專利名稱：人自體膠原蛋白活細胞注射劑及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種注射劑，尤其是涉及生物組織工程學中一種人自體膠原蛋白活細胞注射劑。本發明還涉及該注射劑的制備方法。
背景技術：
隨著歲月的流失，人體皮膚會逐漸變得沒有光澤、失去彈性，最后形成皺紋，這是最常見的皮膚凹陷性缺損，同時皮膚凹陷性缺損也包括創傷性皮膚凹陷、非創傷性皮膚凹陷如嘴唇發育不良、陰莖、陰唇發育不良、皮膚擴張紋等多種情況。以前治療面部凹陷性疤痕多采用注射牛的膠原蛋白，但牛膠原產品的免疫原性限制了人體使用，而國外流行的瘋牛病使國人對進口產品望而生畏，這促使一些人考慮從胎盤中提取人膠原。經臨床應用，如秦軍俠發表于《中國醫藥指南》2005年第六期15-16頁的文章“高效美容膠原在面部凹陷性缺損中的應用”中所說，與牛膠原相比，人膠原是前進了一步，從免疫組織學上講，也只是完成了異種移植到異體移植的跨越，而自體膠原的制備及應用，也即異體到自體的飛躍，截止目前尚未見報道。近年來也有許多人采用肉毒素注射來治療皺紋及瘢痕，參見《中國實用醫學月刊》2004年8月696-697頁“肉毒毒素祛除面部皺紋3000例”(秦軍俠、黃靖西著)，文章表明，肉毒毒素有維持時間短的缺點。既然異體、異種組織應用有缺點、受限制，尋找合適的自體組織移植治療皮膚凹陷性缺陷就一直成為臨床應用的重要課題，在《中華臨床與衛生》2005年2期3-4頁“自體脂肪顆粒注射移植的臨床應用”(秦軍俠著)一文中表明，自體脂肪顆粒移植后有較多的液化，吸收是其主要缺點。近年來出現的一種細胞整形術是一種較好的方法，在《中華現代皮膚科學雜志》2005年1期4-5頁“皮膚組織工程學技術在面部缺陷中的應用—自身皮膚(幼生)干細胞培育注射儲存”(黃靖西、秦軍俠著)一文中，是將自體皮膚成纖維細胞在體外經過培養擴增后，再次注射到需要進行修復的部位，但由于該注射液中只含有成纖維細胞，注射液比較稀薄，修復細小皺紋尚可，在進行豐口唇、豐陰唇、增粗陰莖等填補體表較大缺損時則顯體積不足。
發明內容
本發明的目的是針對上述現有技術所存在的不足而提供的一種人自體膠原蛋白活細胞注射劑。
本發明的另一目的是提供該注射劑的制備方法。
為實現上述目的，本發明可采取下述技術方案本發明所述的人自體膠原蛋白活細胞注射劑，由人自體膠原蛋白和所含的真皮成纖維細胞組成。
所述人自體膠原蛋白是由來源于人身自體的真皮成纖維細胞在體外擴增、培養后產生。
本發明所述注射劑的制備方法，是將來源于人身自體的真皮成纖維細胞在體外擴增和培養，使之產生膠原蛋白；將膠原蛋白和所含的真皮成纖維細胞取出即得到該注射劑。
本發明的優點在于與以往所用的祛除皮膚凹陷性缺陷的注射液相比，本發明所保護的注射液在遇有填補體表較大缺損時，如修補皺紋、皮膚擴張紋、凹陷性瘢痕、非創傷性皮膚凹陷以及嘴唇增厚、性器官整形等，將含有成纖維細胞的自體膠原注射劑注入缺陷區，近期效果十分理想；當該批膠原蛋白衰老，被膠原酶和蛋白水解酶等酶類清理破壞掉時，注射劑內包含的成纖維細胞又產生新的膠原蛋白來代替它們，較好的完成了承上啟下的作用，起到持續不衰的優異效果，使遠期效果也變得十分理想，實現了從異體到自體質的飛躍。由于本發明使用的皮膚組織取自人身自體，無排斥反應和毒副作用；被治療者用過后效果顯著，表情自然，保持時間長久。
具體實施例方式
本發明所述的注射劑由來源于人身自體的真皮成纖維細胞在體外擴增和培養，使之產生膠原；將膠原蛋白和所含的真皮成纖維細胞合成后即得到該注射劑。
該注射劑的具體制備步驟為1、該生物樣品的提取方法多種多樣，可以從胎兒出生時脫離母體的臍帶上獲取，也可以從愛美人士切除眼袋時丟棄的離體皮、瘢痕切除術中丟棄的瘢痕組織中獲得。將采集到的生物樣品建檔保存，具體保存方法為當培養物建立起來而快達到融合時，成纖維細胞可以采樣凍存，凍存寧早勿晚，因為正常成纖維細胞的傳代次數是有限的；這些成纖維細胞可保存在任何適于保存成纖維細胞的培養液中，如應用含70％生長液，20％(V/V)胎牛血清，10％二甲基亞砜(DSMO)的培養液效果就不錯。復蘇后的細胞可以用來做傳代培養，然后用于同一受治者，免除了重新采樣的不便。如將被治療者的成纖維細胞樣本在年輕時儲存起來，等若干年后皮膚出現老化癥狀時，取出被治療者年輕時所儲存的生物樣品培育、擴增，然后注射到所需要的部位，祛皺嫩膚的效果非常好。
2、制備過程(1)組織消化(SanyaCO2培養箱)將生物樣品放置于35mm培養皿中加入2ml濃度為0.05％的胰酶/EDTA液，37℃，10分鐘；EDTA液+10％FBS培養液終止；(2)細胞分離將消化后的生物樣品剪碎并用吸管打散；(3)離心吹散后的細胞收集至離心管中，Backman公司控溫離心機，25℃，1000轉/min，離心5分鐘，棄去上清液；(4)原代細胞培養在離心管中加入1ml低血清真皮細胞培養液(Sigma公司，美國)吹懸，接種如1×35mm培養皿；SanyaCO2培養箱，37℃，5％CO2，進行培養；(5)傳代細胞的無血清培養每隔2-3天換液一次，當細胞達到50-70％匯集細胞后傳代。細胞可以胰蛋白酶消化后在新培養瓶傳代，例如一瓶細胞可以分成三瓶來養，三底T-150型培養瓶有450平方厘米的培養面積，就可用于該細胞的培養，一個三底T-150型培養瓶可以接種6×106個細胞，長滿可有1.8×107個細胞。通常5-7天細胞可以長滿，這時生長液換成無血清培養基；然后細胞孵育在37℃無蛋白培養基中6小時至2周或更久均可，直至長到分泌出足夠使用的膠原蛋白；(6)獲取注射劑無血清培養結束后，棄去培養液，培養瓶中的膠原蛋白及所含的成纖維細胞直接取出即得到所述注射劑。該注射劑也可根據實際需要，加入適量的生理鹽水、林格氏液、葡萄糖等溶液后，調治成不同吸收度、不同粘稠度的注射劑使用。
權利要求
1.一種人自體膠原蛋白活細胞注射劑，其特征在于所述的注射劑由人自體膠原蛋白和所含的真皮成纖維細胞組成。
2.根據權利要求1所述的注射劑，其特征在于所述人自體膠原蛋白是由來源于人身自體的真皮成纖維細胞在體外擴增、培養后產生。
3.如權利要求1所述注射劑的制備方法，其特征在于將來源于人身自體的真皮成纖維細胞在體外擴增和培養，使之產生膠原蛋白；將膠原蛋白和所含的真皮成纖維細胞取出即得到該注射劑。
全文摘要
本發明公開了一種人自體膠原蛋白活細胞注射劑及其制備方法，由人自體膠原蛋白和所含的真皮成纖維細胞組成。制備方法是將來源于人身自體的真皮成纖維細胞在體外擴增和培養，使之產生膠原蛋白；將膠原蛋白和所含的真皮成纖維細胞取出即得到該注射劑。本發明的優點在于與以往所用的祛除皮膚凹陷性缺陷的注射液相比，在遇有填補體表較大缺損時，將含有成纖維細胞的自體膠原注射劑注入缺陷區，近期效果十分理想；當該批膠原蛋白衰老，被膠原酶和蛋白水解酶等酶類清理破壞掉時，注射劑內包含的成纖維細胞又產生新的膠原蛋白來代替它們，較好的完成了承上啟下的作用，起到持續不衰的優異效果，使遠期效果也變得十分理想，實現了從異體到自體質的飛躍。
文檔編號A61P17/00GK1840194SQ200610017330
公開日2006年10月4日 申請日期2006年1月11日 優先權日2006年1月11日
發明者黃靖西, 秦軍俠, 葛明明, 黃海 申請人:黃靖西, 秦軍俠, 葛明明, 黃海