專利名稱：：TGF-β1抑制性多肽在制備免疫反應調節劑上的用途的制作方法
技術領域：
：本發明屬于免疫反應調節劑的制備領域。
背景技術：
：TGF-/31(轉化生長因子/31)是強有力的免疫調節劑，其存在于免疫反應的各個時期，產生不同的作用。現已知其為強有力的免疫系統細胞調節劑，所述免疫系統細胞包括淋巴細胞、巨噬細胞和樹突細月包(LetterioJ丄，1998)。TGF-/31的生物學活性差別很大，其取決于細胞分化的類型和狀態，以及其他細胞因子的存在，這暗示該組細胞因子平衡的改變還能影響TGF-/31并有助于與免疫系統機能失調相關的病理的發展。以復雜的、環境依賴的方式調節免疫反應，這由通過使用不同疾病的實驗模型揭示，用于對關于TGF-/31表達、其受體或調節蛋白的遺傳修飾小鼠作出評價。TGF-01在體液、細胞毒素和免疫耐受應答的發展以及許多傳染性和自身免疫性疾病的病理起源中調節免疫系統細胞的功能和相互作用。在其發育的各個時期，T淋巴細胞明顯受TGF-/31調節(FontanaA.etal.，1992)。TGF-/31的作用依淋巴細胞的分化狀態和所接收的活化信號類型而各不相同。對人淋巴細胞TGF-/31作用的最初研究揭示其在產生和分泌TGF-(S1上的能力，所述TGF-01作為IL-2依賴的增殖和細胞溶解功能的抑制劑(PardouxC.etal.，1997)。樹突細胞是明顯分化的白細胞群，這歸因于其作為T淋巴細月包應答活化中的抗原提呈細胞的功能。它們是高度特化的細胞群，包括上皮朗格罕氏細胞和來自淋巴結的濾泡樹突細胞，并且其中TGF-/31調節其分化和活性兩者(StroblH，KnappW.，1999)。已鑒定，TGF-貝在體外增強自CD34+前體的樹突細胞的功能性分化，該功能性分化通過其他細胞因子(TNF-Q!、SCF和GM-CSF)的存在而誘導。TGF-^1還通過提高培養的樹突細胞的存活力而發揮作用。另一方面，TGF-/31在該細胞類型中的作用還似乎與調節機制有關，該調節機制抑制低特異性應答，以避免自身免疫性過程。在B細胞Ig(免疫球蛋白)的分化、增殖和產生中，TGF-/31通過對某些表面分子水平的抑制發揮調節作用，所述表面分子包括前B淋巴細胞和成熟B細胞兩者內的主要組織相容性復合體II型(MCH-II)。另一方面，TGF-iSl普遍抑制Ig分泌，但明顯地誘導IgA的產生，正因此它在與黏膜相關的免疫反應中發揮重要作用。對TGF-/31作為所有類型Ig產生的抑制劑的作用的大多數研究已在體外完成。然而，還描述了對淋巴細胞培養物中某些水平的TGF-]81的需求，所述TGF-j31以自分泌水平起作用，用于IgG和IgE的有效產生。因此，根據該免疫反應環境，TGF-i31在抗體^"導上的功能如同在許多其他過程中一才羊，是雙重而相反的(LebmanD.A.,EdmistonJ.S.，1999)。就巨噬細胞而言，組織水平的TGF-/31的作用通常是抑制性的，并且有助于結束炎性應答。TGF-/31對于巨噬細胞失活的最為相關的作用可能歸因于其限制IFN-7或LPS活化的細胞產生氧反應物和氮代謝中間物的能力。對活化的巨噬細胞的NO(—氧化氮)產生起作用的酶是一氧化氮合酶(iNOS)酶的可誘導形式。不同的細胞因子包括TGF-/31對該酶活性的調節一般允許免疫反應的調節，特別是巨噬細胞對微生物和腫瘤細胞的應答的調節的。TGF-]81抑制該iNOS酶，在轉錄水平降低mRNA水平并抑制蛋白活性。TGF-/31還通過使巨噬細胞失活和控制外周血單核細胞而抑制氧反應物中間物的產生和氧化細胞毒性(AshcroftG.S.,1999)。另外，描述了由不同微生物的感染所產生的許多疾病中TGF-/31的活化或產生，以及其信號轉導通路的改變，所述微生物包括利什曼原蟲、克氏錐蟲、人免疫缺陷病毒、丙型肝炎病毒。最接近本發明的
背景技術：
的文件是專利ES2146552和專利申請ES200302020。第一份文件涉及與生物體中其受體結合的TGF-/31的拮抗劑肽的應用，其特征在于它具有與TGF-/51和/或其受體的氨基酸序列相似或相同的部分氨基酸序列；以及其在制備用于肝臟疾病(特別是肝纖維化)的組合物上的應用。這篇文件保護肽pl44(SEQIDNO:l)及其上述用途，但是它沒有提及其在制備免疫反應調節劑上的用途，該用途構成本發明的目的。專利申請ES200302020保護抑制TGF-/31生物學活性的肽及其在疾病治療上的用途，所述肽產自噬菌體文庫，所述疾病在進展時具有TGF-/31的去調節表達，特別是纖維化改變。這篇文件保護公開的肽p17(SEQIDNO:2)及其用途，但是它仍然沒有涉及其在制備免疫調節劑上的用途。該免疫系統調節作用非常重要，因為它根據需要，允許刺激或抑制免疫反應的不同方面，并且它甚至可以具有作為疫苗接種佐劑的應用。另一相關文件是專利申請WO2005/059133A2，該申請涉及藥物組合物，其包括至少一種免疫細胞功能刺激物和至少一種抑制細胞增殖和/或誘導細胞死亡的物質。TGF-i31的拮抗劑用作免疫系統功能的刺激物，其選自與編碼TGF-j81、TGF-iSl抑制性蛋白和肽的mRNA或DNA雜交的寡核苷酸，所述TGF-j31抑制性蛋白和肽分子量小于100kD并抑制TGF-]S1。另外，這份文件涉及所述藥物組合物在肺瘤治療方面的用途。盡管如此，這份文件未使用作為TGF-/31抑制劑的任何肽，而使用寡核苷酸，雖然能推斷出具有這些特征的肽會基本上具有類似的作用。需要相當多的實驗過程才能肯定這點。以下顯示本申請引用的參考文獻列表AshcroftGS.(1999).BidirectionalregulationofmacrophagefunctionbyTGF-beta(TGF-/3對巨噬細胞功能的雙向調節).MicrobesInfect.Dec;l(15):1275-82.FontanaA，ConstamDB,FreiK,MalipieroU,PfisterHW.Modulationoftheimmuneresponsebytransforminggrowthfactorbeta(轉化生長因子]3對免疫反應的調節).(1992)IntArchAllergyImmunol.;99(1):1-7.Lai，M.Z.,Ross,D.T.，Guillet，J.G.，Briner,T.G，Gefter，M丄.，Smith,J.A.(1987).Tlymphocyteresponsetobacteriophagelambdarepressorclprotein(對噬菌體X阻遏物cl蛋白的T淋巴細胞應答).Recognitionofthesamepeptidepresentbylamoleculesofdifferenthaplotypes(對由不同單元型Ia分子提呈的相同肽的識別).J.Immunol139，3973-80.Letterio，J,J.,Roberts,A.B.(1998).RegulationofimmuneresponsesbyTGF-beta(TGF-j8對免疫反應的調節).AnnuRevImmunol16，137-761.LebmanDA,EdmistonJS.(1999).TheroleofTGF畫betaingrowth,differentiationandmaturationofBlymphocytes(TGF-i8在B淋巴細月包生長、分化和成熟中的作用).MicrobesInfect.Dec;l(15):1297-304.Pardoux,C.,Ma，X.,Gobert,S.,Pellegrini,S,，Mayeux,P"Gay,F.，Trinchieri,G"Chouaib,S.(1999》Downregulationofinterleukin-12(IL-12)responsivenessinhumanTcellsbytransforminggrowthfactor-beta:relationshipwithIL-12signaling(轉化生長因子/對人T細胞白介素-12(IL-12)應答性的下調與IL-12信號轉導的關系).Blood93,1488-55.Schini,V.B.,Durante,W"Elizondo，E.,Scott-Burden，T.，Junquero,D,C.,Schafer，A.I.,Vanhouette，P.M.(1992).TheinductionofnitricoxidesynthaseactivityisprohibitedbyTGF-beta1，PDGFABandPDGFBBinvascularsmoothmusclecells(—氧化氮合酶活性的謙導受血管平滑月幾細胞內TGF-iSl、PDGFAB和PDGFBB的抑制).EurJPharmacol216,379-83.StroblH，KnappW.(1999).TGF-betalregulationofdendriticcells(樹突細胞的TGF-/S1調節).Microbesinfect.Dec;1(15):1283-90.TeicherB.A.(2001》Malignantcells,directorsofthemalignantprocess:Roleoftransforming:Roleoftransforminggrowthfactor-beta(惡、性細胞、惡性過程的指標轉化的作用轉化生長因子0的作用).CancerandMetastasisReviews20,133-143.
發明內容為便于本文的理解，指出術語"肽pl44"指抑制TGF-/31的肽，其特征在于其氨基酸序列對應SEQIDNO:l定義的序列。同樣的，術語"肽pl7"指抑制TGF-jSl活性的肽，其特征在于其氨基酸序列對應SEQIDNO:2定義的序列。"弗氏不完全佐劑"指本領域技術人員公知的組合物，其特征在于它由油包水的乳劑組成，其作為佐劑延遲抗原釋放。本發明涉及免疫反應調節劑，其特征在于它包括抑制TGF-j81的肽，所述肽選自序列對應SEQIDNO:l的肽pl44、序列對應SEQIDNO:2的肽p17、與上述具有至少90%同源性的肽，或者以上的片l史。在本發明的特別實施方案中，抑制TGF-i81的肽的所述片段選自序列SEQIDNO:3定義的片段pl7(l-11)、對應SEQIDNO:4的片段pl7(l-ll)am以及序列SEQIDNO:5定義的片4殳Acpl7(l-ll)am。另一方面，本發明還涉及所述調節劑在調節體液或細胞免疫反應或兩者上的應用。在優選實施方案中，本發明涉及該調節劑作為疫苗接種佐劑的應用。在本發明的具體實施方案中，該免疫反應調節劑的特征在于它還包括弗氏不完全佐劑。在優選實施方案中，本發明涉及所述調節劑在制備用于病理治療的藥物組合物上的應用，所述病理選自與誘導由TGF-/31介導的免疫抑制的樣吏生物相關的病理和與癌癥相關的病理。優選地，所述孩i生4勿選自利4十曼原、蟲(丄g/sAmfl"z'fl)、克氏4,蟲(7>7/^"asomflcn/zz〕、人免疫缺陷病毒、流感病毒和單純皰滲病毒。同樣的，在本發明的具體實施方案中，上述組合物用于癌癥治療，所述癌癥選自乳腺癌、前列腺癌、結腸癌、胰腺癌、皮膚癌、肝癌、多發性骨髓瘤和胃癌。本發明涉及抑制TGF-/31的肽在制備免疫反應調節劑上的應用，所述肽選自其序列對應SEQIDNO:1的肽pl44、其序列對應SEQIDNO:2的肽p17、與其具有至少90%同源性的肽，或者以上的片段。此外，本發明涉及使用抑制TGF-j31的肽制備免疫反應調節劑的方法，所述肽選自序列對應SEQIDNO:1的肽pl44、序列對應SEQIDNO:2的肽p17、與上述具有至少90%同源性的肽，或者以上的片段。另外，本發明涉及獲自肽pl7的抑制TGF-/31的肽的片段的應用，所述片段選自序列SEQIDNO:3定義的片段pl7(l-ll)、對應SEQIDNO:4的片段pl7(l-ll)am以及序列SEQIDNO:5定義的片,殳Acpl7(l-ll)am。為l更于本文的理解，指出肽pl7(l-ll)am對應與肽p17的氨基酸1至11對應的片段，其中位點11的氨基酸(色氨酸)已酰胺化；Acpl7(l-ll)am對應還具有位點1的氨基酸(賴氨酸)酰胺化的前述片段。本發明還涉及與所述肽具有至少70%同源性的肽，并且優選;l也，與所述肽具有至少80%同源性的肽，條件是它們保有抑制TGF-jSl生物學活性的能力。以及保有抑制TGF-/31生物學活性的能力的以上的任何片段。在優選實施方案中，本發明涉及抑制TGF-/31的前述肽的應用，其特征在于前述調節劑調節體液或細胞免疫反應或兩者。在本發明的具體實施方案中，所述調節劑對免疫反應有刺激作用，優選地作為疫苗接種佐劑。另一方面，本發明的優選實施方案的特征在于所述調節劑對免疫反應具有抑制作用。另外，本發明涉及編碼抑制TGF-(31的肽的DNA序列在制備免疫反應調節劑上的應用，所述肽選自序列對應SEQIDNO:l的肽pl44、序列對應SEQIDNO:2的肽p17、與上述具有至少90%同源性的肽，或者以上的片段。本發明還涉及重組表達系統在制備免疫反應調節劑上的應用，所述重組表達系統編碼肽p144、肽pl7、與其具有至少90%同源性的肽，或者以上的片段。在本發明的優選實施方案中，所述免疫反應調節劑的作用選自免疫反應刺激物和抑制劑。另一方面，本發明涉及其序列對應SEQIDNO:l的抑制TGF-|31的肽、與其具有至少90%同源性的肽或者以上之一的片段，在制備用于病理治療的組合物上的應用，所述病理選自與誘導由TGF-i81介導的免疫抑制的樣么生物相關的病理和與癌癥相關的病理。在本發明的一個具體實施方案中，所述微生物選自利什曼原蟲、克氏錐蟲、人免疫缺陷病毒、流感病毒和單純皰滲病毒。本發明的具體實施方案的特征在于所述組合物會作用于對建立的腫瘤的免疫反應的誘導，從而抑制與各種類型腫瘤中TGF-/31的產生和/或活化相關的免疫抑制劑作用(TeicherB.A.,2001),所述腫瘤為乳腺癌、前列腺癌、結腸癌、胰腺癌、皮膚癌、肝癌、多發性骨髓瘤和胃癌。本發明的該調節劑客體可用于各種各樣的哺乳動物，包括嚙齒類和靈長類。并且，在優選實施方案中，用于人類。附圖簡述圖1.在使用pl44(實心條)或使用抗體中和TGF-(81(空心條)溫育后樹突細胞成熟期間，不同標志物表達的抑制。所述細胞表面標志物表達通過流式細胞儀測量。圖2.向BALB/c小鼠進行p144和/或RAd-IL12給藥，第0、3及6天時，所述給藥對血清IFN-7水平的作用。腹腔給藥1()Spfu的小鼠RAd-IL12(空心條)或RAdIL-12和pl44(實心條)。圖3.小鼠RAd-IL12的108pfu給藥后第0和第6天，血清NO水平(/aM)，所述給藥通過腹腔途徑，同時使用pl44(實心條)或不使用pl44(空心條)。圖4.在存在或不存在p144下，使用RAdLacZinact皮下免疫(FIA中)后第15天，BALB/c小鼠內對誘導的RAdLacZ的體液應答。圖5.在存在或不存在p144下，使用RAdLacZinact第二次皮下免疫(FIA中)后第15天，BALB/c小鼠內對誘導的RAdLacZ的體液應答。圖6.通過靜脈途徑使用4x108pfu的RAdLacZact進行感染后第7天時，圖5所述小鼠內誘導的體液應答。對照組對應使用4><108pfu的RAdLacZact靜脈給藥僅一次的小鼠。圖7.靜脈給藥4x108pfu的RAdLacZact7天后，來自圖6所述小鼠的肝臟樣品組織學切片的X-gal染色。圖8.使用FIS的免疫混合物的p144包含物對淋巴細胞培養物上清液內IL-2(A)和IFN-7(B)水平的作用，所述淋巴細胞培養物源自僅用FIS或用FIS+pl44免疫的小鼠的淋巴結。在使用6/aM(空心條)或30/iM(實心條)的FIS或p144的培養物再刺激后，體外測量細胞因子的產生。圖9.通過靜脈途徑給藥5x105CT26細胞并接受不同的處理(i)-(iv)的BALB/c小鼠的存活率。除僅在第10天接受5x105CT26細胞的對照組之外，余下的三組還在第0天使用FIA中的50/ig的AH1通過皮下途徑在第0天免疫。組(iii)和組(iv)還通過腹腔途徑分別在第4-20和第10-20天期間每兩天接受50/xg的p144。圖10.向小鼠NK細胞培養基添加TGF-iSl阻斷肽pl7，抑制其對高IL-2濃度應答時的增殖。在所有情況下，比較使用和不使用肽p17時以完全相同的方式建立的"自然殺傷，，淋巴細胞。A)標示倍數下來自RAG一小鼠的總脾細胞培養物的細胞計數。所示值對應每種情況下，以絕對數對2x3.5cm直徑孔計數的平均值。B)標示倍數下DX5+細胞培養物的計數，所述細胞培養物^f茲力地純化自RAG一小鼠脾細胞，其缺少T淋巴細胞和B淋巴細胞，所述計數以每種情況下2x0.4cm直徑孔計數的平均值表示。C)微量培養細胞的增殖，其與B表示的相似，并且在相同倍數下，在6小時的測定中以氣標記的胸苷摻入測量之。圖11.肽pl7降低小鼠NK細胞內膜上活化標志物CD25和CD69的表達水平。直方圖表示流式細胞術測定的細胞內這些標志物的表達水平，所述細胞使用和不使用肽培養，并使用IL-2活化。每一標志物的平均熒光強度(MFI)標示在每一直方圖內。圖12.肽pl7增加小鼠NK細胞對各種使用IL-2活化的腫瘤林系的細胞毒性。圖示表示細胞4朱系的裂解百分比，所述細胞株系對NK的細胞毒性具有不同的敏感性。使用或不使用肽培養持續6天維持效應細胞，并且在鉻釋^:測定時間期間，所述效應細胞作用于靶細胞，其以效應淋巴細胞和把細胞的相應比例示出。圖13.圖示按照每孔存在的樹突細胞的量，以氚標記胸苷的摻入jLig/ml)，經測量的細胞增殖。在混合的白細胞應答(MLR)測定中，肽pl7增加非刺激或使用LPS或pIC刺激的CD的淋巴細胞增殖。圖14.CD25群對脾細胞的增殖產生抑制劑作用，所述脾細胞由抗CD3抗體活化(0.5j^l/孔)(菱形)，CD25-(正方形)細胞不能產生該作用，從而相對于不存在增殖性刺激物時脾細胞的基礎增殖(三角形)，允許細胞增殖。圖15.與調節性T細胞和活化的小鼠脾細胞共培養的抑制TGF-j3的肽(由p17截斷并修飾)抑制調節性T細胞所施加的對細胞增殖的抑制劑作用。可以觀察到肽pl7(l-ll)am和Acpl7(l-ll)am對調節性T淋巴細胞的抑制性作用產生的劑量依賴的作用。所施加的抑制是劑量依賴的，在50jiiM濃度下，pl7(l-ll)am能夠抑制20%的抑制劑作用，在25jLtM濃度下，pl7(l-ll)am抑制128%,而Acpl7(l-ll)am抑制148%。圖16.在第6和第10天之間通過腹腔途徑給藥(50/ig/小鼠/48小時)的抑制TGF-j3的肽、pl44和pl7(l-ll)am延遲動物內腫瘤生長，所述腫瘤生長來自第0天50,000CT26細胞的皮下接種，所述動物在第0天的10天前使用AH1免疫。發明實施方案以下，使用說明性特征顯示本發明的一些功能性實施例，并且顯示絕非以限制其范圍的方式進行。實施例1本實施例研究系統內肽pl44的作用，其中外源TGF-/31用作脾細胞群向樹突細胞分化的誘導劑。樹突細胞的分離和培養在處死8周齡雄性C57小鼠之后，在無菌條件下提取其脾，并且在具有干凈培養基的板上將其同質化以產生細胞懸浮液。1000rpm下離心該細胞5分鐘，并且使用1ml/脾的ACK裂解溶液(0.15MNH4C1,lmMKHC03，0.1MEDTA鈉鹽溶液，pH7.2-7.4)于37°C下重懸所得細胞沉淀物l分鐘。下一步，離心所述細胞并使用10ml的冷R10培養基(RPMI-1640,10%FBS，谷氨酰胺，2x10-5M2-巰基乙醇)清洗該細胞，以再次離心并清洗。最后，將該細胞重懸于50ml的R10培養基。準備6孔板(Costar弁3471),使用每孔1ml的R10培養基于室溫下處理它們15分鐘，以區分脾細月包和樹突細月包[RIO+10ng/ml的小鼠GM國CSF(Peprotec,ECLTD，London,UK)+1ng/ml的TGF國j81(RDSystems,Minneapolis,USA)]。下一步，向每孔添力卩2ml的所述細胞懸浮液并且于37。C和5。/。C02下溫育。在最初幾周期間，更換培養基兩次，其通過去除lml上清液和添加11111樹突細胞的新鮮培養基(1110+GM-CSF+TGF-/31)。兩周后，分離該培養基。向所述板每孔添加1ml的無酶BPS(GIBCOBRL)的解離培養基，并且于37。C下溫育該培養基，隨后將其移除并添加2ml的微溫培養基(RIO+GM-CSF+TGF-/31)。下一步，用移液管緩慢吸取該細胞，并且于1000rpm下離心所吸取的細胞，并且將其重懸于新鮮培養基(RIO+GM-CSF+TGF-Z51)。如此獲得的細胞可通過于板上接種而再擴增，重復最初過程。樹突細胞的處理72小時內，對源自脾細胞的18天樹突細胞培養物進行以下處理。對照組使用具有0.25%DMSO的樹突細胞的培養基(GM-CSF+TGF-j31)處理細胞。抗(TGF-j31)抗體使用具有0.25%DMSO的樹突細胞的培養基(GM-CSF+TGF-(31)處理細胞，以20ptg/ml的濃度向其添加抗(TGF-j3)中和抗體(Pharmingen)。肽pl44:使用樹突細胞的培養基(GM-CSF+TGF-01)處理細胞，在具有DMSO的溶液中向其添加肽p144，其中25。/。DMSO下最終肽溶液為50jiig/ml。48小時后，更新對應于每一處理的培養基，并且在處理結束時，在使用解離培養基(GIBCOBRL)處理之后，通過移液器吸取收集所述細胞。通過流式細胞儀進行的表面標志物分析4吏用流式細月包4義(FACScalibur,Becton-Dickinson,SanJose,CA,USA)進行表面標志物的測定，所述表面標志物來自使用不同處理培養的脾細胞。使用每孔2ml鹽水溶液清洗該細胞，并且隨后添加1ml于無酶PBS中的解離培養基(GIBCOBRL)，并且于37。C下溫育10分鐘。隨后移除該培養基并添加2ml的PBS。使用移液管緩慢吹打細胞，并且以1000rpm離心所吹打的細胞以2xl()6纟田胞/ml的濃度重懸于PBS中。使用于管形瓶中的1/il與FITC偶聯(lmg/ml)的小鼠抗CD80、抗CDllc和抗MHCI單克隆抗體(Becton-Dickinson,Pharmingen)溫育100jtd/孔的所得細胞懸浮液，所述溫育在96孔板上于4°C及黑暗下進行，持續30分鐘。隨后，使用PBS清洗該細胞3次，其通過以1500rpm離心(Centrifuge581OR,eppendorf)該板5分鐘，從而去除上清液并重懸所述細胞于100jLtl的PBS。作為陰性對照，使用與FITC(Becton-Dickinson,Pharmingen)偶聯的非反應性單克隆抗體。在體外的脾細胞成熟期間，培養基內某些因子和細胞因子的存在可能使細胞分化為不同的白細胞表型。在這種情況下，將TGF-/31描述為體外的必要因子，以致于某些細胞類型在表面表達與樹突細胞相關的標志物。我們研究存在p144的樹突細胞的溫育在72小時期間對這些細胞的標志物的作用時，觀察到pl44對MHCI、CDllc和CD80表達的負作用。該作用與在抗(TGF-)81)抗體存在下溫育所述細胞時產生的作用具有相同的意義和類似的強度。的確，如圖l可以觀察到的，通過使用pl44或抗(TGF-j31)抗體的處理，以相似的方式降低與每一標志物相關的熒光水平。該結果揭示TGF-(31在樹突細胞成熟中的重要細胞應答兩者的誘導具有重要作用。實施例2用于小鼠IL-12的重組腺病毒的體內活性本實施例研究體內系統內肽pl44的作用，其中TGF-/31作為本模型內誘導的細胞因子的假定拮抗劑起作用。通過該重組腺病毒內包含的轉基因的表達產生的小鼠IL-12通過包括IFN-7和一氧化氮的級聯因子的誘導而誘導炎性狀態。TGF-/31已描述為IL-12、IFN-7和NO的產生和生物學作用的抑制劑(PardouxC.etal.，1999;SchiniV.B.etal.,1992)。在本模型中，向3只BALB/c小鼠的組通過腹腔給藥溶于500jLd含鹽血清的1x1()Spfu的小鼠RAdlL-12,所述小鼠4至8周大(Harlan),4安以下組分配動物RadlL-12:所述動物在第0天接受1x108pfu的小鼠RAdIL-12。RadIL-12+pl44:所述動物接受與前組相同的處理，但是持續5天向它們給予肽，在所述腺病毒的給藥之后，以每日100j[ig含有0.66%DMSO的PS的劑量給藥。在為隨后血清內IFN-7和NO水平的定量而進行的免疫后，在第6天和第9天從兩組提取血液樣品。IFN-7水平的測量按照廠商提供的說明，通過商業ELISA(MouseIFN-7DuosetELISADevelopmentSystem,Genzyme,CambridgeandOPTEIAMouseIFN畫7Ser,Pharmingen,SanDiego,USA)測量IFN-7的量。將結果表示為pg/ml的IFN-7，并且使用已知量的IFN-7的標準曲線。一氧化氮水平的測量NO產生水平的測量視為對血清內亞硝酸鹽和硝酸鹽水平的間接測量。通過使用SieversNOA280—氧化氮檢測儀的化學發光試驗進行該測量，其按照廠商推薦的方法(SieversInstrumentsInc.1996)。根據所使用的NO還原過程，所用技術允許測量硝酸鹽或硝酸鹽+亞硝酸鹽。樣品中存在的亞硝酸鹽通過與溶于冰醋酸的350mMNal的溫育而纟皮還原為NO,按照下列反應r+N02-+2『---------+NO+%I2+H20在亞硝酸鹽和硝酸鹽的測量中，其通過在90。C下與溶于1NHC1的50mMVC13而還原為NO按照下列反應2N(V+3f+2H20——2NO+3V02+4H+還原為NO發生在檢測儀的槽里。此前兩種反應的任一種得到的NO通過真空泵被轉運至該檢測儀。在;f企測儀里，在NO和臭氧之間產生化學發光反應NO+03---------------+02+N02*------------—-》N02+h*NO/發射光是在光諳的紅色和紅外區域，并由紅色敏感的光電倍增器管檢測。對該信號進行定量，并且由計算機收集并處理所得數據。使用表達小鼠IL-12的重組腺病毒(RAd)對小鼠的給藥產生級聯應答，其中突出的是IFN-7和NO血清水平的顯著提高。因為IFN-7和NO誘導過程受TGF-j81水平的影響(SchiniV.B.etal.，1992),我們還研究pl44的給藥對所述水平的作用。圖2和圖3分別標示小鼠血清內和NO的水平，所述小鼠已被給予1x108pfU劑量的使用或不使用pl44的小鼠IL-12重組腺病毒(RAdIL-12)。圖2顯示肽pl44與RAdIL-12的一同給藥相對于僅給予RAdIL-12后達到的誘導的IFN-7水平，提高了該水平。圖3顯示使用或不使用pl44的RAdIL-12給藥對NO血清水平的作用。RAdIL-12和p144的聯合給藥相對于僅給予RAdIL-12產生的NO，在第6天產生更高水平的NO。基于TGF-/31向IL-12的調節、表達和活性施加的作用以及該細胞因子所活化的過程，可以解釋p144對促炎細胞因子的該誘導模型的作用。事實上，已描述TGF-/31向IL-12和IFN-7的表達和活性施加拮抗作用。因此，如果pl44中和TGF-/31,那么它去除該細胞因子對IL-12和IFN-7表達和活性的拮抗作用，并且它們因此提高IFN-7的血清水平(圖2)。大體上，在本模型中，TGF-i81通過既檢查IL-12的表達，又(以伴隨形式)檢查TGF-/31的表達而發揮作用。結果，p144對TGF-/31的抑制具有提高IFN-7表達的作用。至于p144對NO增加的作用，我們相信其解釋還可基于p144對TGF-j31的抑制。事實上，由于TGF-(31抑制負責NO產生的iNOS酶的表達和活化，因此可在邏輯上得出結論如果該細胞因子被去除，NO水平會有提高的趨勢，正如圖3所示在第6天觀察到的。由于IFN-7誘導iNOS的表達和活性，圖2和3的結果是一致的，因為在第6天觀察到p144的給藥分別有助于IFN-7和NO水平的提高。實施例3抗體誘導為分析肽p144對體液應答的免疫調節作用，使用6至8周齡的雌性BALB/c小鼠(Harlan,Barcelona)。對于特異性抗體的誘導，接種于100°C水浴加熱10分鐘滅活的重組腺病毒(RAd-LacZ)。動物組和處理通過200^tl的腹腔混合物免疫每組的三只小鼠，所述200pl的腹腔混合物包含1xl08pfU的滅活的RAd-LacZ腺病毒、生理血清(PS)或具有50pg的肽pl44，所有均如表M4標示，以l:l體積比于弗氏完全佐劑(FCA)中乳化。首次免疫后第30天，使用相同但于弗氏不完全佐劑(FIA)中乳化的混合物再次免疫動物。在第15天和第45天從眶后叢(retroorbitalplexus)取血液樣品，以定量每一動物產生的抗腺病毒抗體。為研究在^f吏用p144處理的小鼠內抗原不耐性的可能的誘導，在第一次注射后第50天，使用于100piRPMI-1640的4xl08pfU的活化RAd-LacZ靜脈接種小鼠，所述小鼠包括小鼠新組(對照iv)，其僅接受靜脈劑量的活化LacZ腺病毒。7天后取所有組的血液樣品。下一步，處死所述動物，以包括OCT⑧的肝臟樣品(Tissue-Tek⑧，SAKURA，荷蘭)來隨后對肝內LacZ表達進行評估。表l具有熱滅活腺病毒的不同組免疫混合物的組成組RAd-LacZP144FCA/FIAPS<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>血清內抗RAdLacZ抗體的定量通過使用Maxisorp平底96孔板(Nunc,Roskilde,丹麥)的ELISA試驗，進行血清內抗RAd-LacZ抗體的檢測，其基于使用2,2，-連氮基-雙-3-乙基苯并二氫瘞唑啉-6-磺酸(ABTS)作為顯影劑的抗生蛋白鏈菌素-生物素系統。使用每孔50pl的下述溶液在4。C下過夜溫育所述板，所述溶液是以101(}pfii/ml溶于10ml0.1MNa2CO3(pH=10.5^々75pl的RAd-LacZ。下一步，使用每孔200pl的PBST清洗緩沖液(具有0.1%吐溫20的pH=6的磷酸鹽緩沖液)進行3次清洗。通過將所述壽反于室溫下與每孔400|il的具有1%奶粉的PBST(PLT)溫育1小時，阻斷非特異性結合。騰空所述板并使用PBST進行三次清洗。在100pi的PLT中添加4pl血清，得到8種雙份系列溶液，并且將所述板在37。C下于培養箱中溫育1小時。使用PBST將其清洗三次，并且使用每孔50nl的溶于PBST的1/1000的下述稀釋液將其在37°C下溫育1小時，即所述稀釋液是獲得自山羊(Amersham)的生物素化小鼠抗IgG抗體的稀釋液。使用PBST將其清洗三次，并且每孔添加50|il的抗生蛋白鏈菌素-過氧化物酶(Amersham)的1/500溶液。在1小時的溫育之后，使用PBST進行三次清洗，并且隨后對該板進行顯影。ABTS用作顯影反應底物，該底物在存在過氧化氫和過氧化物酶下著綠色。使用10ml的0.6%醋酸(11=4.6)、7.5pl的33%H202(v/v)以及100jil的40mMABTS制備溶液。每孔添加100并且1小時后，用MultiskanPlusMKIIreader(Labsystem,Helsinki,芬蘭)在405nm下讀取所述板。轉基因表達的原位染色(X-gal染色)室溫干燥包含在用于最適切割溫度化合物(OCT)的化合物內的來自肝臟樣品制備物的低溫恒溫器切片(6pm)。下一步，使用0.5%的戊二醛(glutaldehyde)將其固定IO分鐘，每制備物添加200pl。下一步，在PBS中進行3次清洗，以便隨后添加200pi的染色混合物溶于PBS的30mMK3Fe(CN)6、30mMIQFe(CN)6、20ng/mlX-Gal和MgCl2。37。C下將該制備物溫育12小時，此后，在PBS中進行3次清洗，并且，一旦干燥，將制備物封片。將某些重組病毒用作基因治療工具有下述缺陷由于抗病毒抗體的誘導使它們用不了幾次。的確，如果不止一次給予病毒，其作用會顯著下降(或完全喪失)，這是出于這樣的事實最初給藥誘導的抗體能夠中和在隨后處理中所給藥的病毒。因為這個原因，我們決定研究pl44在抗重組病毒抗體誘導的過程中所起的作用。本實驗背后的基本想法是要研究pl44對TGF-j81的中和是否可以抑制抗體誘導，或著甚至誘導對連續給藥的腺病毒的免疫耐受。因此，在第一次實驗中，我們使用熱滅活的用于LacZ的重組腺病毒(RAdLacZinact)免疫小鼠。在存在或不存在p144下進行該免疫。如圖4所示，通過ELISA檢測，該第一次免疫對于抗RAdLacZ產物的產生沒有可定量的作用。但是，在第二次免疫后觀察到非常不同的作用(圖5)。因此，使用通過p144的存在而滅活的RAdLacZ的第二次免疫誘導高效價的抗RAdLacZ抗體。但是，由于p144包括在免疫混合物內，抗RAdLacZ抗體效價明顯低于僅使用滅活的RAdLacZ所獲得的效價。在這些結果之后，決定研究使用p144處理的小鼠是否可能已發生對滅活腺病毒形式的抗原的一定程度的耐受。為進行這一研究，通過靜脈途徑，在第20天(在第二次免疫之后)，在缺少肽p144的情況下，使用活化的LacZ腺病毒(RAdLacZact)接種前述小鼠組。7天后，轉基因的表達在體內表達，并且對血清內抗體的存在以及肝臟內LacZ的表達兩者進行定量。如從圖6可觀察到的，兩組小鼠的該抗體效價大致相等，說明未產生耐受，并且僅當p144包括在具有抗原(本例中為熱滅活的腺病毒)的免疫混合物內，它才能夠抑制體液免疫。圖6所示的對第7天小鼠肝臟的組織學分析顯示，僅有使用RAdLacZact靜脈感染的對照組為LacZ染色陽性，這暗示在其他組中，血清內抗腺病毒抗體的存在足以中和該RAdLacZact病毒的給藥，從而阻礙肝臟內的感染及隨后的LacZ基因的表達(圖7)。實施例4本實施例研究免疫混合物內與肽(FIS)共同存在的肽p144的作用，其作為T輔助細胞決定簇發揮作用。該肽誘導有利于針對不同抗原的抗體產生的細胞因子譜。T輔助細胞應答的誘導FIS肽被表征為源自抹香鯨肌紅蛋白(氛基酸(106-118))的T輔助細胞決定簇。該肽已廣泛用于抗半抗原肽抗體的誘導。我們想要分析肽p144對細胞因子語的誘導的作用，所述細胞因子譜的誘導尤其由IFN-7和IL-12的增加來表征。在本模型中，通過靜脈途徑向4到8周齡的3只雌性BALB/c小鼠(Harlan,Barcelona)的組進行下述的給藥，在下列處理中分FIS:通過靜脈途徑接受由弗氏不完全佐劑和包含50pgFIS的鹽水血清構成的1:1乳劑的小鼠。FIS+pl44:通過靜脈途徑接受由弗氏不完全佐劑和包含50pgFIS和50|igpl44的鹽水血清構成的1:1乳劑的小鼠。免疫后第10天，處死所述動物，并提取胭窩、腹股溝和主動脈周圍的淋巴結。使用注射器同質化該淋巴結，并且使用清洗培養基(清潔的RPMI1640培養基)于4。C下清洗該淋巴結三次。下一步，將所述細^^以5.3x106細胞/ml的濃度重懸于完全培養基(具有10%FBS、2mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100ing/ml鏈霉素、5xl(T5M的/5巰基乙醇、25mM的Hepes和丙酮酸鈉的RPMI1640)，向平底96孔板的每一孔添加150pl。以每孔100的量添加三份的不同肽濃度(6和10^M)。37。C和5%C02下于培養箱中上培養細胞兩天。24小時后，于該96孔板上收集50pl的上清液，以測量所述細胞產生的IL-2，并且在48小時后，收集50pl的上清液，以測量IFN々。-20。C下冷凍該上清液直至進行細胞因子濃度的定量。測量IFN々水平按照廠商提供的說明，通過商業ELISA(MouseIFN-yDuosetELISADevelopmentSystem,Genzyme,CambridgeandOPTEIAMouseIFN-7Set,Pharmingen,SanDiego,USA)測量的量。將結果表示為pg/ml的IFN-7，并且使用已知量的IFN-7的標準曲線。測量IL-2水平通過研究CTL丄細胞系的增殖，測量每一上清液內IL-2的量，所述細胞系的生長具有IL-2依賴性(LaiM.etal.，1987)。使用添加濃度為10U/ml的IL-2的完全培養基維持培養物內的該細胞系。為實施該試驗，使用每孔3000-5000CTL丄細胞培養上清液，將其稀釋至終體積100pl。在培養24小時后，每孔添加0.5pCi(25Ci/mmol)的氣標記的胸苷(Amersham),并且20小時后，使用過濾器(Unifilter-96GF/C:PerkinElmer)和收集器(Filtermate196Harvester,Packard)于板上收集該細胞。在每孔添加25pi閃爍液(MICROSCINT氣Packard,BioscienceCompany)之后,在閃爍i十數器(TopCount,MicroplateScintillationCounter,Packard)中定量放射性。將計數的結果表示為mU/ml的IL-2，在標準曲線內插每孔的讀數。FIS肽是T輔助細胞決定簇，其包括抹香鯨肌紅蛋白序列的殘基106至118。使用FIS對BALB/c小鼠的免疫誘導IFN-7和IL-2的活化，產生應答該肽的T淋巴細胞。由于TGF-Z31在免疫反應的誘導上起作用，因而研究在使用FIS對小鼠免疫之后，存在和不存在pl44時，pl44對細胞因子產生的作用。為進行這一研究，單獨使用50嗎的FIS，或者在存在50pg的p144下使用50pg的FIS免疫BALB/c小鼠。如可從圖8觀察到的，免疫混合物內肽pl44的存在相對于FIS,減少IL-2和IFN-7產生。重要的是指出p144還很可能由II類MHC分子從BALB/c小鼠作為DTh提呈，因為在體外針對pl44再刺激時，觀察到IL-2產生，并且還觀察到IFN-7的產生。該結果暗示免疫混合物內包含p144對DTh"輔助細胞"的能力具有負作用，這很可能是因為TGF-/31的中和，而這種中和在免疫反應誘導時會是必需的。實施例5A.肽p144對具有腫瘤抗原DTc(AHl)和DTh(LQV)的免疫混合物的作用DTc是由提呈細胞表面的MHC-II提呈的肽，并且DTc是由提呈細胞表面的MHC-I提呈的肽，并且存在于肺瘤細胞。已知DTc(AHl肽)和DTh(LVQ肽)的聯合免疫能夠對抗500,000CT26腫瘤細胞的皮下生長而起到保護作用，所述兩種肽都來自CT26細月包表達的腫瘤抗原gp70蛋白。由于TGF-01在免疫反應誘導過程中很重要，因而我們想研究肽p144對負責對抗CT26細胞生長的保護的應答誘導的作用。如表1所示，使用弗氏不完全佐劑的下列混合物免疫三組BALB/c小鼠(i)使用AH1LVQ，(ii)使用AHl+LVQ+pl44以及(iii)僅使用弗氏不完全佐劑。觀察到唯有使用AH1+LVQ的免疫成功保護小鼠，并且因此，在免疫混合物內摻入p144對針對CT26細胞生長的保護具有負作用。表2p144與AH1+LVQ的一同給藥，對在使用AH1+LVQ的BALB/c小鼠的免疫之后達到的對抗CT26細胞生長的保護具有負作用<table>complextableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>由于肽p144能夠阻斷TGF-j81活性，因此所得結果暗示該細胞因子在有效抗腫瘤應答的誘導上起關鍵作用，并且其在該階段的阻斷對保護性抗腫瘤應答具有負作用。該結果與此前另一結果(圖8)—致，其中它顯示pi44與DThFIS的一同給藥怎樣阻斷對FIS的Th應答的活化。B.在肺部轉移模型中，使用DTc(AHl)免疫后肽p144的作用據推測，一旦已誘導免疫反應，TGF-/31的中和便可對其發展具有有益效果。為證明該觀點，在不同時間和不同免疫方法下，研究pl44的給藥對肺部轉移模型中小鼠存活的作用，所述模型通過經靜脈途徑的5x105CT26細胞的給藥來誘導。以往經驗已知僅使用DTcAH1的免疫在CT26細胞的靜脈給藥之后，產生腫瘤外觀的某種延遲。基于這一理由，在存活實驗中，在使用AH1免疫之后，于不同時間下比較p144的包含。因而，組(i)的動物僅接受CT26細胞的給藥，使用于FIA(弗氏不完全佐劑)中的50/igAHl通過皮下途徑在第0天免疫動物組(ii)、(iii)和(iv)，并且隨后在第10天通過靜脈途徑向其進行5x105CT26細胞的給藥。組(iii)還在第4天到第20天之間，每隔一天通過腹腔途徑接受溶于500/xlPS(生理血清)的50/igp144。組(iv)與組(iii)一樣，僅在第10天到第20天之間，每間隔一天通過腹腔途徑接受溶于500/xlPS的50/igp144。如從圖9觀察到的，使用AH1的免疫(ii)相對于未免疫的對照組(i)僅介導死亡率的輕微延遲。在使用AH1免疫的動物中，使用p144的處理增強存活作用，尤其在組(iv)中，其中在第10天到第20天之間進行p144的給藥。C.在皮下腫瘤模型中，使用DTc(AHl)的免疫之后p144肽的作用下一步，研究p144對腫瘤進展模型的作用，該模型的攻擊性弱于CT26的靜脈給藥。在該新才莫型中，在第0天使用50/xgAH1免疫小鼠，并且IO天后，通過皮下途徑向其進行5x1()SCT26細胞的給藥。此外，在第10-30天之間每隔一天通過腹腔途徑使用50/Ag的pl44處理另外兩組小鼠(組2和3),其目的在于測試阻斷TGF-/31對抗CT26腫瘤細胞的保護的作用。表3在使用AH1的免疫后，p144的給藥對抗具有AH1的BALB/c小鼠內CT26細胞生長的保護具有正向作用<table>complextableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>如表3所能觀察到的，在使用AH1免疫10天后，TGF-(31的阻斷產生抗肺瘤生長的保護，所述腫瘤生長在腫瘤細胞的皮下給藥后第50天測量。該保護達到40%的動物。假設抗腫瘤細胞生長的保護的有效性因TGF-jSl的中和而提高，那么它將非常有趣并且是為獲得更好的抗腫瘤應答而可以采用的一種策略。實施例6NK細胞的調節材料與方法NK細胞培養從來自RAG1一小鼠的脾細胞進行NK細胞培養，所述脾細胞不帶有T和B淋巴細胞。在一些情況下，以4x106細胞/mlRPMI培養基在6孔板上培養總脾細胞，所述RPMI培養基的富集使用10%SBF、L-谷氨酰胺、抗生素、非必需氨基酸、j8巰基乙醇和600IU/ml的人重組白介素-2(Chiron)。在一半孔內，以150/xg/ml的濃度添加肽p17。48小時后，移除該培養基并且使用RPMI培養基清洗所述孔以棄取非附著的細胞。下一步，使用/不使用肽添加新鮮培養基。在不早于第5天，再次更換培養基，這一次替代相應培養物內的所有細胞和肽p17。在該培養的不早于第5天和不早于第6天，進行使用臺盼藍的細胞計數。在其它情況下，按照廠商的說明，使用MiniMACS系統、抗DX5珠和MS柱(MiltenyiBiotech),通過免疫石茲性選擇純化來自小鼠脾細胞的NK細胞。因此獲得的細胞以1.5x10Vml在具有/不具有150jng/ml肽pl7的前述培養基中于48孔板上培養。48小時后，向具有pl7的細胞添加新肽，并且在不早于第2天和不早于第4天進行計數。流式細胞計量使用下列PE標記的大鼠抗小鼠單克隆抗體抗CD25、抗CD69和同位素對照抗體，所述抗體均來自Pharmingen(BD)。4吏用FACScalibur和CellQuest程序進行樣品的獲取和分析。使用氚標記胸苷的增殖試驗對于該試驗，在培養的第2和第4天使用DX5+細胞。簡單說，使用和不使用肽進行三份10000細胞/孔的鋪板，測量在添加胸苷6小時后具有6000IU/mlIL-2的典型培養基內氚標記胸苷的4參入進4亍。鉻釋放試驗通過標準4.5小時"Cr釋放試驗驗證NK細胞的細胞毒性。簡單說，經2小時使用50Mg51Cr的Ci溫育耙細胞，清洗它們(3次)并且，下一步，按不同比例(最大40:1(效應細胞:把細胞))添加效應細胞。最后，在4.5小時后在TopCount閃爍計數器(PerkinElmer)中測量NK細胞造成的裂解所導致的51Cr的釋》文。以釋;^文的Cr相對于細胞獲得的總量的百分比測量細胞毒性。細胞系下列腫瘤系用作細胞毒性試驗中NK細胞的靶細胞源自C57BL/6和CT26小鼠(結腸癌)的MC38(結腸癌)和LLC(肺癌)，以及來自BALB/c小鼠的RENCA(腎癌)。使用添加胎兒牛血清、抗生素和L-谷氨酰胺的RPMI培養LLC和RENCA，并且使用以同樣方式添加的DMEM培養MC38和RENCA。結果在通過直接細胞計數或DNA合成(氚標記胸苷的摻入)的增殖定量試驗中，肽p17對獲得自RAG1一小鼠并在體外培養的NK細胞群施加明顯的抗增殖作用(圖10)。在分析pl7對細胞表面不同標志物表達的作用時，發現p17降低以平均熒光強度測量的CD25和CD69水平(圖11)。CD25和CD69標志物介導免疫抑制，并且兩者都由TGF-/31誘導。因此，在免疫系統的該細胞群中，肽pl7通過阻斷TGF-iSl的作用，作用于所述標志物的誘導(CD25和CD69)。另一方面，由于細胞毒性試驗以該細胞群對抗不同小鼠腫瘤系(圖12)，因而肽pl7的存在或多或少提高該自然殺傷細胞群的細胞毒活性。在所有實驗模型中，得出的結論是肽p17對NK細胞的增殖、分化和效應時期施加明顯的生物學活性。實施例7樹突細胞的調節才才泮牛和方法取自小鼠骨髄的樹突細胞(DC)的獲得首先，于水上分離腿并將其置于具有10。/。RPMIFBS的板上。為獲得骨髓，必需從股骨切下股骨頭，并且使培養基穿過骨的內部，以將骨髓拖至具有10%RPMIFBS的培養皿。下一步，借助注射器打碎骨髓，并且在Falcon管內收集內容物，將該管以2000rpm離心5分鐘；離心后，移除上清液，并使用ACK裂解緩沖液溶解紅細胞。一旦裂解細胞，便進行非目的細胞群的清除；為進行這步，使用商業抗體和與兔補體結合的產自腹水的抗體。以2x107個細胞/1111的細胞濃度進行所述清除，添力口下列混合物100ptg/ml的腹水抗CD4100/xg/ml的腹水抗CD81/20稀釋液中的B220上清液(抗B淋巴細胞)10/xl/mlGR1(抗粒細胞)1/20稀釋液中的補體37°C下溫育該混合物50分鐘，約每15-20分鐘攪拌。該時間過去后，使用干凈RPMI培養基進行清洗，并且定量所獲得的細胞數量。最后，將細胞接種在12孔板上，其終濃度為1x107細胞/1111(3ml/孑L)和20Mg/ml的IL-4和GM-CSF細胞因子。在接種后第3天和第5天，從每一種細胞移除2ml，使用新鮮培養基及對應于該體積的細胞因子濃度替代所述細胞。在收集CD的第6天，將其定量并置于12孔板上，其終濃度為1x1(f/ml(3ml/孑L)和20/ig/ml的IL-4和GM-CSF細月包因子，并且進行下列處-無刺激物-無pl7-有pl7(150]iig/ml)-無pl7國有pl7(150jug/ml)-無pl7-有pl7(150/ig/ml)-無pl7-有pl7(150jng/ml)-無pl7-有pl7(150Mg/ml)-LPS(10/xg/ml)-多聚(I:C)(100/ig/ml)國1668(1jiiM)-3TC畫CG40LLPS:脂多糖Poly(I:C):合成雙鏈RNA(聚肌胞苷酸)1668:寡脫氧核苷酸(ODN)37TC-CD40L:產生CD40配體的細胞系在不同刺激物的存在下，留存所述細胞48小時；這段時間過后，收集所述細胞并定量，其目的在于進行混合的白細胞應答試驗，該試驗由同種異基因反應組成，其中屬于測定的林系的非附著的小鼠脾細胞與小鼠的另一種不同細胞林系的樹突細胞相對抗。本試驗的目的在于研究所述CD的提呈能力，所述CD因屬于小鼠的不同細月&朱系而表現不同的HLA限制性，所述HLA限制性由使其增殖的其它小鼠的淋巴細胞識別。通過氣標記胸苷的摻入測定增殖程度。該參數指明該CD提呈抗原的效率。在這種情況下，自BALB/c小鼠獲得非附著細胞，并且自C57小鼠獲得樹突細胞。此外，使用不同刺激物溫育所述細胞以觀察p17在該環境的作用。在混合的白細胞應答試驗(MLR)中，肽p17能夠增加淋巴細胞的增殖，這是所述細胞提呈抗原效率提高的結果。非刺激或使用LPS或pIC刺激的樹突細胞產生肽p17的所述作用(圖13)。但是，其它刺激結果勻、于犰/眾拔主雙平的差異，以及因此導致的增殖性淋巴細胞應答的差異。所述結果揭示抑制TGF-/31的肽在抗原提呈細胞(CD)的刺激和抗原提呈效率上的潛力。實施例8調節性T淋巴細胞的調節作用材料和方法1.總脾細胞的獲得為從6周齡的雌性Balb-c小鼠獲得脾細胞，處死4只動物，并且在提取脾后，將其轉移至干凈的培養基以利用石英分散，過濾勻漿(70微米過濾器)并且將其轉移至50ml管，以便隨后對其清洗和離心。所得細胞在裂解緩沖液中溫育1分鐘，以便清除紅細胞，并且隨后使用干凈的培養基清洗它們。最終，將所得細胞重懸于1mlAUTOMACS培養基，并對其計數。2.CD25+、淋巴細胞的純化通過使用CD25PE標記的》茲性柱進行CD25+淋巴細胞的純化，并且在溫育后，添加抗PE磁性微球劑(藻紅蛋白)。溫育、清洗和過濾(30微米過濾器)后，使所述樣品通過磁性柱，從而通過重力獲得包含CD25群的洗脫液。一旦從》茲場提取到該柱，便在壓力下清洗它，從而獲得CD25+細胞。3.抑制劑活性試驗為驗證CD25+群的調節性質，在U形底96孔板上每孔接種共IOO，OOO脾細胞，其體積為每孔200/d,并且僅用抗CD3抗體(0.5jtd/孔)或相對的CD25+或CD25-，；故置每孔25,000細胞(CD25+)或每孔50,000細胞(CD25-)，從而實現對所述細胞濃度的雙重稀釋。4.肽對抑制劑作用的抑制試驗在具有200/il體積/孔的U底96孔板上，每孔接種100,000脾細胞和抗CD3抗體(0.5]Ld/孔)以及每孔25,000CD25+淋巴細胞。向所述混合物添加肽(3柱/肽，于第一排5(H敬M，并在隨后三排雙重稀釋)。分析3種肽P17(l-11)SEQIDNO:3，P17(l-ll)amSEQIDNO:4和AcP17(l-ll)amSEQIDNO:5。該試-瞼以及抑制劑活性試-瞼都在37。C下溫育48小時，以0.5uCi/孔添加氣標記胸苷，并且8小時后將其收集，隨后計數每孔細胞發出的CPM。5.Treg有效分離的驗證使用熒光抗CD4和抗CD25抗體標記，并通過流式細胞計量分析(89%的磁性分離群是CD4+CD25+)。結果所選擇的CD25+是具有調節活性的T淋巴細胞圖14顯示了在存在適當的刺激物(抗CD3)和不存在調節細胞的情況下，脾細胞群的增殖。CD25+淋巴細胞的存在產生對總脾細胞增殖的完全抑制。TGF/5的抑制性肽能夠阻斷調節性T淋巴細胞(CD25+)的抑制活性基于圖14所述的建立的模型，源自肽pl7的肽能夠劑量依賴地阻斷CD25+淋巴細胞群的抗增殖作用。在50jiiM濃度下，肽AcP17(l-ll)Am和P17(l-l)am能夠完全抑制調節性T淋巴細胞的作用(圖15)。實施例8對肺瘤生長的作用材料和方法組4組，每組7只6周齡的雌性balb-c小鼠AH1十FIAs.c.(皮下)AHl+FIAs,c.+p144(50/igi.p.(腹腔)/次/小鼠)AHl+FIAs.c.+pl7(l畫11)(50ggi.p./次/小鼠)設計AHl+FIA:第10天；肽從不晚于第6天起每隔一天，直至第10天腫瘤模型量從第10天到第41天，每三天。使用CT26在第0天攻擊(500000細胞/小鼠于脅腹皮下給予)。結果使用肽處理的組的平均腫瘤體積的減小研究腫瘤進展模型內，肽p144和pl7(l-ll)Am的作用。在本模型中，在5xl05CT26細胞的給藥10天前，使用50pgAH1免疫小鼠。為驗證阻斷TGF-/31對抗CT腫瘤細胞的保護的作用，在第6到第10天之間每隔一天(50/ig/小鼠/48小時)使用肽p144和pl7(l-ll)Am通過腹腔途徑處理另外兩組小鼠。所述肽能夠產生抗腫瘤生長的保護，所述肺瘤生長在肺瘤細胞的皮下給予后第42天測量。在pl44的情況下，該保護達到100%的動物(圖16)。由于抗腫瘤細胞生長的保護的有效性因TGF-/31的中和而4是高，因而重申所述多肽在以改進抗腫瘤治療為目的而采用的策略上所具有的極大益處和可能的發展。權利要求1.免疫反應調節劑，其特征在于包括抑制TGF-β1的肽，所述肽選自序列對應SEQIDNO1的肽p144、序列對應SEQIDNO2的肽p17、與上述具有至少90％同源性的肽，或者以上的片段。2.如權利要求1所述的免疫反應調節劑，其特征在于包括抑制TGF-/31的肽的片段，所述肽的片段選自序列SEQIDNO:3定義的片段pl7(l-11)、對應SEQIDNO:4的片段pl7(l-ll)am以及序列SEQIDNO:5定義的片段Acpl7(l-1l)am。兩者的調節上的用途。3.<image>imageseeoriginaldocumentpage2</image>4.如權利要求3所述的調節劑作為疫苗接種佐劑的用途。5.如權利要求3所述的調節劑在制備用于病理治療的藥物組合物上的用途，所述病理選自與誘導由TGF-j31介導的免疫抑制的孩i生物相關的病理和與癌癥相關的病理。6.如權利要求5所述的免疫反應調節劑的用途，其特征在于，所述孩史生4勿選自利"f十曼原蟲(丄"'5^nfl"zVz)、克氏4,蟲(r/j;7fl"aswwflcn^z()、人免疫缺陷病毒、流感病毒和單純皰滲病毒。7.如權利要求5所述的調節劑的用途，其特征在于，所述組合物用于癌癥治療，所述癌癥選自乳腺癌、前列腺癌、結腸癌、胰腺癌、皮膚癌、肝癌、多發性骨髓瘤和胃癌。8.抑制TGF-/31的肽在制備免疫反應調節劑上的用途，所述肽選自序列對應SEQIDNO:l的肽pl44、序列對應SEQIDNO:2的肽p17、與上述具有至少90%同源性的肽，或者以上的片段。9.如權利要求8所述的抑制TGF-(31的肽的片段的用途，所述肽的片段選自序列SEQIDNO:3定義的片段pl7(l-11)、對應SEQIDNO:4的片段pl7(l-ll)am以及序列SEQIDNO:5定義的片Acpl7(l-ll)am。10.如權利要求8或9所述的抑制TGF-/51的肽的用途，其特征在于，所述調節劑調節體液或細胞免疫反應或調節兩者。11.如權利要求8至10中任何一項所述的抑制TGF-i81的肽的用途，其特征在于，所述調節劑對免疫反應具有刺激作用。12.如權利要求8至11中任何一項所述的抑制TGF-/31的肽作為疫苗接種佐劑的用途。13.如權利要求8至10中任何一項所述的抑制TGF-/31的肽的用途，其特征在于，所述調節劑對免疫反應具有抑制作用。14.編碼抑制TGF-iSl的肽的DNA序列在制備免疫反應調節劑上的用途，所述肽選自序列對應SEQIDNO:l的肽p144、序列對應SEQIDNO:2的肽pl7、與上述具有至少90%同源性的肽，或者以上的片段。15.編碼抑制TGF-/31的肽的重組表達系統在制備免疫反應調節劑上的用途，所述肽選自序列對應SEQIDNO:l的肽pl44、序列對應SEQIDNO:2的肽pl7、與上述具有至少90%同源性的肽，或者以上的片段。16.如權利要求14所述的DNA序列或者如權利要求15所述的重組表達系統的用途，其特征在于，所述免疫反應調節劑具有選自下述的作用免疫反應的刺激劑和抑制劑。17.序列對應SEQIDNO:l、SEQIDNO:2的抑制TGF-/31的肽、與其具有至少90%同源性的肽，或者以上之一的片段在制備用于病理治療的組合物上的用途，所述病理選自與誘導由TGF-/51介導的免疫抑制的^f效生物相關的病理和與癌癥相關的病理。18.如權利要求17所述的抑制TGF-/31的肽的用途，其特征在于，所述孩《生物選自利什曼原蟲(丄e^/zm朋/fl)、克氏錐蟲(T)y/fl"osomacn^')、人免疫缺陷病毒、流感病毒和單純皰滲病毒。19.如權利要求17所述的抑制TGF-/51的肽的用途，其特征在于，所述組合物用于癌癥治療，所述癌癥選自乳腺癌、前列腺癌、結腸癌、胰腺癌、皮膚癌、肝癌、多發性骨髓瘤和胃癌。全文摘要本發明涉及抑制TGF-β1的肽在制備免疫反應調節劑上的用途，所述肽選自序列對應于SEQIDNO1的肽p144、序列對應于SEQIDNO2的肽p17、與上述具有至少90％同源性的肽，或者以上的片段。文檔編號A61P37/00GK101340927SQ200580052342公開日2009年1月7日申請日期2005年10月24日優先權日2005年10月24日發明者哈維爾·多托爾德拉斯埃雷里亞斯,帕布魯·薩羅韋烏加里薩,弗朗西斯科·博拉斯奎斯塔,胡安·何塞·拉薩爾特薩加斯蒂韋爾薩,諾利埃·卡撒瑞斯阿加,赫蘇斯·普列托巴爾圖埃納,露西婭·吉爾格雷羅申請人:西瑪生物醫學信息公司