專利名稱：Sars冠狀病毒的干擾rna及其應用的制作方法
背景技術：
非典型肺炎(SARS)是由一種新發現的冠狀病毒(severe acute respiratorysyndrome associated coronavirus，Nidovirales；Coronaviridae；Coronavirus；Group2 species)所引起。病毒的基因組由一條單鏈RNA組成，其中包含有14個開放式閱讀框(ORF)。目前已知病毒編碼的蛋白質包括脂雙層膜及其上的棒狀膜蛋白S、包膜蛋白E、膜糖蛋白M、以及膜內部衣殼蛋白N，以及一些蛋白酶和復制酶，然而大多數的ORF是否編碼蛋白質，以及他們的功能都不清楚(Rota PA，Oberste MS，The genome sequence of the ARS-associatedcoronavirus.Science.2003 May 30；300(5624)1399-404)。
ORF3a是最近研究比較集中的SARS病毒基因之一。ORF3a編碼了一個全長274個氨基酸的全新病毒蛋白，已有研究人員通過免疫印跡和蛋白質質譜的方法證明了這一病毒蛋白的存在，并推測其很可能是病毒的結構蛋白。通過生物信息學分析，該蛋白具有3個跨膜區，與其他已知蛋白的同源性很低(吳家睿，曾嶸等，申請號200310108604.X)。雖然通過很多不同的實驗方法都證明了3a蛋白的存在，但是關于這一蛋白功能的研究還很少，而現有的文獻都沒有能夠闡明該蛋白在病毒周期中的作用。(Naoto Ito，Eric C.Mossel，Krishna Narayanan，Vsevolod L.Popov，et al.，Severe acute respiratory syndromecoronavirus 3a protein is a viral structural protein，2005，J.Virol.79，3182-3186)。
通過和其他現有的冠狀病毒(229E，OC43)對應的蛋白比較可以發現，只有SARS冠狀病毒具有全長表達的3a蛋白，其余兩種病毒蛋白缺少了蛋白C段的大部分氨基酸。而只有SARS病毒具有極高的致死率。因此，推測ORF3a基因與病毒的致病性密切相關，而充分研究ORF3a基因的功能必將為設計研發全新的抗SARS藥物提供新的靶點。也可以為治療其他冠狀病毒引起的疾病具有提示作用。
發明內容
所要解決的技術問題本發明需要解決的技術問題是提供SARS冠狀病毒的干擾RNA及其應用，以克服現有技術中未能闡明致病性機理，因而未能利用干擾RNA作用于SARS冠狀病毒ORF3a基因從而抑制病毒的缺陷。
技術方案本發明的技術方案之一是提供SARS冠狀病毒的干擾RNA，其堿基序列選自SEQ ID NO1，2或3；或者SEQ ID NO1，2或3核苷酸序列經過一個或多個堿基的取代、缺失或添加而形成的，且能與SARS病毒基因組同源性結合，作用于ORF3a基因的衍生RNA序列。
所說的SEQ ID NO1，2和3序列分別為SEQ ID NO15’UGCAUCAACGCAUGUAGAA 3’，即si-001SEQ ID NO25’AGAUACAAUUGUCGUUACU 3’，即si-002SEQ ID NO35’CAGCUUGAGUCUACACAAA 3’，即si-003上述的SARS冠狀病毒的干擾RNA的一種優選方案為，當所說的干擾RNA SEQ ID NO3的作用濃度為25nM時，對病毒釋放的抑制率為30％。
上述的SARS冠狀病毒的干擾RNA的一種優選方案為，當所說的干擾RNA SEQ ID NO3的作用濃度為50nM時，對病毒釋放的抑制率為60％。
上述的SARS冠狀病毒的干擾RNA的一種優選方案為，當所說的干擾RNA SEQ ID NO3的作用濃度為100nM時，對病毒釋放的抑制率為90％。
上述的SARS冠狀病毒的干擾RNA SEQ ID NO3，其病毒抑制率的檢測方法包括如下步驟a.將不同濃度的干擾RNA與空白的對照分別轉染FRhK-4細胞；b.將SARS-CoV病毒(MOI＝10)加到經轉染的FRhK-4細胞中；c.取病毒感染細胞的上清，分別檢測上清中的病毒滴度；d.計算病毒釋放抑制率＝(1-上清中的病毒拷貝數/對照組上清中的病毒拷貝數)×100％。
這些步驟并不是一成不變的，本領域的普通技術人員可以根據實際情況進行合理的修改使之符合檢測應用的要求。比如根據要求選擇病毒靶細胞的種類，選擇是否將干擾RNA和病毒靶細胞、SARS-CoV病毒共同培養，選擇使用PCR方法、還是免疫印跡方法來滴定上清中的病毒滴度，以及增加病毒擴增培養的步驟以使檢測更為靈敏等等。或者，采用如下步驟a.轉染SARS-CoV病毒到靶細胞FRhK-4中；b.將不同濃度的干擾RNA與空白的對照分別處理經轉染的FRhK-4細胞；c.取病毒感染細胞的上清，分別檢測上清中的病毒滴度；d.計算病毒釋放抑制率＝(1-上清中的病毒拷貝數/對照組上清中的病毒拷貝數)×100％。
本發明的技術方案之二是提供一種SARS冠狀病毒的干擾RNA抑制SARS病毒的方法，其特征在于，用技術方案之一所說的干擾RNA處理病毒感染細胞。優選的干擾RNA的核苷酸序列為SEQ ID NO3。
上述的SARS冠狀病毒的干擾RNA抑制SARS病毒的方法的一種優選方式為，所說的干擾RNA SEQ ID NO3的作用濃度范圍為25-100nM，相應的病毒釋放抑制率為30％-90％。
上述的SARS冠狀病毒的干擾RNA在制備抗SARS病毒的藥物中的應用，比如本發明的干擾RNA可以以藥物組合物的形式進行作用，所說的藥物組合物含有治療有效量的上述干擾RNA為活性成分，以及含有一種或多種藥學上可接受的載體。
本發明的藥物組合物優選含有重量比為0.1％-99.5％的活性成分，最優選含有重量比為0.5％-95％的活性成分。
本發明的干擾RNA和藥物組合物可用于制備預防或者治療SARS冠狀病毒感染的藥物。
上述所述藥學上可接受的載體是指藥學領域常規的藥物載體，例如稀釋劑、賦形劑、填充劑、黏合劑、濕潤劑、崩解劑、促進吸收劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑等。另外，還可以在組合物中加入其它輔劑如香味劑、甜味劑等。
本發明的干擾RNA可以組合物的形式通過口服、鼻吸入、直腸或腸胃外給藥的方實施用于需要這種治療的患者。用于口服時，可將其制成顆粒劑、片劑或者膠囊；用于腸胃外給藥時，可將其制成注射用的溶液、水或油性懸浮劑等。優選的形式是注射劑，特別優選肌肉注射劑。
本發明的藥物組合物的各種劑型可以按照藥學領域的常規生產方法制備。
本發明的化合物的施用量可根據用藥途徑、患者的年齡、體重、所治療的疾病的類型和嚴重程度等變化，干擾RNA的中位治療濃度范圍可以為25-100nM，優選80-100nM。可以一次或多次施用。
有益效果應用干擾RNA的方法將SARS病毒感染過程中的3a蛋白基因表達抑制之后，發現SARS病毒的釋放受到了抑制，上清中的病毒數量急劇減少。說明SARS病毒3a蛋白控制了病毒的釋放。從而首次發現了SARS病毒的新的藥物靶點。
而設計篩選的3個干擾RNA靶點都可以有效的抑制3a蛋白的表達，具有極高的藥物應用價值。
圖1是采用三種不同的siRNA序列干擾抑制FRhK-4細胞中轉染的3a蛋白的表達，并采用免疫印記的方法檢測抑制效果。
圖2是選擇了抑制效果最好的si-003先轉染細胞后再用SARS-CoV病毒感染，在濃度分別為100nM，50nM，25nM，12.5nM的條件下，采用病毒N基因的引物，干擾RNA對細胞內病毒基因拷貝數的定量實時PCR檢測結果(N拷貝數/β-actin的拷貝數)。
圖3是選擇了抑制效果最好的si-003先轉染細胞后再用SARS-CoV病毒感染，在濃度分別為100nM，50nM，25nM，12.5nM的條件下，采用病毒P基因的引物，干擾RNA對細胞內病毒基因拷貝數的定量實時PCR檢測結果(P拷貝數/β-actin的拷貝數)。
圖4是選擇了抑制效果最好的si-003先轉染細胞后再用SARS-CoV病毒感染，在濃度分別為100nM，50nM，25nM，12.5nM的條件下，細胞上清中病毒的含量采用滴定的方法計算TCID50。
圖5是選擇了抑制效果最好的si-003先轉染細胞后再用SARS-CoV病毒感染，在濃度分別為100nM，50nM，25nM，12.5nM的條件下，上清中的病毒含量采用定量實時PCR方法檢測病毒拷貝數的結果。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照制造廠商所建議的條件。所有無機化學試劑和有機溶劑購自上海化學試劑廠和Sigma公司。
實施例所用病毒株為SARS coronavirus GZ50；Viruses；ssRNApositive-strand viruses，no DNA stage；Nidovirales；Coronaviridae；Coronavirus；Group 2 species。GeneBank號為AAS00004。由香港大學鄭伯建教授提供。
實施例1通過抑制ORF3a基因的表達來抑制SARS病毒的釋放試驗采用了RNA干擾技術。首先研究了3a蛋白的核酸序列，設計了三條干擾RNA靶點。(SEQ ID NO1UGCAUCAACGCAUGUAGAA，SEQ ID NO2AGAUACAAUUGUCGUUACU，and SEQ ID NO3CAGCUUGAGUCUACACAAA)。在細胞中驗證后發現SEQ ID NO3具有最好的抑制ORF3a基因表達的效果。所以應用該干擾RNA進行病毒實驗。
采用不同濃度的SEQIDNO3(100nM，50nM，25nM，12.5nM)以及一組空白對照組，先轉染干擾RNA FRhK-4細胞中，8小時后，再用SARS-CoV病毒感染轉染的細胞。24小時后，取病毒感染細胞的上清，分別采用免疫印記的方法測定上清中的病毒滴度，并記錄抑制效果。(圖1)實施例2采用病毒N基因的引物進行定量實時PCR檢測上清和被感染細胞中的病毒拷貝數選擇抑制效果最好的si-003先轉染細胞后再用SARS-CoV病毒感染(其他方法同實施例1)，在濃度分別為100nM，50nM，25nM，12.5nM的條件下，采用病毒N基因的引物進行定量實時PCR檢測干擾RNA對病毒基因拷貝數的抑制效果，結果發現RNA干擾后的細胞內病毒基因組中N的拷貝數沒有變化(N基因拷貝數/β-actin對照的拷貝數)。(圖2)實施例3采用病毒P基因的引物進行定量實時PCR檢測上清和被感染細胞中的病毒拷貝數選擇抑制效果最好的si-003，先轉染細胞后再用SARS-CoV病毒感染(其他方法同實施例1)，在濃度分別為100nM，50nM，25nM，12.5nM的條件下，采用病毒P基因的引物進行定量實時PCR檢測干擾RNA對病毒基因拷貝數的抑制效果(P基因拷貝數/β-actin對照的拷貝數)。結果顯示P拷貝數沒有變化。(圖3)實施例4采用滴定的方法計算細胞上清中病毒的含量TCID50選擇抑制效果最好的si-003先轉染細胞后再用SARS-CoV病毒感染(其他方法同實施例1)，在濃度分別為100nM，50nM，25nM，12.5nM的條件下，采用滴定的方法計算細胞上清中病毒的含量TCID50。結果顯示25nM的干擾RNA可以使得上清中的病毒減少了30％，50nM可以減少65％的病毒釋放；100nM的干擾RNA使得上清中的病毒數只有對照組的10％(圖4)實施例4采用定量實時PCR的方法檢測上清中病毒的拷貝數選擇抑制效果最好的si-003先轉染細胞后再用SARS-CoV病毒感染(其他方法同實施例1)，在濃度分別為100nM，50nM，25nM，12.5nM的條件下，采用定量實時PCR方法檢測上清中的病毒含量(病毒拷貝數)的結果。25nM的干擾RNA可以使得上清中的病毒基因拷貝數減少了30％，50nM可以減少65％；100nM的干擾RNA使得上清中的病毒基因拷貝數只有對照組的10％(圖5)
核苷酸/氨基酸序列表SEQUENCE LISTING<110>中國科學院上海生命科學研究院<120>SARS冠狀病毒的干擾RNA及其應用<130>2006052903<160>3<170>Patentln version 3.3<210>1<211>19<212>RNA<213>severe acute respiratory syndrome associated coronavirus<220>
<221>SiRNA<222>(1)..(19)<400>1ugcaucaacg cauguagaa19
<210>2<211>19<212>RNA<213>severe acute respiratory syndrome associated coronavirus<220>
<221>SiRNA<222>(1)..(19)<400>2agauacaauu gucguuacu19<210>3<211>19<212>RNA<213>severe acute respiratory syndrome associated coronavirus<220>
<221>SiRNA<222>(1)..(19)<400>3cagcuugagu cuacacaaa19
權利要求
1.SARS冠狀病毒的干擾RNA，其特征在于，其堿基序列選自SEQ ID NO1，2或3；或者SEQ ID NO1，2或3的核苷酸序列經過一個或多個堿基的取代、缺失或添加而形成的，且能與SARS病毒基因組同源性結合，作用于ORF3a基因的衍生RNA序列。
2.根據權利要求1所述的SARS冠狀病毒的干擾RNA，其特征在于，25nM的SEQ ID NO3干擾RNA對病毒釋放的抑制率為30％。
3.根據權利要求1所述的SARS冠狀病毒的干擾RNA，其特征在于，50nM的SEQ ID NO3干擾RNA對病毒釋放的抑制率為65％。
4.根據權利要求1所述的SARS冠狀病毒的干擾RNA，其特征在于，100nM的SEQ ID NO3干擾RNA對病毒釋放的抑制率為90％。
5.根據權利要求2-4所述的SARS冠狀病毒的干擾RNA，其病毒釋放抑制率的檢測方法包括如下步驟為a.將不同濃度的干擾RNA與空白的對照分別轉染FRhK-4細胞；b.將SARS-CoV病毒加到經轉染的FRhK-4細胞中；c.取病毒感染細胞的上清，分別檢測上清中的病毒滴度；d.計算病毒釋放抑制率＝(1-上清中的病毒拷貝數/對照組上清中的病毒拷貝數)×100％。
6.一種SARS冠狀病毒的干擾RNA抑制SARS病毒的方法，其特征在于，用權利要求1所說的干擾RNA處理病毒感染細胞。
7.根據權利要求6所述的SARS冠狀病毒的干擾RNA抑制SARS病毒的方法，其特征在于，所說的干擾RNA的核苷酸序列為SEQ ID NO3。
8.根據權利要求7所述的SARS冠狀病毒的干擾RNA抑制SARS病毒的方法，其特征在于，所說的干擾RNA SEQ ID NO3的作用濃度范圍為25-100nM。
9.根據權利要求8所述的SARS冠狀病毒的干擾RNA抑制SARS病毒的方法，其特征在于，所說的干擾RNA SEQ ID NO3在作用濃度范圍為25-100nM時，相應的病毒釋放抑制率為30％-90％。
10.權利要求1所述的SARS冠狀病毒的干擾RNA在制備抗SARS病毒的藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及SARS冠狀病毒的干擾RNA及其應用，其序列為SEQ ID NO1－3。干擾RNA所作用的ORF3a基因在病毒周期中起重要作用，是潛在的SARS治療靶點。本發明還涉及干擾RNA對體外培養的SARS冠狀病毒進行抑制的方法，在SARS預防和治療領域具有重要應用前景。
文檔編號A61P31/14GK101085986SQ20061002747
公開日2007年12月12日 申請日期2006年6月8日 優先權日2006年6月8日
發明者孫兵, 鄭伯健, 呂偉, 徐可 申請人:中國科學院上海生命科學研究院