專利名稱：新型抗乙肝病毒抑制劑及其應用的制作方法
技術領域：
本發明設計藥物領域，具體地，本發明設計一種含咖啡提取物的抗乙肝病毒(HBV)抑制劑及其應用。所述抗乙肝病毒抑制劑抑制HBVDNA復制，抑制HBeAg和HbsAg的合成和分泌，可用作治療和輔助治療乙型肝炎的藥物。
背景技術：
咖啡成分包括綠原酸(A)，咖啡酸(B)和奎寧(尼)酸(C)等，其化學結構式如下。雖然有統計學的研究報道長期飲用咖啡能降低肝細胞肝癌的發病率，減少慢性肝炎的發生(包括慢性病毒性肝炎)，以及咖啡成分具有抗HIV，HSV等的活性報道，但是關于咖啡及其成分具有直接的抗HBV活性作用，國內外未見有研究報道。本發明的研究結果證明了咖啡，咖啡粗提物以及咖啡中含有的一類天然小分子化合物具有明顯的抗乙肝病毒活性作用，抑制HBV DNA復制，抑制HBeAg和HbsAg的合成和分泌。我們的研究結果證實了日常飲用咖啡可能具有防治乙肝病毒引起的乙肝病毒性肝炎。
發明內容
本發明的目的是提供一種包含咖啡提取物的抗乙肝病毒抑制劑。
本發明的再一目的是提供上述抗乙肝病毒抑制劑在制備用于治療乙肝的藥物中的應用。
本發明提供了一種抗乙肝病毒抑制劑，其包括咖啡提取物和輔劑，其中，基于100重量份的所述抗乙肝病毒抑制劑，含有10～90重量份的咖啡提取物，余量為輔劑。
在本發明的抗乙肝病毒抑制劑中，其中所述咖啡提取物為普通咖啡、低咖啡因咖啡或脫咖啡因咖啡的提取物；所述輔劑為維生素C、羥丙維生素、預膠化淀粉、微粉硅膠、蔗糖、乙醇、防腐劑、和/或硬脂酸鎂。
根據本發明的技術方案，所述咖啡提取物通過以下方法制備，1)咖啡在80～100℃的熱水過濾或熱水煮5～10分鐘，獲得咖啡溶液，其中，咖啡與水的重量比為1∶15～1∶5，并凍干咖啡溶液，獲得粉末狀咖啡提取物，其中，優選咖啡與水的重量比為1∶10；或2)稱取咖啡置于圓底燒瓶內，加入95％食用乙醇，乙醇體積與咖啡質量的比例為1∶5ml/g，混合物加熱到90℃進行回流1.5小時，過濾，濾液于旋轉蒸發儀上、在60℃下進行濃縮成浸膏，進行噴霧干燥得粉末狀咖啡粗提物；或3)稱取咖啡置于圓底燒瓶內，加入40-60％食用乙醇，乙醇體積與咖啡質量的比例為1∶5ml/g，混合物加熱到90℃進行回流1.5小時，過濾，濾液于旋轉蒸發儀上60℃進行濃縮成浸膏，進行噴霧干燥得粉末狀咖啡粗提物。
本發明還提供了上述抗乙肝病毒抑制劑在制備用于治療乙肝的藥物中的應用。
對于本發明的抗乙肝病毒抑制劑，其服用形式包括片劑(包括泡騰片)、膠囊劑(包括軟膠囊)、沖劑、口服液、丸劑(包括滴丸)等已有的任意一種口服劑型。
本發明研究證明了咖啡和咖啡提取物能有效抑制乙肝病毒DNA復制、乙肝病毒s抗原和e抗原的合成，咖啡為一種常用飲料食品，無明顯的毒副作用，其提取物可用于制成治療或輔助治療乙型肝炎的藥物。
具體實施例方式
實施例實施例1提取咖啡粗提物普通咖啡(麥斯威爾咖啡，100％純咖啡，美國Maxwell咖啡公司)和低咖啡因咖啡(美樂家經典低因咖啡，中等程度烤陪，100％純美樂家咖啡，包含不超過0.4％的咖啡因，德國Melitta集團)購自麥德龍超市。粗提物的提取方法為(1)稱取40g咖啡，加入約400ml水，用咖啡壺(咖啡壺專用18k包金金屬過濾網)煮成新鮮咖啡后，凍干，獲得粉末狀咖啡粗提物；或者，(2)稱取100g咖啡置于1L的圓底燒瓶，加入95％食用乙醇約500ml，加熱到90℃進行回流1.5小時，過濾，濾液于旋轉蒸發儀上、在60℃下進行濃縮成浸膏，進行噴霧干燥得粉末狀咖啡粗提物；或者，(3)稱取100g咖啡置于1L的圓底燒瓶，加入40-60％食用乙醇約500ml，加熱到90℃進行回流1.5小時，過濾，濾液于旋轉蒸發儀上60℃進行濃縮成浸膏，進行噴霧干燥得粉末狀咖啡粗提物。稱重，與原咖啡質量相比，得回收率。綠原酸，咖啡酸和奎寧(尼)酸在咖啡粗提物中的含量，分別以各自的標準品為對照，做標準曲線，采用HPLC-ESI-MS/MS法進行含量測定。
實施例2～3提取咖啡粗提物除了咖啡與水的重量比為1∶15和1∶5之外，以與實施例1相同的方法提取咖啡粗提物。
實施例4選用下列用量的咖啡或脫咖啡因咖啡提取物，并使用藥食兩用植物金銀花提取物配以輔料，以如下比例混合咖啡或脫咖啡因咖啡提取物 400克金銀花提取物 400克羥丙維生素 20克微粉硅膠 60克預膠化淀粉 120克硬脂酸鎂 適量制成 1000粒將脫咖啡因咖啡提取物、金銀花提取物與附加劑混合均勻，用10％預膠化淀粉漿作為粘合劑，濕法制粒，烘干，加入適量硬脂酸鎂混合，壓制成片劑。
實施例5選用下列用量的咖啡或脫咖啡因咖啡提取物、維生素C與輔料，以如下比例混合咖啡或脫咖啡因咖啡提取物 400克維生素C 400克羥丙維生素20克微粉硅膠 48克乙醇 適量硬脂酸鎂 適量制成 900粒將咖啡與羥丙纖維素及微粉硅膠混合，用適量70％醇做濕潤劑，濕法制粒，過40目篩選成顆粒，烘干，加入硬脂酸鎂，混合，裝入硬膠囊。
實施例6選用下列用量的咖啡或脫咖啡因咖啡提取物、維生素C與附加劑，以如下比例混合咖啡或脫咖啡因咖啡提取物800克維生素C 400克蔗糖40克防腐劑 適量蒸餾水 適量制成20000ml
取蒸餾水適量，加入咖啡，邊加邊攪拌使溶解，過濾。另將蔗糖和防腐劑用蒸餾水加熱溶解，在攪拌下緩緩加入上述溶液，加蒸餾水至全量，混合，冷藏，過濾，罐封，滅菌，得口服液。
實施例7除基于1000g的總混合物使用200g咖啡或脫咖啡因咖啡提取物和600g金銀花提取物外，以與實施例4相同的方法制劑。
實施例8除基于1000g的總混合物使用600g咖啡或脫咖啡因咖啡提取物和200g金銀花提取物外，以與實施例4相同的方法制劑。
實驗實施例一、實驗目的樣品化合物抗乙型肝炎病毒(HBV)活性篩選。試驗包括在病毒一細胞水平的試驗中，檢測樣品化合物的細胞毒性、對乙型肝炎病毒表面和核心抗原的分泌，以及病毒核酸(DNA)的復制水平的影響作用。
二、實驗原理乙型肝炎病毒(HBV)轉基因人肝癌細胞HepG2.2.15細胞株，在培養時能分泌乙肝病毒顆粒(含抗原和DNA)于培養上清中。
在抗病毒藥物的干預下，檢測細胞分泌到培養上清中的HBsAg、HBeAg以及病毒DNA含量，參照未加藥對照組的含量，可以觀測樣品藥物的抗病毒活性作用，同時檢測樣品藥物的細胞毒性作用。運用MTT法檢測樣品藥物導致50％細胞毒性死亡的數值濃度為CC50；用ELISA方法檢測樣品藥物達到抑制HBsAg、HBeAg分泌，以及運用熒光定量PCR法檢測樣品藥物抑制病毒DNA復制量的50％時的濃度數值為IC50。
三、實驗樣品臨用時配成實驗所需樣品藥物濃度，每個樣品藥物做7個稀釋濃度的試驗，并設拉米夫定等抗病毒藥物作為實驗的陽性對照藥。
四、實驗方法1、培養上清的收集將HepG2.2.15細胞接種于96孔板中，次日加入樣品藥物，定期更換培養液及同濃度的樣品藥物，于第八天收集培養上清待測。向96孔板中的細胞加MTT，4小時后加MTT溶解液反應過夜，次日在酶標儀上測OD570。根據OD值計算出樣品藥物對HepG2.2.15細胞的毒性作用，影響細胞生長的狀況，導致半數細胞死亡量所需的濃度(CC50)。
2、處理細胞的收集將HepG2.2.15細胞接種于培養瓶中，次日加入樣品藥物，經定期更換培養液及同濃度的樣品藥物，于第八天收集細胞待測。
3、培養上清中HBsAg和HBeAg含量的檢測(ELISA法)運用HBsAg和HBeAg檢測用試劑盒(華美生物工程公司，河南洛陽)進行檢測。向包被好的條形板中加入樣品，并加入等量的酶標結合物，37℃反應1小時后洗板，重復5次。加入顯色液A和B，15分鐘后終止反應，測定OD450/630，并根據OD值計算出樣品對HBV抗原的半數抑制率(IC50)。
4、熒光定量PCR法檢測樣本中HBV-DNA含量(1)細胞外培養上清中HBV DNA檢測取適量的培養上清加入到等體積的病毒提取液中，混勻后煮沸，然后于室溫10000rpm離心5分鐘，取適量的上清用于PCR擴增，同時設置HBV-DNA標準樣品5個，做標準曲線。并根據檢測所得的病毒DNA復制值，計算出每個樣品藥物各濃度時對HBV-DNA復制的抑制率，然后再進行樣品藥物半數抑制率計算獲得其(IC50)，對不能進行IC50值計算的樣品，給與ICx表示并給出相應的濃度數值。
試驗用PCR引物為P15’ATCCTGCTGCTATGCCTCATCTT3’P25’ACAGTGGGGAAAGCCCTACGAA3’，試驗用PCR探針為5’TGGCTAGTTTACTAGTGCCATTTTG3’(2)細胞內HBV核心顆粒中DNA檢測溶液A1ml 10mM Tris(pH 7.5)/1mM EDTA/50mM NaCl/8％蔗糖/0.25％Nonidet(諾乃洗滌劑)P-40，裂解液溶液BDNase I(50g/ml)和RNase A(20g/ml)，提取液溶液C26％聚乙二醇/1.4M NaCl/25mM EDTA，沉淀液溶液D10mM Tris(pH 7.5)/6mM MgCl2，懸液采用的方法為用藥處理8天的細胞，胰酶消化，從細胞中提取核心顆粒中的DNA消化下來的細胞用溶液A裂解，4℃離心3min，取上清，調成6mM MgCl2濃度，加入溶液B，37℃30min。加入330μl溶液C沉淀核心顆粒，4℃30min后，離心4min。沉淀重懸于100μl溶液D，加入DNase I 37℃消化15min，所獲得的樣品進行實時熒光定量PCR，以HepG2.2.15細胞總DNA中GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)為內標，檢測HBV核心顆粒中DNA水平的改變。
試驗引物為P35’-GGTATCGTGGAAGGACTCATGAC-3’P45’-ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAGC-3’五、實驗結果表1、實施例1制備的咖啡提取物及咖啡成分綠原酸，咖啡酸和奎寧(尼)酸對HepG2.2.15細胞HBV的抑制作用
aCC50為樣品藥物對HepG2.2.15細胞的生長的影響，50％致死濃度。
bIC50為樣品對DNA拷貝的抑制達50％時的濃度。SI為樣品生物活性選擇系數。
表2、綠原酸，咖啡酸和奎寧(尼)酸在咖啡中的含量
40g咖啡，經18k包金金屬過濾網咖啡壺加熱過濾后得到約400ml新鮮飲用咖啡，經凍干濃縮成咖啡粗提物。普通咖啡回收得10g咖啡粗提物；低咖啡因咖啡回收得8.6g咖啡粗提物。檢測相應的活性化合物在粗提物中的含量，然后換算成在100ml新鮮飲用咖啡中的含量。
權利要求
1.一種抗乙肝病毒抑制劑，其特征在于，包括咖啡提取物和輔劑。
2.如權利要求1所述的抗乙肝病毒抑制劑，其特征在于，基于100重量份的所述抗乙肝病毒抑制劑，含有10～90重量份的咖啡提取物，余量為輔劑。
3.如權利要求1或2所述的抗乙肝病毒抑制劑，其特征在于，所述咖啡提取物為普通咖啡、低咖啡因咖啡或脫咖啡因咖啡的提取物。
4.如權利要求1所述的抗乙肝病毒抑制劑，其特征在于，所述輔劑包括維生素C、羥丙維生素、預膠化淀粉、微粉硅膠、蔗糖、乙醇、防腐劑、和/或硬脂酸鎂。
5.如權利要求1所述的抗乙肝病毒抑制劑，其特征在于，所述咖啡提取物通過以下方法制備，1)咖啡在80～100℃的熱水過濾或熱水煮5～10分鐘，獲得咖啡溶液，其中，咖啡與水的重量比為1∶15～1∶5，并凍干咖啡溶液，獲得粉末狀咖啡提取物；或2)稱取咖啡置于圓底燒瓶內，加入95％食用乙醇，乙醇體積與咖啡質量的比例為1∶5ml/g，混合物加熱到90℃進行回流1.5小時，過濾，濾液于旋轉蒸發儀上、在60℃下進行濃縮成浸膏，進行噴霧干燥得粉末狀咖啡粗提物；或3)稱取咖啡置于圓底燒瓶內，加入40-60％食用乙醇，乙醇體積與咖啡質量的比例為1∶5ml/g，混合物加熱到90℃進行回流1.5小時，過濾，濾液于旋轉蒸發儀上60℃進行濃縮成浸膏，進行噴霧干燥得粉末狀咖啡粗提物。
6.如權利要求5所述的抗乙肝病毒抑制劑，其特征在于，在方法1)中，咖啡與水的重量比為1∶10。
7.權利要求1所述的抗乙肝病毒抑制劑在制備用于治療乙肝的藥物中的應用。
8.權利要求1的抗乙肝病毒抑制劑的劑型，其特征在于，所述劑型為片劑、膠囊劑、沖劑、口服液、或丸劑。
全文摘要
本發明設計一種含咖啡提取物的抗乙肝病毒(HBV)抑制劑及其應用。經藥理試驗表明該類抑制劑能有效抑制乙肝病毒DNA復制、乙肝病毒s抗原和e抗原的合成，并且具有高效低毒的優點，因此，可以用作治療或輔助治療乙型肝炎，且具有廉價、安全、方便的特點。
文檔編號A61K9/10GK1879727SQ20061002639
公開日2006年12月20日 申請日期2006年5月9日 優先權日2006年5月9日
發明者左建平, 趙維民, 王桂鳳, 劉群芳, 石麗萍, 張如雋, 任宇丹, 鄒健, 何佩嵐, 馮加權, 唐煒, 朱峰華 申請人:中國科學院上海藥物研究所