專利名稱：與利培酮臨床療效相關的核酸序列的制作方法
技術領域：
本發明涉及的是一種基因技術領域的核酸序列，特別是一種與利培酮臨床療效相關的核酸序列。
背景技術：
利培酮(risperidone)是新一代的抗精神病藥物，1984年由比利時楊森制藥公司開發，商品名為維思通(Risperidal)，為苯異噁唑(benzisoxazole)衍生物，它與5-HT2受體和DRD2受體都有很高的親和力，與第一代抗精神病藥物相比，利培酮對精神分裂癥的陽性癥狀及陰性癥狀均有良好療效，且錐體外系癥狀(EPS)等不良反應發生率低(Leysen JE，Gommeren W，Eens A，De Chaffog De CoucellesD，Stoof JC，Janssen PAJ.Biochemical profile of risperidone，a newantipsychotic.J Pharmacol Exp Ther 1988；247661-670)。在實際應用中，利培酮的臨床療效存在很大的個體差異，僅有約50％的用藥患者可獲得較好療效，其它的服藥患者則療效不明顯、甚至出現嚴重的不良反應，而目前臨床上除了試錯試驗外，尚無有效預測利培酮藥物效應的方法，這種臨床療效的不確定性已成為用藥安全的重要隱患，而且浪費了大量醫療資源(Miyamoto S，Duncan GE，Marx CE，Lieberman JA.Treatments for schizophreniaacritical review of pharmacology and mechanisms of action of antipsychoticdrugs.Mol Psychiatry 2005；10(1)79-104)。現有研究結果顯示，遺傳因素是利培酮臨床療效產生個體差異的重要原因，與利培酮臨床療效相關的基因主要包括代謝酶、轉運體、靶點等的編碼基因。DRD2是利培酮的主要作用靶點(Kapur S，Zipursky RB，Remington G.Clinical and theoretical implicationsof 5-HT2 and D2 receptor occupancy of clozapine，risperidone，andolanzapine in schizophrenia.Am J Psychiatry 1999；156(2)286-93)，DRD2基因的多態性可顯著影響DRD2的功能，這提示DRD2基因的多態性可能與利培酮臨床療效的個體差異有關。
單核苷酸多態性rs1799978(A-241G)位于DRD2基因上游調控區，經對現有技術文獻的檢索發現，至今未見關于DRD2基因的單核苷酸多態性位點rs1799978與利培酮臨床療效相關，可作為分子標記用于預測利培酮臨床療效的相關報道。
發明內容
本發明的目的在于克服現有技術中的不足，提供一種與利培酮臨床療效相關的核酸序列。使其可用于預測利培酮的臨床療效、指導利培酮的個體化治療。
本發明是通過以下技術方案實現的，本發明所分離出的DNA分子，它具有SEQ ID NO1所示的序列，在SEQ ID NO1所示序列的第251位為單核苷酸多態性位點rs1799978，所述的單核苷酸多態性位點rs1799978，是指在SEQ NO1所示序列中的第251為存在A，在其DNA互補鏈上為T等位位點，位于DRD2基因上游-241位。
所述的SEQ ID NO1序列，其中，第251位的單核苷酸多態性位點為A純合子。個體利用利培酮治療更易于獲得較好療效。根據該多態性的等位位點特征可以預測利培酮的臨床療效，指導臨床合理用藥。
本發明所述利培酮臨床療效相關核酸序列如SEQ NO.1所示(a)序列特征*長度1000堿基對*類型核酸*鏈型雙鏈*拓撲結構線形(b)分子類型基因組DNA(gDNA文庫)(c)假設否(d)反義否(e)最初來源人(f)SEQ ID NO.1核酸序列描述如下ggcctccttt tgcatttcca tgtcaggtca actccaaaca ggctttttcc 50tttggatgag tccagcaata gaactgacta catagattcc aagacctgaa 100gtcagaaaac ggatgcggac ctcttccaac acctcctctc cttgcctgac 150ttgctggatg ggtggtgcct cccgcaaccc ttggcttctg agtcctcaaa 200
ggagaagact ggcgagcaga cggtgaggac ccagcctgca atcacagctt 250attactctgg gtgtgggtgg gagcgcagtg ggcggtcgag ggttgcgttc 300ccgcctcaaa acaagggatg gcggaatccc ccaacccctc ctacccgttc 350aggccgggga tcgccgagga ggtacagctc ctttggtggg gggcgggggc 400ggggcctgtc tcaggggcgg ggaccggggc acctccctcc cgcgctcccc 450gcgctcgggc gccgcagagc tgtccagctt cagtgccgaa ccggcagcct 500cacgcgcgca ccgcgccgcc tccgccccgt ccccgcgctc cctcctgccc 550gcccgccccg cgcccggccc cgccccgccc cgccccgccg cggcccgtcc 600actgctcccc gcgggccaga gccggccgag ctgctgcccg ccggggctct 650gaacggcgcg gcggggccgg gagccaggga ccggccgagg agagtggcgg 700ccccggacgg ctgccggagg ggcggccgcg cgtggatgcg gcgggagctg 750gaagcctcaa gcagccggcg ccgtctctgc ccccgggcgc cctatggctt 800gaaggtaagc accggccgga tggagcggcg ggcgactcag tgtcacgggg 850agaggaggag ggacctccaa ggggagcgag gccaggacca gaagtttgtg 900cggccactcc tggccgcctg ctcgggagcg cccgcctggg atccggctct 950gcatgggctc cccgtcgggc gggggcagag ggcgtctgga gcccgcggct 1000序列中251號的字母代表單核苷酸多態性位點(single nucleotidepolymorphisms，SNP)A/G的等位位點位置。
利用本發明提供的利培酮臨床療效相關的單核苷酸多態性位點的核酸序列，構建預測利培酮臨床療效的試劑盒，可用于利培酮的個體化治療。
具體實施例方式
以下結合具體實施例，以進一步說明本發明。應理解，以下實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。
實施例1基因的收集和抽提精神分裂癥患者來自于中國上海市精神衛生中心，以DSM-IV(中國精神病分類方案與診斷標準第二版修訂版)為診斷標準。在知情同意的前提下參加本課題的研究，采集血液，并簽署知情同意書。所有入組患者均無第二代抗精神病藥物用藥史，經過周期為4周的藥物清洗期后開始臨床實驗。分別于實驗開始、4周、8周時采用簡明精神病量表(Brief Psychiatric Rating Scale，BPRS)對患者臨床癥狀評分，BPRS減分率大于或等于40％者定義為有效，小于40％者為無效。
實施例2核苷酸序列的獲得以及單核苷酸多態性位點rs1799978的檢測本發明采用直接測序的方法對DRD2基因單核苷酸多態性位點rs1799978(其等位位點為A/G)等位位點在利培酮治療有效患者組和利培酮治療無效患者組中的頻率分布情況進行了檢測。PCR反應均采用96孔板，用Gene Amp PCR system9700完成。
(1)PCR反應擴增引物正向引物(Pri-F)5’-CCCCACCAAAGGAGCTGTACCT-3’(SEQ ID NO2)反向引物(Pri-R)5’-CAGAAAACGGATGCGGACCTCT-3’(SEQ ID NO3)反應試劑反應體系總體積為10.0ul，其中ddH2O 5.8ul滅菌雙蒸水Buffer 1.0ul聚合反應緩沖液包含Mg2+ Tris-HCl溶液dNTP1.0ul2mM dNTP溶液Pri-F 0.5ul 10pmol/ul正向引物Pri-R 0.5ul 10pmol/ul反向引物Taq0.2ul DNA合成多聚酶DNA1.0ul 10ng/ul人體DNA擴增模板反應條件94℃ 4min，37×(94℃ 30s，68℃ 30s，72℃ 60s)，72℃ 10min，4℃∞(2)測序反應PCR產物采用shrimp alkaline phosphatase(Roche，Basel，Switzerland)and exonulease I純化，具體過程按說明書操作。
測序反應體系DNA 3.0ul 純化后DNA，計200ngBDT 1.0ul ABI BigDyeTerminator Cylce sequencing Ready Reaction
Kit 3.1Primer 1.0ul所獲得的PCR產物的正向或反向引物3pmol/ul測序反應條件96℃ 2min，40×(94℃ 30s，50℃ 30s，60℃ 120s)，4℃∞結束后加入70％乙醇避光靜置15分鐘，4000轉/分鐘離心30分鐘，甩去乙醇，70％乙醇洗兩次，靜置晾干，加入HIDI變性后上樣。測序采用ABI PRISM3100 DNA Sequencer進行。
實施例3單核苷酸多態性位點rs1799978與利培酮臨床療效的相關性統計利用SPSS10.0計算等位位點、基因型的分布和Hardy-Weinberg平衡，并計算Odds Ratio(OR)及其95％的可信區間，采用G Power Program計算所用樣本量的統計學力度，選用卡方檢驗進行統計學分析，統計學的顯著性水平設定為P小于0.05。
結果位于11q22-23區域DRD2基因上游調控區的rs1799978(其等位位點為A/G)等位位點在利培酮治療有效患者組和利培酮治療無效患者組中的頻率分布情況見表1。
表1.rs1799978等位位點和基因型在利培酮治療有效患者組和無效患者組中的分布和分析結果
注OROdds Ratio；CIConfidence intervals從上表可見，位于11q22-23區域DRD2基因上的常見型單核苷酸多態性位點rs1799978的A等位位點，即在其DNA互補鏈上為T等位位點，在利培酮治療有效組中的分布頻率明顯大于其在利培酮治療無效組中的頻率(P＝0.007)，因此可作為預測利培酮臨床療效的標記分子。rs1799978位于DRD2基因上游-241位，可能影響DRD2基因的表達，或與其它功能性多態性位點連鎖。
本發明的具有實用性的例證1)可以利用本發明所介紹的rs1799978的A等位位點(即在其DNA互補鏈上為T等位位點)作為預測利培酮臨床療效的標記分子，為臨床合理用藥提供依據。
2)利用本發明提供的多態性位點rs1799978的核酸序列，構建用于指導利培酮個體化治療的試劑盒。
3)由于DRD2基因是多種抗精神病藥物的作用靶點，因此，本發明為今后對DRD2基因與其他抗精神病藥物療效關系公開了前期最寶貴的經驗、實驗基礎和應用技術。
序列表<110>上海交通大學<120>與利培酮臨床療效相關的核酸序列<160>1<210>1<211>1000<212>DNA<213>人類(Homo sapiens)<220>
<221>allele<222>(251)…(251)<223>序列中第251位核苷酸為a或g<400>1ggcctccttt tgcatttcca tgtcaggtca actccaaaca ggctttttcc 50
tttggatgag tccagcaata gaactgacta catagattcc aagacctgaa 100gtcagaaaac ggatgcggac ctcttccaac acctcctctc cttgcctgac 150ttgctggatg ggtggtgcct cccgcaaccc ttggcttctg agtcctcaaa 200ggagaagact ggcgagcaga cggtgaggac ccagcctgca atcacagctt 250attactctgg gtgtgggtgg gagcgcagtg ggcggtcgag ggttgcgttc 300ccgcctcaaa acaagggatg gcggaatccc ccaacccctc ctacccgttc 350aggccgggga tcgccgagga ggtacagctc ctttggtggg gggcgggggc 400ggggcctgtc tcaggggcgg ggaccggggc acctccctcc cgcgctcccc 450gcgctcgggc gccgcagagc tgtccagctt cagtgccgaa ccggcagcct 500cacgcgcgca ccgcgccgcc tccgccccgt ccccgcgctc cctcctgccc 550gcccgccccg cgcccggccc cgccccgccc cgccccgccg cggcccgtcc 600actgctcccc gcgggccaga gccggccgag ctgctgcccg ccggggctct 650gaacggcgcg gcggggccgg gagccaggga ccggccgagg agagtggcgg 700ccccggacgg ctgccggagg ggcggccgcg cgtggatgcg gcgggagctg 750gaagcctcaa gcagccggcg ccgtctctgc ccccgggcgc cctatggctt 800gaaggtaagc accggccgga tggagcggcg ggcgactcag tgtcacgggg 850agaggaggag ggacctccaa ggggagcgag gccaggacca gaagtttgtg 900cggccactcc tggccgcctg ctcgggagcg cccgcctggg atccggctct 950gcatgggctc cccgtcgggc gggggcagag ggcgtctgga gcccgcggct 1000
權利要求
1.一種與利培酮臨床療效相關的核酸序列，其特征在于，所分離出的DNA分子，它具有SEQ ID NO1所示的序列，在SEQ ID NO1所示序列的第251位為單核苷酸多態性位點rs1799978。
2.根據權利要求1所述的與利培酮臨床療效相關的核酸序列，其特征是，所述的單核苷酸多態性位點rs1799978，是指在SEQ NO1所示序列中的第251為存在A。
3.根據權利要求2所述的與利培酮臨床療效相關的核酸序列，其特征是，所述的DNA，在其互補鏈上為T等位位點，位于DRD2基因上游-241位。
4.根據權利要求1所述的與利培酮臨床療效相關的核酸序列，其特征是，所述的SEQ ID NO1序列，其中，第251位的單核苷酸多態性位點為A純合子。
全文摘要
本發明涉及的是一種基因技術領域的與利培酮臨床療效相關的核酸序列。本發明所分離出的DNA分子，它具有SEQ ID NO1所示的序列，在SEQ ID NO1所示序列的第251位為單核苷酸多態性位點rs1799978，所述的單核苷酸多態性位點rs1799978是指在SEQ NO1所示序列中的第251為存在A。所述的DNA，在其互補鏈上為T等位位點，位于DRD2基因上游－241位。所述的SEQ ID NO1序列，其中，第251位的單核苷酸多態性位點為A純合子。通過本發明預測利培酮的臨床療效不依賴于醫生的主觀判斷，且時效性強，因此是臨床合理用藥可以借助的有力工具。
文檔編號A61P25/00GK1884528SQ200610028329
公開日2006年12月27日 申請日期2006年6月29日 優先權日2006年6月29日
發明者賀林, 邢清和, 秦煒, 高建軍, 錢學慶, 李華芳 申請人:上海交通大學