專利名稱：未變性魚鱗膠原的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種未變性魚鱗膠原的制備方法，屬于生物醫用材料的制備領域。
背景技術：
未變性天然膠原仍保持其獨特的三股螺旋結構，分子量約為30萬，具有人工合成高分子所不可媲美的低抗原性、良好的生物相容性和生物降解性等功能，其應用已廣泛滲透到燒傷、創傷、矯形以及硬組織修復等領域。未變性天然膠原還具有優良的保濕和促進表皮細胞生長的性能，能夠有效地增強皮膚彈性，減少皮膚皺紋，延緩皮膚衰老，故也可應用于化妝品行業中。
未變性天然膠原的廣泛應用必然導致其需求量愈來愈大，對其品質的要求也愈來愈高。迄今為止，豬、牛等陸生動物的皮和跟腱仍然是提取未變性天然膠原的主要原材料。但是由于瘋牛病和口蹄疫等動物傳染性疾病全球肆虐，并且尚無有效治療方法，以致人們對使用從陸生動物組織中提取的未變性天然膠原產生恐慌。于是，尋求更高質量和更高安全性的提取未變性天然膠原的原材料迫在眉睫。
水產動物膠原蛋白具有陸生動物膠原蛋白沒有的一些特點以及更高的安全性，相對豬、牛等陸生動物而言，水產品作為提取未變性天然膠原的原材料在使用安全性方面更有優勢。
我國是世界上唯一水產養殖量超過捕撈量的國家。伴隨水產業結構的調整，水產加工業逐步發展壯大。加工魚產品的同時產生大量下腳料，其中約5％是魚鱗。但是由于受技術和傳統觀念的制約，在較長一段時間內，魚鱗并沒有被充分利用。據保守估計，我國每年廢棄的魚鱗達30多萬噸。并且魚鱗中含有豐富的膠原蛋白，脂質含量少，有利于膠原的提取和純化。因此，魚鱗作為提取未變性天然膠原的原材料是相當可觀的。
膠原的熱穩定性由其在水系中的熱收縮溫度(Ts)和溶液中分子的熱變性溫度(Td)所決定。對水產動物而言，Ts和Td之差不受動物種屬影響，大致在20-25℃。一般來說，未變性魚鱗膠原的變性溫度比豬、牛等陸生動物膠原的變性溫度低5-15℃。此外，與豬、牛等陸生動物皮膠原纖維不同，魚鱗膠原纖維已嚴重礦化，所以在魚鱗預處理中要加強脫鈣預處理。鑒于豬、牛等陸生動物膠原和魚鱗膠原在熱穩定性以及組織結構上的差異，現有從豬、牛等陸生動物組織中提取未變性天然膠原的制備方法并不適用于制備未變性魚鱗膠原。
發明內容
本發明的目的是針對現有技術的不足而提供一種未變性魚鱗膠原的制備方法，以充分利用魚鱗廢棄物，變廢為寶，提高水產品的附加值。
本發明的目的由以下技術措施實現，其中所述原料份數除特殊說明外，均為重量份數。
未變性魚鱗膠原的制備方法1、原料的預處理選不含雜質的魚鱗，用5-15％的NaCl溶液浸泡24-48小時，攪拌，自來水淘洗，過濾；用0.05-0.2M的NaOH溶液浸泡24-48小時，攪拌，自來水淘洗，過濾；用15-50g/L的H2O2，NaOH調節pH為8-12，浸泡24-36小時，自來水淘洗，蒸餾水浸洗，過濾；將魚鱗用絞肉機絞碎，自然晾干；取絞碎魚鱗100重量份，用0.1-2M的EDTA溶液1000-2000重量份浸泡24-48小時，微波爐輸出功率200-400W，工作頻率2450MHz，輻射10-20分鐘，攪拌，過濾；操作溫度為4-10℃，所得產物作為以下提取原料，備用；2、未變性魚鱗膠原的提取將上述預處理后的魚鱗中加入蛋白酶1-5份，用酸調節pH＝2-4，在溫度為4-6℃浸泡1-3天，獲得未變性魚鱗膠原蛋白液；3、未變性魚鱗膠原的純化將上述蛋白液用10000-20000rpm高速離心機分離，除去濾渣，清液用濃度為0.5-5M的NaCl溶液鹽析，沉淀經離心分離，用0.05-2M的乙酸溶解；如此反復鹽析操作3-5次，再經膜透析處理3次，獲得濃度為0.5-1％的未變性魚鱗膠原溶液；操作溫度均為4-6℃。
上述方法制備得到未變性魚鱗膠原。
蛋白酶為胃蛋白酶、537蛋白酶或真菌復合酶中的任一種。
未變性魚鱗膠原經DSC法測定其變性溫度為25-35℃，詳見圖1所示。SDS-PAGE法測定其分子量及分布，結果表明魚鱗膠原含有分子量分別為20萬和10萬的β鏈和α鏈亞基，詳見圖2所示。
本發明具有如下優點從水產廢棄物魚鱗中提取高附加值的未變性天然膠原，變廢為寶，既消除了對環境的污染，又打破了傳統上過分依賴豬、牛等陸生動物組織提取未變性天然膠原的格局，開拓了高品質、高安全性未變性天然膠原的來源渠道；制備過程中，微波輔助脫鈣，大大改善了脫鈣效果，且縮短了生產周期；采用乙酸、蛋白酶等環境友好材料在低溫下提取膠原，確保了膠原產物的品質和安全性，該產品可廣泛應用于高檔化妝品和生物醫用材料等領域。
圖1為魚鱗膠原的DSC熱變性溫度測試2為魚鱗膠原的SDS-PAGE電泳分離圖，其中M為標準樣品，FS為魚鱗膠原具體實施方式
下面通過實施例對本發明進行具體描述，有必要在此指出的是本實施例只用于對本發明進行進一步說明，不能理解為對本發明保護范圍的限制，該領域的技術熟練人員可以根據上述本發明的內容做出一些非本質的改進和調整。
實施例1選不含雜質的魚鱗作提取原材料。用5％的NaCl溶液浸泡48小時，攪拌，自來水淘洗，過濾。用0.1M的NaOH溶液浸泡36小時，攪拌，自來水淘洗，過濾。用15g/L的H2O2，NaOH調節pH為9，浸泡36小時，自來水淘洗，蒸餾水浸洗，過濾。將魚鱗用絞肉機絞碎，自然晾干。取絞碎魚鱗100g，用0.5M的EDTA溶液2000g浸泡48小時，微波爐輸出功率200W，工作頻率2450MHz，輻射20分鐘，攪拌，過濾。加入蛋白酶1g，用酸調節pH＝2-4，在溫度為4-6℃攪拌72小時。10000rpm離心除去濾渣，清液用濃度為1M的NaCl溶液鹽析，沉淀經離心分離，用2M的乙酸溶解，反復鹽析操作3次，膜透析3次，得到濃度為0.5-0.7％的未變性魚鱗膠原溶液900g。
實施例2
選不含雜質的魚鱗作提取原材料。用10％的NaCl溶液浸泡36小時，攪拌，自來水淘洗，過濾。用0.05M的NaOH溶液浸泡48小時，攪拌，自來水淘洗，過濾。用30g/L的H2O2，NaOH調節pH為10，浸泡30小時，自來水淘洗，蒸餾水浸洗，過濾。將魚鱗用絞肉機絞碎，自然晾干。取絞碎魚鱗100g，用1M的EDTA溶液1500g浸泡36小時，微波爐輸出功率300W，工作頻率2450MHz，輻射15分鐘，攪拌，過濾。加入蛋白酶3g，用酸調節pH＝2-4，在溫度為4-6℃攪拌48小時。15000rpm離心除去濾渣，清液用濃度為2M的NaCl溶液鹽析，沉淀經離心分離，用1M的乙酸溶解，反復鹽析操作4次，膜透析3次，得到濃度為0.7-0.9％的未變性天然魚鱗膠原溶液600g。
實施例3選不含雜質的魚鱗作提取原材料。用15％的NaCl溶液浸泡24小時，攪拌，自來水淘洗，過濾。用0.2M的NaOH溶液浸泡24小時，攪拌，自來水淘洗，過濾。用50g/L的H2O2，NaOH調節pH為10，浸泡24小時，自來水淘洗，蒸餾水浸洗，過濾。將魚鱗用絞肉機絞碎，自然晾干。取絞碎魚鱗100g，用2M的EDTA溶液1500g浸泡24小時，微波爐輸出功率400W，工作頻率2450MHz，輻射10分鐘，攪拌，過濾。加入蛋白酶5g，用酸調節pH＝2-4，在溫度為4-6℃攪拌72小時。20000rpm離心除去濾渣，清液用濃度為3M的NaCl溶液鹽析，沉淀經離心分離，用0.05M的乙酸溶解，反復鹽析操作5次，膜透析3次，得到濃度為0.6-1％的未變性魚鱗膠原溶液800g。
權利要求
1.未變性魚鱗膠原的制備方法，其特征在于該方法包括以下步驟(1)原料的預處理選不含雜質的魚鱗，用5-15％的NaCl溶液浸泡24-48小時，攪拌，自來水淘洗，過濾；用0.05-0.2M的NaOH溶液浸泡24-48小時，攪拌，自來水淘洗，過濾；用15-50g/L的H2O2，NaOH調節pH為8-12，浸泡24-36小時，自來水淘洗，蒸餾水浸洗，過濾；將魚鱗用絞肉機絞碎，自然晾干；取絞碎魚鱗100重量份，用0.1-2M的EDTA溶液1000-2000重量份浸泡24-48小時，微波爐輸出功率200-400W，工作頻率2450MHz，輻射10-20分鐘，攪拌，過濾；操作溫度為4-10℃，所得產物作為以下提取原料，備用；(2)未變性魚鱗膠原的提取將上述預處理后的魚鱗中加入蛋白酶1-5份，用酸調節pH＝2-4，在溫度為4-6℃浸泡1-3天，獲得未變性魚鱗膠原蛋白液；(3)未變性魚鱗膠原的純化將上述蛋白液用10000-20000rpm高速離心機分離，除去濾渣，清液用濃度為0.5-5M的NaCl溶液鹽析，沉淀經離心分離，用0.05-2M的乙酸溶解；如此反復鹽析操作3-5次，再經膜透析處理3次，獲得濃度為0.5-1％的未變性魚鱗膠原溶液；操作溫度均為4-6℃。
2.如權利要求1所述未變性魚鱗膠原的制備方法，其特征在于蛋白酶為胃蛋白酶、537蛋白酶或真菌復合酶中的任一種。
3.如權利要求1所述方法制備得到未變性魚鱗膠原。
全文摘要
一種未變性魚鱗膠原的制備方法，其特點是將魚鱗用5－15％的NaCl溶液浸泡24－48小時，攪拌，過濾；用0.05－0.2M的NaOH溶液浸泡24－48小時，攪拌，過濾；用15－50g/L的H
文檔編號A61K8/30GK1948411SQ20061002218
公開日2007年4月18日 申請日期2006年11月6日 優先權日2006年11月6日
發明者李國英, 劉文濤, 來國莉, 張敏 申請人:四川大學