專利名稱：氨基酸改性殼聚糖親核no供體及其合成方法
技術領域：
本發明涉及一種醫藥工程技術領域的藥物及其合成方法，具體是一種氨基酸改性殼聚糖親核NO供體及其合成方法。
背景技術：
在最近的十年中，國外對基于含有[N(O)NO]-官能團的NO供體控釋材料進行了大量的研究。最初的研究集中于將離子型的親核NO供體NONOate分散于各種疏水性聚合物中，通過NO的釋放增強這些材料的血液相容性。雖然這些研究取得了相當大的成功，但是研究發現，親水性的NO供體會從聚合物中滲出，在血液中形成致癌性的N-亞硝胺物質。將這類材料應用于臨床，還必須考慮以下幾點作為聚合物基體材料的生物相容性和生物可降解性。親核試劑的細胞毒性和生物相容性。有一些[N(O)NO]-基團載體如二乙烯三胺發現對身體有害；聚乙烯亞胺(PEI)會誘導廣泛的細胞死亡，生物相容性較差。因此選用無毒的有良好生物相容性的NO載體引起人們的關注。其中的解決辦法之一就是采用對身體無害的具有仲胺基團的親核載體如聚氨基酸、小分子多肽。
氨基酸是生物體內大量存在的同時具有氨基和羧基的雙官能團生命小分子配體。氨基酸是合成人體蛋白質、激素、酶及抗體的原料，參與人體內正常的代謝和生理活動。而且，氨基酸是生物體中重要的生命物質，是組成酶和蛋白質的基本單元。作為小分子，氨基酸對生物大分子的活性及其生理功能起著極為重要的作用；作為配體，它可與多種金屬離子配位，為研究抗腫瘤、抗癌藥物提供信息。各種氨基酸在生物體中具有不同的生物功能，如生物體中的色氨酸與腦的正常代謝有密切的關系，L-半胱氨酸能增強生物體的抗病能力等。因此目前，聚氨基酸類材料在藥物控制釋放方面的應用又引起了廣泛的關注。氨基酸在人體內通過酶的作用，參與新陳代謝，營養物質被人體吸收，代謝產物為無機小分子，由排泄系統排出體外，所以具有良好的生物相容性。
經對現有技術的文獻檢索發現，Bohl等在《Biomaterials》(生物材料)(2000，212273-2278)上發表了“Nitric oxide-generating polymers reduceplatelet adhesion and smooth muscle cell proliferation”(NO產生聚合物減少血小板粘附和平滑肌細胞增殖)，該文提出了采用氨基酸對具有光學活性的聚乙二醇(PEG)和聚乙烯醇(PVA)改性使其具有親核的NH基團。同NO反應后，得到一系列不同半衰期的NO釋放凝膠材料。其不足之處在于所用的基體材料生物相容性欠佳，由于基體材料的水溶性不能制備機械性能良好的薄膜和涂層。
美國專利USP6261594(Chitosan-based nitric oxide donor compositions)以及USP6451337(Chitosan-based nitric oxide donor compositions)提出了將改性殼聚糖作為親核NO載體，合成出系列殼聚糖-NO加成物。殼聚糖的具體的改性分為兩類(1)親水基團改性N-羧丁基殼聚糖，N-羧乙基殼聚糖，N-羧甲基殼聚糖。(2)疏水性基團改性N-丙基殼聚糖，N-羧乙基殼聚糖甲酯。其不足之處在于改性殼聚糖的生物相容性差，NO的負載程度較低。
發明內容
本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種氨基酸改性殼聚糖親核NO供體及其合成方法。本發明采用氨基酸對殼聚糖進行改性，從而提供更多的親核位點，提高NO的負載量，同時通過殼聚糖和氨基酸這兩種都具有良好生物相容性的材料的結合，有助于解決此類NO供體藥物應用于臨床存在的問題。
本發明是通過以下技術方案實現的本發明所述的氨基酸改性殼聚糖親核NO供體，殼聚糖作為基體材料，采用氨基酸改性增加其親核位點(NH基團)，與NO反應產生[N(O)NO]-官能團，分子結構如下
其中[N(O)NO]-官能團為NH基團同NO反應形成，NH基團來自于氨基酸的氨基NH2或殼聚糖分子結構中的氨基NH2改性反應；R為直鏈或支鏈的烷基。
當氨基酸在殼聚糖的C6位上發生反應時，氨基酸分子上的氨基NH2與C6位羧化殼聚糖分子上的COOH反應，形成NH位點，與NO反應形成[N(O)NO]-基團。
當氨基酸在殼聚糖的C2位發生反應時，氨基酸分子上的羧基和殼聚糖分子中的氨基NH2反應形成NH位點，與NO反應形成[N(O)NO]-基團。
本發明所述的氨基酸改性殼聚糖親核NO供體合成方法，可以采用以下兩種中的任意一種方法(1)在C6位點引入氨基酸。將C6-O羧化殼聚糖的羧基COOH先用N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和二環己基碳二亞胺(DCC)或EDC進行活化，再同氨基酸的氨基(NH2)反應，可制得C6位點氨基酸改性殼聚糖。將改性產物同NO氣體分子在甲醇鈉的甲醇溶液中進行高壓反應(Na+/NH≥3)，壓力為5-10atm，室溫反應3-7天，產生[N(O)NO]-基團。
方法(2)在C2位點引入氨基酸。將氨基酸的羧基先用N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和二環己基碳二亞胺(DCC)或EDC進行活化再同殼聚糖分子上的氨基(NH2)反應，可制得C2位點氨基酸改性殼聚糖。將改性產物同NO氣體分子在甲醇鈉的甲醇溶液中進行高壓反應(Na+/NH≥3)，壓力為5-10atm，室溫反應3-7天，產生[N(O)NO]-基團。
所用殼聚糖的粘均分子量為1-100萬，脫乙酰度50-100％。
所用羧化殼聚糖分子的羧化取代度為1.1，以C6-O羧甲基殼聚糖為主。
所用的氨基酸包括甘氨酸、賴氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等常見的酸性、堿性和中性氨基酸。
本發明制備的氨基酸改性殼聚糖親核NO供體，可以制備成能夠釋放NO分子的藥物膜、微球、納米球，可廣泛的應用于治療心血管系統疾病，肺部高壓，促進傷口愈合，有效的預防成型術后再狹窄，提高醫療裝置的抗血栓性能。
具體實施例方式
本發明合成方法的合成路線如下方法(1)在C6位點引入氨基酸(以甘氨酸(中性)GLY和賴氨酸(堿性)LYS為例)羧基活化
方法(2)在C2位點引入氨基酸因氨基酸中也存在羧基，先將氨基酸中的羧基活化，再與殼聚糖中的2號碳位的-NH2反應。
以下結合本發明技術內容提供實施例實施例1在C6位點引入甘氨酸羧甲基殼聚糖的制備將殼聚糖15g和異丙醇200ml加入三頸瓶中，攪拌使殼聚糖均勻分散在異丙醇中，將10mol/L NaOH溶液50ml分為5份，每隔30min加入一份，室溫攪拌1小時，得反應物淤漿。將24g固體氯乙酸溶于70ml異丙醇中，分4次加入反應物淤漿中。加完后將反應物用水浴加熱到70℃，控溫下開啟回流冷凝裝置，攪拌2小時。停止后用冰醋酸調節pH值到7-8，析出大量淺黃色絮狀沉淀，真空抽濾，得黃色固體，并用甲醇洗滌3次，將所得黃色固體真空干燥1天，溫度為60℃。
羧甲基殼聚糖的活化將羧甲基殼聚糖(CMCS)加入反應器中，然后加入溶劑(水，乙睛，醇)，攪拌使羧甲基殼聚糖充分溶解。已溶解的N-羥基琥珀酰亞胺(N-Hydroxysuccinimide NHS)水溶液和二環己基碳二亞胺(Dicuclohexylcarbodiimide DCC)醇溶液分別加入上述溶液，在上述反應體系中，CMCS∶NHS∶DCC的摩爾比為1∶1.5∶1。室溫攪拌24h得乳黃色混濁液。過濾后，將白色固體用有機溶劑充分洗滌后真空干燥，然后將濾液中的反應物再次沉淀出來后洗滌、真空干燥備用。
甘氨酸改性羧甲基殼聚糖稱取摩爾比為1∶1的甘氨酸和已活化的羧甲基殼聚糖加入0.05mol/L的NaHCO3緩沖溶液中，攪拌反應1天后得淡黃色溶液。將所得溶液濃縮后，透析三天，冷凍干燥后得白色纖維狀物質。
甘氨酸改性殼聚糖FTIR1650-1655cm-1(酰胺I)，1560cm-1(酰胺II)，1600cm-1(-COONa)，13C NMR176.0ppm，-COOH；43.0ppm，-CH2-，1H NMR4.22(1H)，2.52(2H)，3.91(3H)，3.0-3.3(4H，5H，6H)，1.42(7H)，4.33(8H)，3.62(9H)實施例2在C6位點引入賴氨酸稱取摩爾比為1∶1的賴氨酸和實施例1中已活化的羧甲基殼聚糖加入0.05mol/L的NaHCO3緩沖溶液中，攪拌反應1天后得淡黃色溶液。將所得溶液濃縮后，透析三天，冷凍干燥后得白色纖維狀物質。
賴氨酸改性殼聚糖FTIR1730cm-1(-COOH)，1630cm-1和1514cm-1(NH3+)，1415cm-1(-CH2和-CH3)，2928cm-1(-CH2)。1H NMR4.33(8H)，3.41(9H)，1.05(10H)，0.88(11H)，2.35(12H)，3.60(13H).
實施例3在C2位點引入氨基酸因氨基酸中也存在羧基，先將氨基酸中的羧基活化，再與殼聚糖中的2號碳位的-NH2反應。將氨基酸溶于100ml水醇(2∶1)中，加入N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，攪拌反應1h，加入二環己基碳二亞胺(DCC)的醇溶液，室溫反應24h。在上述反應體系中，氨基酸∶NHS∶DCC的摩爾比為1∶1.5∶1。取定量的殼聚糖(氨基酸∶殼聚糖摩爾比1∶1)溶于0.1M醋酸溶液在攪拌下滴加入上述溶液中，室溫反應24h，將所得溶液濃縮后，透析三天，冷凍干燥后得白色纖維狀物質。
FTIR1650cm-1(酰胺I)，1560cm-1(酰胺II)，1310cm-1(酰胺III)；1H NMR3.53(8H)實施例4氨基酸改性殼聚糖負載NO反應將CH3ONa(1.5g，13.9mmol)溶于50ml甲醇中制備甲醇鈉溶液，然后將氨基酸改性后的殼聚糖(1g，4.5mmol)懸浮于該溶液中，需要滿足Na+/NH≥3。將其置于高壓反應釜中，在5atm的NO壓力下反應，每天通NO 60min，反應3天后，過濾用乙醚洗滌產物，常溫真空干燥，貯存于密閉干燥器中，溫度為-20℃。
對于含有[NONO]-的官能團，最有效的表征方法是紫外特征吸收取少量產物溶于0.1M的NaOH溶液中，測得[NONO]-的官能團特征吸收256nm。
NO釋放性能研究氨基酸改性殼聚糖產物因為引入了羧基，因此水溶性較好，試驗研究顯示，其在酸性和堿性溶液中都具有較好的溶解性。將其放入透析袋中測定其NO的釋放過程。對釋放曲線進行函數擬合，求出其釋放半衰期。對于C6GLYCS/NO釋放總量為423nmol/mg，半衰期為0.143h；C6LYSCS/NO，釋放總量為327nmol/mg，半衰期為0.223h；C2GLYCS/NO，釋放總量為310nmol/mg，半衰期為0.311h。
從上述數據可以看出C6位點改性殼聚糖NO親核供體的釋放量大于C2位點改性殼聚糖NO親核供體，但半衰期卻明顯小于C2位點改性殼聚糖NO親核供體。C6位點甘氨酸改性殼聚糖NO的釋放量大于賴氨酸改性殼聚糖NO的釋放量，半衰期則是賴氨酸改性殼聚糖大于甘氨酸改性殼聚糖。
權利要求
1.一種氨基酸改性殼聚糖親核NO供體，其特征在于殼聚糖作為基體材料，采用氨基酸改性增加其NH親核位點，與NO反應產生[N(O)NO]-官能團，分子結構如下 其中[N(O)NO]-官能團為NH基團同NO反應形成，NH基團來自于氨基酸的氨基NH2或殼聚糖分子結構中的氨基NH2改性反應；R為直鏈或支鏈的烷基。
2.根據權利要求1所述的氨基酸改性殼聚糖親核NO供體，其特征是當氨基酸在殼聚糖的C6位上發生反應時，氨基酸分子上的氨基NH2與C6位羧化殼聚糖分子上的COOH反應，形成NH位點，與NO反應形成[N(O)NO]-基團。
3.根據權利要求1所述的氨基酸改性殼聚糖親核NO供體，其特征是當氨基酸在殼聚糖的C2位點發生反應時，氨基酸分子上的羧基和殼聚糖分子中的氨基NH2反應形成NH位點，與NO反應形成[N(O)NO]-基團。
4.一種如權利要求1所述的氨基酸改性殼聚糖親核NO供體合成方法，其特征在于C6位點或C2位點氨基酸改性殼聚糖分子上的NH基團同NO氣體分子在甲醇鈉的甲醇溶液中進行反應，其中Na+/NH≥3，壓力為5atm，室溫反應3天，產生[N(O)NO]-基團，得到含有[N(O)NO]-基團的親核NO供體。
5.根據權利要求4所述的氨基酸改性殼聚糖親核NO供體合成方法，其特征是，NH基團來自于殼聚糖的氨基和羧化殼聚糖的羧基與氨基酸的羧基或氨基反應后形成。
6.根據權利要求4所述的氨基酸改性殼聚糖親核NO供體合成方法，其特征是，C6位點氨基酸改性殼聚糖的制備是將C6位羧化殼聚糖的COOH先用N-羥基琥珀酰亞胺NHS和二環己基碳二亞胺DCC或EDC進行活化再同氨基酸的氨基NH2反應制得。
7.根據權利要求4所述的氨基酸改性殼聚糖親核NO供體合成方法，其特征是，C2位點氨基酸改性殼聚糖的制備是將氨基酸的羧基COOH先用N-羥基琥珀酰亞胺NHS和二環己基碳二亞胺DCC或EDC進行活化再同殼聚糖的氨基NH2反應，制得。
8.根據權利要求6或者7所述的氨基酸改性殼聚糖親核NO供體合成方法，其特征是，所用的氨基酸包括甘氨酸、賴氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸。
9.根據權利要求6所述的氨基酸改性殼聚糖親核NO供體合成方法，其特征是，用氯乙酸和殼聚糖進行羧甲基反應，產物以C6-O羧甲基殼聚糖為主。
全文摘要
一種氨基酸改性殼聚糖親核NO供體及其合成方法，屬于醫藥工程技術領域。本發明選擇殼聚糖作為基體材料，采用氨基酸改性增加其親核位點(NH基團)，與NO反應后生成含有[N(O)NO]官能團的親核NO供體，供體分子結構如下。這類新型的親核NO供體具有不同的NO釋放速率和半衰期，能夠克服目前此類NO供體臨床應用中存在的難題親核試劑(多胺)的細胞毒性和致癌性副產物亞硝胺的生成，因此具有重要的臨床應用價值和應用前景。
文檔編號A61K47/36GK1868544SQ20061002831
公開日2006年11月29日 申請日期2006年6月29日 優先權日2006年6月29日
發明者萬錒俊, 高群 申請人:上海交通大學