可特異性地識別細胞表面外翻的磷脂酰絲氨酸，所以經常被用于細胞凋亡檢測。PI是一種能結合DNA的紅色熒光染料，但只有在細胞經歷壞死，細胞膜破裂的情況下才可透過細胞膜與DNA結合。所以Annexin V-FITC/PI雙染色的流式細胞儀分析，是檢測懸浮細胞凋亡最敏感和最特異的方法。Annexin V-FITC/PI雙標結果顯示，Annexin V(+)/PI(-)細胞和冬凌草甲素作用密切相關，呈時間依賴性。處理4小時之后，Annexin V(+)/PI(-)細胞就已出現(圖2B)。隨后，在8小時之后出現了壞死樣細胞，表現為Annexin V(+)/PI(-)(圖2B)，且這種細胞隨著時間的延長而增多。
1972年Kerr JF最早提出凋亡(apoptosis)這一概念，在古希臘語表示像秋天的樹葉一樣凋落的死亡方式。他發現結扎大鼠肝的左、中葉門靜脈后，其周圍細胞發生缺血性壞死，但肝動脈供應區的實質細胞仍存活，只是范圍逐漸縮小，其間一些細胞不斷轉變成細胞質小塊，不伴有炎癥發生，與細胞壞死不同。細胞凋亡時，形態上早期細胞核固縮、染色質聚集在核膜內側呈新月形、核碎裂；細胞漿和細胞器密度增高，細胞體積變小；線粒體正常或輕微腫脹；細胞膜皺摺、卷曲，早期細胞膜的完整性未破壞；細胞膜出泡(blebbing)、芽，生成膜包裹的凋亡小體(apoptotic bodies)，內含完整的細胞器和核碎片，常迅速被鄰近的細胞吞噬，周圍組織中無炎癥反應。隨后的研究發現，細胞凋亡是一種普遍存在的現象，它是多細胞生物清除體內不需要的及受損傷細胞的一種天然機制，比如在兩棲類胚胎發育過程中尾和腮的消失及非哺乳期乳腺的退化過程中，都會發生細胞凋亡。正常情況下，磷脂在細胞膜上的分布是不均勻的，卵磷脂(Phosphatidylcholine)和鞘磷脂(sphingomyelin)主要分布在細胞膜的外層，而磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine)和磷脂酰絲氨(phosphati dylserine)則分布在內膜。Tanaka Y等和McEvoy L等發現，受損及老化的紅細胞表面存在PS外翻，可被巨噬細胞特異地識別、吞噬。Fadok VA等于1992年發現，凋亡淋巴細胞的磷脂不對稱分布被破壞，從而被巨噬細胞清除。隨后發現PS外翻是凋亡細胞共有的特征。Annexin V是一種Ca2+離子依賴的磷脂結合蛋白，Andree HA等發現Annexin V優先結合帶負電荷的PS。Koopman G等于1992年首次報道了用FITC耦聯的AnnexinV標記凋亡細胞表面外翻的PS，然后經流式細胞儀檢測的方法。他們發現，碘化丙啶，一種能透過破損的細胞膜而與DNA結合的熒光染料，僅能標記部分Annexin V陽性細胞，說明PS外翻是凋亡的早期事件，隨后才會發生細胞膜的破裂。現在，Annexin V-FITC/PI雙標法已成為檢測細胞凋亡的常規方法。我們的結果表明，冬凌草甲素作為一種二萜類化合物，可以誘導Kasumi-1細胞進入自殺程序。形態學觀察發現，冬凌草甲素處理過的Kasumi-1細胞表現出核固縮、碎裂而細胞膜保持完整等凋亡特征，同時應用Annexin V/PI雙染檢測，也證實冬凌草甲素可以誘導Kasumi-1細胞凋亡，并且這種作用呈時間依賴性。
實施例2冬凌草甲素誘導kasumi-1細胞凋亡分子機制研究一、材料和方法1.試劑和儀器冬凌草甲素、碘化丙碇、胎牛血清見實施例1“材料和方法”。羅丹明(Rhodamine，Rh123)為美國Sigma公司產品，羅丹明用三蒸水配成10μg/mL的儲存液，4℃避光保存。Caspase-3特異抑制劑Z-DQMD-FMK為美國Sigma公司產品，使用前溶解于DMSO保存于-20℃。多聚(ADP-核糖)聚合酶(poly(ADP[adenosinediphosphate]-ribose)polymerase，PARP)抗體，抗ETO抗體購自美國Santa Cruz Biotech公司，抗Caspase-3，Caspase-9抗體，辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗，以及免疫印記顯色系統購于美國Cell Signaling公司。Actin抗體購于美國Sigma公司，細胞色素C釋放凋亡分析試劑盒(Cytochromec Releasing Apoptosis AssayKit)為BioVision公司產品。硝酸纖維素膜為英國Amarsham Biosciences公司產品。PonasteroneA為美國Invitrogen公司產品。流式細胞儀，細胞涂片儀見實施例1“材料和方法”。
2.細胞培養和處理Kasumi-1細胞培養同實施例1，實驗過程中，細胞以2-4×105/ml的密度接種培養，應用1μM，2μM，5μM三個濃度的冬凌草甲素，對照組應用處理組中應用最大體積的DMSO處理Kasumi-1細胞24-48小時后行線粒體跨膜電位的檢測；應用5μM濃度的冬凌草甲素，處理Kasumi-1細胞0，4，8，12，24小時時間點后收獲細胞，收獲細胞總蛋白行免疫印跡實驗；應用2μM，5μM兩個濃度的冬凌草甲素并在有/無50μM Caspase-3特異性抑制劑Z-DQMD-FMK的情況下一起進行孵育觀察細胞形態。誘導表達AML1-ETO融合蛋白的U937穩定轉染細胞系(U937-A/E)培養同Kasumi-1，在冬凌草甲素處理前應用Ponasterone A(PA)5ul/ml處理12小時誘導AML1-ETO融合蛋白表達，冬凌草甲素處理0，4，8，12，24，48小時時間點后收獲細胞，收獲細胞總蛋白行免疫印跡實驗。用細胞涂片儀收集至載玻片，用瑞氏染液染色并置于光學顯微鏡下觀察。
3.流式細胞儀分析細胞線粒體跨膜電位的變化線粒體跨膜電位的檢測應用Rh123(10μg/mL)檢測細胞線粒體跨膜電位，具體操作步驟如下(1)收獲1×106-2×106個kasumi-1細胞經預冷1×PBS洗滌兩次后加入100μL Rh123，輕輕混勻，避光37℃孵育30分鐘；(2)預冷1×PBS洗滌兩次后加入5μL的PI，輕輕混勻，避光室溫反應15分鐘；(3)加入400μL 1×PBS，流式細胞儀測定。
4.細胞色素C釋放分析應用細胞色素C釋放凋亡分析試劑盒，具體步驟如下(1)600g，5分鐘，4℃條件下收獲5×107細胞，預冷1×PBS洗滌1次；(2)用加入DTT和蛋白酶抑制劑的1×Cytosol Extraction BufferMix 1ml重懸細胞，冰上放置10分鐘；(3)應用預冷的組織勻漿破碎細胞，保證細胞膜破碎細胞核完整，大致30-50次；(4)把勻漿轉移至1.5ml離心管中，700g，4℃離心10分鐘；(5)收集上清到一個新的1.5ml離心管中，10000g，4℃離心30分鐘；(6)收集上清為無線粒體細胞漿組分；用加入DTT和蛋白酶抑制劑的Mitochondrial Extraction Buffer Mix 0.1ml重懸沉淀，震蕩混勻10秒鐘為線粒體組分；
(7)應用10μg的無線粒體細胞漿組分和線粒體組分進行常規的免疫印跡實驗(選擇12％聚丙烯酰胺凝膠電泳；應用試劑盒中提供的抗細胞色素C抗體)5.免疫印跡(westen blot，WB)主要操作步驟如下(1)收獲細胞，用預冷1×PBS洗滌2次，每1×106個細胞加入80μL蛋白裂解液(1×SDS蛋白上樣緩沖液)，輕輕混勻，沸水煮5-8分鐘，上樣或分裝凍存在-20℃；(2)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質，根據目的蛋白分子量的不同選擇合適的凝膠濃度(8％-12％)，常規電泳條件(80V電壓溴酚蘭至分離膠后改用120V)；(3)應用濕轉方法將凝膠中的蛋白質轉移到0.22μm硝酸纖維素膜上；(4)硝酸纖維素膜用5％脫脂奶粉-TBS封閉過夜；(5)抗體孵育一抗孵育，選用多克隆或單克隆特異性抗體孵育硝酸纖維素膜，室溫，2小時，70rpm震搖；用TBS-Tween(0.1％)洗膜15分鐘，兩次；二抗孵育，選用對應的二抗孵育硝酸纖維素膜，室溫，1.5小時，70rpm震搖；用TBS-Tween(0.1％)洗膜15分鐘，兩次；(6)顯色，應用帶有辣根過氧化物酶底物的顯色系統顯色；(7)X線片感光，顯影，定影。
二、結果和討論1.冬凌草甲素誘導Kasumi-1細胞的凋亡過程中，伴有線粒體跨膜電位的崩塌，并且誘導Caspases介導的內源性細胞凋亡途徑。
為了闡明冬凌草甲素誘導Kasumi-1細胞凋亡的機制，我們首先通過PI和Rh123雙染檢測該化合物對于線粒體跨膜電位(Δψm)的作用。Rh123是一種親脂性陽離子，可發射綠色熒光，它可被線粒體吸收，正常的活細胞因為線粒體Δψm高，所以其攝入的Rh123也高，因此，細胞會發出綠色熒光。而細胞發生凋亡時線粒體Δψm會降低，從而會減低對Rh123的吸收，細胞表現為Rh123低染。當Kasumi-1細胞用冬凌草甲素5uM處理12小時后(圖3)PI陰性但Rh123低染的細胞開始出現，并隨冬凌草甲素作用時間和劑量逐漸增加。
細胞凋亡是一個相關基因嚴格調控的細胞死亡過程。根據凋亡信號的來源可以將細胞凋亡通路分成兩條外源通路(死亡受體通路)和內源通路(線粒體通路)。這兩條通路最后都匯聚于下游的效應Caspase。效應Caspase在細胞凋亡執行階段能夠直接引起細胞重要蛋白質的降解和核酸酶的激活并最終導致細胞凋亡。本實驗應用免疫印跡來檢測凋亡相關蛋白的變化見圖4。可以看到應用5μM濃度的冬凌草甲素處理Kasumi-1細胞0，4，8，12，24小時時間點的Caspase-3的激活和其上游的Caspase-9的激活以及Caspase-3的重要底物的PARP的降解，并且這些改變和冬凌草甲素的作用濃度和時間有顯著的相關性。我們同時又檢測了細胞線粒體內細胞色素C釋放，實驗顯示冬凌草甲素作用Kasumi-1后線粒體內的細胞色素C釋放到了細胞漿中。
2.冬凌草甲素可以引起Kasumi-1細胞和誘導表達AML1-ETO融合蛋白的U937細胞中融合蛋白AML1-ETO的降解。
冬凌草甲素可以引起Kasumi-1細胞AML1-ETO融合蛋白降解，其中全長AML1-ETO融合蛋白大小約94KD，AML1-ETO降解片段(ΔAML1-ETO，Δ-AE)大小約70KD。應用誘導表達AML1-ETO融合蛋白的U937細胞系(U937-A/E)，也觀察到了冬凌草甲素對AML1-ETO融合蛋白的作用。
細胞凋亡是一個受到一系列相關基因嚴格控制的細胞死亡過程。不同的凋亡信號在細胞中引發不同的凋亡信號轉導通路。根據凋亡信號的來源可以將細胞凋亡信號轉導通路分成兩條主要的途經(1)外源通路(死亡受體通路)和內源通路(線粒體通路)。這兩條通路最后都匯集于下游的效應分子Caspase。效應Caspase在細胞凋亡執行階段能夠直接引起重要蛋白質的降解和核酸酶的激活并最終導致細胞的凋亡。外源凋亡通路主要指死亡受體通路。在一定的受體誘導信號刺激下，細胞膜上的死亡受體與其細胞外的相應配體結合后，受體與細胞質中的轉接蛋白和Caspase-8/-10前體蛋白結合并形成寡聚體，這種寡聚體被稱為“凋亡體”。在凋亡體中激活的Caspase-8/-10進而激活下游的效應Caspase(3，6，7)，引起細胞的凋亡。(2)內源通路(線粒體通路)。由于誘變劑，化療藥物和電離輻射造成的細胞內不可修復的基因組損傷會激活凋亡的內源通路，就是線粒體通路。在多種形式的刺激信號作用于線粒體后，將會引起線粒體釋放細胞色素C，AIF(apoptosis-inducing factor)，和Caspase前體蛋白(2，3，8，9)等促凋亡因子。細胞色素C從線粒體被釋放出來后，與Apaf-1(apoptosisprotease activating factor-1)形成復合體，這個復合體吸引Caspase-9前體加入該復合體，隨后Caspase-9被激活，活化的Caspase-9繼而作用下游的效應Caspase(-3，6，7)，引起細胞凋亡。然而，內源和外源兩條通路并不是孤立存在的，它們之間存在著互相作用。除了以上兩條主要的凋亡通路之外，還存在著其他的一些凋亡途徑。袁鈞英等人發現，內質網是另一個在細胞凋亡執行過程中起著重要作用的細胞器，在某些細胞類型中內質網也是內源凋亡途徑的重要成員。如鈣離子通路和Caspase-12參與了這個過程。另外，細胞核的損傷也可以導致細胞凋亡。由誘變劑，化療藥物和電離輻射造成的細胞內DNA損傷，進而導致細胞的凋亡。細胞骨架系統也是細胞凋亡的感受器。
Caspases是一類特異的半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶(Caspase)。在Caspase蛋白酶當中，有一部分與細胞凋亡無關，而與細胞因子的加工和成熟相關，包括Caspase-1，-4，-5，-11，-12和-13。另一部分則參與細胞凋亡，這部分Caspase又可分為兩類，即啟動性Caspase(initiators)和效應性Caspase(effectors)。啟動性Caspase負責接受來自于上游的凋亡信號，其被激活的過程即為細胞凋亡的啟動過程，包括Caspase-2，-8，-9，-10；效應性Caspase位于凋亡信號轉導通路的下游，負責執行細胞凋亡過程，包括Caspase-3，-6，-7。Caspase可以被“死亡受體”途徑中的多個分子激活。FAS/CD95和TNFR1的凋亡功能直接依賴于Caspase。Caspase也可以經線粒體途徑激活。線粒體損傷或其他原因導致線粒體凋亡因子釋放，包括細胞色素C，Apaf-1和AIF等。在細胞色素C和ATP存在下，Apaf-1能通過其N端的CARD與Caspase-9相應的同源序列結合，激活Caspase-9而引發凋亡。細胞一旦發生凋亡，往往一系列Caspase被激活。因此Caspase除了上述幾種激活形式外，同一種Caspase分子還可以結合成多聚體自我激活，或者依賴于其他激活的Caspase來激活，從而引發一系列的Caspase激活級聯反應，引起細胞的凋亡。活化的Caspase的作用主要包括三類其一是降解那些對細胞有保護作用的蛋白質，從而使凋亡抑制蛋白失活。如Caspase可以降解凋亡抑制蛋白Bc1-2/Bc1-x1，使其轉變成促凋亡蛋白。第二個途徑是通過直接降解凋亡細胞的結構蛋白而使細胞結構遭到破壞。如Caspase可以通過降解核纖層來破壞細胞的結構。核纖層蛋白在核膜下組成核纖層骨架，支撐核膜并且對染色質的結構及核功能也有影響。在凋亡發生時，核纖層蛋白被Caspase切割，導致核骨架崩潰，染色質濃縮等典型的凋亡變化。Caspase第三種特異性的作用方式是切割某些重要的在細胞中具有維持細胞穩態功能核修復功能的靶蛋白。如細胞核DNA修復的蛋白質，DNA復制的蛋白質，mRNA剪切的蛋白質等。
我們的實驗結果顯示冬凌草甲素作用Kasumi-1細胞24-48小時后細胞內的Caspase-3被激活，伴有caspase-3重要底物的PARP的降解。應用Caspase-3特異抑制劑Z-DQMD-FMK和冬凌草甲素同時作用Kasumi-1細胞后，細胞的凋亡被抑制，說明Caspase-3的激活是誘導細胞凋亡的關鍵步驟。我們發現細胞在冬凌草甲素處理后伴隨凋亡的同時，出現了線粒體跨膜電位的降低和Caspase-9的激活，以及線粒體內細胞色素C釋放。Caspase-9的激活是效應Caspase-3激活的上游事件，線粒體中的細胞色素C釋放和Caspase-9的激活作用下游的Caspase-3，引起細胞的凋亡，提示冬凌草甲素誘導Kasumi-1細胞凋亡確實是通過內源通路的介導。而在冬凌草甲素誘導Kasumi-1細胞凋亡的過程中是否還存在著其他的凋亡通路或機制仍需要進一步的研究。
我們的實驗結果顯示，在冬凌草甲素誘導Kasumi-1細胞凋亡的過程中，Kasumi-1細胞中特異的融合蛋白AML1-ETO發生降解。應用誘導表達AML1-ETO融合蛋白的U937細胞系(U937-A/E)，也觀察到了冬凌草甲素對AML1-ETO融合蛋白的降解作用(圖5)。
實施例3AML1-ETO融合蛋白上的caspase-3切割位點的研究一、材料和方法1.試劑和儀器冬凌草甲素，胎牛血清見實施例1“材料和方法”。Caspase-3特異抑制劑Z-DQMD-FMK見實施例2“材料和方法”。抗ETO抗體購自美國SantaCruz Biotech公司。Actin抗體購于美國sigma公司。定點突變試劑盒QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit為美國Stratagene公司產品。質粒大抽試劑盒Plasmid Maxi Preparation Kit為德國QIAGEN公司產品。Gene Pulser電穿孔儀和Cuvette電轉杯為美國Bio-Rad公司產品。
2.Caspase-3特異性抑制劑Z-DQMD-FMK抑制實驗Kasumi-1細胞培養同實施例1，實驗過程中，細胞以2-4×105/ml的密度接種培養，應用2μM，5μM兩個濃度的冬凌草甲素并在有/無50μMCaspase-3特異性抑制劑Z-DQMD-FMK的情況下一起進行孵育后收獲細胞，收獲細胞總蛋白行免疫印跡檢測。
3.突變表達質粒的構建應用QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit進行表達質粒的定點突變。應用含有全長AML1-ETO融合基因的質粒pFLAG-CMV4-AML1-ETO做模板。選擇突變點為AML1-ETO融合蛋白中的Asp171，Asp188，Asp192，突變為Asp171Ala，Asp188Ala，Asp192Ala，均為天冬氨酸突變為丙氨酸。
(1)設計引物見下表。
表1定點突變應用引物，下劃線為突變的堿基

(2)突變鏈合成反應按照QuickChange Site-Directed Mutagenesis試劑盒說明操作，PCR反應條件為95℃ 1分鐘95℃ 50秒60℃ 50秒68℃ 8分鐘68℃ 7分鐘其中95℃ 50秒至68℃ 8分鐘三個步驟進行18個循環。
(3)DpnI限制性核酸內切酶消化合成產物。
突變鏈合成反應產物加入1μL DpnI酶，37℃，水浴1小時。
(4)鈣轉化質粒，挑菌落，抽質粒測序鑒定，大抽質粒。
a.應用QuickChange Site-Directed Mutagenesis試劑盒中的XL10-Gold ultracompetent cell為感受態細菌，取45μL上述細菌，加入2μLβ巰基乙醇混合后冰上放置10分鐘，隨后加入2μL的Dpn I酶處理后的合成產物冰上放置30分鐘，然后42℃水浴30秒，冰上放置2分鐘，把上述處理后的感受肽細菌加入500μL預熱(37℃)的LB液中，37℃，225rpm條件下振搖1小時，鋪于氨芐青霉素陽性LB板上，37℃溫箱孵育16小時后觀察有無菌落長出；b.觀察菌落長出后每個板中挑取6個菌落，擴增細菌，抽取質粒并保存菌種，質粒抽提送測序。測序證實突變成功的質粒大抽。
4.突變質粒瞬時表達和檢測。
人類白血病細胞株U937，以3×105/ml的起始濃度接種于含10％胎牛血清的RPMI1640細胞培養液中，在37℃，5％CO2飽和濕度條件下常規培養。
(1)收獲U937細胞，離心200g，5-10分鐘；(2)用含0.5％FBS的1640重懸細胞，離心200g，5-10分鐘；(3)用轉染緩沖液重懸細胞至2×106/ml，取800μl細胞到1.5mlEppendorf離心管中，加入20μg質粒，混勻；(4)把上述細胞懸液于轉移到0.4cm電轉杯(Gene Pulser Cuvette，Bio-Rad公司產品)，在Gene Pulser電穿孔儀(Bio-Rad公司產品)上轉染，電轉染條件電壓280V，電容1050μF；
(5)電轉染后室溫放置10分鐘；(6)把電轉杯中的細胞轉移到3ml含10％FBS的RPMI1640中，培養24-48小時檢測突變質粒的表達情況。
5.冬凌草甲素作用瞬時轉染突變質粒的細胞，觀察AML1-ETO融合蛋白降解情況。
瞬時轉染含野生型或突變AML1-ETO基因的質粒至U937細胞，培養24小時后，應用5μM冬凌草甲素處理轉染后的細胞，每個突變體分處理組和對照組，對照組應用同樣體積的DMSO處理，處理組用5μM冬凌草甲素處理。培養24小時后常規收獲細胞，提取細胞總蛋白行Western blot檢測AML1-ETO融合蛋白的降解情況。
二、結果和討論1.Caspase-3特異性抑制劑Z-DQMD-FMK抑制實驗冬凌草甲素誘導Kasumi-1細胞凋亡可以被Caspase-3特異抑制劑Z-DQMD-FMK抑制，同時Western blot免疫印跡實驗顯示Z-DQMD-FMK阻止了AML1-ETO融合蛋白的降解(圖6)。
2.突變表達質粒的構建。
應用定點突變的方法得到了三個突變表達質粒，為下一步實驗奠定了基礎。
3.冬凌草甲素處理瞬時表達突變質粒的細胞，觀察各個突變體AML1-ETO融合蛋白的降解情況。
冬凌草甲素可以引起瞬時表達AML1-ETO質粒的細胞發生凋亡。Western blot實驗顯示，在瞬時表達Asp188Ala(D188A)突變質粒的U937細胞(圖7，188)及冬凌草甲素作用該細胞中沒有見到AML1-ETO融合蛋白的降解；而在表達野生型(圖7，AE)、Asp171Ala(圖7，171)和Asp192Ala(圖7，192)突變體的細胞，冬凌草甲素仍可引起AML1-ETO融合蛋白的降解，而且其剪切片段的大小和Kasumi-1細胞中的AML1-ETO融合蛋白剪切片段的大小一致。
Caspases的水解位點均為天冬氨酸(Asp，D)。在本實驗中，具有AML1-ETO融合蛋白的細胞(Kasumi-1、U937-A/E)經冬凌草甲素處理后該蛋白出現降解，應用Caspase-3特異性抑制劑和冬凌草甲素共同作用Kasumi-1細胞，細胞凋亡和AML1-ETO融合蛋白的降解均被阻止，說明AML1-ETO融合蛋白的剪切依賴于Caspase-3的激活，因此我們推論AML1-ETO融合蛋白的降解是Caspase-3介導的。由于94 KDa的AML1-ETO融合蛋白降解后產生一個70KDa的片段(本實驗選用的抗ETO抗體是抗ETO蛋白羧基端一小段多肽的抗體)，同時Caspase-3切割位點通常有天冬氨酸的存在，我們選擇了三個最有可能的切割位點進行突變體的構建(Asp171，Asp188，Asp192)，突變為丙氨酸殘基(Ala)。如果我們選擇的三個氨基酸殘基中存在Caspase-3的切割位點，其發生突變后冬凌草甲素處理就不能引起AML1-ETO融合蛋白的降解，反之，冬凌草甲素仍可誘導AML1-ETO融合蛋白降解。本實驗顯示，在表達AML1-ETO的U937細胞中，Asp188Ala突變可阻止冬凌草甲素引起的AML1-ETO融合蛋白降解。然而，野生型和其他兩種突變(Asp171Ala、Asp192Ala)則不能阻止AML1-ETO融合蛋白被降解；在表達野生型和Asp171Ala、Asp192Ala突變體的U937細胞，AML1-ETO融合蛋白的降解與產生的剪切片段大小和Kasumi-1細胞中AML1-ETO融合蛋白的降解/剪切方式相同。以上結果說明了Asp188是Caspase-3切割AML1-ETO融合蛋白的關鍵位點，同時反過來證明了AML1-ETO融合蛋白的剪切是由激活的Caspase-3實施的。
實施例4冬凌草甲素對移植性白血病小鼠的治療作用及其機制研究材料和方法1.試劑和儀器冬凌草甲素、碘化丙碇、胎牛血清、Annexin V檢測試劑盒(ApoAlertAnnexin-Vkit)見實施例1“材料和方法”。CCK-8試劑盒為日本同仁化學研究所產品。流式細胞儀、熒光顯微鏡及細胞涂片儀見實施例1“材料和方法”。酶聯免疫檢測儀為美國Bio-Tek公司產品。
2.增溶劑增溶的冬凌草甲素細胞毒性實驗小鼠實驗應用的冬凌草甲素是增溶劑助溶的冬凌草甲素儲存液，選用非離子型增溶劑pluronic F68進行增溶，增溶劑濃度為1％，溶劑為雙蒸水，冬凌草甲素濃度為2mg/ml，儲存于4℃。進行小鼠體內實驗前應用MTT法進行增溶劑助溶的冬凌草甲素儲存液細胞毒實驗，確定冬凌草甲素的細胞毒作用沒有受到增溶劑的影響以及增溶劑本身對細胞沒有細胞毒性作用。
MTT試驗方法具體如下(1)接種細胞Kasumi-1以2×105/ml的起始濃度接種于含10％胎牛血清的RPMI1640細胞培養液中，在37℃，5％CO2飽和濕度條件下常規培養至對數生長期，后調至濃度1×105/ml密度，每孔約1×104個細胞接種于96孔板中，每孔體積90μL；(2)冬凌草甲素處理應用DMSO溶解的冬凌草甲素和應用1％pluronic F68進行增溶的冬凌草甲素，設三個濃度(0.5μM，5μM，20μM)以及各自的對照組。每個處理設三復管；(3)培養細胞將培養板在37℃，5％CO2飽和濕度條件下常規培養24小時；(4)呈色培養24小時后，每孔加入CCK-8試劑10μL在37℃，5％CO2飽和濕度條件下常規培養1-4小時，(5)比色選擇450-490nm波長，在酶聯免疫檢測儀上測定每個孔的光吸收值(OD)，記錄結果，計算抑制率。抑制率＝1-OD處理組/OD對照組。
3.Kasumi-1細胞裸鼠皮下移植瘤模型的建立和冬凌草甲素治療作用(1)Kasumi-1細胞，培養至對數生長期，細胞記數，記數活細胞數，調整至細胞密度為1.3×108/ml備用。
(2)小鼠的準備BALB/c裸鼠為中科院上海動物中心購買，4-6周齡，均為雌性，在SPF級環境下飼養。
(3)模型建立及冬凌草甲素處理4-6周齡的裸鼠，每只小鼠右頸肩部皮下注射4×107Kasumi-1細胞，觀察小鼠移植瘤成瘤情況，當小鼠瘤塊可觀察到時(約100mm3)，隨機分為三組，第一組為對照組，應用溶劑(1％增溶劑Pluronic F68)0.1ml/10g體重腹腔注射；第二組應用冬凌草甲素7.5mg/Kg體重腹腔注射治療，每天一次，連續應用至成瘤后12天；第三組應用冬凌草甲素15mg/Kg體重腹腔注射治療，每天一次，連用應用至成瘤后第12天。觀察三組間移植瘤的生長情況和瘤體積的大小。處理完成后處死小鼠行移植瘤病理形態學檢查，以及脾臟、肝臟、骨髓、腎臟等重要臟器的病理形態學檢查明確各組織異常細胞侵潤情況。
4.Δ-AE移植小鼠模型建立和冬凌草甲素治療作用(1)Δ-AE移植小鼠脾臟細胞的制備用逆轉錄病毒將C-末端缺失200個氨基酸的AML1-ETO融合基因轉導入C57小鼠的骨髓單個核細胞，這些細胞作為供體細胞；同時用10cGy的輻射量照射C57小鼠(致死量照射)作為受體鼠。將供體細胞移植至受體小鼠，然后將小鼠飼養在無特定病原體(SPF)的環境中。待小鼠發生白血病后取其脾臟細胞，供下一步實驗用。
(2)小鼠的準備C57小鼠從中科院上海動物中心購買，均為雌性，6-8周齡，在SPF級環境下飼養。
(3)Δ-AE轉基因發病鼠脾臟細胞移植及傳代6-8周齡的C57小鼠經400cGy輻射量照射后，24小時內每只小鼠經尾靜脈注射1×106-2×106Δ-AE移植鼠脾臟活細胞(步驟1得到的細胞)，觀察小鼠的活動狀態，兩周后開始每周檢測血常規，并觀察外周血細胞形態，待小鼠發病后，頸椎脫臼法處死小鼠，取骨髓細胞和脾臟細胞用Cytopro甩片儀甩片后晾干，瑞氏染色，顯微鏡下觀察細胞形態，用部分脾臟細胞繼續傳代，剩余骨髓和脾臟細胞液氮凍存備用。第二代移植小鼠建立時每只尾靜脈注射細胞數為3×106個。
(4)建立Δ-AE轉基因發病鼠移植小鼠，隨機分成6組，第一組為對照組，應用溶劑(1％增溶劑Pluronic F68)0.1ml/10g體重腹腔注射；第二組應用低劑量阿糖胞苷(Ara-C-L)，第三組用高劑量阿糖胞苷(Ara-C-H)治療，第四組用冬凌草甲素2.5mg/kg體重腹腔注射治療，每天一次，連用5天，間隔2天，連用2周，第五組用冬凌草甲素7.5mg/kg體重腹腔注射治療，每天一次，連用5天，間隔2天，連用2周，第六組應用冬凌草甲素15mg/kg體重腹腔注射治療，每天一次，連用5天，間隔2天，連用2周。處理均在移植后的第7天后進行。實驗期間觀察小鼠一般狀況，生存期，體重，外周血等情況。待小鼠發病至垂死狀態時處死小鼠取脾臟，觀察大小，收取脾臟和骨髓細胞，并行脾臟、肝臟、骨髓、腎臟等重要臟器的病理形態學檢查明確各組織異常細胞侵潤情況。
結果和討論1.1％F68(pluronic)進行增溶的冬凌草甲素(2mg/ml)對Kasumi-1的細胞毒作用和DMSO溶解的冬凌草甲素一致，并且1％pluronic F68的溶劑對Kasumi-1的細胞沒有毒性(結果未顯示)。
2.Kasumi-1細胞裸鼠皮下移植瘤模型的建立Kasumi-1細胞裸鼠皮下移植瘤模型的建立系采用常規細胞裸鼠皮下移植瘤的方法。Kasumi-1細胞培養至對數生長期調整至細胞密度為1.3×108/ml。應用4-6周齡的BALB/c裸鼠，每只小鼠右頸肩部皮下注射4×107Kasumi-1細胞，觀察小鼠移植瘤成瘤情況并計算瘤體積，其中瘤體積＝長×寬2×π/6。當小鼠瘤塊可觀察到(此時體積在100mm3左右)時將小鼠隨機分組。裸鼠成瘤時間為移植后5-16天，成瘤率100％。組織形態學檢查和重要臟器組織病理檢查，觀察到了小鼠瘤體中大量的Kasumi-1細胞(圖9)，并且這些細胞在脾臟和肝臟以及骨髓中都可以見到，尤其在脾臟中彌漫著大量的異常細胞，導致了脾臟的正常結構的喪失(圖10，CON)。
3.冬凌草甲素可以抑制Kasumi-1細胞裸鼠皮下移植瘤的生長于小鼠瘤塊可觀察到時隨機分為三組，第一組為對照組，應用溶劑(1％增溶劑Pluronic F68)0.1ml/10g體重腹腔注射，第二組應用冬凌草甲素7.5mg/Kg體重腹腔注射治療，每天一次，連續應用至成瘤第12天，第三組應用冬凌草甲素15mg/Kg體重腹腔注射治療每天一次，連續應用至成瘤第12天。病理學檢測發現冬凌草甲素治療組的脾臟中異常細胞比對照組明顯減少，肝臟及骨髓中更是少見異常腫瘤細胞(圖10，Ori)。觀察三組間移植瘤的生長情況，可以看到在治療組小鼠的移植瘤生長要慢于對照組(圖11)。對照組和冬凌草甲素7.5mg/kg組有顯著性差別(P＝0.002，n＝10)，對照組和冬凌草甲素15mg/kg組有顯著性差別(P＝0.001，n＝10)，冬凌草甲素7.5mg/kg組和冬凌草甲素15mg/kg組沒有顯著性差別(P＝0.892)。
4.Δ-AE移植鼠模型的建立與正常C57小鼠相比，Δ-AE移植鼠的外周血及骨髓中，充斥著大量不成熟細胞(圖12A)，這些細胞體積大，核漿比例高，細胞核多為圓型或橢圓形。此外，患病鼠的脾臟明顯增大。脾臟中的侵潤現象非常嚴重，存在大量的白血病細胞，正常的脾小結結構被破壞。肝臟的血管周圍及肝血竇內同樣可觀察到大量侵潤的白血病細胞存在(圖12B，C57)。
5.冬凌草甲素可以在體外誘導Δ-AE移植鼠脾細胞的凋亡把從Δ-AE移植鼠發病鼠脾臟里分離的白血病細胞在10％胎牛血清的RPMI1640細胞培養液中進行體外培養，加入冬凌草甲素5μM后觀察其誘導凋亡效應。冬凌草甲素處理24小時后Annexin V/PI雙染法顯示有57.4％的細胞發生凋亡，而相應的沒有用冬凌草甲素處理的細胞體外培養24小時凋亡細胞為36.3％。Annexin V/PI雙染法分析表明，盡管脾細胞體外培養對照組也會出發生凋亡，但冬凌草甲素處理組凋亡細胞的比例明顯增加。同時，形態學顯示，體外經冬凌草甲素處理24小時后，出現了大量的凋亡細胞，其特征為核固縮破裂等早期凋亡表現，部分細胞則呈現繼發性壞死(圖13)。
6.冬凌草甲素可以延長Δ-AE移植鼠的生存期，并減少白血病細胞的浸潤。
Δ-AE移植小鼠隨機分成6組，按材料和方法中介紹的方法對小鼠進行治療。外周血涂片顯示，患病的Δ-AE轉基因小鼠移植鼠中有大量的原始細胞存在，形態學上表現為細胞體積大，核漿比例高，細胞核未分葉，多呈圓形，而冬凌草甲素處理組中上述細胞較少(圖14A)。待小鼠發病致垂死狀態，頸椎脫臼法處死小鼠，解剖對照組和藥物處理組小鼠并行病理學檢測。發現用藥組小鼠的脾臟明顯小于患病組(圖14B)，肝臟、脾臟病理學檢測顯示對照組Δ-AE移植鼠肝臟、脾臟內存在大量白血病細胞，而經冬凌草甲素治療的小鼠肝、脾浸潤情況明顯改善，其白血病細胞明顯減少，肝、脾的正常結構得以恢復(圖14C)。
小鼠生存期比較對照組小鼠于22天開始出現死亡，27天全部死亡，平均生存期為23.8天，中位生存期23.0天；冬凌草甲素2.5mg/kg/d組小鼠25天開始出現死亡，31天全部死亡，平均生存期為28.3天，中位生存期28.0天；冬凌草甲素7.5mg/kg/d組小鼠24天開始出現死亡，36天全部死亡，平均生存期為29.8天，中位生存期30天；冬凌草甲素15mg/kg/d組小鼠24天開始出現死亡，36天全部死亡，平均生存期為31.3天，中位生存期32天。不同處理組的生存期在統計學上存在顯著差異(P＝0.0001)，表明冬凌草甲素可顯著延長Δ-AE移植小鼠的生存時間，因而對白血病有明確而良好的治療作用。我們還比較了冬凌草甲素與阿糖胞苷對Δ-AE移植性白血病小鼠模型的療效，發現冬凌草甲素在2.5mg/kg/d的劑量下對Δ-AE移植小鼠治療10天產生的療效與阿糖胞苷25mg/kg/d治療5天(小劑量阿糖胞苷)的療效相當，7.5、15mg/kg/d冬凌草甲素的療效優于小劑量阿糖胞苷；25mg/kg/d阿糖胞苷治療10天(大劑量阿糖胞苷)雖然對部分白血病小鼠(4/9)的療效較冬凌草甲素好，但卻引起其他小鼠(5/9)的早期死亡(生存時間僅為18天)。與大劑量阿糖胞苷不同，冬凌草甲素在2.5-15mg/kg/d的劑量下并不引起小鼠骨髓抑制或體重減輕。因而冬凌草甲素在白血病的治療中有療效確切、毒副作用小的特點。
Poloxamer188(Pluronic F68)為聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，是目前用于靜脈乳劑極少數合成乳化劑之一，也是一種非離子型增溶劑。本實驗選用Pluronic F68來增加冬凌草甲素的溶解度。
通過本發明工作，我們發現香茶菜屬二萜類化合物冬凌草甲素能延長Δ-AE移植鼠的生存時間，而該化合物也可以抑制Kasumi-1細胞裸鼠皮下移植瘤的生長，冬凌草甲素同時可以減少這兩種模型小鼠腫瘤細胞的浸潤；白血病細胞體外培養實驗表明，冬凌草甲素可在體外迅速誘導Δ-AE移植鼠白血病細胞凋亡。以上的結果顯示該化合物有很強的抗白血病效果。
目前，對白血病的治療主要以化療為主，輔以骨髓及臍血移植。全反式維甲酸(ATRA)的分化療法、As2O3的凋亡療法及二者的聯合使用使人們對APL這種特殊類型的白血病的治療有了里程碑式的飛躍。而對于其他類型的急性白血病還是以殺傷白血病細胞的化學治療為主。因此，不斷開發新型、安全有效的抗白血病藥物仍是擺在廣大科研工作者面前的一項迫切任務。
綜上研究，冬凌草甲素在Δ-AE移植鼠模型和Kasumi-1細胞裸鼠皮下移植瘤模型中的治療效果說明，該化合物有著很好的臨床應用前景，有可能成為一種新的抗白血病藥物。
實施例5冬凌草甲素對其他白血病細胞作用的研究一、材料和方法1.試劑和儀器冬凌草甲素純度為98％-99.8％。應用DMSO(Sigma)溶解制備成10-2mol/L濃度的儲存液儲存在-20℃。碘化丙碇(Propidium Iodide，PI)為美國Sigma公司產品，碘化丙碇用三蒸水配成250μg/mL的儲存液，4℃避光保存。胎牛血清購自美國Hyclone公司。Annexin V檢測試劑盒(ApoAlert Annexin-V kit)購自美國BD Biosciences公司。流式細胞儀為美國Beckman Coulter公司產品。熒光顯微鏡(Olympus，BX60)及相差顯微鏡(Olympus，IMT)均購自日本Olympus公司。細胞涂片儀cytospin購自英國Shandon公司。
2.細胞培養和處理，細胞形態學觀察不具有t(8；21)染色體易位的AML M2細胞株HL-60、急性單核細胞性白血病U937細胞株、慢性粒細胞性白血病細胞株K562、急性早幼粒細胞性白血病細胞株NB4，以及從不具有t(8；21)染色體易位的AML M2病人、急性早幼粒細胞性白血病和慢性粒細胞性白血病病人原代白血病細胞。
上述細胞株以2×105/ml的起始濃度接種于含10％胎牛血清的RPMI1640細胞培養液中，在37℃，5％CO2飽和濕度條件下常規培養。上述細胞在指數生長期時，細胞密度調整到3×105/ml，應用冬凌草甲素處理，具體應用8μM，20μM，25μM三個濃度，在5μM濃度下選擇0h，4h，8h，12h，24h時間點，對照組應用處理組中加入最大體積的DMSO。處理結束后行流式儀檢測細胞。凋亡，應用Cytopro甩片儀甩片后晾干，瑞氏染色，顯微鏡下觀察細胞形態。
3.Annexin V方法檢測細胞凋亡按照Annexin V檢測試劑盒說明書進行操作，具體步驟如下(1)分別收獲(5-10)×105HL-60、U937、K562、NB4細胞，細胞經預冷的1×PBS洗滌兩次后用試劑盒自帶的Binding Buffer洗滌1次，重懸于100μL Binding Buffer中；(2)加入5μL Annexin V-FITC試劑和5μL的PI，輕輕混勻，避光室溫孵育15-20分鐘；(3)加入400μL Binding Buffer，1小時內流式細胞儀測定。
二、結果和討論冬凌草甲素可以誘導HL-60、U937、K562、NB4細胞發生凋亡，并且這種作用具有劑量和時間依賴性。冬凌草甲素處理過的細胞形態學上表現出了顯著的凋亡特征，如染色質凝聚，細胞核破裂而細胞膜保持完整。細胞凋亡過程中，細胞膜雙分子層中的磷脂不平衡分布會被破壞，發生磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)由內層向外層的翻轉，暴露在外表面的磷脂酰絲氨酸可被周圍的吞噬細胞識別、吞噬，從而使凋亡細胞得以被清除。Annexin V為一種磷脂結合蛋白，可特異性地識別細胞表面外翻的磷脂酰絲氨酸，所以經常被用于細胞凋亡檢測。PI是一種能結合DNA的紅色熒光染料，但只有在細胞經歷壞死，細胞膜破裂的情況下才可透過細胞膜與DNA結合。所以Annexin V-FITC/PI雙染色的流式細胞儀分析，是檢測懸浮細胞凋亡最敏感和最特異的方法。Annexin V-FITC/PI雙染結果顯示，Annexin V(+)/PI(-)細胞和冬凌草甲素作用密切相關，呈時間依賴性。處理4小時之后，Annexin V(+)/PI(-)細胞就已出現。隨后，Annexin V(+)/PI(+)細胞隨著時間的延長而增多。
冬凌草甲素雖然也可以誘導這些細胞發生凋亡，但需要的濃度較高，為8-25μM。
權利要求
1.冬凌草甲素在制備治療急性白血病藥物中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，冬凌草甲素在制備治療含有AMLl-ETO融合基因的急性髓性白血病藥物中的應用。
3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于白血病細胞1-20×105個細胞/毫升，冬凌草甲素使用量0.5-5μM。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于白血病細胞1-20×105個細胞/毫升，冬凌草甲素使用量2-5μM。
5.根據權利要求1所述的應用，冬凌草甲素在制備治療不含有AMLl-ETO融合基因的急性髓性白血病藥物中的應用。
6.根據權利要求1所述的應用，冬凌草甲素在制備治療急性單核細胞性白血病藥物中的應用。
7.根據權利要求1所述的應用，冬凌草甲素在制備治療急性早幼粒細胞性白血病藥物中的應用。
8.根據權利要求5或6或7所述的應用，其特征在于白血病細胞1-20×105個細胞/毫升，冬凌草甲素使用量8-25μM。
9.冬凌草甲素在制備治療慢性粒細胞性白血病藥物中的應用。
10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于白血病細胞1-20×105個細胞/毫升，冬凌草甲素使用量8-25μM。
全文摘要
本發明涉及冬凌草甲素在制備治療急性白血病藥物中的應用；和冬凌草甲素在制備治療慢性粒細胞性白血病藥物中的應用。本發明對冬凌草甲素發掘了新的醫療用途，開拓了一個新的應用領域。冬凌草甲素安全無毒，藥理作用強，預示著很好的藥用前景。冬凌草甲素在體外可誘導白血病細胞凋亡，在體內可延長t(8；21)白血病小鼠模型的生存期，或延緩腫瘤在體內的生長。冬凌草甲素可激活內源性凋亡通路，使在t(8；21)白血病發生過程中起關鍵作用的AML1－ETO融合蛋白發生降解。冬凌草甲素對AML1－ETO融合蛋白的降解是通過活化caspase－3產生的。本發明還首次確定了一個重要的caspase－3切割位點。
文檔編號A61P35/00GK1994293SQ200610030200
公開日2007年7月11日 申請日期2006年8月18日 優先權日2006年8月18日
發明者陳竺, 周光飚, 陳賽娟, 王振義 申請人:上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院