專利名稱：短葉老鸛草素在腫瘤生長(zhǎng)和增殖抑制劑中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及短葉老鸛草素(Brevilin)的用途，特別涉及短葉老鸛草素在制備腫瘤生長(zhǎng)和增殖抑制劑中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鵝不食草(Centipeda minima(L.)A.Br.et Aschers.)系菊科石胡荽屬植物，又名石胡荽、雞腸草。鵝不食草始載于南唐《食性本草》，在我國(guó)著名的藥典《本草綱目》中亦有記載，“鵝不食草可以通鼻氣，利七竅，吐風(fēng)痰，塞鼻息自落”。鵝不食草生長(zhǎng)于海拔300～1900米的陰濕處，主產(chǎn)于我國(guó)浙江、湖北、江蘇、廣東等地。在國(guó)外主要分布于印度平原和錫蘭島。
鵝不食草主要成分包括有揮發(fā)性油類，甾體類，萜類化合物和黃酮類等主要有效成分。藥理研究證明，它有廣泛的藥理作用，如抗炎，抗原生生物，抗菌抗過(guò)敏等作用。
萜類化合物是鵝不食草的主要化學(xué)成分之一，很多萜類化合物具有重要的生理活性，比如，山金車(chē)內(nèi)酯C和D具有相似的抗枯草桿菌作用，MIC值為150微克/毫升。鵝不食草揮發(fā)油0.05毫升/千克和0.01毫升/千克劑量組對(duì)小鼠急性炎癥均有明顯抑制作用。
有關(guān)短葉老鸛草素的公開(kāi)專利和發(fā)表的文獻(xiàn)大致可分為二類第一類是關(guān)于利用植物化學(xué)的方法研究短葉老鸛草素分離提取或者在植物中的含量，Bohlmann F，Chen ZL.New guaianolides from Centipeda minima.KeXue TongBao 1984；29(7)900-3。劉宇 楊艷芳 吳和珍 劉焱文.RP-HPLC法測(cè)定鵝不食草中短葉老鸛草素的含量，中藥材2005，6(28)473-474報(bào)道鵝不食草中短葉老鸛草素的含量為3毫克/克。
第二類是關(guān)于短葉老鸛草素生物活性的研究，在這些報(bào)道中短葉老鸛草素具有抗原生蟲(chóng)活性，如瘧原蟲(chóng)和阿米巴蟲(chóng)等，Sharma P，Sharma J D.A Review of Plant Species Assessedin vitro for Antiamoebic Activity or both Antiamoebic and Antiplasmodial Properties.Phytother.Res.2001 15，1-17.
目前，在相關(guān)檢索中并未發(fā)現(xiàn)關(guān)于短葉老鸛草素用于制備抗癌藥物的專利，然而，當(dāng)前腫瘤化療治療領(lǐng)域急需解決的問(wèn)題是尋找出新的低毒、高效抗癌藥物資源。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)腫瘤治療領(lǐng)域急需解決的問(wèn)題，尋找出新的低毒、高效抗癌藥物資源。提供應(yīng)用短葉老鸛草素(Brevilin)或其與藥理學(xué)上允許的添加成分相組合而制成的腫瘤生長(zhǎng)和增殖抑制劑。
本發(fā)明提供的腫瘤生長(zhǎng)和增殖抑制劑，應(yīng)用分子結(jié)構(gòu)如下式的短葉老鸛草素，作為腫瘤生長(zhǎng)和增殖抑制劑中的有效成分。
本發(fā)明提供的腫瘤生長(zhǎng)和增殖抑制劑，為短葉老鸛草素(Brevilin)或其與藥理學(xué)上允許的添加成分相組合而成的抑制劑。所述抑制劑劑型為經(jīng)口給藥的固型制劑散劑，丸劑，片劑或膠囊劑，或?yàn)榉墙?jīng)口給藥的外用劑，軟膏，貼敷劑，注射劑。
本發(fā)明的腫瘤生長(zhǎng)和增殖抑制劑中的短葉老鸛草素由鵝不食草提取或向SIGMA(西格瑪)公司購(gòu)買(mǎi)，純度大于等于99％時(shí)，藥效更好。
本發(fā)明中所說(shuō)的腫瘤為醫(yī)學(xué)上所屬的各類腫瘤，包括良性腫瘤和惡性腫瘤。而所說(shuō)的惡性腫瘤包括惡性黑色素瘤，惡性淋巴瘤，消化器官的腫瘤(胃癌，腸癌，肝癌，膽囊癌，膽道癌，胰腺癌)，肺癌，乳癌，睪丸癌，卵巢癌，子宮癌，前列腺癌，上顎癌，舌癌，口腔癌，咽喉癌，甲狀腺癌，腦部腫瘤，各類肉瘤，骨肉瘤，白血病，神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，膀胱腫瘤，皮膚癌，皮膚附屬器官癌和皮膚轉(zhuǎn)移癌。
本發(fā)明提供的腫瘤生長(zhǎng)和增殖的抑制劑，小劑量即產(chǎn)生抑制多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用且具有劑量依賴性，可將它們作為治療腫瘤的藥物，應(yīng)用于腫瘤的化學(xué)治療中。
本發(fā)明提供的腫瘤生長(zhǎng)和增殖的抑制劑，在低濃度的情況下具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用，說(shuō)明不僅具有殺滅腫瘤細(xì)胞的作用而且可以遏制腫瘤細(xì)胞的無(wú)限增殖能力，因而可以發(fā)揮更進(jìn)一步更大程度治療腫瘤的效果。
本發(fā)明提供的腫瘤生長(zhǎng)和增殖的抑制劑，對(duì)不同的人類癌細(xì)胞和人類正常細(xì)胞有不同的細(xì)胞毒性，尤其是對(duì)癌細(xì)胞的IC50要比正常細(xì)胞的IC50低很多，而且兩者差異顯著(p＜0.05)。
本發(fā)明的腫瘤生長(zhǎng)和增殖的抑制劑，低毒，適合于人和哺乳類動(dòng)物經(jīng)口或非經(jīng)口給藥。
本發(fā)明提供的腫瘤生長(zhǎng)和增殖的抑制劑，在劑型方面無(wú)特定的限制，可作為經(jīng)口給藥的散劑，丸劑，片劑，膠囊劑等固型制劑，也可作為非經(jīng)口給藥的外用劑，軟膏，貼敷劑，注射劑。
本發(fā)明提供的腫瘤生長(zhǎng)和增殖的抑制劑，通常能與不影響藥理學(xué)作用的輔助料配合制成經(jīng)口或非經(jīng)口給藥的制劑。
本發(fā)明提供的腫瘤生長(zhǎng)和增殖的抑制劑，可經(jīng)水溶劑(如蒸餾水)，水溶性制劑(如生理鹽水)，脂溶劑(如胡麻油)等溶劑用常規(guī)法調(diào)制。
本發(fā)明提供的腫瘤生長(zhǎng)和增殖的抑制劑，通常能與藥理學(xué)上允許的稀釋劑，著色劑，安定劑，界面活性劑，助溶劑，緩沖劑，矯味劑，香料，保存劑或糖衣劑相組合，用于經(jīng)口或非經(jīng)口劑型。
本發(fā)明提供的腫瘤生長(zhǎng)和增殖的抑制劑，在劑型上通常能與藥理學(xué)上允許的稀釋成分和成型成分相組合，用于經(jīng)口或非經(jīng)口劑型。
本發(fā)明提供的腫瘤生長(zhǎng)和增殖的抑制劑經(jīng)口劑型，是指片劑，丸劑，顆粒劑，散劑或膠囊。非經(jīng)口劑型是指靜脈注射劑，肌肉注射劑，皮下注射劑，浴劑，直腸，肛門(mén)或陰道給藥。
本發(fā)明的顯著的優(yōu)點(diǎn)和技術(shù)上的進(jìn)步本發(fā)明提供的具有抑制多種人類腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖作用的天然化合物，克服了傳統(tǒng)上中藥服用計(jì)量大且療效不穩(wěn)定的缺陷，用現(xiàn)代生物技術(shù)作為發(fā)明的手段，明確了有效成分，運(yùn)用純化合物作為抗腫瘤藥物，減少了未知成分引起負(fù)作用的可能性。該種化合物具有顯著的抑制人類腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖作用(體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn))，同時(shí)對(duì)人類正常細(xì)胞的細(xì)胞毒性較小，具有良好的應(yīng)用前景。
表1為不同濃度的短葉老鸛草素對(duì)A375，A431，95D，MKN45，BEL-7402，LoVo細(xì)胞的抑制作用。
表2為不同濃度的短葉老鸛草素對(duì)293，L02細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。
圖1為不同藥物及濃度抑制C57小鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的比較。
圖2為短葉老鸛草素結(jié)構(gòu)式。
具體實(shí)施例方式
下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明內(nèi)容作進(jìn)一步說(shuō)明。所舉之例并不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍實(shí)施例1短葉老鸛草素對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性作用短葉老鸛草素為從鵝不食草中分離得到的純天然產(chǎn)物，純度大于99％，用DMEM(杜氏改良依格培養(yǎng)基，Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM)培養(yǎng)液稀釋成所需濃度。采用噻唑藍(lán)(MTT)快速比色法測(cè)定短葉老鸛草素對(duì)A375，A431，95D，MKN45，BEL-7402，LoVo，HL60細(xì)胞的毒性作用。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞(106細(xì)胞/毫升)，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔0.2毫升，分別加入設(shè)定濃度的短葉老鸛草素處理，每濃度平行4孔，對(duì)照組加等量體積的培養(yǎng)液，置37℃，5％CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)1-4天，實(shí)驗(yàn)終止前4小時(shí)每孔加入5毫克/毫升MTT 10微升，培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入0.04當(dāng)量的二甲基亞砜(DMSO)，每孔150微升，振蕩10分鐘，待MTT還原產(chǎn)物完全溶解，用BioRad 550型酶標(biāo)儀，以550納米為實(shí)驗(yàn)波長(zhǎng)，655納米為參照波長(zhǎng)測(cè)定其吸收度，計(jì)算腫瘤細(xì)胞的抑制率和藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率，并以藥物的不同濃度和細(xì)胞的抑制率作圖，確定細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表1所示。
表1不同濃度的Brevilin對(duì)A375，A431，95D，MKN45，BEL-7402，LoVo細(xì)胞的抑制作用
注A375-95D-LoVo-A431-人表皮鱗狀癌細(xì)胞，HL60-人急性早幼粒白血病細(xì)胞，MKN45-人胃癌細(xì)胞，BEL-7402-人肝癌細(xì)胞，LoVo-結(jié)腸癌細(xì)胞，95D-人肺巨細(xì)胞癌高轉(zhuǎn)移株細(xì)胞，A375人惡性黑色素瘤。
表2不同濃度的Brevilin對(duì)293，L02細(xì)胞的細(xì)胞毒性
注293-人體正常胚胎腎細(xì)胞，L02-肝細(xì)胞。
以上實(shí)施例說(shuō)明，短葉老鸛草素對(duì)不同種類的腫瘤細(xì)胞均具有良好的殺滅作用，而且這種抑制效果還具有劑量依賴性。
實(shí)施例2短葉老鸛草素對(duì)正常L02細(xì)胞的毒性作用短葉老鸛草素為從鵝不食草中分離得到的純天然產(chǎn)物，純度大于99％，用DMEM培養(yǎng)液稀釋成所需濃度。采用噻唑藍(lán)(MTT)快速比色法測(cè)定短葉老鸛草素對(duì)L02細(xì)胞的毒性作用。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞(106細(xì)胞/毫升)接種于96孔培養(yǎng)板，每孔0.2毫升，分別加入設(shè)定濃度的短葉老鸛草素處理，每濃度平行4孔，對(duì)照組加等量體積的培養(yǎng)液，置37℃，5％CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)1-4天，實(shí)驗(yàn)終止前4小時(shí)每孔加入5毫克/毫升MTT 10微升，培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入0.04當(dāng)量二甲基亞砜(DMSO)，每孔150微升，振蕩10分鐘待MTT還原產(chǎn)物完全溶解，用BioRad 550型酶標(biāo)儀，以550納米為實(shí)驗(yàn)波長(zhǎng)，655納米為參照波長(zhǎng)測(cè)定其吸收度，計(jì)算腫瘤細(xì)胞的抑制率和藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率，并以藥物的不同濃度和細(xì)胞的抑制率作圖，確定細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表2所示。
以上實(shí)施例說(shuō)明，短葉老鸛草素對(duì)人類腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性較大，對(duì)正常細(xì)胞的細(xì)胞毒性較弱，即GA-Me和GA-T對(duì)某些人類腫瘤細(xì)胞具有一定的靶向抑制作用。
實(shí)施例3短葉老鸛草素抑制C57小鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)活性的比較短葉老鸛草素為從鵝不食草中分離得到的純天然產(chǎn)物，純度大于99％。雄性，荷瘤C57小鼠兩只，剝離小鼠的實(shí)體瘤，剪碎并用酸磷緩沖液(pH 7.4)研磨，80目篩網(wǎng)過(guò)濾。配成細(xì)胞懸浮液備用。雄性C57按體重隨機(jī)分組，前肢腋下注射腫瘤細(xì)胞懸浮液(1×106個(gè)/毫升)，在接種同時(shí)不同的藥物腹腔每日注射，陰性對(duì)照為生理鹽水(PBS)。以抗癌藥物為陽(yáng)性對(duì)照，給藥8天，后處死，剝離小鼠的實(shí)體瘤稱重。與對(duì)照比較計(jì)算抑制率。藥物的不同濃度對(duì)腫瘤的抑制率的影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。
以上實(shí)施例說(shuō)明，短葉老鸛草素在體內(nèi)也能抑制腫瘤的生長(zhǎng)，同時(shí)也具有劑量依賴性。
權(quán)利要求
1.短葉老鸛草素在制備腫瘤生長(zhǎng)和增殖抑制劑中的應(yīng)用，其特征在于，分子結(jié)構(gòu)如下式的短葉老鸛草素，用作制備腫瘤生長(zhǎng)和增殖抑制劑中的有效成分。
2.如權(quán)利要求1所說(shuō)的短葉老鸛草素在制備腫瘤生長(zhǎng)和增殖抑制劑中的應(yīng)用，其特征在于，短葉老鸛草素或其與藥理學(xué)上允許的添加成分相組合制備成腫瘤生長(zhǎng)和增殖抑制劑，所述抑制劑劑型為經(jīng)口給藥的固型制劑散劑，丸劑，片劑或膠囊劑，或?yàn)榉墙?jīng)口給藥的外用劑，軟膏，貼敷劑，注射劑。
3.如權(quán)利要求1或2所說(shuō)的短葉老鸛草素在制備腫瘤生長(zhǎng)和增殖抑制劑中的應(yīng)用，其特征在于，所說(shuō)的短葉老鸛草素的純度大于等于99％。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了短葉老鸛草素(Brevlin)在制備腫瘤生長(zhǎng)或增殖的抑制劑中的應(yīng)用。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)證明短葉老鸛草素具有顯著的抑制人類腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或增殖作用，同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞的毒性較小，具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61K36/185GK1907277SQ20061001978
公開(kāi)日2007年2月7日 申請(qǐng)日期2006年8月1日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月1日
發(fā)明者吳和珍, 劉建文, 劉焱文, 楊艷芳, 李長(zhǎng)龍 申請(qǐng)人:湖北中醫(yī)學(xué)院