專利名稱：mfg12－鼠纖維介素反義質粒的構建方法及其藥學用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物材料領域。具體是利用Mouse Fibrinogen-likeprotein 2，mfgl2、簡稱mfgl2鼠纖維介素反義質粒，構建一種新的生物制劑，用于病毒誘導的重型肝炎和其它以微循環障礙損傷為主要病理生理特征疾病的治療的藥學用途。
背景技術：
新近發現的纖維介素屬于纖維蛋白原相關蛋白超家族，又稱fgl2凝血酶原酶，具有絲氨酸蛋白酶活性。mfgl2鼠纖維介素，又稱為鼠凝血酶原酶，基因定位于5號染色體，編碼蛋白含432個氨基酸，與人纖維介素hfgl2具有80％的同源性。
用鼠3型肝炎病毒mouse hepatitis virus-3，MHV-3感染不同種系近親繁殖小鼠，已成功建立了類似人類各種不同臨床類型的肝炎，包括暴發型肝炎、慢性肝炎及臨床健康病毒攜帶者(授權公告號CN1181735C)；MHV-3誘導產生的mfgl2在鼠病變肝組織中選擇性高度表達，其基因表達水平與肝組織纖維蛋白沉積及廣泛肝細胞壞死密切相關；MHV-3感染小鼠接受mfgl2凝血酶原酶中和抗體注射后可減輕肝臟疾病嚴重程度并顯著降低死亡率。以上結果表明，mfgl2凝血酶原酶在鼠暴發型肝炎的發病過程中起重要作用(參見Li C.等人，實驗醫學雜志，176689(1992)；寧琴等人，生物化學雜志，2749930(1999)。)在上述研究的基礎上，發明人進一步研究發現暴發型乙型肝炎或重癥乙型肝炎病人肝臟組織的枯否氏細胞、血管內皮細胞和壞死、纖維化區域發現hfgl2的高度表達，說明hfgl2在人病毒性肝炎的惡化進展中起著關鍵性的作用。因此發明人提出fgl2在病毒性肝炎中引發肝臟纖維蛋白沉淀和微血管內微循環障礙，導致肝細胞壞死。該理論在國際上首次提出，并對重型肝炎的分子機制發表了全新的見解(參見陳悅等人，中華醫學雜志，83446(2003)；Marsden PA等人，臨床調查學雜志，11258(2003)。)由于病毒性肝炎發病率高、危害性大，且無確定有效的治療方法，已成為嚴重影響我國人民健康與生活水平、制約經濟發展的重要疾病。病毒誘導的重型肝炎更是缺乏特異、有效的治療手段，預后不良，病死率極高。基因反義技術是根據核酸雜交原理設計的，它能選擇性地與靶基因特定功能位置結合(雜交)，抑制該基因表達，而不影響宿主正常功能。自從80年代初由Izant和Weitraub首次報道胸腺嘧啶激酶(TK)基因反義RNA能選擇性抑制真核細胞TK基因表達以來，反義RNA作為一種調控特定基因表達的手段已被廣泛采用。反義RNA分子與特異RNA分子互補結合，特異性封閉某些基因使其不表達或低表達，從而影響細胞的代謝活性及功能，因此具有潛在的藥用價值。發明人構建了mfgl2反義質粒，并對其進行了大量細胞和動物水平的實驗，結果證明了mfgl2反義質粒轉入細胞后表達反義RNA，并對mfgl2凝血酶原酶基因進行特異性的抑制，從而對病毒誘導的重型肝炎和其它以微循環障礙損傷為主要病理生理特征疾病的治療具有潛在的藥學價值。
發明內容
所以，本發明的第一個目的是提供獲得mfgl2凝血酶原酶基因的反義模板的方法；本發明的第二個目的是提供將mfgl2凝血酶原酶基因的反義模板插入真核表達載體構建mfgl2反義質粒的過程；本發明的第三個目的是提供利用mfgl2反義質粒特異性地抑制Raw246.7細胞中mfgl2表達的方法；本發明的第四個目的是提供利用mfgl2反義質粒顯著提高暴發型肝炎小鼠模型生存率和改善肝組織病理學變化和肝功能的方法。
本發明基于重型肝炎暫無確定有效的治療方法，提出了一種用于治療病毒誘導的重型肝炎的基因藥物。發明人構建了一種新的生物制劑-mfgl2反義質粒，用以抑制mfgl2凝血酶原酶的表達，緩解微循環障礙，減少局部纖維素沉積和細胞壞死，可望提高重型肝炎患者的存活率和生存質量。我們通過大量的細胞實驗，證實mfgl2反義質粒可以有效抑制mfgl2基因的表達；同時利用MHV-3腹腔感染Balb/cJ小鼠導致的暴發型肝炎動物模型，進一步論證該基因藥物可以提高暴發型肝炎小鼠生存率和改善肝組織學變化和肝功能。
實現本發明所述的一種mfgl2鼠纖維反義質粒的構建方法包括以下步驟步驟一，載體的構建部分1)PCR產生針對mfgl2凝血酶原酶基因的反義模板。
產生反義序列的模板gccgcactgc aaggatgagg cttcctggtt ggttgtggct gagttctgcc gtcctcgctg 60cctgccgagc ggtggaggag cacaacctga ctgaggggct ggaggatgcc agcgcccagg 120ctgcctgccc cgcgaggctg gagggcagcg ggaggtgcga ggggagccag tgccccttcc 180agctcaccct gcccacgctg accatccagc tcccgcggca gcttggcagc atggaggagg 240tgctcaaaga agtgcggacc ctcaaggaag cagtggacag tctgaagaaa tcctgccagg 300actgtaagtt gcaggctgac ga 322該序列mfgl2基因的部分外顯子1的序列，是通過PCR從含有mfgl2凝血酶原酶的mRNA cDNA的載體pCR3.1擴增得到，部分外顯子1兩端引入酶切位點Xba I和EcoR I。
2)將1)步驟中產生的模板插入pcDNA3.0載體構成mfgl2反義質粒。
產生的反義模板可反向插入pcDNA3.0載體的酶切位點EcoR I和Xba I(見圖2)。
本發明所述的一種mfgl2鼠纖維反義質粒的構建方法，還在于產生mfgl2凝血酶原酶反義序列的模板為mfgl2基因的部分外顯子，其序列為gccgcactgc aaggatgagg cttcctggtt ggttgtggct gagttctgcc gtcctcgctg 60cctgccgagc ggtggaggag cacaacctga ctgaggggct ggaggatgcc agcgcccagg 120ctgcctgccc cgcgaggctg gagggcagcg ggaggtgcga ggggagccag tgccccttcc 180agctcaccct gcccacgctg accatccagc tcccgcggca gcttggcagc atggaggagg 240tgctcaaaga agtgcggacc ctcaaggaag cagtggacag tctgaagaaa tcctgccagg 300actgtaagtt gcaggctgac ga 322本發明所述的一種mfgl2鼠纖維反義質粒的構建方法，還在于mfgl2外顯子1來自含有mfgl2凝血酶原酶的mRNA cDNA的載體pCR3.1。
本發明所述的一種mfgl2鼠纖維反義質粒的構建方法，還在于構建的產生mfgl2凝血酶原酶反義的模板需要通過反向插入載體pcDNA3.0構成一表達體系。
本發明所述的一種mfgl2鼠纖維反義質粒的保藏培養物Echerichid Coli JM109/pcDNA3.0 mfgl2 antisense已于2006年3月28日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號CCTCCNOM206030。
一種藥物組合物，它包括本發明所述的構建針對mfgl2凝血酶原酶的反義質粒和藥學上所接受的載體或賦形劑。
步驟二、載體的細胞和動物水平的試驗mfgl2反義質粒對mfgl2基因表達的抑制作用1)RT-PCR、免疫組化和Western-blot等方法分別從基因水平和蛋白水平檢測到了mfgl2反義質粒對Raw246.7細胞中mfgl2表達的特異性抑制作用2)生存曲線觀察到mfgl2反義質粒治療使暴發性肝衰竭小鼠的生存率由0提高到33％。
3)RT-PCR、免疫組化分別從基因水平和蛋白水平檢測到mfgl2反義質粒治療組中小鼠肝臟mfgl2的表達受到了特異性的抑制；HE染色亦觀察到mfgl2反義質粒治療組小鼠肝組織壞死輕微，而對照組肝組織有大片壞死。
綜上所述，系列體內外試驗均表明本發明涉及的新的生物制劑mfgl2反義質粒可有效地干預mfgl2凝血酶原酶的表達。我們研究發現，在血竇微血栓周圍和局部纖維素沉積區域的巨噬細胞和血管內皮細胞高表達凝血酶原酶，推測mfgl2凝血酶原酶不僅在病毒誘導的重型肝炎的發生發展中發揮關鍵作用，而且在移植急性排斥反應、系統性紅斑狼瘡等以微循環障礙為主要病理生理特征的疾病的發生中也起著重要作用。因此，本發明的提出對于探討這些以微循環障礙損傷為病理生理特征的病癥的發病機理及治療的藥學價值，尤其是在提高重型肝炎患者的存活率、延長移植物存活時間等方面具有深遠而重大的意義。
圖1本發明擴增出的mfgl2基因的部分外顯示1的序列；圖2含有mfgl2凝血酶原酶的mRNAcDNA的載體pCR3.1列圖譜；圖3pcDNA3.0載體圖譜；圖4mfgl2鼠纖維介素反義質粒構建流程圖；
圖5RT-PCR檢測mfgl2 antisense plasmid轉染8h時對Raw246.7細胞中mfgl2 mRNA表達的抑制作用。
圖中，1.空白對照組；2.IFN-γ組；3.IFN-γ+mfgl2 sense plasmid組；4.mfgl2 antisense plasmid組。
圖6免疫組化檢測mfgl2 antisense plasmid轉染24h對Raw246.7細胞中mfgl2蛋白表達的抑制作用。
圖中，A.IFN-γ組；B.IFN-γ+mfgl2 antisense plasmid組(棕染區mfgl2表達陽性區域)圖7Western blot檢測mfgl2 antisense plasmid轉染48h對Raw246.7細胞中mfgl2蛋白表達的抑制作用。
圖中，1.IFN-γ組；2.IFN-γ+mfgl2 sense plasmid組；3.IFN-γ+mfgl2 antisense plasmid組；4.空白對照組圖8mfgl2 antisense plasmid基因治療對暴發性肝衰竭小鼠生存率的影響。
圖9RT-PCR檢測mfgl2 antisense plasmid對小鼠暴發性肝衰竭模型肝臟mfgl2 mRNA表達的抑制作用。
圖中，1，2，3注射mfgl2 antisense plasmid；4，5，6注射mfgl2 sense plasmid圖10免疫組化檢測mfgl2 antisense plasmid對小鼠暴發性肝衰竭模型肝臟中mfgl2蛋白表達的抑制作用。
圖中，A.注射mfgl2 antisense plasmid小鼠肝臟；B.注射mfgl2sense plasmid小鼠肝臟(棕染區為mfgl2表達陽性區域)圖11mfgl2 antisense plasmid治療組與mfgl2 sense plasmid組小鼠暴發性肝衰竭模型肝臟HE染色比較。
圖中，A.注射mfgl2 antisense plasmid小鼠肝臟；B.注射mfgl2sense plasmid組小鼠肝臟(箭頭所指區域為壞死區)具體實施方式
以下結合具體實施例對本發明作進一步的詳細描述本發明提出構建mfgl2反義質粒的方法并在細胞與動物水平證實其治療效應包括以下步驟一、載體的構建部分構建mfgl2反義質粒的方法1、根據mfgl2凝血酶原酶cDNA序列，用軟件Primer設計出mfgl2基因的部分外顯子1(322nt)上下游的引物，通過PCR從含有mfgl2凝血酶原酶的mRNA cDNA的載體pCR3.1(見圖2)擴增出部分外顯子1(見圖1)，部分外顯子1序列兩端引入酶切位點XbaI和EcoRI。
2、擴增出的mfgl2凝血酶原酶基因的的部分外顯子1反向插入pcDNA3.0載體(見圖3)相應酶切位點EcoR I和Xba I，這樣連接形成的載體在轉染細胞內可轉錄出mfgl2基因的部分外顯子1的反義RNA。
二、載體的細胞和動物水平的試驗研究對于反義寡核苷酸表達體系在導入人體細胞后是否能特異性結合到靶基因并有效表達的問題，目前國際上尚無能夠提供直接證據的相關實驗方法，只能通過最終干預效果來間接反映上述生物制劑結合和表達的效率。發明人構建了mfgl2反義質粒，并對其進行細胞和動物水平的實驗，現報告如下[實驗一]材料mfgl2 antisense plasmidmfgl2反義質粒，用于抑制mfgl2凝血酶原酶。
mfgl2 sense plasmid對照質粒，用于實驗空白對照。
Raw246.7細胞小鼠巨噬細胞系。
IFN-γ可刺激Raw246.7細胞表達mfgl2。
方法利用mfgl2 antisense plasmid轉染Raw246.7細胞6h后，加IFN-γ100U/ml刺激作為試驗組(IFN-γ+mfgl2 sense plasmid組)，同時設立IFN-γ+mfgl2 sense plasmid組、僅用IFN-γ刺激組(IFN-γ組)和未用IFN-γ刺激組(空白組)作為對照，通過RT-PCR、免疫組化和Western-blot來檢測mfgl2在Raw246.7細胞系中表達的情況。
結果如圖5所示，RT-PCR、免疫組化和Western-blot分別從基因水平和蛋白水平檢測到了mfgl2反義質粒對Raw246.7細胞中mfgl2表達的特異性抑制作用。
1.空白對照組；2.IFN-γ組；3.IFN-γ+mfgl2 sense plasmid組；4.mfgl2antisense plasmid組；見圖5.RT-PCR檢測mfgl2 antisense plasmid轉染8h時對Raw246.7細胞中mfgl2 mRNA表達的抑制作用見圖6.免疫組化檢測mfgl2 antisense plasmid轉染24h對Raw246.7細胞中mfgl2蛋白表達的抑制作用A.IFN-γ+mfgl2 sense plasmid組；B.IFN-γ+mfgl2 antisense plasmid組(棕染區為mfgl2表達陽性區域)見圖7.Western blot檢測mfgl2 antisense plasmid轉染48h對Raw246.7細胞中mfgl2蛋白表達的抑制作用1.IFN-γ組；2.IFN-γ+mfgl2 sense plasmid組；3.IFN-γ+mfgl2antisense plasmid組；4.空白對照組[實驗二]材料mfgl2 antisense plasmid同上。
mfgl2 sense plasmid同上。
小鼠暴發性肝衰竭模型見本發明說明書背景技術部分。
方法在制備暴發性肝衰竭小鼠模型病毒感染前1天和0天分別對其尾靜脈進行高壓注射(即將大體積裸質粒DNA溶液經尾靜脈快速注入使之聚集于肝臟)mfgl2 antisense plasmid作為治療組，對照組用mfgl2sense plasmid代替，觀察兩組動物生存曲線。
結果如圖8所示，生存曲線觀察到mfgl2 antisense plasmid治療使暴發性肝衰竭小鼠的生存率由0提高到33％。
mfgl2 antisense plasmid基因治療對暴發性肝衰竭小鼠生存率的影響[實驗三]材料mfgl2 antisense plasmid同上。
mfgl2 sense plasmid同上。
小鼠暴發性肝衰竭模型見本發明說明書背景技術部分。
方法在制備暴發性肝衰竭小鼠模型病毒感染前1天和0天分別對其尾靜脈進行高壓注射mfgl2 antisense plasmid作為治療組，對照組用mfgl2 sense plasmid代替，感染后2天后收集小鼠肝臟標本，RT-PCR和免疫組化染色方法檢測mfgl2的表達水平，HE染色觀察肝臟病理組織學改變。
結果如下圖所示，RT-PCR、免疫組化分別從基因水平和蛋白水平檢測到了mfgl2反義質粒治療組中小鼠肝臟mfgl2的表達受到了特異性的抑制；HE染色亦觀察到mfgl2反義質粒治療組小鼠肝組織壞死輕微，而對照組肝組織有大片壞死。
見圖9RT-PCR檢測mfgl2 antisense plasmid對小鼠暴發性肝衰竭模型肝臟中mfgl2 mRNA表達的抑制作用1，2，3注射mfgl2 antisense plasmid；4，5，6注射mfgl2 sense plasmid
見圖10.免疫組化檢測mfgl2 antisense plasmid對小鼠暴發性肝衰竭模型肝臟中mfgl2蛋白表達的抑制作用A.注射mfgl2 antisense plasmid小鼠肝臟；B.注射mfgl2 sense plasmid小鼠肝臟(棕染區為mfgl2表達陽性區域)見圖11.mfgl2 antisense plasmid治療組與mfgl2 sense plasmid組小鼠暴發性肝衰竭模型肝臟HE染色比較；A.注射mfgl2 antisense plasmid小鼠肝臟；B.注射mfgl2 sense plasmid組小鼠肝臟(箭頭所指區域為壞死區)
權利要求
1.一種mfgl2鼠纖維反義質粒的構建方法，步驟如下步驟一，載體的構建部分1)PCR產生針對mfgl2凝血酶原酶基因的反義模板。產生反義序列的模板gccgcactgc aaggatgagg cttcctggtt ggttgtggct gagttctgcc gtcctcgctg 60cctgccgagc ggtggaggag cacaacctga ctgaggggct ggaggatgcc agcgcccagg 120ctgcctgccc cgcgaggctg gagggcagcg ggaggtgcga ggggagccag tgccccttcc 180agctcaccct gcccacgctg accatccagc tcccgcggca gcttggcagc atggaggagg 240tgctcaaaga agtgcggacc ctcaaggaag cagtggacag tctgaagaaa tcctgccagg 300actgtaagtt gcaggctgac ga 322該序列mfgl2基因的部分外顯子1的序列，是通過PCR從含有mfgl2凝血酶原酶的mRNA cDNA的載體pCR3.1擴增得到，部分外顯子1兩端引入酶切位點Xba I和EcoR I。2)將1)步驟中產生的模板插入pcDNA3.0載體構成mfgl2反義質粒。產生的反義模板可反向插入pcDNA3.0載體的酶切位點EcoRI和XbaI。
2.根據權利要求1所述的一種mfgl2鼠纖維反義質粒的構建方法，其特征在于產生mfgl2凝血酶原酶反義序列的模板為mfgl2基因的部分外顯子，其序列為gccgcactgc aaggatgagg cttcctggtt ggttgtggct gagttctgcc gtcctcgctg 60cctgccgagc ggtggaggag cacaacctga ctgaggggct ggaggatgcc agcgcccagg 120ctgcctgccc cgcgaggctg gagggcagcg ggaggtgcga ggggagccag tgccccttcc 180agctcaccct gcccacgctg accatccagc tcccgcggca gcttggcagc atggaggagg 240tgctcaaaga agtgcggacc ctcaaggaag cagtggacag tctgaagaaa tcctgccagg 300actgtaagtt gcaggctgac ga 322
3.根據權利要求1所述的一種mfgl2鼠纖維反義質粒的構建方法，其特征在于mfgl2外顯子1來自含有mfgl2凝血酶原酶的mRNAcDNA的載體pCR3.1。
4.根據權利要求1所述的一種mfgl2鼠纖維反義質粒的構建方法，其特征在于構建的產生mfgl2凝血酶原酶反義的模板需要通過反向插入載體pcDNA3.0構成一表達體系。
5.根據權利要求書1所述的一種mfgl2鼠纖維反義質粒的保藏培養物Echerichid Coli JM 109/pcDNA3.0 mfgl2 antisense已于2006年3月28日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號CCTCCNOM206030。
6.一種藥物組合物，它包括本發明所述的構建針對mfgl2凝血酶原酶的反義質粒和藥學上所接受的載體或賦形劑。
全文摘要
本發明涉及生物材料領域。具體是利用MouseFibrinogen－like protein2，mfgl2、簡稱mfgl2鼠纖維介素反義質粒，構建一種新的生物制劑，用于病毒誘導的重型肝炎和其它以微循環障礙損傷為主要病理生理特征疾病的治療的藥學用途。本發明基于重型肝炎暫無確定有效的治療方法，提出了一種用于治療病毒誘導的重型肝炎的基因藥物。發明人構建了一種新的生物制劑－mfgl2鼠纖維介素反義質粒，用以抑制mfgl2凝血酶原酶的表達。
文檔編號A61K49/00GK1844399SQ200610018749
公開日2006年10月11日 申請日期2006年4月13日 優先權日2006年4月13日
發明者寧琴, 羅小平, 朱傳龍, 孫奕, 習東, 嚴偉明 申請人:華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院