聚乙二醇修飾的神經毒素,其制備方法及用途的制作方法

專利名稱：聚乙二醇修飾的神經毒素,其制備方法及用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物制藥領域，具體地說，涉及一種聚乙二醇修飾的神經毒素、其制備方法及用途。
背景技術：
神經毒素(neurotoxin，NT)是一類單鏈多肽，可以從金環蛇(Bungarusfasciatus(Schneider))，銀環蛇(Bungarus multicinctus multicinctus(Blyth))，眼鏡蛇(Naja naja(Linnaeus))及眼鏡王蛇(Ophiophagushannah(Cantor))的毒液中分離提純得到。按照作用靶部位的不同，神經毒素可以分為突觸前神經毒素和突觸后神經毒素。由于突觸前神經毒素的致死活性比突觸后神經毒素高得多，所以臨床上應用較多的是突觸后神經毒素。
目前實測的突觸后神經毒素全序列有100多個。它們的分子量大約為6800，多為堿性蛋白，等電點在9～10之間，不具有酶活性，功能單一，只作用于乙酰膽堿受體。其中的短鏈神經毒素含60-62個氨基酸殘基及4個二硫鍵，長鏈神經毒素含65-74個氨基酸殘基及5個二硫鍵。序列比較表明，短鏈神經毒素之間的同源性高達70～95％以上，它們都有明顯的氨基酸殘基重復的現象，例如QQ，TT，GG等。來源于眼鏡蛇毒的短鏈神經毒素N端序列大都為LECHNNQQ。短鏈神經毒素是乙酰膽堿的強拮抗劑，它競爭性地結合位于神經-肌肉接頭后膜的乙酰膽堿受體(AChRs)，阻止肌肉細胞的去極化，使動物產生松弛性肌肉麻痹，最后因呼吸衰竭而死亡。
中國專利CN104096A和CN1209998A公開了一種來源于眼鏡蛇蛇毒神經毒素的制備方法及臨床戒毒和止痛的醫學用途。長期的臨床使用表明，神經毒素對停用或禁戒海洛因、嗎啡等后出現的各種生理和精神依賴癥狀均有一定療效，且具有無成癮性、無耐受性的特點。
但是對于人體而言，神經毒素屬于異源蛋白，所以在使用過程中同樣具有蛋白質藥物所共有的特點，如存在免疫原性，半衰期短，穩定性差等。其中由眼鏡蛇神經毒素引起的過敏反應已有報道。(劉文，陳慧，鄭惠.科洛曲片致過敏性休克.藥物不良反應雜志[J].2001，(3)196.)為此，有必要采用蛋白質修飾技術以獲得低免疫原性的眼鏡蛇神經毒素，從而改善該蛋白質的藥物動力學特性，以提高其耐受性和減少給藥次數。
目前普遍采用的改造蛋白質分子的方法是大分子化學修飾法。所謂蛋白質的大分子化學修飾，是相對于采用較小分子量的修飾劑去修飾蛋白質而言的。大分子修飾劑，通常指一些人工或天然的聚合物，如聚乙二醇(PEG)，右旋糖苷(葡聚糖)，人血清白蛋白，肝素，聚賴氨酸，聚丙氨酸，聚乙烯酸和聚乙烯砒咯烷酮等(Lundblad，R.L.Bradshaw，R.A.Applications of Site-Specific Chemical Modification in the Manufacture ofBiopharmaceuticalsI.An Overview.Biotechnol.Appl.Biochem.1997，26143-151.)。其中應用最多、成功率最高的是PEG修飾技術。
用于修飾蛋白質藥物的PEG有很多種，包括修飾氨基的烷基化PEG和酰基化PEG，修飾巰基的PEG馬來酰亞胺和PEG-鄰-吡啶二硫醚等，以及修飾羧基的PEG-酰肼等。典型的修飾反應列舉如下 APEG-醛；BPEG-羥基琥珀酰亞胺酯；CPEG-馬來酰亞胺；DPEG-酰肼修飾研究中大多數是將多肽分子中的氨基作為修飾位點。
為克服蛇毒神經毒素作為藥物使用所存在的不足，采用聚乙二醇修飾技術對神經毒素的氨基進行修飾，以獲得聚乙二醇修飾的神經毒素。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是，針對現有技術的神經毒素存在免疫原性，半衰期短，穩定性差等缺陷，采用蛋白質修飾技術以獲得低免疫原性的眼鏡蛇神經毒素，從而改善該蛋白質的藥物動力學特性，以提高其耐受性和減少給藥次數，更好地滿足神經毒素在臨床應用方面的需求。
本發明的一個目的是提供一種聚乙二醇修飾的神經毒素，其特征在于，神經毒素的氨基上連接有活化的聚乙二醇或其衍生物鏈。
優選地，所述聚乙二醇修飾的神經毒素具有如下通式結構 其中m為單甲氧基(monomethoxy)的縮寫，n＝2～5；R代表去除一個氨基(NH2)的神經毒素分子。
所說的神經毒素包括從蛇毒中提取或用基因工程手段制備的各種神經毒素；優選從眼鏡蛇蛇毒中提取。
所說的活化的聚乙二醇或其衍生物是本領域一般技術人員所公知的，并且描述于例如Robert MJ等，先進的藥物傳遞評論(Advanced DrugDelivery Reviews)(2002；54459-476)。優選地，使用丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯或丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯，可采用美國Nektar Therapeutics公司生產的產品。
所說的聚乙二醇鏈的分子量為2000～100000。
本發明的另一個目的是提供聚乙二醇修飾的神經毒素的制備方法，包括如下步驟在神經毒素溶液中，加入磷酸氫二鈉溶液，調節其pH值在4.5-9.5。然后加入活化的聚乙二醇或其衍生物，優選與神經毒素的摩爾比為0.1～100。反應溫度優選為4-40℃，反應時間優選為5～120分鐘。反應完畢后，將反應混合液優選采用離子交換柱進行色譜分離，用磷酸鹽緩沖液將其平衡，用含NaCl的磷酸鹽緩沖液洗脫，即可得聚乙二醇修飾的神經毒素。
舉例來說，本發明聚乙二醇修飾的神經毒素可以由下式制得
其中R-NH2為神經毒素。mPEG為CH3O-(CH2CH2O)t-CH2CH2OH其中m＝單甲氧基(monomethoxy)的縮寫，t＝44～2200；n＝2～5R代表代表去除一個氨基(NH2)的神經毒素分子。
本發明制備的聚乙二醇修飾的神經毒素為單聚乙二醇修飾的神經毒素，也就是只對1分子神經毒素的1個氨基進行修飾，當然該氨基可以是N末端的氨基，也可以是賴氨酸上的ε-氨基。
本發明的另一個目的是提供聚乙二醇修飾的神經毒素在制備高效低毒的戒毒藥物中的應用。
本發明的聚乙二醇修飾的神經毒素可以與任何藥學上可接受載體結合，制備成任何藥學上可接受劑型的戒毒藥物。
本發明的聚乙二醇修飾的神經毒素能夠基本保持神經毒素的生物活性，同時它比未修飾的神經毒素有較低的免疫原性、毒性和更好的穩定性，因此作為戒毒藥物，它比未修飾的神經毒素有更大的優越性。本發明的聚乙二醇修飾的神經毒素的制備方法，簡單易行。


圖1是聚乙二醇修飾眼鏡蛇神經毒素分離純化圖譜。
圖2是聚乙二醇修飾眼鏡蛇神經毒素HPLC分析圖譜。
圖3是眼鏡蛇神經毒素HPLC分析圖譜。
圖4是聚乙二醇修飾眼鏡蛇神經毒素的MALDI-TOF-MS圖具體實施方式
在具體實施方式
中僅用來源于眼鏡蛇蛇毒的一種神經毒素進行說明，但本發明并不限于這種神經毒素。
實施例1
丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯5000(mPEG-SPA-5000)對眼鏡蛇神經毒素修飾條件的選擇反應溫度的選擇取1.5mg/ml的眼鏡蛇神經毒素溶液2ml，加2ml磷酸鹽緩沖液使溶液的pH值為8.0，再加入mPEG-SPA-5000固體1.6mg，溶解，混勻，各取0.3ml置于4支帶塞試管中，然后分別置于4℃、10℃、25℃和37℃反應30min后終止反應。比較修飾率，確定修飾條件。結果表明在這些溫度下都能得到聚乙二醇修飾的眼鏡蛇神經毒素，其中25℃的修飾率最高。
反應時間的選擇取1.5mg/ml的眼鏡蛇神經毒素溶液2ml，加2ml磷酸鹽緩沖液使溶液的pH值為8.0，再加入mPEG-SPA-5000固體1.6mg，溶解，混勻，各取0.3ml置于4支帶塞試管中，然后于25℃分別反應5、10、15、30、60、120min后終止反應。比較修飾率，確定修飾條件。結果表明在這些條件下都能得到聚乙二醇修飾的眼鏡蛇神經毒素，其中30min后的修飾率沒有明顯提高。
mPEG-SPA-5000同眼鏡蛇神經毒素的摩爾比的選擇取1.5mg/ml的眼鏡蛇神經毒素溶液2ml，加2ml磷酸鹽緩沖液使溶液的pH值為8.0，各取0.3ml置于4支帶塞試管中，然后分別加入mPEG-SPA-5000固體0.016、0.16、1.6、16mg(相當于mPEG-SPA-5000同眼鏡蛇神經毒素的摩爾比在0.1~100)，溶解，混勻，反應30min后終止反應。比較修飾率，確定修飾條件。結果表明在這些條件下都能得到聚乙二醇修飾的眼鏡蛇神經毒素，當mPEG-SPA-5000同眼鏡蛇神經毒素的摩爾比在10時修飾率已達到最高，進一步增加mPEG-SPA-5000的量修飾率也沒有明顯地增加。
反應pH值的選擇各取0.5mg/ml的眼鏡蛇神經毒素溶液2ml，置于6支帶塞試管中，分別加2ml不同pH值的磷酸鹽緩沖液使溶液的pH值為4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5，再加入mPEG-SPA-5000固體7.0mg，溶解，混勻，于25℃反應30min后終止反應。比較修飾率，確定修飾條件。結果表明在這些條件都能得到聚乙二醇修飾的眼鏡蛇神經毒素，其中pH值為8.0時修飾率最高。
實施例2
修飾產物的分離純化與鑒定取1.1mg/ml的眼鏡蛇神經毒素溶液2ml，加磷酸鹽緩沖液使溶液的pH值為8.0，再加入mPEG-SPA-5000固體15.7mg，溶解，混勻，于25℃反應30min，加入100mg甘氨酸終止反應。
取上述反應液，用截流分子量為3000的超濾膜濃縮至15ml，上柱分離。色譜條件如下層析填料Source 30S柱規格2.6×8cm流動相0.02M Na2HPO4-NaH2PO4，pH8.0流速3.0ml/min檢測波長215nm收集每管5ml結果得到兩個洗脫峰，分別為聚乙二醇修飾的眼鏡蛇神經毒素和眼鏡蛇神經毒素，具體結果見圖1，圖中保留體積38.49ml的峰為聚乙二醇化眼鏡蛇神經毒素峰，保留體積為68.96ml的峰為眼鏡蛇神經毒素峰。
采用反相高效液相色譜(RP-HPLC)對得到的組分峰進行分析，合并相同組分。色譜條件如下色譜柱Symmetry300TMC45μm；3.9×150mm檢測波長215nm流動相A)水/三氟乙酸(100/0.1)B)水/三氟乙酸/乙腈(10/0.1/90)梯度洗脫方法B(0～18min，0％～50％；18min~23min，50％~0％)流速1.0ml/min柱溫37℃RP-HPLC分析結果表明得到的聚乙二醇修飾眼鏡蛇神經毒素和眼鏡蛇神經毒素的純度均在95％以上，具體結果見圖2和圖3，圖中保留時間為12.079min的為聚乙二醇修飾眼鏡蛇神經毒素，保留時間為8.789min的為眼鏡蛇神經毒素。
采用MALDI-TOF對聚乙二醇修飾眼鏡蛇神經毒素進行分子量測定，結果表明聚乙二醇修飾眼鏡蛇神經毒素的分子量在12000道爾頓(見圖4)，而眼鏡蛇神經毒素的分子量為7000道爾頓，二者相差5000左右，這表明該聚乙二醇修飾眼鏡蛇神經毒素為單修飾，也即是結合了一分子的聚乙二醇。
實施例3聚乙二醇修飾的眼鏡蛇神經毒素穩定性的研究反復凍融穩定性取眼鏡蛇神經毒素和聚乙二醇修飾的眼鏡蛇神經毒素(無菌液態，無任何保護劑)，置-28℃冷凍后，于室溫下融解，用HPLC法檢測其裂解情況。如此反復凍融三次。結果表明，眼鏡蛇神經毒素及聚乙二醇修飾的眼鏡蛇神經毒素反復凍融三次后，峰面積均基本保持不變。因此，可以認為聚乙二醇修飾的眼鏡蛇神經毒素保持了眼鏡蛇神經毒素抗反復凍融的穩定性。
熱穩定性取眼鏡蛇神經毒素和聚乙二醇修飾的眼鏡蛇神經毒素(無菌液態，無任何保護劑)，分別置于30℃、40℃、60℃條件下。于第5及第10天取樣，用HPLC法檢測其裂解情況。結果表明，眼鏡蛇神經毒素在60℃下5天時峰面積即有明顯減少，而聚乙二醇修飾的眼鏡蛇神經毒素在10天時峰面積未有明顯改變。在30℃、40℃時，眼鏡蛇神經毒素及聚乙二醇修飾的眼鏡蛇神經毒素10天內峰面積均基本保持不變。因此，可以初步認為聚乙二醇修飾的眼鏡蛇神經毒素可以明顯增加眼鏡蛇神經毒素的熱穩定性。
酶穩定性取0.1％胰蛋白酶溶液(pH7.8)2.7ml，分別加入0.3ml眼鏡蛇神經毒素和聚乙二醇修飾的眼鏡蛇神經毒素樣品，37℃水浴，于0、0.5、1、2、4h取樣0.3ml，測定樣品的生物活性。結果表明眼鏡蛇神經毒素在0.5h內活性迅速降到原來的20％，而聚乙二醇修飾的眼鏡蛇神經毒素在1h內活性僅降到原來的50％。因此，聚乙二醇修飾的眼鏡蛇神經毒素能明顯增加眼鏡蛇神經毒素抵抗胰蛋白酶水解的能力。
實施例4聚乙二醇修飾眼鏡蛇神經毒素與眼鏡蛇神經毒素的藥效學比較研究對嗎啡依賴動物戒斷作用的研究
(1)試驗方法1、小鼠跳躍試驗取小鼠80只，隨機分為4組即空白對照組、聚乙二醇修飾眼鏡蛇神經毒素1、2、3組共4組。各組均腹腔注射嗎啡，給藥程序見表1，最后一次給嗎啡后的50分鐘，聚乙二醇修飾眼鏡蛇毒1、2、3組分別按55.32mg/kg、110.64mg/kg、221.28mg/kg劑量灌胃，此后30分鐘各組均腹腔注射納洛酮15mg/kg，觀察15分鐘內小鼠跳躍次數及1小時體重變化，結果見表2。
2、大鼠催促試驗取大鼠40只，隨機分為4組即空白對照組、聚乙二醇修飾眼鏡蛇神經毒素1、2、3組共4組。各組均腹腔注射嗎啡，每天3次，給藥劑量為第一天10mg/kg/次、第2-3天20mg/kg/次、第4-10天30mg/kg/次。眼鏡蛇神經毒素組和聚乙二醇修飾眼鏡蛇神經毒素1、2、3組于試驗第八天起口服灌胃，每天一次，連續3次，給藥程序見表3。在最后一次腹腔注射嗎啡后8小時，腹腔注射納洛酮10mg/kg，觀察1小時內的戒斷癥狀及體重改變，并對戒斷癥狀進行評分。(見表3)3、嗎啡依賴猴自然戒斷試驗取獼猴6只，體重3-5kg，隨機分為2組，即空白對照組和聚乙二醇修飾眼鏡蛇神經毒素組，各組動物均每天2次皮下注射嗎啡，21天內嗎啡劑量由2.5mg/kg遞增至25mg/kg，此后按此劑量維持90天，至試驗結束。
在試驗81天起用摻食法分別在兩組食物中加眼鏡蛇神經毒素和聚乙二醇修飾眼鏡蛇神經毒素，給藥劑量81-82天為11.79mg/kg/天；第83-84天為23.58mg/kg/天；第85-86天為47.16mg/kg/天；第87-88天為94.32mg/kg/天；第89天為188.64mg/kg/天。第90天停藥后觀察各組情況變化。
(2)試驗結果1、小鼠跳躍試驗
表1小鼠跳躍試驗嗎啡給藥程序

表2聚乙二醇修飾眼鏡蛇神經毒素對嗎啡依賴小鼠跳躍試驗的影響

**p＜0.01空白組比較從表4可知，聚乙二醇修飾眼鏡蛇神經毒素組小鼠經納洛酮催促后，與眼鏡蛇神經毒素組比較跳躍次數及體重減輕程度均有顯著性差異(p＜0.05)，提示聚乙二醇修飾眼鏡蛇神經毒素對嗎啡依賴小鼠具有減輕其戒斷癥狀作用。
2、大鼠催促試驗表3聚乙二醇修飾眼鏡蛇神經毒素對嗎啡依賴大鼠催促試驗的影響

**P＜0.01與生理鹽水組比較試驗中，各組嗎啡致大鼠依賴后，用納洛酮催促結果發現眼鏡蛇神經毒素組大鼠表現為高度激惹、腹瀉、流涎、咬牙、異常姿勢及體重明顯減輕，其戒斷癥狀評分(表5)明顯高于聚乙二醇修飾眼鏡蛇神經毒素各組(P＜0.01)，聚乙二醇修飾眼鏡蛇神經毒素各組在停用嗎啡后，見輕微流淚、腹瀉、流涎及體重減輕。結果提示聚乙二醇修飾眼鏡蛇神經毒素對嗎啡依賴大鼠有減輕其戒斷癥狀作用。
3、嗎啡依賴猴自然戒斷試驗各組在停用嗎啡后，眼鏡蛇神經毒素組在停用嗎啡3小時后出現明顯癥狀，主要表現為煩躁不安、咬籠、咬鏈條、陣發性震顫、流涎，3小時后2只猴出現腹瀉，癥狀持續2-3小時，以后每1-3小時反復出現，到72小時出現嗜睡躺臥，體重下降0.7-0.9kg，一只猴死亡。而聚乙二醇修飾眼鏡蛇神經毒素組則在停用嗎啡后出現輕度煩躁不安、嘶叫、流淚，1只猴出現腹瀉，以上癥狀均較眼鏡蛇神經毒素組輕，5小時后癥狀基本消失，72小時后體重下降0.3-0.4kg。
結論1、小鼠跳躍試驗當口服本品總量為小鼠鎮痛ED50的1-4倍時，可明顯減輕依賴嗎啡小鼠的跳躍次數和體重減輕程度，明顯低于眼鏡蛇神經毒素組(P＜0.05)。
2、大鼠催促試驗當口服本品總量為大鼠鎮痛ED50的4.5-18倍時，其戒斷癥狀評分及體重減輕程度明顯低于眼鏡蛇神經毒素組(P＜0.01)。
3、嗎啡依賴猴自然戒斷試驗當口服本品總量為猴鎮痛ED50的26倍時，其出現的戒斷癥狀及體重減輕程度明顯低于眼鏡蛇神經毒素組。
總之，通過小鼠跳躍試驗、大鼠催促試驗和嗎啡依賴猴自然戒斷試驗均證實聚乙二醇修飾眼鏡蛇神經毒素相比眼鏡蛇神經毒素，其緩解嗎啡依賴動物戒斷癥狀的功效更顯著。
實施例5聚乙二醇修飾眼鏡蛇神經毒素與眼鏡蛇神經毒素的急性毒性試驗比較研究將四種不同濃度的聚乙二醇修飾眼鏡蛇神經毒素和眼鏡蛇神經毒素注射至體重20-25g的小鼠的腹腔內。每種濃度注射8只小鼠。計算聚乙二醇修飾眼鏡蛇神經毒素和眼鏡蛇神經毒素引起50％死亡的劑量(LD50)。(LD50計算方法參見Reed LJ and Muench H.Am.J.Hygiene，1938；27493.)結果測定出眼鏡蛇神經毒素LD50為0.20mg/kg，聚乙二醇修飾眼鏡蛇神經毒素的LD50為10.0mg/kg。因此，眼鏡蛇神經毒素經聚乙二醇修飾后，其毒性顯著降低。
實施例6聚乙二醇修飾的眼鏡蛇神經毒素對實驗動物免疫原性的研究以家兔作為制備抗血清的實驗動物，采用福氏佐劑免疫法，并分別以眼鏡蛇神經毒素和聚乙二醇修飾的眼鏡蛇神經毒素作為抗原，劑量均為20μg/kg/次，每周1次，共5次。
分別以眼鏡蛇神經毒素和聚乙二醇修飾的眼鏡蛇神經毒素作為抗原，用雙向免疫擴散法測定它們各自抗血清的效價，測定結果為眼鏡蛇神經毒素組抗血清的效價為1∶16；聚乙二醇修飾的眼鏡蛇神經毒素組抗血清的效價測不出。
分別以眼鏡蛇神經毒素和聚乙二醇修飾的眼鏡蛇神經毒素作為抗原，然后用眼鏡蛇神經毒素組的抗血清作為第一抗體，再以辣根過氧化酶(HRP)標記的羊抗兔IgG作為第二抗體，用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定它們各自的免疫原性，測定結果為眼鏡蛇神經毒素組為陽性，聚乙二醇修飾的眼鏡蛇神經毒素組為陰性。
以上結果表明同眼鏡蛇神經毒素比較，聚乙二醇修飾的眼鏡蛇神經毒素的免疫原性顯著降低。
實施例7用丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯2000(mPEG-SPA-2000)、丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯10000(mPEG-SPA-10000)、丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯20000(mPEG-SPA-20000)或丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯30000(mPEG-SPA-30000)代替實施例1中的mPEG-SPA-5000，得到了實施例中1-6相似的結果。
實施例8用丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯2000(mPEG-SBA-2000)、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯10000(mPEG-SBA-10000)、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯20000(mPEG-SBA-20000)或丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯30000(mPEG-SBA-30000)代替實施例1中的mPEG-SPA-5000，得到了實施例中1-6相似的結果。
權利要求
1.一種聚乙二醇修飾的神經毒素，其特征在于，神經毒素的氨基上連接有活化的聚乙二醇或其衍生物鏈。
2.如權利要求1所述的聚乙二醇修飾的神經毒素，其特征在于，其結構如下 其中m為單甲氧基，n＝2～5；R代表去除一個氨基(NH2)的神經毒素分子。
3.如權利要求1所述的聚乙二醇修飾的神經毒素，其特征在于，所述的神經毒素包括從蛇毒中提取或用基因工程手段制備的各種神經毒素。
4.如權利要求3所述的聚乙二醇修飾的神經毒素，其特征在于，所述的神經毒素為從眼鏡蛇蛇毒中提取的神經毒素。
5.如權利要求1所述的聚乙二醇修飾的神經毒素，其特征在于，所述的活化的聚乙二醇或其衍生物為丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯或丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯。
6.如權利要求1～5任一項所述的聚乙二醇修飾的神經毒素，其特征在于，所述的聚乙二醇鏈的分子量為2000～100000。
7.制備權利要求1～5任一項所述的聚乙二醇修飾的神經毒素，其特征在于，包括如下步驟在神經毒素溶液中，加入磷酸氫二鈉溶液，調節其pH值在4.5～9.5，然后加入活化的聚乙二醇或其衍生物，反應完畢后，將反應混合液進行色譜分離，即可得聚乙二醇修飾的神經毒素。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，反應溫度為4～40℃。
9.如權利要求7所述的方法，其特征在于，反應時間為5～120分鐘。
10.如權利要求7所述的方法，其特征在于，活化的聚乙二醇或其衍生物與神經毒素的摩爾比為0.1～100。
11.權利要求1～6所述的聚乙二醇修飾的神經毒素在制備戒毒藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種聚乙二醇修飾的神經毒素及其制備方法。其特征在于，神經毒素的氨基上連接有活化的聚乙二醇或其衍生物鏈。本發明的聚乙二醇修飾的神經毒素能夠基本保持神經毒素的生物活性，同時它比未修飾的神經毒素有較低的免疫原性、毒性和更好的穩定性，從而改善了神經毒素的藥物動力學特性，提高了耐受性和減少了給藥次數。本發明還公開了聚乙二醇修飾的神經毒素在制備高效低毒的戒毒藥物中的應用。
文檔編號A61K47/48GK101077888SQ20061002683
公開日2007年11月28日 申請日期2006年5月24日 優先權日2006年5月24日
發明者馮軍, 趙文杰, 翟寧, 薛春佳, 公偉 申請人:上海醫藥工業研究院