專利名稱：人早胚來源的表皮或毛囊干細胞的制備及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及干細胞及基因工程技術領域，具體涉及一種可以快速增殖的人胚源性表皮(毛囊)干細胞的方法及其應用。
背景技術：
皮膚是人體的最大器官，因處在體表，急易受到損傷。如燒傷、燙傷、挫傷、創傷等在臨床上十分常見。皮膚創面的覆蓋和表皮細胞的再生是治療皮膚損傷的關鍵。創傷救治的根本在于創面的愈合。目前現行的對大面積深度創面仍采用自體皮膚移植、自/異體混合移植、或自/異體皮膚更植等修復方法，這些方法存在療程長、并發癥多、治療費用高、愈合質量差、造成新的創面等缺點。皮膚創傷修復過程中，皮膚附屬器的再生是個難題。隨著干細胞研究的深入，人們嘗試進行細胞移植來治療皮膚創傷。但是成體來源的表皮干細胞增殖緩慢，培養條件苛刻。
1962年，Stanley Cohen在雌性小鼠下頜腺發現表皮生長因子(EGF)，是一種小分子單鏈多肽。1975年，Harry Gregory發現了人的EGF。除下頜腺以外，人體的多種組織也有EGF分布，如十二指腸的Brunners腺、含中性粘蛋白的胃粘膜細胞系、外分泌腺體以及多種腫瘤細胞等。EGF能通過胞外信號調節激酶(ERK)途徑引起3T3細胞的內源性的黏著斑激酶(FAK)磷酸化。從而激活細胞黏附。EGF受體不僅具有受體功能，而且具有酶活性，故既有結合配體發生構象變化的特點，又能作為激酶，催化底物蛋白發生酪氨酸磷酸化。現已知EGF是通過與細胞膜上的EGF受體(EGFR)結合而發揮作用的。EGFR是一種相對分子質量為170kD的糖蛋白，由1186個氨基酸殘基構成，為原癌基因cerbB1所編碼。該基因位于小鼠的第11條染色體及人的第7條染色體上。其結構分為3個區域伸向膜外與EGF識別并結合的氨基酸區域、位于細胞膜中間的跨膜區以及具有酪氨酸激酶活性的細胞質內的羧基端區(Wiley LM，Adamson ED，Tsark EC.Epidermal growth factor receptor function in earlymammalian development[J].Biol Essays.1995；17(10)839-846.)。EGFR的結構和功能在不同種屬動物中基本相似，分子進化比較保守。EGF同其受體結合時，可引起細胞漿內EGFR的酪氨酸蛋白激酶活性增加，使酪氨酸殘基的磷酸化增加，從而造成細胞內游離Ca2+增多，基因轉錄增加，DNA復制增多及細胞分裂；當細胞內Ca2+增多時，還能激活蛋白激酶C和環腺苷酶，改變細胞的骨架結構，使細胞分化。Ga2+依賴的細胞黏附能激活CDC42，可能是通過c-Src和FRG途徑(Tatsuro Fukuharal，Kazuya Shimizul，Tomomi Kawakatsul，et al.Activation of Cdc42 by transinteractions of the cell adhesion molecules nectins through c-Src andCdc42-GEF FRG.The Journal of Cell Biology.2004；166393-405)。E-鈣粘附分子的缺乏或結構的改變與人類特定的腫瘤的侵入和轉歸有密切的關系。用培養的人角化細胞進行研究發現，細胞間粘附的形成系細胞外鈣離子的濃度參與調控，當培養液的鈣離子濃度在低水平(30μM)時，細胞呈單層生長而且沒有粘附功能，當鈣離子濃度增加(1.0mM)時，快速引起粘附連接和橋粒的形成，所以是一種鈣離子依賴的粘附蛋白(王運濤，鄭啟新，郭曉東，等.野生型Smad3基因促進大鼠骨髓間充質干細胞成骨分化的實驗研究.中華醫學雜志.2004；841523-1527)。
在特定的體內外微環境條件下，干細胞能夠誘導分化為各種組織細胞，為多種疾病的治療拓展了新的治療途徑。干細胞在不同部位分化為不同組織細胞，組織微環境如鈣離子濃度在調控干細胞分化方向上起了重要作用。
本發明人已經成功從4到6周左右人胚分離培養了人胚源性間充質干細胞(hMSC)。(仵敏娟，劉厚奇等.人早期胚胎間充質干細胞的定位和體外初步分離培養.第二軍醫大學學報2004；25(8)818-821)發明內容本發明的目的在于克服成體表皮干細胞增殖緩慢的問題，利用上述人胚源性間充質干細胞(hMSC)，提供一種可以快速增殖的人胚源性表皮(毛囊)干細胞的方法及其應用。
本發明將人早期胚胎來源的間充質干細胞(hMSC)在特定組織微環境下誘導為人胚源性表皮(毛囊)干細胞。
本發明根據EGF質粒轉染能激活FAK，改變細胞的骨架結構，使細胞分化；外源鈣離子刺激能激活鈣離子依賴的黏附蛋白這一事實，按照文獻方法從人成體表皮組織獲取含EGF基因cDNA片段并重組到真核表達載體pCDNA3.0，(參照陳廷速等，人表皮生長因子(hEGF)基因的合成、鑒定及植物表達質粒的構建，廣西大學學報(自然科學版)，27(2)122-127)，轉染人胚源性間充質干細胞(hMSC)，以便用表達的外源性EGF蛋白啟動信號轉導，促進其向表皮分化，同時結合一定濃度的鈣離子刺激。
本發明提供一種可以快速增殖的人胚源性表皮(毛囊)干細胞的方法，它包括將含EGF的重組表達載體轉染人胚源性間充質干細胞，并在轉染過程中用0.4-1.0mmol濃度的鈣離子刺激。
通過體外實驗研究發現，轉染后細胞形態有變化，由纖維形變為短圓形的細胞(圖1)。加一定濃度鈣離子刺激后，細胞成典型的表皮細胞狀生長(圖2)，并表達角蛋白，角蛋白19等抗原(圖3)。
考慮到動物體內的微環境對干細胞分化的誘導作用，本發明將人胚源性間充質干細胞種植到裸鼠皮下。在皮下微環境的誘導下，人胚源性干細胞向表皮細胞分化。體內實驗表明，人胚源性間充質干細胞在裸鼠皮下可分化為表皮細胞，并直接參與了裸鼠毛發的再生(圖4)。人角蛋白19染色和堿性磷酸酶染色的結果也表明人胚源性間充質干細胞移植裸鼠的移植處的皮膚細微結構，具有表皮(毛囊)干細胞的特性(圖5)。
本發明提供的一種可以快速增殖的人胚源性表皮(毛囊)干細胞的方法，可獲得增殖相對迅速的人胚源性表皮細胞，可應用于臨床皮膚創傷治療。
圖1為轉染EGF后的人胚源性間充質干細胞圖2為鈣離子刺激后的轉染EGF的人胚源性間充質干細胞圖3為免疫組化檢測角蛋白和角蛋白19的試驗結果其中AEGF；B角蛋白19；C角蛋白；D陰性對照圖4為免疫熒光共聚焦檢測人胚源性間充質干細胞在裸鼠體內分化為毛發的試驗結果其中A組織相關溶性抗原HLAI； B角蛋白；C陰性對照； DA和B疊加圖5為人K角蛋白19染色和堿性磷酸酶染色的裸鼠試驗結果其中C，G人角蛋白19染色結果；D，H堿性磷酸酶染色結果。
具體實施例方式
現結合實施例及附圖，對本發明作進一步的描述。
實施例1(1)制備人表皮細胞總RNA成人體皮經原代培養得到表皮細胞(楊玲，劉厚奇等。成人體皮表皮干細胞的定位及分離培養。第二軍醫大學學報，2004，25(8)815-817.)。用上海華舜生物工程有限公司總RNA抽提試劑盒，按常規的異硫氰酸胍法提取獲得總RNA。
(2)合成引物及構建pCDNA3.0-EGF真核表達載體將hEGF基因移至真核載體pCDNA3.0。按照文獻獲取含EGF基因cDNA片段并重組到真核表達載體pCDNA3.0(參照陳廷速等，人表皮生長因子(hEGF)基因的合成、鑒定及植物表達質粒的構建，廣西大學學報(自然科學版)，27(2)122-127)。
(3)建立pCDNA3.0和pCDNA3.0-EGF重組人胚源性間充質干細胞細胞株按美國GibcoL生產的脂質體轉染試劑盒說明書操作，將空載體pCDNA3.0和重組載體pCDNA3.0-EGF分別轉染對數生長期的人胚源性間充質干細胞。具體方法如下將6孔板中長到50％～60％的人胚源性間充質干細胞用無血清DMEM培養基洗滌一次，加入2ml無血清培養基培養6小時。
轉染液制備在聚苯乙烯管中制備以下兩液(為轉染每一個孔細胞所用的量)A液用不含血清的DMEM培養基分別將空載體和重組載體稀釋成1～10μg，每份樣品為100μl；B液用不含血清的DMEM培養基將質脂體進行對倍稀釋，總量為兩個100μl；將A，B二液輕輕混勻，室溫中置10～15分鐘。
轉染準備用2ml不含血清DMEM培養基漂洗細胞兩次；再加入1ml不含血清培養基。
轉染用A/B復合物緩緩加入培養基中，搖勻、置于37℃、5％CO2的培養箱中培養5小時，吸除無血清轉染液，換入正常含10％小牛血清的DMEM培養液繼續培養。用G418(美國GibcoL)篩選(G418 600μg/ml)，挑選G418陽性單克隆細胞擴增培養。分別得空載體pCDNA3.0和重組質粒pCDNA3.0-EGF的人胚源性間充質干細胞細胞株。
(4)鈣離子和EGF協調作用取55.4g CaCl2溶于800ml重蒸水中，加重蒸水定容至1000ml制備1mol CaCl2(氯化鈣)。高壓滅菌后室溫保存。用含0.4mmol鈣離子的、10％DMEM的培養基培養6孔板中長到60％～70％的轉染EGF的人胚源性間充質干細胞。
(5)細胞實驗(體外實驗)利用免疫組化、細胞計數、流式細胞儀等生物學實驗方法，從形態學、蛋白表達等方面分析細胞形態變化，及表皮細胞表面標志角蛋白和角蛋白19及EGF的表達。
具體方法如下1)細胞生長狀態的比較用倒置相差顯微鏡觀察轉染有pCDNA3.0-EGF，pCDNA3.0空載體的人胚源性間充質干細胞及未進行轉染的人胚源性間充質干細胞。可見轉染pCDNA3.0-EGF的人胚源性間充質干細胞與其它兩組相比細胞明顯變圓。分別接種轉染有pCDNA3.0-EGF，pCDNA3.0空載體及未進行轉染的人胚源性間充質干細胞于6孔板中，進行細胞計數。分別將這三種細胞按1×105個/ml接種于6孔板，每12小時計數1次，共計96小時。計數3次，取平均值，繪制生長曲線。結果顯示含pCDNA3.0-EGF重組子的人胚源性間充質干細胞與未進行轉染的人胚源性間充質干細胞相比細胞增殖無明顯變化。
含0.4mmol鈣離子培養基培養后，細胞成典型的表皮細胞特征。
2)免疫組化檢測角蛋白和角蛋白19及EGF的表達制備轉染有pCDNA3.0-EGF，pCDNA3.0空載體的人胚源性間充質干細胞及未進行轉染的人胚源性間充質干細胞的細胞爬片，所收集細胞在含0.4mmol鈣離子培養。用免疫組化檢測角蛋白和角蛋白19及EGF的表達水平。一抗為兔抗小鼠角蛋白、角蛋白19多克隆抗體(北京中山生物技術有限公司)和兔抗人EGF多克隆抗體(SANTA CRUZBIOTECHNOLOGY，INC.)，二抗為FITC標記的山羊抗兔IgG(北京中山生物技術有限公司)。結果經鈣離子刺激后，pCDNA3.0-EGF重組人胚源性間充質干細胞細胞株表達角蛋白和角蛋白19及EGF。這說明pCDNA3.0-EGF重組人胚源性間充質干細胞經鈣離子刺激后，開始表達表皮細胞的特異性抗原角蛋白和角蛋白19及EGF。
(6)體內試驗實驗所用裸鼠BALB/c Nu品系，SPF級。體重約15～25g，3～4周齡，購自上海實驗動物中心。共24只裸鼠，分四組人胚源性間充質干細胞注射組，人成體皮膚成纖維細胞注射組，無血清DMEM注射組，野生組。將人胚源性間充質干細胞與人成體皮膚成纖維細胞分別以無血清DMEM培養基為母液制備成細胞總數不低于1×107個/0.2ml的細胞懸液，用1ml注射器抽取細胞懸液0.2ml注入裸鼠背部皮下。SPF級條件下喂養、每日觀察，四周后取材，結果發現細胞注射處有毛發生成。各組動物，經實驗處理后，在外形、活性等方面無差異。處死后各組裸鼠之間相比，H-E染色，肝、脾、腎等臟器無差異。
對各組裸鼠注射部位的皮膚組織做角蛋白19染色，顯微鏡下觀察發現注射人胚源性間充質干細胞的裸鼠皮膚有大量的毛囊出現，而其它各組則無此現象。堿性磷酸酶染色也清楚的顯示注射人胚源性間充質干細胞的裸鼠皮下有大量毛囊生成。
具體方法如下1)熒光共聚焦制備各組實驗裸鼠注射處皮膚切片。用免疫熒光共聚焦檢測組織相關融性抗原HLA-I和角蛋白的表達水平。一抗為小鼠抗人單克隆抗體HLA-I(Sigma CO)和兔抗鼠多克隆抗體角蛋白(北京中山生物技術有限公司)。二抗為FITC標記的山羊抗小鼠IgG(華美生物工程有限公司產品)和TRITC標記的山羊抗兔IgG(北京中山生物技術有限公司)。結果人胚源性間充質干細胞注射處的皮膚，檢測到大量的組織相關融性抗原HLA-I和角蛋白。兩者的表達有部分重疊。這說明人胚源性間充質干細胞在裸鼠體內分化未毛囊，引起了裸鼠毛發的再生。
2)蘇木精-伊紅(HE)染色方法同常規石蠟切片蘇木精-伊紅(HE)染色。
3)堿性磷酸酶染色方法如下將新鮮制備的各實驗組裸鼠皮膚的冰凍切片取出，2％多聚甲醛固定，TSM1洗，TSM2洗，NBT/BCIP顯色。
權利要求
1.一種可以快速增殖的人胚源性表皮或毛囊干細胞的方法，其特征在于將含表皮生長因子的重組表達載體轉染人早期胚胎來源的間充質干細胞，將其誘導為人胚源性表皮細胞，并在轉染過程中用0.4-1.0mmol濃度的鈣離子刺激。
2.根據權利要求1所述的一種可以快速增殖的人胚源性表皮或毛囊干細胞的方法，其特征在于其中的表皮生長因子的重組表達載體是真核表達載體pCDNA3.0-EGF。
3.權利要求1所述的一種可以快速增殖的人胚源性表皮或毛囊干細胞的方法，在臨床皮膚創傷治療方面的應用。
全文摘要
本發明涉及干細胞及基因工程技術領域。皮膚創面的覆蓋和表皮細胞的再生是治療皮膚損傷的關鍵，隨著干細胞研究的深入，人們嘗試進行細胞移植來治療皮膚創傷，但是成體來源的表皮干細胞增殖緩慢，培養條件苛刻。本發明的目的在于克服成體表皮干細胞增殖緩慢的問題，提供一種可以快速增殖的人胚源性表皮(毛囊)干細胞的方法及其應用。本發明將含EGF的重組表達載體轉染人胚源性間充質干細胞(hMSC)，并在轉染過程中用一定濃度的鈣離子刺激，分化為典型的表皮細胞。在裸鼠皮下微環境誘導下，分化為皮膚相關組織的細胞，直接參與了裸鼠毛發的再生。本發明可獲得增殖相對迅速的人胚源性表皮(毛囊)干細胞，對臨床皮膚創傷治療方面有巨大的應用潛能。
文檔編號A61K35/36GK1834253SQ20061002531
公開日2006年9月20日 申請日期2006年3月30日 優先權日2006年3月30日
發明者劉厚奇, 仵敏娟, 楊玲 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學