專利名稱：新型多肽神經(jīng)組織工程支架材料及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生命科學(xué)領(lǐng)域，它涉及一種設(shè)計(jì)合成的新型多肽神經(jīng)組織工程支架材料及其制備方法和在脊髓損傷治療中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
神經(jīng)系統(tǒng)(nervous system，NS)由于病變或損傷，導(dǎo)致大量的神經(jīng)元發(fā)生變性壞死，軸突崩解，抑制性因子如炎性因子，軟骨素酶ABC(Chondroitmase ABC)等大量存在，神經(jīng)細(xì)胞不能再生，軟組織屏障，如膠質(zhì)瘡痕阻斷神經(jīng)通路連接，因而其治療及康復(fù)效果不理想。
神經(jīng)組織工程包括三要素①支架材料，②種子細(xì)胞，如雪旺氏細(xì)胞(SchwannCells，SCs)，神經(jīng)干細(xì)胞(Neural stem cells，NSCs)等，③各種細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子及信號(hào)肽。支架材料主要恢復(fù)神經(jīng)的三維結(jié)構(gòu)，為各種神經(jīng)細(xì)胞的黏附、生長(zhǎng)及細(xì)胞外基質(zhì)的沉積提供足夠大的表面積及空間，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞起支撐、誘導(dǎo)及營(yíng)養(yǎng)作用，有利于血管的長(zhǎng)入。
將組織工程運(yùn)用于NS疾病的治療，重構(gòu)其支架結(jié)構(gòu)(解剖結(jié)構(gòu))與營(yíng)養(yǎng)支持，促進(jìn)各種神經(jīng)細(xì)胞的再生，恢復(fù)神經(jīng)纖維連接與信號(hào)通路的完整與通暢，促進(jìn)軸突的再生與長(zhǎng)入及髓鞘化，促進(jìn)血管的再生，減少抑制因子的產(chǎn)生及膠質(zhì)疤痕的形成。支架材料發(fā)揮維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nerve system，CNS)三維結(jié)構(gòu)及調(diào)控CNS的神經(jīng)細(xì)胞在支架材料的生長(zhǎng)，遷延、分化。
現(xiàn)有用于神經(jīng)組織工程的支架材料有兩類①無機(jī)材料，其機(jī)械強(qiáng)度過高，粘彈性差，生物降解困難；很少用于神經(jīng)組織工程；②有機(jī)高分子材料，其降解后生物利用度低，或降解產(chǎn)物對(duì)生物體有害等缺點(diǎn)，主要用于制作周圍神經(jīng)的導(dǎo)管。以上兩類材料本身固有的缺點(diǎn)限制它們?cè)谥袠猩窠?jīng)組織工程(NerveTissue Engineering，NTE)中的應(yīng)用。
多肽在液體環(huán)境中有三種狀態(tài)可溶性液態(tài)，溶解性差的沉淀物及膠體狀物質(zhì)。自組裝技術(shù)運(yùn)用于多肽，在水相離子環(huán)境中或生理鹽溶液觸發(fā)形成三維支架材料凝膠，它具有以下優(yōu)點(diǎn)①粘彈性好，與腦及脊髓組織有相近的壓縮模量(compressive modulus)，②易于運(yùn)輸，可以通過注射技術(shù)運(yùn)送到靶位點(diǎn)，③降解性好及生物利用度高，降解產(chǎn)物為氨基酸單體，作為生物體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的來源，④很少引起毒副反應(yīng)及免疫反應(yīng)。使多肽自組裝凝膠成為一種新型的組織工程支架材料。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，而提供一種新型多肽神經(jīng)組織工程支架材料。
本發(fā)明的另一個(gè)目在于提供上述新型多肽神經(jīng)組織工程支架材料的制備方法。
本發(fā)明的再一個(gè)目在于提供上述新型多肽神經(jīng)組織工程支架材料在治療脊髓損傷藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的是通過如下措施來達(dá)到的新型多肽神經(jīng)組織工程支架材料，其特征在于多肽結(jié)構(gòu)序列為C16H31O-Ala-Ala-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Asp-Asp-Ile-lys-Val-Ala-Val-COOH(其中Ala，A-丙氨酸；Gly，G-精氨酸；Asp，D-天冬氨酸；Ile，I-異亮氨酸；lys，K-賴氨酸；Val，V-纈氨酸)。簡(jiǎn)寫為C16H31O-A3G4D2IKVAV。
制備上述新型多肽神經(jīng)組織工程支架材料，它包括如下步驟肽鏈合成采用芴甲氧羰基(fluorenylmethyloxycarbonyl，F(xiàn)moc)/苯并三唑-1-三氧吡咯烷磷基六氟磷酸(Benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphoniumhexafluorophosphate，PyBOP)方法①取100mg芴甲氧羰基-纈氨酸-Wang樹脂(Fmoc-Val-wang resin)在二甲基甲酰胺(dimethylformamide，DMF)溶液中浸泡20分鐘，用30％六氫吡啶脫去Fmoc，②3摩爾的PyBOP和芴甲氧羰基-丙氨酸-羥基苯并三唑(Fmoc-Ala-OH HOBt)加入到①中的纈氨酸-Wang樹脂(Val-wangresin)，室溫反應(yīng)1小時(shí)，③重復(fù)上述①和②的步驟，并不斷的更加Fmoc-(A，G，G，G，G，D，D，I，K，V，A，V)(A-丙氨酸，G-甘氨酸，D-天冬氨酸，I-異亮氨酸，K-賴氨酸，V-纈氨酸)，最后加脂酸C16H32O2，一直到肽鏈結(jié)束，④用三氟乙酸∶硅烷∶水＝95∶2.5∶2.5將多肽(C16H31O-A3G4D2IKVAV)從樹脂上切落。純化，收集純化的肽凍干，取小樣做質(zhì)譜儀(Mass Spectrograph，MS)分析。將肽溶于氫氧化鈉(NaOH)溶液中，PH＝9.0，濃度為1wt％。加入等體積DMEM/F12自組裝成凝膠，涼干，磷鎢酸染色，TEM觀察。
本發(fā)明新型多肽神經(jīng)組織工程支架材料在制備治療脊髓損傷藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明新型多肽神經(jīng)組織工程支架材料具有以下優(yōu)點(diǎn)①含有長(zhǎng)鏈的烷基尾C16H31O，該結(jié)構(gòu)可提高肽對(duì)氫離子敏感度。烷基尾逐漸縮短到無烷基尾時(shí)，肽對(duì)氫離子觸發(fā)的自組裝能力下降，最終不能自組裝成凝膠。該烷基尾可在納米尺度上調(diào)整自組裝納米纖維的直徑、長(zhǎng)度。②A3G4(AAAGGGG)，一方面與烷基起協(xié)同效應(yīng)，另一方面使其后部的活性區(qū)域IKVAV伸出到纖維表面，從而暴露多肽的活性區(qū)域。③D2，肽在PH＝9.0的環(huán)境中帶有負(fù)電荷，保證其可溶性，自組裝后其凝膠內(nèi)部PH值為7.2～7.4左右。若D2換成D或E，肽溶解，PH值必須達(dá)到10～11的范圍，自組裝形成三維凝膠，其內(nèi)部的PH值可達(dá)9.5左右，不適于細(xì)胞在該環(huán)境生長(zhǎng)。④含IKVAV，它來源于層粘連蛋白(laminin)核心序列。IKVAV序列促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)粘附、遷移、突觸的再塑。⑤反應(yīng)條件簡(jiǎn)單，可由達(dá)爾伯克(氏)改良伊格爾(氏)培養(yǎng)基[dulbecco’s modifiedeagle’s medium，DMEM]觸發(fā)，也可置于鹽酸蒸氣的環(huán)境。⑥凝膠粘彈性好，易于運(yùn)輸。⑦凝膠多孔結(jié)構(gòu)，為細(xì)胞提供足夠的空間及表面積。⑧降解產(chǎn)物可被機(jī)體吸收，無免疫反應(yīng)及毒性反應(yīng)。⑨肽序列易于人工設(shè)計(jì)與修改以滿足特定需求。
圖1為C16H31O-A3G4D2IKVAV的質(zhì)譜圖。
圖2為C16H31O-A3G4D2IKVAV的高效液相色譜圖(HPLC)，多肽保留時(shí)間為8.118，對(duì)應(yīng)于表1的第7峰號(hào)，表1峰號(hào)7示肽純度為95.22％。
圖3中A瓶裝1wt％肽，B瓶為DMEM/F12，C為空，D為自組裝凝膠(倒置)。
圖4自組裝凝膠由交互排列的納米纖維構(gòu)成，纖維直徑有3～5納米，長(zhǎng)度100納米～1500納米。
圖5 2.5wt％寡肽自組裝凝膠為有孔隙的板層狀排列。
圖6相差顯微鏡示原代細(xì)胞聚集為球形。
圖7免疫組化示Nestin陽性的細(xì)胞(黃色)。
圖8細(xì)胞在凝膠表面長(zhǎng)出突起。
圖9細(xì)胞在蓋波片僅形成球。
圖10Nestin(+)的細(xì)胞在凝膠表面聚集呈球。
圖11細(xì)胞在凝膠表面分化為有突起的NF(+)的紅色熒光神經(jīng)元。
圖12細(xì)胞在凝膠表面分化為有突起的GFAP(+)的綠色熒光膠質(zhì)細(xì)胞。
圖13合并熒光為黃色。
圖14Nestin(+)的未分化細(xì)胞。
圖15細(xì)胞在無血清的凝膠表面長(zhǎng)出突起。
圖16細(xì)胞在有血清的凝膠表面長(zhǎng)出突起。
圖17細(xì)胞在無血清的多聚賴氨酸包被表面形成球。
圖18細(xì)胞在有血清的多聚賴氨酸包被表面長(zhǎng)出突起。
圖19Nestin(+)的細(xì)胞(A1亞組)。
圖20Nestin(+)的細(xì)胞(B1亞組)。
圖21NF(+)的紅色熒光的神經(jīng)元。
圖22GFAP(+)的綠色熒光的星形細(xì)胞。
圖23合并熒光為黃色。
圖24Nestin(+)的細(xì)胞(C亞組)。
圖25NF(+)的紅色熒光的神經(jīng)元(D亞組)。
圖26GFAP(+)的綠色熒光的星形細(xì)胞(D亞組)。
圖27合并熒光為黃色。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施情況。
本發(fā)明新型多肽神經(jīng)組織工程支架材料，多肽結(jié)構(gòu)序列為C16H31O-Ala-Ala-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Asp-Asp-Ile-lys-Val-Ala-Val-COOH。(其中Ala，A-丙氨酸；Gly，G-精氨酸；Asp，D-天冬氨酸；Ile，I-異亮氨酸；lys，K-賴氨酸；Val，V-纈氨酸)。簡(jiǎn)寫為C16H31O-A3G4D2IKVAV。
制備上述多肽神經(jīng)組織工程支架材料，它包括如下步驟合成肽鏈的合成采用Fmoc/PyBOP方法。Fmoc的脫帽用30％六氫吡啶的DMF溶液。肽鏈從樹脂上的切落用切肽試劑(三氟乙酸/硅烷/水＝95/2.5/2.5)。稱取1000mgFmoc-Val-wang resin，依次按下列量加入各種Fmoc-氨基酸Mwt(分子量)mg(毫克)1Fmoc-Ala-OH-----------------------311.34----934.12Fmoc-Ala-OH-----------------------311.34----934.1
3Fmoc-Ala-OH-----------------------311.34----934.14Fmoc-Gly-OH-----------------------297.31----892.05Fmoc-Gly-OH-----------------------297.31----892.06Fmoc-Gly-OH-----------------------297.31----892.07Fmoc-Gly-OH-----------------------297.31----892.08Fmoc-Asp-OH-----------------------297.31----892.09Fmoc-Asp-OH-----------------------311.34----934.110Fmoc-Ile-OH----------------------311.34----934.111Fmoc-lys-OH----------------------311.34----934.112Fmoc-Val-OH----------------------311.34----934.113Fmoc-Ala-OH----------------------311.34----934.114Fmoc-Val-OH----------------------383.44----828.315C16H31O2----------------------256.44----553.9每步接肽反應(yīng)加入PyBOP Mwt520.30 1123.9[mg/coupling]HOBt+H2O(1) Mwt153.10 4320[micro-L/coupling]0.50[mmol/mL DMF]NMM(1) 109.95[mL/mol](×1.50eq) 3240[micro-L/coupling]1.00[mmol/mL DMF]脫帽反應(yīng)加入六氫吡啶 30％ 9000×2[micro-L/coupling]洗滌時(shí)用DMF 9000×5[micro-L/coupling]DMF 9000×5[micro-L/coupling]
接肽在431A型多肽自動(dòng)合成儀(Applied biosystems，USA)(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)上進(jìn)行，接完的樹脂全部轉(zhuǎn)移至茄形瓶中，加入事先配好并預(yù)冷的切肽試劑[三氟乙酸/硅烷/水/(95/2.5/2.5)]200ml。25℃下攪拌反應(yīng)2小時(shí)。過濾，收集濾液。樹脂用少量三氟乙酸洗3次。將洗滌液與濾液合并，濃縮后冷卻，然后加入1000ml冷乙醚使多肽沉淀。離心收集，真空干燥。得粗品約660mg。
純化使用碳18(C18)反相柱子，條件為A相為95％的水(甲醇配比)，B相為95％的甲醇(甲醇配比)，然后各加0.1％的TFA，常規(guī)條件從A相到B相為20分鐘梯度。檢測(cè)波長(zhǎng)220nm，流速10ml/min，先用A溶液平衡柱子，上樣后，從A到B溶液梯度洗脫20min，收集目標(biāo)肽的洗脫液，凍干。
新型多肽結(jié)構(gòu)序列為C16H31O-Ala-Ala-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Asp-Asp-Ile-lys-Val-Ala-Val-COOH(其中Ala，A-丙氨酸，Gly，G-精氨酸，Asp，D-天冬氨酸，Ile，I-異亮氨酸，lys，K-賴氨酸，Val，V-纈氨酸)，簡(jiǎn)寫為C16H31O-A3G4D2IKVAV。
構(gòu)建的多肽序列C16H31O-A3G4D2IKVAV，HPLC(圖l，表1)示其純度為95％以上，MS(圖2)示分子量為1438.2，與理論分子量相吻合。
表1峰號(hào)7示肽純度為95.22％
多肽構(gòu)建三維凝膠支架材料
①寡肽溶液在DMEM/F12觸發(fā)下，數(shù)秒鐘于小瓶?jī)?nèi)形成透明粘彈性凝膠，倒置玻璃小瓶，凝膠貼附于小瓶底部，無滑脫(圖3)②蓋玻片上寡肽溶液置于10M HCL蒸氣中，半小時(shí)開始形成凝膠，2小時(shí)后完全形成具有一定厚度的透明薄層凝膠，蓋玻片任意改換位置，其上的凝膠不會(huì)變形脫落。
③蓋玻片上溶液置于37℃的密閉箱中，在蓋玻片上發(fā)現(xiàn)多肽的固體殘跡，未見自組裝凝膠形成。
④透射電鏡顯示寡肽自組裝為凝膠，形成編織狀納米纖維，纖維直徑有3～5納米，長(zhǎng)度100納米～1500納米，寡肽濃度增加，其納米纖維排列愈密(圖4)。
⑤掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope，SEM)顯示2.5wt％寡肽自組裝凝膠呈板層狀排列，層層間有規(guī)則的孔隙(圖5)。
神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)在自組裝凝膠的生長(zhǎng)及分化NSCs在自組裝凝膠表面的生長(zhǎng)及分化(二維凝膠)取乳鼠，常規(guī)消毒，剪除頭部皮膚及顱骨，剔除腦膜、血管及小腦，彎鑷夾取雙側(cè)大腦皮質(zhì)，放入置有磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution，PBS)溶液中的小燒杯中，用火焰拋光的玻璃吸管吹打，200目濾網(wǎng)過濾，過濾液置于25ml玻璃培養(yǎng)瓶中，加入無血清DMEM/F12+重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bovine basic fibroblast growth factor，bFGF)(20ng/ml)+表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)(20ng/ml)+B27(2％)，在37℃5％CO2及95％空氣培養(yǎng)箱培養(yǎng)。三天后換液。待NSCs形成透明球狀并布滿瓶底，傳代。
NSCs鑒定神經(jīng)干細(xì)胞以1×105/ml，接種于包被有多聚賴氨酸的蓋玻片表面，無血清培養(yǎng)3天。4％多聚甲醛固定半小時(shí)，免疫組織化學(xué)SABC法鑒定。
倒置相差顯微鏡示單個(gè)細(xì)胞呈圓形，胞漿透明胞核圓形淡染，細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)，2～3d后，神經(jīng)干細(xì)胞逐漸聚集形成發(fā)光的懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞球，可見核分裂相，細(xì)胞球布滿于瓶底，須及時(shí)傳代(圖6)。免疫組化SABC法顯示，細(xì)胞聚集呈球形，巢蛋白(nestin)染色強(qiáng)陽性(黃色)(圖7)取200ul1wt％多肽液，置于3×3cm2蓋玻片上，加入200ul DMEM/F12，數(shù)秒鐘即可形成二維透明質(zhì)軟凝膠薄膜，可用注射器抽吸，檢測(cè)薄膜滲液PH為7.4。實(shí)驗(yàn)組NSCs接種于二維自組裝凝膠薄膜表面，分A及B亞組，無血清培養(yǎng)(DMEM/F12)；對(duì)照組NSCs接種于多聚賴氨酸包被蓋玻片表面，分C及D亞組，無血清培養(yǎng)(DMEM/F12)；實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組的細(xì)胞均置于培養(yǎng)板中，于37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡觀察。
接種7天后，將實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組吸出培養(yǎng)液，4％多聚甲醛4℃固定30分鐘，PBS緩沖液浸洗3次，室溫晾干，采用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。室溫下封閉血清反應(yīng)20min，滴入一抗后4℃過夜，加入二抗，室溫下作用半小時(shí)，一抗為多克隆兔抗鼠Nestin，多克隆兔抗鼠神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)，單克隆鼠抗人神經(jīng)微絲(neurofilament，NF)，二抗標(biāo)記有異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)羊抗兔IgG(FITC-IgG)，四乙基若丹明異硫氰酸鹽(tetraethyl rhodamine isothiocyanate，TRITC)的羊抗鼠IgG(TRITC-IgG)，A及C組檢測(cè)Nestin，B及D組檢測(cè)NF與GFAP。激光共聚焦顯微鏡觀察。
倒置相差顯微鏡觀察試驗(yàn)組中，在二維凝膠材料表面，細(xì)胞聚集為球形，以后細(xì)胞球變大，部分細(xì)胞長(zhǎng)出突起，可與周圍細(xì)胞突起形成突觸(圖8)，對(duì)照組中，細(xì)胞僅形成細(xì)胞球，未見突起(圖9)。
激光共聚焦顯微鏡觀察試驗(yàn)組中，神經(jīng)干細(xì)胞聚集成球形，熒光顯綠色，Nestin陽性(圖10)；NSCs可分化為有突起的神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞，雙標(biāo)為強(qiáng)的紅色熒光，NF(+)(圖11)，較弱綠色熒光，GFAP(+)(圖12)，合并熒光為黃色(圖13)。對(duì)照組中，神經(jīng)干細(xì)胞聚集成球，熒光顯綠色，Nestin陽性(圖14)，細(xì)胞未發(fā)生明顯的分化。
NSCs在自組裝凝膠內(nèi)部的生長(zhǎng)及分化(三維凝膠)實(shí)驗(yàn)組分A1、A2、B1及B2亞組，取密度為1×105/ml NSCs的DMEM/F12懸液，滴加于四塊蓋玻片上，各加入等體積1wt％多肽液，數(shù)秒鐘形成透明的0.4×3×3cm3凝膠，30分鐘后吸出凝膠滲液，PH＝7.4，A1及A2亞組加入DMEM/F12，B1及B2亞組加入DMEM/F12+1％肽牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)CS)。
對(duì)照組分C及D亞組，密度為1×105/ml NSCs的DMEM/F12懸液，滴加于多聚賴氨酸包被兩塊蓋玻片上，C亞組加入DMEM/F12，D亞組加入DMEM/F12+1％FCS。
將實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組置于培養(yǎng)板中，在37℃5％CO2及95％飽和濕度空氣中培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡(Inverted Phase Contrast Microscope，IPCM)觀察。
培養(yǎng)7天后，4％多聚甲醛4℃固定30分鐘，PBS緩沖液浸洗3次。采用免疫細(xì)胞化學(xué)法，室溫下封閉血清20min，滴入一抗后4℃過夜，加入二抗，室溫下作用半小時(shí)，一抗為多克隆兔抗鼠Nestin，多克隆兔抗鼠GFAP，單克隆鼠抗人NF，二抗標(biāo)記有FITC羊抗兔IgG(FITC-IgG)，TRITC的羊抗鼠IgG(TRITC-IgG)，A1、B1及C亞組檢測(cè)Nestin，A2、B2及D亞組檢測(cè)NF與GFAP。激光共聚焦顯微鏡(LaserConfocal Microscopy，LCM)觀察。
IPCM觀察實(shí)驗(yàn)組中，NSCs在材料內(nèi)部接種3天，聚集呈球形。7天后，細(xì)胞長(zhǎng)出突起，A1、A2、B1及B2亞組細(xì)胞形態(tài)無明顯差異，表明自組裝三維凝膠可誘導(dǎo)細(xì)胞分化，與1％FCS無關(guān)；對(duì)照組中，NSCs在多聚賴氨酸包被蓋玻片表面接種3天，聚集呈球形。7天后，C亞組細(xì)胞未長(zhǎng)出突起，D亞組細(xì)胞球長(zhǎng)出較短突起。在A2，B2及D亞組(圖15，16，18)，細(xì)胞長(zhǎng)出突起，C亞組僅形成球(圖17)LCM觀察試驗(yàn)組中，A1、B1亞組接種后3天，細(xì)胞聚集成球形，熒光顯綠色，Nestin陽性。A2、B2亞組接種后7天，NSCs可分化為神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞，雙標(biāo)為強(qiáng)的紅色熒光，NF(+)，較弱綠色熒光，GFAP(+)，合并熒光為黃色。對(duì)照組中，C組細(xì)胞聚集成球，熒光顯綠色，Nestin陽性。D組細(xì)胞分化為神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞，雙標(biāo)為紅色熒光的NF(+)，綠色熒光的GFAP(+)，合并熒光為黃色。
LCM示圖19，20為Nestin(+)的細(xì)胞(A1及B1亞組)；A2及B2亞組細(xì)胞均分化，與1％FCS無關(guān)，NF(+)的紅色熒光的神經(jīng)元(圖21)及GFAP(+)的綠色熒光的星形細(xì)胞(圖22)及合并熒光為黃色(圖23)；C亞組(圖24)為Nestin(+)的細(xì)胞；D亞組NF(+)的紅色熒光的神經(jīng)元(圖25)及GFAP(+)的綠色熒光的星形細(xì)胞(圖26)及合并熒光為黃色(圖27)NSCs具有自我更新能力，主要位于脊髓的室管膜區(qū)，大腦的室下區(qū)，海馬及齒狀區(qū)，在一定條件下分化為神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞等，NSCs可選作神經(jīng)組織工程的種子細(xì)胞。選取乳鼠大腦皮層的NSCs，優(yōu)點(diǎn)①可去除腦膜及血管，無上皮細(xì)胞及其它細(xì)胞的污染，細(xì)胞較為單一，②所需乳鼠的量較小，③易于操作，可獲取大量皮質(zhì)NSCs，④細(xì)胞活力好，胚胎鼠NSCs需求量大，操作困難，細(xì)胞活力與乳鼠干細(xì)胞無差異；成年鼠皮質(zhì)干細(xì)胞活力差，主要向膠質(zhì)細(xì)胞分化，⑤機(jī)械分離，不需胰蛋白酶或EDTA消化培養(yǎng)出乳鼠NSCs，有效保護(hù)細(xì)胞膜。
三維凝膠包裹NSCs，其納米纖維表面的IKVAV與細(xì)胞膜的受體結(jié)合，可誘導(dǎo)NSCs分化為神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞。IPCM觀察試驗(yàn)組中，A2及B2的細(xì)胞長(zhǎng)出突起，與血清無明顯相關(guān)；對(duì)照組中，1％FCS可誘導(dǎo)多聚賴氨酸包被的蓋波片上細(xì)胞發(fā)生分化。采用免疫細(xì)胞化學(xué)法，試驗(yàn)組中，NSCs接種7天后發(fā)生分化，NF(+)，GFAP(+)；D亞組細(xì)胞NF(+)，GFAP(+)。表明自組裝凝膠可誘導(dǎo)NSCs分化為神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞的能力。
本發(fā)明成功構(gòu)建兩親性肽序列-C16H31O-A3G4D2IKVAV，MS證明其分子量與理論肽的分子量一致，在DMEM/F12的觸發(fā)下自組裝為三維多孔的凝膠結(jié)構(gòu)，TEM證明其為多孔的交織排列的納米纖維，IPCM及LCM觀察該凝膠對(duì)細(xì)胞起支撐，而且誘導(dǎo)細(xì)胞分化為神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞。表明肽自組裝凝膠可作為神經(jīng)組織工程優(yōu)良的支架材料，可包裹工程化的細(xì)胞、活性分子或藥物，靶向?qū)虢M織及器官，逃避機(jī)體的免疫反應(yīng)，在局部發(fā)揮作用。
需要說明的是對(duì)于本專業(yè)普通的技術(shù)人員來說，在不改變本發(fā)明原理的情況下，還可以對(duì)本發(fā)明做出適當(dāng)?shù)母淖兒妥冃?，這同樣屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
序列表<110>華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院<120>新型多肽神經(jīng)組織工程支架材料及其制備方法和應(yīng)用<130>無<160>1<170>Patentln version 3.1<210>1<211>14<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>LIPID<222>(1)..(1)<223>PALMITATE<400>1Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly Asp Asp Ile Lys Val Ala Val1 5 10
權(quán)利要求
1.一種新型多肽神經(jīng)組織工程支架材料，其特征在于其結(jié)構(gòu)為C16H31O-Ala-Ala-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Asp-Asp-Ile-lys-Val-Ala-Val-COOH。
2.制備權(quán)利要求1所述一種新型多肽神經(jīng)組織工程支架材料的方法，其特征在于它包括如下步驟肽鏈合成采用芴甲氧羰基/苯并三唑-1-三氧吡咯烷磷基六氟磷酸方法，①取100mg芴甲氧羰基-纈氨酸-Wang樹脂在二甲基甲酰胺溶液中浸泡20分鐘，用30％六氫吡啶脫去Fmoc；②3摩爾的PyBOP和芴甲氧羰基-丙氨酸-羥基苯并三唑加入到①中的纈氨酸-Wang樹脂，室溫反應(yīng)1小時(shí)；③重復(fù)上述①和②的步驟，并不斷的更加Fmoc-A，G，G，G，G，D，D，I，K，V，A，V，最后加脂酸C16H32O2，到肽鏈結(jié)束；④用三氟乙酸∶硅烷∶水＝95∶2.5∶2.5將多肽C16H31O-A3G4D2IKVAV從樹脂上切落，純化，收集純化的肽凍干，即得新型多肽神經(jīng)組織工程支架材料。
3.一種新型多肽神經(jīng)組織工程支架材料的應(yīng)用，其特征在于該新型多肽神經(jīng)組織工程支架材料在治療脊髓損傷藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
一種新型多肽神經(jīng)組織工程支架材料，其結(jié)構(gòu)為C
文檔編號(hào)A61L27/00GK1915438SQ200610019738
公開日2007年2月21日 申請(qǐng)日期2006年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月27日
發(fā)明者鄭啟新, 宋玉林, 吳永超, 郭曉東 申請(qǐng)人:華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院