專利名稱：用于制備免疫治療性組合物的慢病毒載體的制作方法
技術領域：
本發明涉及逆轉錄病毒載體，尤其是慢病毒載體在制備如下組合物中的用途，所述組合物能誘導或促進針對該載體中存在之核苷酸序列編碼的表位的體外(在優選實施方案中，體內)免疫反應的出現或增強。
本發明人已經表明按照本發明制備的載體可以產生針對表位的細胞介導的免疫反應，尤其是細胞毒性T淋巴細胞(CTL)反應。
他們還進一步獲得了數據，表明該細胞介導的免疫反應可以是特異性的反應，產生的是針對一個或幾個由包含在載體中的核苷酸序列編碼的表位的免疫反應。
因此，本發明提供可以用于抗腫瘤和癌癥的治療程序的工具，尤其是可以用于抗腫瘤的免疫療法或接種疫苗療法的工具。
本發明也公開了可以用于治療或預防傳染病，尤其是與例如逆轉錄病毒感染等病毒感染有關的疾病的工具。
本發明人進一步獲得的結果表明由本發明組合物誘導的與治療有關的細胞介導的免疫反應，尤其是CTL反應，對腫瘤抗原、病毒抗原或被病毒感染的細胞的抗原是特異性的，并且也可受MHC(主要組織相容性復合物)的特定分子的限制。
本發明特別涉及載體在免疫原性組合物中的用途，以便產生受MHC復合物I類分子—例如HLA-A2或B7分子—限制的細胞介導的免疫反應。
因此，本發明與包含重組載體的免疫原性組合物有關，該重組載體中包括多核苷酸，該多核苷酸包含順式作用的中心起始區(cPPT)和順式作用的終止區(CTS)。在反轉錄期間，cPPT和CTS序列誘導三鏈DNA結構的形成，該結構在此被稱作DNA三鏈體。DNA三鏈體刺激載體DNA基因組的向核內輸入，這些區域是逆轉錄病毒或逆轉錄病毒樣起源的，所說的載體還包含確定的核苷酸序列(轉基因或感興趣的序列)和逆轉錄病毒或逆轉錄病毒樣起源的逆轉錄、表達和殼體化的調節信號，其中所說的組合物能夠誘導或刺激針對一個或數個由載體中的轉基因序列編碼的表位的CTL(細胞毒性T淋巴細胞)或CD4反應。
在本發明的優選實施方案中，針對一個或數個表位的細胞介導的免疫反應，尤其是CTL反應或CD4反應，是記憶性CTL或CD4反應。
需要強調的是，正是由于cPPT和CTS區域在載體中的存在，使得三鏈體DNA結構得以形成，并因此影響了、尤其是提高了在被所說的載體重組的細胞中載體基因組的向核內輸入。
本發明的免疫原性組合物誘導、或增強記憶性CTL反應的能力或概括地來說是與記憶性CTL反應的出現有關的能力，使得該免疫原性組合物能夠被用于抗腫瘤治療或抗病毒治療或抗病原體治療的程序中，包括當需要誘導長期持續的免疫反應的時候，或在某段時間需要尋找可長期誘導的反應的時候，在該免疫原性組合物給藥后至少可以誘導這樣的反應。換句話說，通過誘導或刺激或參與細胞介導的免疫反應的出現，尤其是CTL反應或記憶反應的出現，該免疫原性組合物可以被用來制備治療性組合物，以治療腫瘤性疾病或傳染性疾病，例如細菌性或病毒性疾病。
需要強調的是由于在載體和載體顆粒中存在cPPT和CTS區域，導致在載體序列中存在三鏈體結構，這使得本發明的免疫原性組合物能夠在靶細胞中刺激載體基因組的向核內輸入。在載體中誘導的表位可以是自身或非自身的。
本發明也包括含有逆轉錄病毒的或合成來源的cPPT和CTS序列的核苷酸序列在增加核苷酸序列或多肽序列進入靶細胞或受體細胞的核中的用途。
作為實例，可以理解，上述的三鏈體序列包含對受體細胞來說是外源的序列或自身序列。
因此，本發明披露了可以在與接種疫苗程序類似的治療性程序中使用的組合物，以用于腫瘤的治療，特別是抗癌或抗感染性疾病的治療。
我們很有興趣地注意到根據本發明，轉基因或感興趣的序列可能是編碼一個或數個腫瘤細胞的一個或數個表位(例如已經被確認為誘導針對腫瘤的細胞介導免疫反應的潛在靶抗原的表位)的序列數個表位形成多表位(polyepitope)，其可能由本發明的轉基因所編碼。在具體的實施方案中，它們可來自已經在腫瘤中被識別出來的靶抗原，并可被以這樣的方式選擇即當它們的編碼序列聯合形成轉基因的時候，可以產生針對所有的表位或針對它們中的大部份表位的細胞介導的免疫反應。細胞介導的免疫反應可以在體外測定，或在優選實施方案中在體內檢測。在實施例中描述了能夠完成這樣的檢測的程序。
在幾個類型的腫瘤中，特別是在黑素瘤或在包括腎癌，膀胱癌，結腸癌，肺癌，乳腺癌，白血病和淋巴瘤等在內的癌中，已經鑒別出靶抗原。
依照本發明的另外方面，該免疫原性組合物可以被用在傳染病中獲得細胞介導的免疫反應，這些傳染病包括與病毒有關的感染，或與任何類型的病原體(包括分枝桿菌(Mycobacteria)，例如結核分枝桿菌(M.tuberculosis))有關的感染。
在此，可以鑒定出能夠引起細胞介導的免疫反應的特異性抗原，它們的編碼序列插入載體中用于該免疫原性組合物中。作為實例，結核分枝桿菌的des基因就可以這樣用。
此外，根據本發明，用于免疫原性組合物中的載體可能表達腫瘤細胞或受病毒感染的細胞上鑒定為靶抗原的蛋白質(包括糖蛋白或其他蛋白質來源的化合物)上存在的表位。
除此之外，我們還注意到表位、以及用來提供表位的多肽或蛋白質可以通過例如突變、缺失或插入而被修飾，例如為了提高它們的穩定性而對其進行修飾。
本發明也涉及包含重組逆轉錄病毒顆粒的免疫原性組合物，該病毒顆粒包含1)包含確定的核苷酸序列(轉基因)的重組核苷酸序列，所述確定的核苷酸序列被置于轉錄和表達的調節信號以及逆轉錄、表達和殼體化的調節信號的控制下，和
2)包含順式作用中心起始區(cPPT)和順式作用終止區(CTS)的多核苷酸，這些區域是逆轉錄病毒或逆轉錄病毒樣起源的，或來自轉座子，并被以相對于逆轉錄病毒或逆轉錄病毒樣起源的逆轉錄調節信號或轉座子調節信號有功能的方向和位置插入，其中該免疫原性組合物能夠誘導或刺激針對由載體中存在的轉基因序列編碼的一個或數個表位的CTL(細胞毒性T淋巴細胞)反應。
包含cPPT和CTS順式作用序列的DNA片段能夠在反向轉錄之后采取三鏈DNA結構，即“DNA三鏈體”，并刺激載體DNA的向核內輸入。
依照具體的實施方案，能夠誘導或者刺激針對一個或數個由存在于載體中的轉基因序列編碼的表位的CTL(細胞毒性T淋巴細胞)反應的免疫原性組合物，包含重組的逆轉錄病毒載體顆粒，這些顆粒包含a)相應于慢病毒的核蛋白或功能性衍生多肽的gag多肽(GAG多肽)，b)由慢病毒的RT、PRO、IN蛋白或功能性衍生多肽構成的pol多肽(POL多肽)，c)包膜多肽或功能性衍生多肽(ENV多肽)。
d)重組的核苷酸序列，其包含確定的核苷酸序列(轉基因或感興趣的序列)，該序列編碼一個或數個表位，被置于轉錄和表達的調節信號控制下；含有逆轉錄病毒或逆轉錄病毒樣起源的逆轉錄、表達和殼體化的調節信號的序列；以及含有順式作用中心起始區(cPPT)和順式作用終止區(CTS)的多核苷酸，這些區域是逆轉錄病毒或逆轉錄病毒樣起源的，并被以相對于前述的逆轉錄病毒或逆轉錄病毒樣起源的調節信號有功能的方向插入。
依照另外的實施方案，能夠誘導或刺激針對一個或數個由存在于載體中的轉基因序列編碼的表位的CTL(細胞毒性T淋巴細胞)反應的免疫原性組合物包含重組的逆轉錄病毒樣顆粒，這些顆粒包含a)包含順式作用中心起始區(cPPT)和順式作用終止區(CTS)的多核苷酸，這些區域來自反轉錄轉座子并被以相對于反轉錄轉座子調節信號有功能的方向插入，
b)相應于反轉錄轉座子的核蛋白或功能性衍生多肽的多肽(GAG多肽)，c)相應于反轉錄轉座子的RT、PRO、IN蛋白或功能性衍生多肽的pol多肽(POL多肽)，d)病毒的包膜多肽，e)重組的核苷酸序列，其包含確定的核苷酸序列(轉基因或感興趣的序列)，該序列被置于轉錄和表達的調節信號和反轉錄轉座子的逆轉錄、表達和殼體化的調節信號的控制下。
存在于對應一個或其它上述定義的免疫原性組合物中的重組逆轉錄病毒載體顆粒，在優選實施方案中能夠誘導、增強記憶細胞介導的免疫反應尤其是記憶性CTL反應的出現，或與記憶細胞介導的免疫反應尤其是記憶CTL反應的出現有關。
根據上述披露的包含載體或載體顆粒的免疫原性組合物的定義，該組合物可以根據幾個可能的實施方案而制備。
在本發明的優選實施方案中，免疫原性組合物是以這樣的方法制備的即逆轉錄病毒起源的序列來自于慢病毒基因組。
依照另外的實施方案，這些序列是逆轉錄病毒樣起源的而且來自于反轉錄轉座子。
在本發明的另外的實施方案中，或除了上述定義的特征以外，包含在重組載體中的轉基因或感興趣的序列包含在包括轉錄和表達的調節信號的表達盒中。
或者，載體的逆轉錄、表達和殼體化的調節信號是慢病毒來源的，并且包含cPPT和CTS區的多核苷酸也是慢病毒來源的。
依照另外的實施方案，在載體中的逆轉錄、表達和殼體化的調節信號和含有cPPT和CTS區的多核苷酸，起源于HIV型逆轉錄病毒，特別是HIV-1或HIV-2。
其他的病毒尤其是慢病毒可以被用來設計逆轉錄、表達和殼體化的調節信號，也可以用來獲得含有cPPT和CTS區的多核苷酸。特別是可以使用慢病毒CAEV、EIAV、VISNA、HIV、SIV或FIV。
為了獲得本發明的免疫原性組合物的重組逆轉錄病毒顆粒，編碼載體的反式互補所必需的多肽或蛋白質的序列是例如來自慢病毒，尤其是來自HIV，包括HIV-1和HIV-2逆轉錄病毒，的GAG、POL和ENV蛋白質。
或者，GAG和POL序列可以來自與ENV序列不同的病毒。例如GAG和POL序列可能來自HIV逆轉錄病毒，而ENV序列可能來自另外的病毒或逆轉錄病毒，而且可以是雙嗜性或親嗜性ENV序列。
在另外的實施方案中，ENV序列起源于皰疹性口腔炎病毒(VSV)。
依照本發明的特別的實施方案，能夠誘導或刺激針對由存在于載體中的轉基因序列編碼的一個或數個表位的CTL(細胞毒性T淋巴細胞)反應的免疫原性組合物包含重組逆轉錄病毒樣顆粒，該顆粒包含a)包含順式作用中心起始區(cPPT)和順式作用終止區(CTS)的多核苷酸，這些區域起源于反轉錄轉座子并被以相對于反轉錄轉座子調節信號有功能的方向插入，b)相應于反轉錄轉座子的核蛋白或功能性衍生多肽的多肽(GAG多肽)，c)相應于反轉錄轉座子的RT、PRO、IN蛋白質或功能性衍生多肽的pol多肽(POL多肽)，d)病毒的包膜多肽，e)重組的核苷酸序列，其包含確定的核苷酸序列(轉基因或感興趣的序列)，該序列被置于轉錄和表達的調節信號和反轉錄轉座子的逆轉錄、表達和殼體化的調節信號控制下。
根據上述披露的特點，包含重組的逆轉錄病毒樣顆粒的本發明的免疫原性組合物在優選實施方案中能夠產生記憶細胞介導的反應，尤其是記憶性CTL反應。
本發明也與載體結構有關，這些載體結構于1999年10月11日被保藏于CNCM(國立微生物保藏中心，Collection Nationale de Culture deMicroorganismes at Institut Pasteur in Paris，法國)。
第一個載體是pTRIP.TEL/AML-IRES-GFP，于1999年10月11日按編號I-2326保藏。第二個載體被指定為pTRIP-ILKE-IRES-GFP，并于1999年10月11日按編號I-2327保藏。
第三個載體是pTRIP.DES-IRES-GFP，于1999年10月11日按編號I-2331保藏在CNCM。
存在于上述結構中的編碼抗原的序列可以被任何其他的感興趣的抗原或表位所取代，包括上面提到的結核分枝桿菌的完整DES基因。
依照本發明的另外的方面，載體、載體顆粒和包含它們的免疫原性組合物，是以這樣的方式設計的即cPPT和CTS區位于載體的序列的中心。
“位于中心”意謂著cPPT和CTS區處在載體序列的中心，或大約在該序列的中心。尤其是cPPT和CTS區域可以位于逆轉錄的線性載體DNA的中間三分之一之內。
由于cPPT和CTS序列存在的結果，在病毒的逆轉錄期間所形成的三鏈體序列的中心定位，使得接觸了該載體或載體顆粒的細胞的轉導水平得到了提高。
或者，依照該載體的一個變體，載體的轉錄單位，包括轉基因，可以被插入在LTR區域的U3區域里面。因此，不論轉基因的大小，在逆轉錄之后，轉基因都會被復制并因此出現在三鏈體序列的兩側，因此使得三鏈體序列能位于載體的中心位置。
本發明也涉及與本發明的免疫原性組合物接觸過的細胞，并且尤其涉及被該免疫原性組合物的載體或載體顆粒所轉導的重組細胞。
有利的是這些細胞是抗原提呈細胞，例如，這些細胞可以從肺細胞、腦細胞、上皮細胞、星形膠質細胞、小膠質細胞(mycroglia)、少突膠質細胞、神經元、肌細胞、肝細胞、樹突細胞、神經元細胞、骨髓細胞株、巨噬細胞、成纖維細胞、造血細胞中選擇。
本發明的免疫原性組合物可以因此被用于腫瘤特別是癌癥的治療程序，或制備腫瘤特別是癌癥的治療性療法的治療組合物，以產生初次(primary)細胞介導的免疫反應，尤其是CTL反應，有利的是該反應是記憶性CTL反應。或者，它也可以作為另外已知的抗癌治療的輔助性治療來使用。
例如，本發明的免疫原性組合物可以與化學療法或免疫化學療法或另外的抗癌治療方法聯合使用。
根據本發明，“抗癌治療”的表述意味著抑制腫瘤的生長或腫瘤的潛在生長或抑制惡性細胞的擴散，包括控制轉移形成的可能性，或兩者皆有。
因此，依照本發明，“抗癌治療”的表述涉及用來控制腫瘤的惡性生長和擴散，以及預期該疾病的復發的程序，尤其是考慮到該免疫原性組合物能夠誘導或增強，一般地說，能夠參與，記憶細胞介導的反應的事實。
可能用本發明的組合物治療的腫瘤有例如黑素瘤或包括(肺癌、膀胱癌、腎癌、結腸癌)以及淋巴增生在內的癌。
可能被治療的腫瘤也包括所有表達腫瘤特異性抗原的腫瘤，腫瘤特異性抗原包括突變的自身蛋白質和/或過量表達的自身蛋白質。
本發明的免疫原性組合物的每個可能的可接受的給藥方式都是我們所感興趣的，包括含離體步驟的給藥程序，例如離體轉導靶細胞，繼而將處理過的細胞輸給將要接受治療的患者。
或者，本發明的免疫原性組合物可以通過常用的給藥途徑直接對患者給藥，這些途徑包括全身性(IV)、局部性、或經皮膚的、皮內的、例如腫瘤內給藥等給藥途徑。
在具體的實施方案中，本發明的免疫原性組合物可以通過這樣的方式直接對患者給藥，即它將會在體內誘導、增強或參與細胞介導的免疫反應，尤其是CTL介導的免疫反應。
在另外的實施方案中，可以使用該免疫原性組合物以使它們能夠誘導出現長期的記憶性細胞介導的反應。
需要強調的是本發明的免疫原性組合物具有特別的益處，這是因為存在于載體和載體顆粒中的cPPT和CTS序列具有誘導或刺激靶細胞中載體基因組的向核內輸入的性質。
本發明的免疫原性組合物特別的優點是它們可以用來引發或刺激針對由存在于載體或載體顆粒中的感興趣的核苷酸序列或轉基因編碼的多個表位的細胞介導的免疫反應，而且它們也能用來引發或刺激針對基因(例如致病因子的基因)全序列或上述基因能夠編碼至少8到15個氨基酸、優選9到12個氨基酸的片段的產物的細胞介導的反應。本發明也包括含有如下核苷酸序列的核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼上述誘導細胞反應的氨基酸序列的多個重復(至少兩個同樣的序列)和/或包含至少兩個對應于不同病原體或腫瘤抗原兩個表位的不同序列的氨基酸序列。
本發明的其他特性或優點在下列各項實施例和附圖中展示。
圖1編碼黑素瘤多表位的、來自HIV-1的三鏈體DNA陽性重組載體。
圖2用TRIP-mel-IRES-GFP載體免疫后的HHD小鼠的CTL反應。
圖3HIV-1來源的中心DNA三鏈體陽性或陰性載體轉導人細胞5天后在人細胞中的GFP表達。
圖4使用人樹突細胞的體外CTL反應。
圖5pHR.MEL-IRES-GFP載體的限制性酶切圖譜黑素瘤特異性CTLs的單一或多個表位的序列。
HR.MEL-IRES-GFP的構建。
為了要構造HL.MEL-IRES-GFP質粒，按編號I-2185于1999年4月20日保藏在CNCM的TRIP.MEL-IRES-GFP的NdeI/XhoI片段，其包含CMV啟動子的一部分、多表位MEL和IRES-GFP，代替包含CMV啟動子一部份和GFP的HR GFP NdeI/XhoI片段。
圖6pTRIP.ILKE-IRES-GFP載體的限制性酶切圖譜HIV特異性CTLs單個或多個表位的序列，I9V.(ILKE)；(RT476-484)的表位。
TRIP.ILKE-IRES-GFP的構建(1999年10月6日存放在CNCM，巴黎，法國，編號是...)TRIP.ILKE-IRES-GFP是通過將ILKE的PCR產物插入TRIPΔEIRES-GFP內，并位于CMV啟動子和IRES之間而構建出來的。從ILKE開始的圍繞CTL表位的區域通過PCR方法在pLAI模板上用下列引物擴增5 ILKE5’TCAGATCTGCCACCATGGCACTAACAGAAGTAATACCAC 3’3 RIILKE5’CGGAATTCTTATTGGCCTTGCCCCTGCTTC 3’.
Kozak序列被插進上游引物內，而終止密碼子被插進下游引物內。
在用BglII/Eco RI消化后，PCR產物被插進TRIPΔE IRES-GFP的BamHI/EcoRI位點內。
該載體表達編碼GFP和VIH的RT基因區的雙順反子信使，其對應于表位簇，尤其包含受HLA.A2.1限制的I9V表位(RT 476-484)(Walker B.D.，1989 PNASS 86 p.9514-9518)。
圖7pTRIP.TEL/AML-IRES-GFP載體的限制性圖譜。
轉移(translocation)TEL/AML序列TRIP.TEL/AML-IRES-GFP是通過將TEL/AML的PCR產物插入TRIPΔE IRES-GFP之內，并位于CMV啟動子和IRES之間而構建出來的。在TEL和AMI之間圍繞轉移的區域通過PCR方法用下列引物擴增5 Bgl TA5’GAAGATCTGCCACCATGAAGCCCATCAACCTCTCTCAT 3’3 RITA5’CGGAATTCTTACCCAGCGCAACGCCTC 3’Kozak序列被插進上游引物內，而終止密碼子被插進下游引物內。
在用BglII/EcoRI消化后，PCR產物被插進TRIPΔE IRES-GFP的BamHI/EcoRI位點內。
圖8來自HIV的DNA三鏈體陽性載體轉導小鼠樹突細胞的能力，該載體編碼I9V表位肽(來自于HIV 1 pol)和GFP，該細胞是通過使用來自HHD轉基因小鼠的骨髓細胞而制備出來的。
約80％的小鼠樹突細胞被來自HIV的三鏈體陽性重組載體所轉導。這已經通過細胞內部的GFP表達的FACS分析所證明。
圖9編碼結核分枝桿菌的DES基因的TRIP-des-IRES-GFP載體免疫后，HHD小鼠中的CTL反應的評價。
圖10pTRIP.DES-IRES-GFP的限制性酶切圖譜，該載體于1999年10月11日保藏在CNCM。
實施例慢病毒載體有轉導包括非分裂細胞在內的細胞的能力，而且人們逐漸打算將其用于基因治療。最近，我們顯示了包含多嘌呤區段順式作用序列(中心DNA三鏈體)的慢病毒載體比那些缺失了中心DNA三鏈體的載體對人和鼠的細胞表現出更高的轉導效率(Chameau P.等，J.Mol.Biol.1994，241，651-662)。現在已經檢測了包含或不包含中心DNA三鏈體和編碼相同的HLA-A2.1限制性黑素瘤CTL多表位的慢病毒載體誘導CTL反應的能力。包含中心DNA的慢病毒載體直接體內給藥可以在HHD(HLA-A2.1純)小鼠中誘導針對由多表位序列編碼的所有表位多肽的強烈的CTL反應。含有DNA三鏈體的慢病毒載體已經清楚地顯示了它的優點。此外，我們表明包含了DNA三鏈體的慢病毒載體轉導人的樹突細胞的效率比不包含三鏈體的載體高7倍。這些被離體轉導的樹突細胞引發了針對大部份黑素瘤表位多肽的有效的特異性初次CTL反應。由于對修飾過的慢病毒載體的安全性的關心已經被解決，我們打算將該載體不只是用于人的體內基因治療，而且還要用于癌癥患者的免疫療法。
介紹逆轉錄病毒的慢病毒亞科能感染包括非分裂細胞在內的大多數細胞類型。這個性質使慢病毒對基因治療來說是具有吸引力的。幾個復制缺陷的人重組慢病毒載體已經被不同的小組構建了(Naldini PNAS93，11382-8，Science，1996)。這些經過重新設計和去毒的慢病毒載體被提議作為最有效的和安全的基因治療載體(Zufferey R，& Kim V.N.JVirol，72，9873-80，1998)。我們發展了以人的慢病毒(HlV)為基礎的帶有皰疹性口腔炎病毒G糖蛋白(VSVG)的假型載體(Burns J.C.，1993PNAS 90，8033-7)。這個載體缺失了大部份非必需的病毒蛋白質，但是含有多嘌呤區段順式作用序列(cPPT，中心DNA三鏈體)。中心DNA三鏈體在相當程度上提高了逆轉錄的HIV-DNA分子的向核內輸入。而且，觀察到包含中心DNA三鏈體的慢病毒載體比不包含三鏈體的載體對鼠和人細胞表現出更有效的體外轉導。
HHD(HLA-A2.1純)轉基因小鼠(Pascolo等，J.Exp.Med，1997，1852043-2051)允許對表位多肽和不同的免疫策略的免疫原性潛力進行實驗性受控評估。使用這些HHD小鼠，由不同的重組載體編碼的黑素瘤多表位在單個動物中同時誘發CTL反應的能力已經被報道了。首先研究了包含或不包含中心DNA三鏈體和編碼相同的黑素瘤多表位的慢病毒載體在HHD轉基因小鼠體內誘導CTL的能力。進而研究了由相同的重組慢病毒載體轉導的人樹突細胞(hDC)是否可以離體誘導針對黑素瘤多表位基序的初次CTL反應。目前的結果證明通過重組載體體內直接給藥或離體使用轉導的樹突細胞，DNA三鏈體明顯提高了慢病毒載體誘導特異性CTL反應的能力。
結果實施例1黑素瘤多表位免疫。
證明了注射編碼來自黑素瘤的多表位基序的重組DNA可以在HHD小鼠中同時誘發針對數個黑素瘤表位的CTL反應之后，我們檢測了編碼相同的黑素瘤多表位基序的慢病毒載體(圖1)的免疫原性能力。TRIP-mel-IRES-GFP載體(CNCM 1-2185，于1999年4月20日保藏)按每只小鼠1.25μg/p24經靜脈內、腹膜內、或皮下給藥。每組至少使用3只小鼠。
針對十個黑素瘤表位中的大部份表位的多個特異性CTL反應同時被誘導出來。不論何種給藥途徑，觀察到針對負載多肽和TRIP-mel-IRES-GFP轉導的HHD-轉染的HeLa細胞兩者的CTL反應相類似(數據未顯示)。然而，腹膜內注射可誘導略微好些的CTL反應。針對NA17-A.nt38和gp100.154表位多肽引發了強烈的反應。針對gp100.457、MART.1.27、Mage-3和酪氨酸酶.368-D的明顯反應也被觀察到了。針對gp100.209、gp100.280、MART-1.32和酪氨酸酶.1的CTL反應是很弱的。當使用其他的非慢病毒載體給藥時，TRIP-mel-IRES-GFP載體免疫后能引發弱CTL反應的表位都不能再誘導CTL反應。
誘導體內可檢測的CTL反應所需要的慢病毒載體的最小劑量使用六個不同劑量的TRIP-mel-IRES GFP載體腹膜內注射以確定能夠在HHD小鼠中引發明顯的CTL反應的慢病毒載體的最低劑量，每個劑量使用4只小鼠。共進行了兩次實驗，其中兩只小鼠的效應細胞在51Cr實驗之前被混合以具有類似的E/T比。在大多數的實驗中，研究人員檢測了針對所有的黑素瘤表位多肽的CTL反應。因為結果高度地類似并且非常平均，所以為了使結果變得清楚和簡單，只有針對NA17/A表位肽的CTL反應被考慮用來比較“量-效”關系。每只小鼠使用的劑量在500ng到2500ng/p24之間時可以獲得最好的CTL反應。雖然產生了針對某些黑素瘤表位的可檢測的CTL反應，但是慢病毒的高劑量并不比低劑量誘導更好的CTL反應。每只小鼠500ng/p24以下的劑量是不足以誘導有效的CTL反應的，即便證實了該劑量可以誘導某些針對某些黑素瘤表位多肽的特異性CTL反應。值得注意的是在每只小鼠1250ng/p24的劑量時，一些小鼠產生了針對包括在多表位基序10個表位中的所有10個表位的CTL反應(圖3)。
長期記憶性CTL的誘導用TRIP-mel-IRES-GFP載體注射8只小鼠。免疫12天或5個月后處死小鼠。用黑素瘤表位多肽體外刺激5天后，再用10％TCGF處理2天，混合4只小鼠的效應細胞，測定其針對負載在HHD-轉染的RMAS細胞上的多肽的活性。證明了在12天前免疫的小鼠中存在針對除了gp100.209和Mart1.32以外的所有黑素瘤表位多肽的特異CTL反應。在TRIP-mel-IRES-GFP注射后的5個月，所有初次CTL誘導表位仍然誘導強烈的CTL反應(圖2)。在免疫小鼠后的12天或5個月，令人驚訝的是CTL反應的水平仍然是可比較的。這提示體內被慢病毒載體轉導的細胞并沒有被免疫系統消滅，而是在繼續制造所編碼的黑素瘤多表位。
中心DNA三鏈體在體內免疫中的作用HMD小鼠分別同時被TRIP-meL-IRES-GFP和HR-mel-IRES-GFP載體單獨免疫，每只小鼠腹膜內給藥劑量分別為800ng，200ng，50ng，12ng和3ng/p24。在兩個單獨的實驗中，每個劑量至少檢測4只小鼠。在被合成多肽體外刺激之后，使用肽反復刺激的(pulsed)RMAS-HHD靶細胞檢測脾細胞的溶細胞能力。因為結果高度地均一，為了使結果清楚和簡單，只檢測了針對NA17/A，Mart-1.27，gp100.154和酪氨酸酶.368-D表位多肽的CTL反應。
大體上，用TRIP-LV載體以每只小鼠800ng，200ng和50ng/p24免疫的小鼠與用HR-LV載體免疫的小鼠相比，可以誘導出更好的CTL反應。無論使用何種載體，每只小鼠12ng/p24以下的劑量沒有產生可檢測的CTL反應(數據未顯示)。這證實了包含中心DNA復合物的慢病毒載體與那些缺乏該復合物的載體相比，其轉導能力得到了提高。
用慢病毒載體轉導樹突細胞最初觀察到與使用缺乏中心DNA三鏈體的載體相比，使用包含中心DNA三鏈體的慢病毒載體轉導腫瘤細胞，例如MT4和HeLa細胞，可以提高轉導效率達30倍。隨即在來自健康的供體或HHD小鼠的樹突細胞(DC)中檢測了這兩種慢病毒載體在不同濃度的轉導能力。樹突細胞表達GFP的百分率和它們的平均熒光強度被FACS測量，而且被當作這兩個慢病毒載體轉導樹突細胞的水平。
在所有的載體濃度上，TRIP-GFP載體都比HR-GFP載體更有效地轉導細胞。被TRIP-GFP載體轉導的鼠和人樹突細胞的GFP表達分別比那些被HR-GFP載體轉導的表達高3和7倍(圖3)。使用被TRIP mel IRES-GFP載體轉導的人樹突細胞的初次CTL誘導使用來自被TRIP mel-IRES-GFP轉導的健康HLA-A2.1供體的樹突細胞，體外刺激來自同一供體的單核細胞(MNC)，每星期一次。在樹突細胞中出現的GFP表達用FACS分析以證實有效的轉導。在三個星期之后，在無胎牛血清(FCS)的培養條件下，使用肽反復刺激的T2細胞作為靶細胞，在51Cr實驗中檢測單核細胞的細胞毒性能力。
TRIP-mel-IRES-GFP載體轉導的人樹突細胞(hDC)可以誘導針對除了Mart1.31之外的所有黑素瘤表位肽的明顯的CTL反應，而未轉導的人樹突細胞僅能誘導平常的背景反應(圖4)。
討論最近的報告顯示來自復制缺陷慢病毒的載體能轉導多種非分裂細胞(Naldini，1996，Kafri，1997)。慢病毒能夠通過非分裂細胞的完整的核膜而進入(Case，1999)。我們現在有證據表明這個步驟很大程度上是由被命名為中心DNA三鏈體的多嘌呤區段順式作用序列配合完成的。將該序列引入慢病毒來源的載體內，可能會使幾個細胞類型在體內和體外的穩定轉導提高達30倍，這些細胞包括神經元、肝細胞和造血干/祖細胞。
最近，在解決慢病毒來源的載體的安全性考慮方面以及它們在基因治療中的用途已經取得了進步(Narry Kim V等1988，Zufferey，1999)。然而，在已經成功使用鼠逆轉錄病毒載體和非逆轉錄病毒載體所進行的免疫治療應用方面從來沒有研究使用慢病毒載體(Condon，1996；Song，1997；Specht，1997)。為了發展有力的疫苗策略，檢測了包含中心DNA三鏈體并編碼黑素瘤多表位的慢病毒載體的免疫原性能力。首先研究了該載體的直接注射以測定它是否能在體內引發針對黑素瘤表位的特異性CTL反應。先在HHD HLA-A2.1(純)轉基因小鼠中比較了幾個免疫策略。使用了重組的pCMV-B10(HBs)DNA或編碼相同的黑素瘤多表位的重組疫苗，可能同時在單個小鼠中誘導針對包含在黑素瘤多表位中的4到6個不同肽的CTL反應。在與由其他的編碼相同的多表位基序的載體進行比較時，在特異性溶解以及引起CTL反應的多肽的數量方面，我們在編碼相同的黑素瘤多表位的TRIP mel IRES-GFP載體中獲得明顯更好的結果。特別是腹膜內和皮下注射該載體在一些小鼠中誘導出針對由TRIP mel IRES-GFP載體編碼的所有表位的CTL反應。
幾個小組報告被轉導的樹突細胞或負載的多肽可以被用作針對多種癌細胞的有力的免疫方法(Mayardomo，JI，1995，Song W，1997，Specht，JM，1997)。就本發明來說，因此需要研究是否鼠和人的樹突細胞能被有效轉導并且在體外誘導初次CTL反應。現在的結果清楚地表明這些細胞可以很容易地被轉導。此外，這些轉導細胞提呈所有由重組慢病毒載體編碼的表位。有趣的是人樹突細胞可能最容易被轉導。細胞的體外轉導可以避免慢病毒載體將它們的基因組以危險的方式整合到多種宿主細胞。由于這個原因，體外轉導的細胞應該構成適當的和安全的遞送方法以便進行初次臨床應用。
Warner等首先表明逆轉錄病毒載體在幾個動物模型以及HIV患者中具有誘導有效的CTL反應的能力，他們使用的是表達HIV-1蛋白質的鼠逆轉錄病毒載體轉導的成纖維細胞(Warner，1998年的綜述)。將載體直接注射進入小鼠體內，可以在有效提呈抗原的樹突狀的細胞中檢測到前病毒DNA(Song，1997)。然而，與慢病毒載體相反，鼠逆轉錄病毒載體不能轉導例如樹突細胞這樣的非分裂細胞，所編碼的基因的體內表達時常遭遇“關閉”。因此，這些逆轉錄病毒載體對人的免疫治療來說不是最好的候選者(Kafri)。
我們的結果清楚地表明包含中心DNA三鏈體的來自慢病毒的載體與那些不包含中心DNA三鏈體的載體相比，在HHD小鼠體內可以誘導更強的CTL反應。此外，包含中心DNA三鏈體的慢病毒載體可以在體外很容易地轉導人樹突細胞，其可以隨即用于臨床的免疫療法。
材料和方法慢病毒載體的構建載體質粒pTRIP-EGFP起源于HR’CMVLacZ(Naldini等，PNAS93，11382-8，1996)。LacZ報道基因被EGFP基因(Clontech公司)所取代。在TRIP-EGFP中，EGFP基因被插入含有cPPT和CTS序列的HIV-1 LAI的中心片段的Clal位點。
通過PCR方法從pEGFP-N1質粒中擴增EGFP基因，使用的是Pfu聚合酶(Stratagene公司)，并分別在5’和3’端增加BamHI和XhoI限制性位點。PCR引物如下Bam GFP 5’CC GGATCC CCA CCG GTC GCC ACC 3’Xho GFP 5’CC CTCGAG CTA GAG TCG CGG CCG 3’HR GFP載體是通過將這個PCR片段克隆回pHR’CMVLacZ的BamHI和XhoI位點，用EGFP取代LacZ ORF而構建出來的。
pLAI3(4793到4971)的一個包含cPPT和CTS的178bp片段通過PCR方法擴增出來。NarI限制性位點被添加在引物的5’端，目的是將這個片段插進HR GFP的單一Cla I位點之內Nar TRIP+5’GTC GTC GGCGCC GAATTC ACA AAT GGC AGT ATT CAT CC3’Nar TRIP-5’GTC GTC GGCGCC CCA AAG TGG ATC TCT GCT GTC C 3’將該三鏈體序列以正確的方向插入，產生TRIP GFP質體載體，以反向方向插入得到TRIPinv GFP。或者，從pcPPT-AG、pcPPT-D、pcPPT-225和pCTS質粒中擴增同樣的三鏈體片段以產生在cPPT或CTS中含有相同突變的載體，作為相應的病毒。
首先，在TRIP GFP載體或TRIP-EGFP(1998年4月15日保藏在CNCM，編號I-2005)中存在的EcoRI位點被補平，產生TRIP GFPΔE載體。然后包含小RNA病毒的內部核糖體進入位點(IRES)的1.2KbBamHI/XhoI片段被克隆到EGFP的上游，取代TRIP GFPΔE載體中的0.7kb BamHI/XhoI EGFP，產生cTRIP AE IRES GFP載體。在CMV啟動子和IRES GFP序列之間存在的位點是BamHI-BstXI-SnaBI和EcoRI。一個CTL多表位黑素瘤(mel)片段通過PCR方法在pBS Melpoly上產生，并將kozac共有序列插在引物5BglMlu Mel之內5’CCAGATCTACGCGTGCCACCATGGCTGCTGGT 3’3RIMel5’CGGAATTCGACCTAAACGCAACGGATG3’.
mel PCR片段被BglII/EcoRI消化并插在TRIPΔE IRES GFP的BamHI/EcoRI位點，產生TRIPΔE mel IRES GFP，它也被稱作TRIP melIRES GFP。
HR mel IRES GFP是通過將包含TRIP mel IRES GFP的黑素瘤多表位和IRES GFP的NdeI/XhoI片段與HR GFP的同樣片段進行互換而產生的。NdeI位點位于CMV啟動子的末端。
病毒載體的制備慢病毒載體按先前描述過的方法(Naldini I.M.PNAS 1996和Science，1996)通過使用磷酸鈣技術瞬時tree-質粒轉染293T細胞來制備。簡而言之，293T細胞被20μg VSV包膜質粒(pMDG)和40μg不同的包裝質粒(8.2或8.91)和慢病毒載體質粒所轉染。轉染后60小時和84小時收集條件培養基。然后濃縮病毒，dNTPs按先前的描述處理(Naldini，Science 1996)。HeLa P4.2細胞和MT4細胞上的病毒滴度通過連續稀釋和p24 ELISA檢測法來確定(Naldini，Science，1996)。
在存在20μM DEAE-葡聚糖的情況下，通過用等量的顆粒(每孔1ngp24病毒抗原)感染96孔板中的一式三份的P4細胞來進行病毒的一個周期滴定。整個實驗添加1μM蛋白酶抑制劑Saquinavir(Roche公司)，以限制對單一感染周期的分析。感染的前一天用8μM aphicolin處理以抑制細胞有絲分裂。使用化學發光的β-Gal報道基因測定法(Boehringer公司)在感染后48小時檢測β-半乳糖苷酶的活性。
一式三份的HeLa細胞被等量的載體顆粒(每孔5ng P24)所感染。在轉導后48小時，用200μl TNB(Tris 50mM PH 7.5，NaCl 150mM)替換培養基，使用微量反應板熒光計(Victor2，Wallac公司)和適合EGFP的濾光器(激發485nm，發射520nm)測定活細胞的熒光。
小鼠HHD小鼠已經在先前被描述過了(Pascolo，1997)。它們表達轉基因的單鏈組織相容性I類分子，其中人b2m的C末端通過肽臂(GGGGS)x3共價連接到嵌合的重鏈(HLA-A2.1 a1-a2，H-2Dba3-跨膜，和胞內域)的N末端。這些小鼠的H-2 Db和小鼠b2m基因被同源重組進一步打亂，導致完全缺乏血清學上可檢測的小鼠組織相容性I類分子在細胞表面的表達。
人樹突細胞的產生和初次CTL誘導從HLA-A2.1單倍型(IDM，巴黎，法國)的健康供體的細胞提取物中獲得了人樹突細胞。使用針對CD3、CD14、CD80、CD83、HLA-ABC和HLA-DR的單克隆抗體對這些樹突細胞進行的FACS分析顯示其具有不成熟的樹突細胞表現型。人樹突細胞在1ml AMV-5培養基中被慢病毒載體轉導10天，濃度為每1×106細胞600ng，300ng，150ng和150ng/p24。用FACS(Becton Dickinson，BD，美國)測量在被兩個慢病毒載體轉導的人樹突細胞中GFP表達的百分率和平均熒光強度。
用人樹突細胞或被轉導的人樹突細胞按1個人樹突細胞對4個單核細胞的比例在體外刺激來自相同的供體的單核細胞(MVC)。使用同樣的低溫貯存的轉導過的人樹突細胞對單核細胞再刺激兩次，然后在4小時51Cr釋放實驗中檢測細胞溶解活性，使用負載了相關肽或陰性對照(Inf.m.58)肽的T2細胞作為靶細胞(10μg/ml，5×106個細胞/ml，在無胎牛血清的RPMI培養基中，室溫下2小時)。
鼠樹突細胞的產生骨髓來源的樹突細胞按先前描述的方法[43，51]產生。骨髓單核細胞被培養在補充了10％胎牛血清，2mM L谷氨酰胺，50U/ml青霉素，50μg/ml鏈霉素、5×10-5M 2-巰基乙醇(完全RPMI培養基)的RPMI培養基中，進一步補充了20ng/ml重組的小鼠GM-CSF和100ng/ml重組的小鼠IL4(兩者均來自GENZYME公司，Cambridge，MA)。在第2天和第6天，非貼壁細胞被小心地移動，而且加入補充了10ng/ml小鼠GM-CSF和50ng小鼠IL4的新鮮的完全RPMI培養基。在第7天，該培養基被1ml補充了慢病毒載體的完全RPMI培養基所替代，慢病毒載體的濃度是每1×106個細胞600ng，300ng，150ng和150ng/p24。在第9天收集的、用適當的單克隆抗體評估的樹突細胞的純度超過95％(IAb+，HHD+，CD3-，33D1+，NDL145+，以及CD11c+)。然后在第9和12天用FACS測量鼠樹突細胞中的GFP表達的百分率和平均熒光強度。
載體免疫作用和體外再刺激和細胞溶解測定用慢病毒載體經腹膜內、靜脈內或皮下注射HHD小鼠12天。然后將致敏小鼠的脾細胞在完全RPMI培養基中分別用每個表位肽再刺激7天。最后兩天，培養的細胞被10％TCGF再刺激。在第7天，按已經描述過的方法(Pascolo，1997)在4小時51Cr釋放測定試驗中檢測培養細胞的細胞溶解活性，使用HHD-轉染的、負載了有關的或陰性對照(Inf.m.58)肽(10μg/ml，5×106個細胞/ml，在無胎牛血清的RPMI培養基中，室溫下2小時)的TAP-RMA-S細胞作為靶細胞。TRIP-mel-IRES-GFP轉導的或非轉導的HHD-轉染的HeLa細胞可以被當作平行靶細胞來使用。特異性溶解百分率依下列公式計算(實驗釋放-自發釋放)/(總釋放-自發釋放)×100。
實施例2編碼結核分枝桿菌DES基因的TRIP-des-IRES-GFP載體免疫后的HHD小鼠CTL反應的評價。
DES基因公開在WO 98/04711中。
實驗步驟第一步，用TRIP-des-IRES-GFP載體轉導HeLa-HDD細胞。轉導和通過有限稀釋法克隆這些細胞。表達較高水平的GFP的克隆被選擇出來用于在經典的51CrCTL試驗中充當靶細胞。
第二步，使用每只小鼠1.2micg/p24的TRIP-des-IRES-GFP載體顆粒腹膜內注射HDD小鼠。這些小鼠的脾細胞在注射后的12天在體外被0.2micg或1micg/p24/ml(2×106個細胞/ml)的載體顆粒刺激，或用被TRIP-des-IRES-GFP轉導的、1micg/p24/ml/2×106細胞/ml的LPS刺激同源母細胞刺激。在體外刺激6天之后，使用被des轉導的HeLa-HHD靶細胞在51Cr試驗中檢測細胞的細胞溶解能力。對照靶細胞是被黑素瘤多表位(TRIP-mel-IRES-GFP)轉導的HeLa-HDD細胞。
結果這些已經完成的實驗的目的是研究編碼整個基因的、HIV來源的三鏈體陽性載體是否能夠轉導細胞，以及誘導針對表達相同的基因的靶細胞的特異性CTL反應。正如圖9中所說明的那樣，在所有的情況下都獲得特異性溶解。被轉導的LPS母細胞誘導弱的CTL反應。使用1micg/p24/ml的載體顆粒獲得了最好的結果。這些結果表明全基因可以被導入宿主細胞的基因組中，而且它的產物被加工、提呈并誘導明顯的CTL反應。這些結果也表明des基因包含至少一個或多個HLA-A2.1限制的CTL表位肽。
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序列表<110>INSTITUT PASTEURCENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE<120>用于制備免疫原性組合物的載體<130>B4408_AD/CAL<140>NOT YET ASSIGNED<141>2000-10-10<150>99402492.5<151>1999-10-11<160>11<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(39)<223>引物<400>1tcagatctgc caccatggca ctaacagaag taataccac 39<210>2<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
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權利要求
1.包含重組載體的免疫原性組合物，該載體的特征在于它含有包含順式作用中心起始區(cPPT)和順式作用終止區(CTS)的多核苷酸，這些區域是逆轉錄病毒或逆轉錄病毒樣起源的，所說的載體除此之外還包含確定的核苷酸序列(轉基因或感興趣的序列)和逆轉錄病毒或逆轉錄病毒樣起源的逆轉錄、表達和殼體化的調節信號，其中該免疫原性組合物能夠誘導或刺激針對一個或幾個由載體中存在的轉基因序列編碼的表位的細胞介導的反應，例如CTL(細胞毒性T淋巴細胞)反應或CD4反應。
2.權利要求1的免疫原性組合物，其中所產生的CTL反應是記憶性CTL反應。
3.權利要求1的免疫原性組合物，其特征在于逆轉錄病毒來源的序列來自慢病毒基因組。
4.權利要求1到3中的任意一項的免疫原性組合物，其特征在于轉基因或感興趣的序列被包含在包括轉錄和表達的調節信號的表達盒中。
5.包含重組的逆轉錄病毒顆粒的免疫原性組合物，所述重組逆轉錄病毒顆粒包含1)包含確定的核苷酸序列(轉基因)的重組核苷酸序列，所述確定的核苷酸序列被置于轉錄和表達的調節信號以及逆轉錄、表達和殼體化的調節信號的控制下，和2)包含順式作用中心起始區(cPPT)和順式作用終止區(CTS)的多核苷酸，這些區域是逆轉錄病毒或逆轉錄病毒樣起源的，或來自轉座子，并被以相對于逆轉錄病毒或逆轉錄病毒樣起源的逆轉錄調節信號或轉座子調節信號有功能的方向和位置插入，其中該免疫原性組合物能夠誘導或刺激針對由載體中存在的轉基因序列編碼的一個或數個表位的細胞介導的反應，例如CTL(細胞毒性T淋巴細胞)反應或CD4反應。
6.包含重組逆轉錄病毒載體顆粒的免疫原性組合物，所述載體顆粒包含a)相應于慢病毒的核蛋白或功能性衍生多肽的gag多肽(GAG多肽)，b)由慢病毒的RT、PRO、IN蛋白或功能性衍生多肽構成的pol多肽(POL多肽)，c)包膜多肽或功能性衍生多肽(ENV多肽)，d)重組的核苷酸序列，其包含確定的核苷酸序列(轉基因或感興趣的序列)，該序列編碼一個或數個表位，被置于轉錄和表達的調節信號控制下；含有逆轉錄病毒或逆轉錄病毒樣起源的逆轉錄、表達和殼體化的調節信號的序列；以及包含順式作用中心起始區(cPPT)和順式作用終止區(CTS)的多核苷酸，這些區域是逆轉錄病毒或逆轉錄病毒樣起源的，并被以相對于前述的逆轉錄病毒或逆轉錄病毒樣起源的調節信號有功能的方向和位置插入，其中該免疫原性組合物能夠誘導或刺激針對由載體中存在的轉基因序列編碼的一個或數個表位的CTL(細胞毒性T淋巴細胞)反應。
7.免疫原性組合物，其中重組的逆轉錄病毒樣顆粒包含a)包含順式作用中心起始區(cPPT)和順式作用終止區(CTS)的多核苷酸，這些區域起源于反轉錄轉座子并被以相對于反轉錄轉座子調節信號有功能的方向插入，b)相應于反轉錄轉座子的核蛋白或功能性衍生多肽的多肽(GAG多肽)，c)相應于反轉錄轉座子的RT、PRO、IN蛋白或功能性衍生多肽的pol多肽(POL多肽)，d)病毒的包膜多肽，e)重組的核苷酸序列，其包含確定的核苷酸序列(轉基因或感興趣的序列)，該序列被置于轉錄和表達的調節信號以及反轉錄轉座子的逆轉錄、表達和殼體化的調節信號控制下，其中該免疫原性組合物能夠誘導或刺激針對由載體中存在的轉基因序列編碼的一個或數個表位的細胞介導的反應，例如CTL(細胞毒性T淋巴細胞)反應或CD4反應，其中該免疫原性組合物能夠誘導或刺激針對由轉基因序列編碼的一個或數個表位的細胞介導的反應CTL(細胞毒性T淋巴細胞)反應或CD4反應。
8.權利要求5到7中的任意一項的免疫原性組合物，其中所產生的CTL反應是記憶性CTL反應或CD4反應。
9.權利要求1到8中的任意一項的免疫原性組合物，其特征在于逆轉錄、表達和殼體化的調節信號是慢病毒起源的，并且含有cPPT和CTS區的多核苷酸也是慢病毒起源的。
10.權利要求1到9中的任意一項的免疫原性組合物，其特征在于在載體中的逆轉錄、表達和殼體化的調節信號和含有cPPT和CTS區的多核苷酸來自HIV型逆轉錄病毒，特別是HIV-1或HIV-2。
11.權利要求10的免疫原性組合物，其特征在于逆轉錄、表達和殼體化的調節信號和含有cPPT和CTS區的多核苷酸來自從慢病毒CAEV，EIAV，VISNA，HIV，SIV或FIV中選擇的病毒。
12.權利要求1到11中的任意一項的免疫原性組合物，其特征在于載體的多核苷酸是含有HIV-1逆轉錄病毒基因組的順式作用中心起始區(cPPT)和終止區域(CTS)的DNA序列。
13.權利要求5到12中的任意一項的免疫原性組合物，其特征在于載體顆粒的gag、pol和env序列來自HIV逆轉錄病毒，特別是HIV-1或HIV-2，的序列。
14.權利要求5到12中的任意一項的免疫原性組合物，其特征在于gag和pol序列來自HIV逆轉錄病毒的序列，而env序列來自不同的HIV逆轉錄病毒或病毒。
15.權利要求14的免疫原性組合物，其特征在于env序列編碼雙嗜性ENV多肽。
16.權利要求14的免疫原性組合物，其特征在于env序列編碼親嗜性ENV多肽。
17.權利要求14的免疫原性組合物，其特征在于env序列來自皰疹性口腔炎病毒(VSV)。
18.載體，其特征在于它是pTRIP.TEL/AML-IRES-EGFP質粒，于1999年10月11日按編號I-2326保藏在CNCM；或Ptrip.DES-IRES-GFP，于1999年10月11日按編號I-2331保藏在CNCM。
19.載體，其特征在于它是pTRIP.ILKE-IRES-GFP質粒，該質粒于1999年10月11日按編號I-2327保藏在CNCM。
20.與權利要求1到17中的任意一項的免疫原性組合物接觸過的重組細胞。
21.權利要求20的重組細胞，其是抗原提呈細胞，或是從肺細胞、腦細胞、上皮細胞、星形膠質細胞、小膠質細胞(mycroglia)、少突膠質細胞、神經元、肌細胞、肝細胞、樹突細胞、神經元細胞、骨髓細胞株、巨噬細胞、成纖維細胞、造血細胞中選擇的細胞。
22.權利要求1到17中的任意一項的免疫原性組合物或重組細胞，用于腫瘤或傳染病的治療性處理。
23.權利要求1到17中的任意一項的免疫原性組合物，其中包括在載體中的轉基因是表位，包含多表位的多肽，來自腫瘤細胞或感染性因子的蛋白質。
24.權利要求23的免疫原性組合物，其中所述表位、包含多表位的多肽或所述蛋白質來自于黑素瘤細胞。
25.權利要求1到17中的任意一項的組合物或權利要求1到17中的任意一項所定義的載體或載體顆粒，其中cPPT和CTS區域定位在載體序列的中心。
26.權利要求1到17中的任意一項的組合物或權利要求1到17中的任意一項所定義的載體或載體顆粒，其中轉基因被插入在逆轉錄調節信號的U3區中。
27.重組載體，其特征在于它含有包含順式作用中心起始區(cPPT)和順式作用終止區(CTS)的多核苷酸，這些區域是逆轉錄病毒或逆轉錄病毒樣起源的，所說的載體另外包含確定的核苷酸序列(轉基因或感興趣的序列)，該核苷酸序列是致病因子的基因序列；以及逆轉錄病毒或逆轉錄病毒樣起源的逆轉錄、表達和殼體化的調節信號，其中該免疫原性組合物能夠誘導或刺激針對由載體中存在的轉基因序列編碼的一個或數個表位的細胞介導的反應，例如CTL(細胞毒性T淋巴細胞)反應或CD4反應。
28.權利要求27的重組載體，其中感興趣的核苷酸序列或轉基因是編碼細菌例如分枝桿菌、特別是結核分枝桿菌的抗原的基因。
29.權利要求27的重組載體，其中感興趣的核苷酸序列或轉基因是編碼病毒或逆轉錄病毒的抗原的基因。
30.權利要求18或19的載體，其中TEL/AML或ILKE表位被全部或部分的致病因子基因，例如結核分枝桿菌的DES基因，所取代。
31.權利要求1到17中的任意一項的免疫原性組合物，其能夠誘導或刺激載體的基因組在靶細胞中的向核內輸入。
32.權利要求18或19或27到31之任意一項的載體在權利要求1到17之任意一項的免疫原性組合物中的用途。
33.包含cPPT和CTS區域的核苷酸序列的用途，該cPPT和CTS區域在反轉錄之后在慢病毒載體或反轉錄轉座子載體中采取三鏈DNA結構(DNA三鏈體)并且刺激載體DNA進入被轉導細胞的核的比率。
34.權利要求33的核苷酸序列在細胞或患者中誘導細胞反應的用途。
35.cPPT和CTS區域誘導的三鏈DNA序列，其能夠誘導高的載體DNA進核比率，或增加載體DNA向核內輸入的比率。
全文摘要
本發明涉及包含重組載體的免疫原性組合物，該載體的特點是含有包含順式作用中心起始區(cPPT)和順式作用終止區(CTS)的多核苷酸，這些區域是逆轉錄病毒或逆轉錄病毒樣起源的，所說的載體除此之外還包含確定的核苷酸序列(轉基因或感興趣的序列)和逆轉錄病毒或逆轉錄病毒樣起源的逆轉錄、表達和殼體化的調節信號，其中該免疫原性組合物能夠誘導或刺激針對一個或幾個由載體中的轉基因序列編碼的表位的細胞介導的反應，例如CTL(細胞毒性T淋巴細胞)反應或CD4反應。
文檔編號A61K39/00GK1840204SQ20061000456
公開日2006年10月4日 申請日期2000年10月10日 優先權日1999年10月11日
發明者P·查尼奧, H·菲拉特, V·贊諾 申請人:巴斯德研究所, 國家科研中心