專利名稱:用干擾素治療肺病的方法
技術領域:
本發明涉及用干擾素氣霧劑治療肺病的方法,用于氣霧劑輸送的一種 或多種干擾素制劑以及確定氣霧劑沉積的方法。
背景
根據現行NAEPP/NIH指南,哮喘治療的主要方式仍然是抗炎劑,其 中皮質類固醇是最有效的。但是,長期施用皮質類固醇會引起全身性的副 作用。而且, 一些哮喘病患者對皮質類固醇有抗性。因此,需要針對過敏 性氣道疾病中炎性反應的新藥劑。
哮喘的免疫機理包括記憶性CD4+T輔助細胞的極化參與,以及分泌 二型(Th2)細胞因子(白介素(IL) -4, IL-5)的細胞的不平衡性。細胞 因子干擾素-y (IFN-y)是幼稚(naive) CD4+淋巴細胞分化成Thl表型所 必需的。
哮喘中的氣道炎癥特征為嗜曙紅細胞和激活的CD4+ T細胞數目增 多。哮喘涉及記憶性CD4+ T輔助細胞的極化參與和分泌Th2型細胞因子 的細胞相對于那些分泌Thl型細胞因子的細胞的不平衡性。 一些細胞因子 的產生增加以及組織嗜曙紅細胞增多和IgE產生增加,所述細胞因子包括 2型細胞因子IL-4和IL-5、腫瘤壞死因子(TNF)-a和粒細胞-巨噬細胞集落 刺激因子(GM-CSF)。大部分氣道炎癥的細胞因子譜(profile)研究來 自小鼠哮喘模型。動物通常用卵清蛋白的抗原致敏并攻擊后,發現產生抗 原特異性IgE、氣道嗜曙紅細胞增多和針對氣霧劑抗原刺激的氣道高反應
性。這些變化與Th2細胞因子增多和IFN-y產生減少相關(Brusselle ef a/., 爿m Ce〃編編,1995 Mar; 12(3):254-259)。
Th2細胞因子IL4在氣道炎癥中扮演重要角色,它可促進由B細胞到 IgE合成的同種型轉換并誘導幼稚T細胞分化成Th2淋巴細胞。IL-4敲除 小鼠經氣霧劑抗原攻擊后在氣道中不能產生特異性IgE、氣道高反應性、 氣道嗜曙紅細胞增多或Th2細胞因子(Brusselle "/.,」w Ji ay/^ CW/ Mo/ 所o/, 1995 Mar; 12(3):254-259)。在最初暴露于抗原而非在攻擊過程中用抗 IL-4處理的野生型小鼠會抑制IL-5的產生和氣道嗜曙紅細胞增多,而在抗 原攻擊過程中施用抗IL-4則不會抑制嗜曙紅細胞增多,這表明IL-4對誘 導局部Th2反應是必需的(Coyle " a/., JAe5pzy Ce〃 JWo/說o/ 1995 Jul; 13(1):54國59)。
IL-10是由Thl和Th2淋巴細胞、單核細胞和巨噬細胞、肥大細胞、 角質形成細胞和嗜曙紅細胞產生的細胞因子。IL-10通過下調不同細胞特 別是單核細胞的促炎性細胞因子的合成而作為抗炎性細胞因子發揮作用。 IL-10通過功能性抑制抗原呈遞細胞(APC)來下調IL-5的產生(Pretolani et al, Res Immunol 1997 Jan)。 IL-10對嗜曙紅細胞功能的直接效果也己被 證實。低濃度的IL-10在降低嗜曙紅細胞的CD4表達和加速細胞死亡方面 幾乎和皮質類固醇的活性一樣。GM-CSF是一種直接參與發炎組織中嗜曙 紅細胞和中性粒細胞的歸巢和激活的細胞因子。已經注意到在哮喘患者中 與正常對照相比,由PBMC產生的IL-10和肺泡巨噬細胞水平減少(Borish, L W a/,, / w C7/" 7m附,/ 1996 Jun; 97(6): 1288-1296; Koning a/" Cyoh"e 1997 Jun; 9(6):427-436)。在兩個過敏性炎癥小鼠模型中,滴注IL-10 可保護致敏的小鼠使其不發生氣道嗜曙紅細胞增多和中性白細胞增多, 可能是通過抑制IL-5和TNF-a實現(Zuany-Amorim W / C7/" /"veW 1996:2644-2651; Zuany-Amorim a/" //附mwwo/ 1996 Jul 1; 157(1):377-84)。
與細胞因子產生的Th2/Thl 二分法一致,在哮喘鼠模型中觀察到IL-4 和IL-5占主導的細胞因子譜和低水平的Thl細胞因子IFN-y和IL-12 (Ohkawara "/.,爿w Ji es; /r Ce// Afo/說o/1997 May; 16(5):510-20)。近期有
動物研究著眼于以重組鼠IL-12進行治療,試圖扭轉Th2的優勢。體外數 據表明,在T淋巴細胞的初次抗原刺激中,IL-12的存在會促進Thl細胞 的發育(Kips a/., Jm J A&^^ Owe MW 1996 Feb; 153(2):535-9)。 Kips 在體內實驗中確認了這一點在免疫時施用IL-12,防止了產生特異性
IgE、氣道嗜曙紅細胞增多和氣道高反應性。雖然在氣霧劑攻擊已經致敏 的小鼠的過程中施用IL-12可防止氣道嗜曙紅細胞增多和氣道高反應性, 但不能降低特異性IgE的產生,表明IL-12刺激幼稚Th細胞向Thl細胞分 化,并且能夠抑制Th2細胞的發育。以IL-12抑制抗原誘導的氣道嗜曙紅 細胞增多在致敏初期是IFN-Y依賴性的,但在再次攻擊時變成IFN-Y非依 賴性的(Brussdle " a/,,」m Ji e^^ Ce〃 Mo/ B/o/ 1997 Dec; 17(6):767-71)。 并且,在用氣源性致敏原攻擊前,將肺中的IL-12基因用痘苗病毒載體通 過粘膜基因轉移到致敏的小鼠中,被證實可導致以IFN-y依賴性方式抑制 IL-4和IL-5、氣道高反應性和氣道嗜曙紅細胞增多(Hogan " a/., - £wr /mmw"o/ 1998 Feb.; 28(2):413畫23)。
增加的IFN-Y水平可推動免疫反應轉向Thl表型并且可能對哮喘有 益。人類臨床相關性聚焦在血清或刺激后的PBMC中的細胞因子水平。大 多數利用受激的PBMC所作的細胞因子的測定是在兒童中進行的。這些研 究證實哮喘癥兒童具有IL-4和IL-5產生增多和IFN-y產生減少的傾向。 此外,其它人證實特應性和/或過敏嚴重程度和IFN-Y釋放之間成逆相關 (Imada a/"(1995) /mw 畫Zogy 85(3): 373-80; Corrigan " a/"(1990)爿w 及ev及&s/ ^ 141 (4)Pt 1: 970-7; Leonard " a/. , (1997)力w /及as"/7/r Ce〃 Afo/ 5/o/ 17(3): 368-75; Kang & a/"(1997) J/"fe /eraw Cyo&"e及as 17(8): 481-7)。哮喘病患者BAL液中的細胞因子水平顯示出低水平的IFN-y (Kang a/., (1997)J/"fer/eraw Cytoh'we及ay 17(8): 481-7)。
人的rIFN-Y的臨床試驗非常少。到1999年,IFN-y被指明可用于治療 慢性肉芽腫性疾病,其中長期治療(平均持續2.5年)可改善皮膚損傷, 具有最小程度的副反應(發燒,腹瀉,流感類似癥狀)(W五wg/JMW324 (8):509陽16; Bemiller " a/. (1995) B/ood Ce〃s M / Ifc 21(3): 239-47; Weening Wa/., (1995)五^/尸eoT/arr 154(4): 295-8)。 Boguniewicz用漸強劑量的氣霧 劑化rlFN,(最大劑量500 mcg,總實驗劑量2400 mcg)治療5個輕度特 應性哮喘患者,用藥超過20天(Boguniewicz " a/., (1995) /力/ergv C7/w //wmmo/95(l)Ptl: 133-5)。所有病人耐受霧狀r IFN-y,但是在包含峰流量 的所測終點沒有顯著變化。
我們向5個具有持續性抗酸桿菌(AFB)涂片及培養陽性多藥抗藥性 結核病(TB)患者施用霧狀rlFN隱y(CondosWa/., (1997)丄a"cef 349(9064): 1513-5)。病人接受氣霧劑r IFN個500 mcg, 一周3次,共4周(總試驗 劑量6000 mcg)。治療很好的實現了耐受,副反應極少。4周結束時,5 個病人中的4個呈現痰AFB涂片陰性并且到達陽性培養的時間增加,表 明治療后機體負荷減少。有趣的是,在這些報道的和其它的病人中,治療 后1小時后進行的PEFR改善了 6% (n=10)。
特發性間質性肺炎按照組織學被分為七類。這包括普通的間質性肺炎 (UIP),非特異性間質性肺炎(NSIP),彌漫性肺泡損傷(DAD),機化性肺炎 (OP),脫屑性間質性肺炎(DIP),呼吸性細支氣管炎(RB),和淋巴細胞間質 性肺炎(LIP)。參見,例如Nicholson,歷Wo; a^o/ogv, 2002, 41, 381-391; White, J尸aAo/ 2003, 201, 343-354。
術語"特發性肺纖維變性(IPF)"同義于"隱原性纖維性肺泡炎(CFA)", 是一個臨床術語,指特發性間質性肺炎的一個主要亞組,它描述了一種疾 病,其特征為特發性進行性間質性疾病,呼吸困難出現之后平均存活時間 為3-6年。特發性肺纖維變性的診斷是通過鑒定肺組織活檢樣本上的普通 間質性肺炎(UIP)進行的。組織學模式的特征為不均勻性,包括斑隙性慢 性發炎(肺泡炎),進行性損傷(增殖性肌纖維母細胞和成纖維細胞的小 聚集物,術語稱為纖維形成病灶)以及纖維化(密集的膠原和蜂窩狀改 變)(^i ,伊y》〃,King " a/" 2000,爿w / o/^asp. am/ CV"/ca/ O^e Med" 164, 1025-1032)。對間質性肺炎另一個亞組的治療不能表明可以成功治愈 特發性間質性纖維化。
皮質類固醇和細胞毒素劑是治療的主要方式,只有10-30%的患者表 現出初始瞬時反應,表明需要長期治療(Mapd e"/. (1996) C/zeW 110:1058-1067; Raghu ef a/. (1991)爿w. Z ev. i es;^. 144:291-296)。由于特發性肺
纖維變性的預后很差,需要新的治療方法。
干擾素是由免疫系統細胞產生的天然蛋白質家族。已經鑒定出3類干 擾素,a、 &和y。每類有不同的效應,雖然他們的活性有重疊。總起來 說,干擾素指導免疫系統攻擊病毒、細菌、腫瘤和其它可能入侵身體的外 源物質。 一旦干擾素檢測到并攻擊外源物質,會通過減速、阻斷或者改變 其生長或功能來改變它。
干擾素-Y是多效性細胞因子,具有特異性免疫調節作用,例如激活巨 噬細胞、加強氧自由基的釋放、殺死微生物、加強MHCII類分子的表 達、抗病毒作用、誘導可誘導一氧化氮合酶基因及NO的釋^[、募集和激 活免疫效應細胞的趨化因子、下調轉鐵蛋白受體以限制微生物對鐵的獲取 (細胞內病原存活所需)等。缺乏干擾素-y或其受體的基因工程化小鼠對 分枝桿菌感染極其易感。
重組IFN-Y在1980年代通過肌內和皮下途徑施用于正常的志愿者和 癌癥患者。有單核細胞的激活的證據,例如氧化劑釋放。Jaffe等人報道了 向20個正常的志愿者施用rIFNy (參J , Jaffe ef a/" / C7/" /"veM 88, 297-302 (1991》。首先,他們通過皮下施用rIFN-Y 250|ng,觀察到在4小時出現 血清水平峰值,24小時出現最小值。
幾個臨床試驗受到資助以研究IFN-Y對傳染性疾病的作用。MDR-TB 臨床試驗,題目為"A Phase II/III Study of the Safty and Efficacy of Inhaled Aerosolized Recombinant Interferon-y 1 b in Patients with Pulmonary Multiple Drug Resistant Tuberculosis (MDR-TB) Who have Failed an Appropriate Three Month Treatment",在不同i也區(Cape Town、 Port Elizabeth、 Durban、 Mexico)招募了 80個MDR-TB患者,隨機接受氣霧劑rIFN-y (500嗎 MWF)或安慰劑,在第二線治療以外至少6個月。這個臨床試驗提前被結 束了,因為痰涂片、MA培養或胸X光片變化都缺乏有效性。
Ziesche等向9/18個特發性肺纖維變性(IPF)患者皮下給予rlFN-p劑 量為200 mg, 一周三次,同時口服強的松。參見Ziesche " a/., (1999) tv.
MW., 341, 1264-1269)。接下來發表了以干擾素y-lb治療IPF的3 期臨床試驗的結果。雖然這是第一個具有足夠量樣本容量的EPF臨床試
驗,是隨機的、預期的、雙盲的、安慰劑-對照研究,但沒有發現對生理 功能標記物例如最大肺活量有顯著作用。但是,安慰劑組發生了較多死 亡,接受干擾素,lb治療的一個亞組的病人其存活率顯著改善,而且最大
肺活量值是正常預測值的55%或更高,對一氧化碳的肺擴散容量值是正常 預測值的35%或更高。那個研究中疾病進展和存活率不相符的原因有待探 討。 一個可能性是當其使IPF患者的臨床過程復雜化時,干擾素Y-lb治療 改善了宿主對感染的抵御并減少了下呼吸道感染的嚴重性。這個可能性被 Strieter等的發現所支持,其發現在接受干擾素Y-lb治療的個體的血漿和 支氣管肺泡灌洗(BAL)液中,與接受安慰劑的相比,可被干擾素誘導的 具有抗微生物特性的CXC趨化因子I-TAC/CXCL11被顯著上調,而促纖 維化細胞因子大體上并沒有被持續6個月治療期的干擾素y-lb治療顯著改 變(參見Strieter " a/.,」m / A&^z> OzY Care MW. (2004)。 解釋這個黯淡 結果的一個可能是以現行劑量策略向肺間質所施用的藥物水平不足。
發明簡述
在一方面,本發明特點為一種在患肺病個體中治療肺病的方法,包括 施以治療有效量的氣霧劑干擾素。在很多實施方案中,肺病是阻塞性肺 病。在一些實施方案中,肺病是哮喘或特發性肺纖維變性。在一個實施方 案中,肺病的征狀改善可通過預測最大肺活量值(FVC)比治療前至少高 大約10%,優選至少高大約20%或至少大約25%甚至33%來測量。干擾 素可以是干擾素-a、干擾素-P或干擾素-y。
在另一實施方案中,患肺病例如IPF或哮喘的個體對一種或多種皮質 類固醇、環磷酰胺和硫唑嘌呤治療無反應。而且,在對免疫抑制治療具有 最低限度反應的病人中,其肺功能測試有中度但不顯著的改善,本發明的 進一步的方面以氣霧劑化干擾素合并治療這些病人,同時保留一或多種其 它治療方案的治療,包括但不限于以一或多種免疫抑制劑或抗炎劑治療。
在更具體的實施方案中,氣霧劑化干擾素以大約250 pg至750嗎范 圍的劑量通過噴霧器施用,每周三次。在另一個實施方案中,通過噴霧器 施用500嗎的劑量,優選每周三次。按照噴霧器的效率可施用更低的劑
里。
如果需要以干擾素-Y治療和其它治療形式組合治療IPF患者,氣霧劑
化干擾素-Y要被滴定以保證這些患者不會得到非所需的效應。此外,當考 慮組合治療時,其他藥劑可通過被認為是最有效的方式施用。這可能包括
靜脈內、肌內、皮下或可與IFN-Y合并以氣霧劑施用。
在另一方面,本發明的特點是一種精確地確定一種通過氣霧劑施用的 藥劑在上呼吸道沉積的方法。在本發明的這個方面的一個實施方案中,通 過氣霧劑施用的藥劑是干擾素例如干擾素-a、干擾素-卩或干擾素-Y。這項 技術是獨特的,可應用于向所有類型的肺病患者施用干擾素例如干擾素-a、干擾素-(3或IFN-Y。
其它目標和優點會通過閱讀接下來的詳細描述并結合以下示例性附圖 而變得明朗。
圖1描述了一種典型的潮式呼吸模式。
圖2描述了慢速深吸氣方法與潮式呼吸相比特點為吸氣流降低和吸氣 時間大幅延長。
圖3代表用慢速深度呼吸模式吸入4.5 pm的氣霧劑的人類個體的沉 積模式。圖像表明氣霧劑的上氣道最小限度(小于10%)的沉積,以胃中 少量的活性闡明。沉積圖像代表了以慢速深度模式(吸氣時間大約8秒) 呼吸3次后,放射性標記的氣霧劑沉積在人類個體的肺外周。
圖4是同一個體以潮式呼吸20次吸入1.5 nm顆粒(現行標準吸入模 式)的說明性掃描。圖像分析表明包含使用大顆粒、慢吸氣和延長的吸氣 時間的慢速深呼吸方法每次呼吸在肺中沉積氣霧劑顆粒效率高51倍。
圖5描述了一個患IPF的病人的沉積掃描,其已通過噴霧器接受每周
3次共12周的500嗎IFN-Y治療。治療后進行成像。感興趣區域以輪廓標 出。sU/L是肺上部沉積的放射活性相對于肺下部沉積的分布,以氙作標準 化。圖中水平線代表肺上象限和下象限的分界線。sC/P指如下所述的特定 的中心相對于外周的比率。a/Xe指氣霧劑相對于氙的比率。
圖6代表氣霧劑治療前后從BAL中所測的TGF-卩水平。
圖7表明在一個為5個患IPF的病人進行的氣霧劑rIFN-Y的研究中, 5個病人接受治療后其增加的百分率預測總肺活量。所有的病人均報告其 呼吸短促有主觀性改善。在3個月治療末期,這個研究中的病人其總肺活 量有統計學上顯著的增加。5個研究病人中的2個其最大肺活量有超過 200 cc,s的改善(分別為200和500 cc)。
圖8表明在一個為5個患IPF的病人進行的氣霧劑rIFN-Y的研究中5 個病人中的3個接受治療后其增加的百分率預測總肺活量。這些生理變化 伴隨著從這些病人的支氣管肺泡灌洗(BAL)液(從肺內皮層洗出的液體)中 回收的活性TGF-卩水平的降低。
圖9A和9B表明接受氣霧劑rIFN-Y治療IPF的5個病人中TGF-卩在 其總蛋白中所占比例減少。TGF-P是肺纖維化中主要調控物之一。它的激 活導致膠原產生。其水平降低應該引起較少的膠原沉積和較少的肺纖維 化。
圖IO表明干擾素-Y氣霧劑治療前后,在肺結核和特發性肺纖維變性病
人肺部所測的干擾素-Y的量。
圖11代表哮喘病人接受氣霧劑IFN-y治療后其峰流量值的百分率變 化。所有接受氣霧劑IFN-Y治療的病人都用肺量測定法評估可逆性氣道疾 病。在每個氣霧劑治療中,病人在治療前后進行峰流量的監控。
圖12提供了圖2中所指的所測峰流量的百分比變化的總結。在氣霧 劑干擾素Y治療后平均峰流量增加,在一些病人中有顯著增加。特別注意 至IJ,在所有的干擾素Y治療后峰流量測量值降低的病人中,沒有發現咳嗽 或其它抱怨。這些數據表明氣霧劑干擾素Y在氣道疾病患者中是安全并是 良好耐受的。
發明詳述
在描述本發明的方法和治療方法學之前,應該理解本發明不限于描述 的特定方法和實驗條件,因為這些方法和條件可變。也應理解所用術語只 是為了描述特定實施方案,并不是為了限定本發明的范圍,因為本發明的
范圍由所附權利要求書限定。
如本說明書和權利要求書中所用,單數形式"一"和"所述"包括復數形 式,除非上下文另有明確說明。因此例如,"所述方法"包括一或多種方法 和/或這里描述的和/或通過閱讀本文內容本領域技術人員顯而易見的步驟 等等。
除非另有說明,本文所用的所有技術和科學術語具有本發明所屬領域 的技術人員通常理解的意義。雖然相似或等價于這里描述的任何方法和材 料均可應用于實踐或測試本發明,這里描述了優選地方法和材料。所有提 到的文獻引入以作參考,來批露和描述所引文獻中的方法和減材料。
定義
術語"改善的征狀"在特定實施方案中,評定為預測的FVC值比治療 前至少改善10%。
短語"對一或多種皮質類固醇、環磷酰胺和硫唑嘌呤治療無反應"指對 常規現有技術治療無反應的患者群體。
肺活量(VC)指可以進出肺的空氣總量。 Fevl指一秒鐘用力呼氣量。
Fevl/FVC率指一秒鐘用力呼氣量與最大肺活量的比值。 術語"肺病,,指任何影響至少部分肺或呼吸系統的病理學。這個術語包 括阻塞性和非阻塞性病癥,例如哮喘、肺氣腫、慢性阻塞性肺病、肺炎、 肺結核和任何形式的纖維化,包括但不限于特發性肺纖維變性。
術語"阻塞性肺病"指任何可導致進出呼吸系統空氣流減少的肺病。氣 流相對正常的減少可以總的或一段有限時間內例如FVC或FEV1進行測
里o
術語"特發性肺纖維變性(IPF)"同義于"隱原性纖維化肺泡炎 (CFA)",是一個臨床術語,指特發性間質性肺炎的一個主要亞組,它 描述了一種疾病,特征為特發性進行性間質性疾病,呼吸困難出現之后平 均存活時間為3-6年。特發性肺纖維變性的診斷通過鑒定肺組織活檢樣本 上的普通間質性肺炎(UIP)進行。組織學模式的特征為不均勻性,包括 斑隙性慢性炎癥(肺泡炎)、進行性損傷(增殖性肌纖維母細胞和成纖維 細胞的小聚集物,術語稱為纖維形成病灶)以及纖維化(密集的膠原和蜂 窩狀改變)。
術語"哮喘"指一種包含炎癥(細胞損傷)和導向肺的氣道縮窄的普遍 疾病。哮喘在兒童和成年人中發生。兒童哮喘可繼續到青春期和成年期, 但是一些患哮喘的成人在其年輕時沒有哮喘。世界范圍內數以百萬的人受 哮喘影響,這些年更為普遍。
"慢速深呼吸"指任何呼吸模式,其中吸氣時間比呼氣時間長。這種模
式的特點為工作比(duty cycle)(吸氣時間/總呼吸時間)大于0.5。正常潮 式呼吸中工作比總是小于或接近0.5。即是,吸氣時間總是小于呼氣時 間。在疾病狀態下,阻塞性疾病中的工作比降低,在限制性疾病中它可能 仍然小于0.5。"慢速深"呼吸其特點為I/E比率即吸氣時間除以呼氣時間大 于l,在一些情況下,這個比率接近8或9,因此工作比為0.8或0.9。
干擾素-y的作用機理
最近在培養細胞中進行的細胞信號轉導通路研究描繪了一種暫時的針 對IFN-y應答的調節路徑(Vilcek ef a/., (1994) /"f爿rc/ j〃ergv /附mw"o/ 104(4): 311-6; Young " a/v (1995) J丄ei^oc所o/ 58(4): 373-81)。當添加IFN-y與其受體的細胞外結構域結合時發生第一個事件,然后導致在受體細胞 內結構域預先存在的信號轉導及轉錄激活蛋白l(STAT-l)的酪氨酸磷酸 化。只有酪氨酸磷酸化的STAT-1被激活,然后形成同型二聚體(或異二 聚體)并與特異性DNA序列結合。
經過轉位到細胞核并結合至其很多基因的啟動子中的同族(cognate) 調控元件后,STAT-1激活轉錄。STAT-1可與其它預先存在的組成型活性 的轉錄因子一起作用,因此一些基因的轉錄被最大化誘導,而不需要新蛋 白合成。其它基因由STAT-1和應答IFN-Y而新合成的轉錄因子調節。 IRF-1基因,也編碼一個轉錄因子,也由應答IFN-y的STAT-1調節(Pine, R. (1992) ■/ Fira/ 66(7): 4470-8; Pine " a/., (1994)五附6。
/13(1): 158-67; Pine &a/., (1990)^Wo/ Ce/Z所o/ 10(6): 2448-57)。應當注意,IRF-1基因的啟動子
也含有核因子KB(NF-kB)的結合位點,該因子介導腫瘤壞死因子-a (TNF-a)激活的IRF-1基因的轉錄(Harada a/., (1994) Mo/ Ce〃 Ao/ 14(2):1500-9; R. Pine,未發表)。
一旦IRF-1蛋白被合成,它即激活一組臨時下游基因的轉錄。IRF-1 被示出可調節IFN-Y誘導的涉及抗原加工和呈遞的重要基因的表達,所述 基因包括TAP-l、 LMP-2和HLA-A及HLA-B I類主要組織相容性抗原 (Johnson a/., (1994)編Ce〃扁14(2): 1322-32; White " a/., (1996) 7w附wwXy 5(4): 365-76)。
IRF-1被磷酸化,對其磷酸化程度的操作影響其DNA結合活性(Pine W a/., (1990) Mo/ Ce〃 10(6): 2448-57; Nunokawa & a/., (1994」 歷o/ /7" ito Commzm 200(2): 802_7)。但是,沒有清楚證據表明IRF-1的磷 酸化是體內調節的。STAT-1活性依賴于酪氨酸磷酸化,并受絲氨酸磷酸 化程度的影響。但是,潛在的STAT-1的豐度也被調節。用IFN-y過夜處 理的細胞STAT-1蛋白水平增加,雖然酪氨酸磷酸化和DNA結合活性只比 未刺激的細胞稍強(Pine"a/., (1994)/13(1): 158-67)。
基因表達和調節的研究能提供總體免疫狀態的其它方面的信息。特別 的,細胞因子改變的功能性作用可通過測定特異性DNA結合活性來證 實。例如,在T細胞中IL-12導致STAT-4的激活,然而IL-4導致STAT-6的激活,Thl和Th2反應的發生或由一個向另一個的轉換可由在一個特 定時間檢測的STAT DNA結合活性譜中反映出來(Darnell (1996)仏ce"/
//onw及as 51:391-403; Ivashkiv,L. B. (1995)/ www"^ 3(1): 1-4)。
氣霧劑化干擾素1治療IPF
最近,一個小隨機試驗IPF患者皮下干擾素-Y(IFN-力治療(Ziesche " a/. (1999) TV. / Med 341:1264-1269)。 IFN-y治療前和治療中6個月所獲 得的經支氣管活組織檢査樣品分析表明治療前不正常的促纖維化細胞因子 轉化生長因子-P(TGF-P)和結締組織生長因子(CTGF)的增長經IFN-Y治療 后顯著降低(Ziesche " a/. (1999) J:動。經強的松單獨治療的病人其TGF-P和CTGF水平無變化。
干擾素的輸送 氣霧劑的輸送
在本發明一個廣泛的方面,提供了治療患肺病的個體的肺病的方法,
所述肺病包括哮喘和特發性肺纖維變性(IPF),所述方法包括施用治療
上有效量的氣霧劑化干擾素例如干擾素-Y,其中所述肺病的癥狀得到改善 或轉佳。改善的癥狀可以是相對于治療前預測的FVC值至少增加10%。 在一個優選的實施方案中,氣霧劑化IFN-Y可用來治療患哮喘或IPF的個 體,其中所述個體對一或多種皮質類固醇、環磷酰胺和硫唑嘌呤治療無反 應。此外,氣霧劑化干擾素例如IFN-y的施用在患肺纖維化的患者中經過 計算并優化。這樣的施用可使患者在肺功能測試中得到改善。
干擾素例如IFN-Y可通過幾個不同的途徑施用,包括靜脈內、肌內、 皮下、鼻內或通過氣霧劑。但是,當單獨治療一個肺部過程時,直接將藥 物輸送到肺可避免其暴露于其它器官系統。通過氣霧劑有效施用500嗎 IFN-y,每周三次,共兩周,經支氣管肺泡灌洗(BAL)分析證實,施藥后可 在正常病人中引起IFN-Y水平增高。同樣地,大約500微克的干擾素-卩, 每周三次以及大約0.25毫克的干擾素-a,每周三次,被認為是有效的。
本發明的目標是通過肺部施藥途徑輸送干擾素例如干擾素1。干擾素 例如IFN-Y在吸氣時被輸送到哺乳動物的肺部,然后橫越肺上皮層進入血 流(關于這點的其它報告包括Adjei " a/., PHARMACEUTICAL RESEARCH, VOL. 7, No. 6, pp. 565-569 (1990); Adjei " a/" /她m加owa/ Jbwma/ o/尸/K3TmaceM"cs, 63:135-144 (1990); Braquet a/., J"owr"a/ o/ CaWovascw/ar i^arwaco/ogy, Vol. 13, suppl. 5, s. 143-146 (1989); Hubbard & a/., ^麵/j 她血z恥,Vol. III, No. 3, pp. 206-212(1989); Smith " a/"
/ C7z'", /wveW" Vol, 84, pp. 1145-1146 (1989); Oswein " a/" " Jenwo/feariow o/ /Vofe/" ', Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, March, 1990; and Platz " 美國專禾U號5,284,656)。 考慮到用于實踐本發明的是一大類用于肺部輸送治療性產品的器械設備, 包括但不限于噴霧器、定量吸入器和干粉吸入器,所有這些都為本領域技
術人員所熟悉。
一些商售的適合實踐本發明的設備的具體例子有Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri生產的Ultravent噴霧器;由Marquest Medical Products, Englewood, Colorado生產的Acorn II噴霧器;由Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolina生產的Ventolin定量吸入器;及由Fisons Corp., Bedford, Massachusetts生產的Spinhaler干教、吸入器;由Allegiance, McGraw Park, IL生產的MistyNeb; 由Trudell Medical International, Canada 生產的AeroEclipse。
所有這些設備需要使用適合蛋白分散的制劑。通常,每種制劑特異適 用于所用的設備類型,可能除了治療中所用的常規稀釋劑、佐劑和/或載 體外還使用合適的推進劑材料。并且也考慮脂質體、微囊或微球包括復合 體或其它類型的載體。化學修飾的蛋白也可制備在不同制劑中,這依賴于 化學修飾的類型或所用設備的類型。
不管是噴嘴式還是超聲波式,適合噴霧器使用的制劑典型地包含溶解 在水中的蛋白,其濃度為以大約每毫升溶液中有0.1至25 mg的生物活性 蛋白。所述制劑還可包括緩沖劑或簡單的糖(例如,為了蛋白質穩定和調 節滲透壓)。噴霧器制劑還可含有表面活性劑,以減少或防止形成氣霧劑 時溶液的原子化引起的蛋白質表面誘發聚合。
適合定量吸入器使用的制劑通常可以包含良好分散開的粉末,其含有 在表面活性劑幫助下懸浮在推進劑中懸浮的蛋白。推進劑可以是任何用于 此目的常規材料,例如氯氟烴、氫氯氟烴、氫氟烴或烴,包括三氯氟甲 垸、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇及1,1,1,2-四氟乙烷或其組合。合適的 表面活性劑包括三油酸山梨坦和大豆卵磷脂。油酸也可用做表面活性劑。
適合從干粉吸入器中分散的制劑可包含良好分散開的干燥粉末,其含 有蛋白并可能包括膨脹劑,例如乳糖、山梨醇、蔗糖或甘露醇,含量為可 以促進粉末從所述設備中分散,例如重量占制劑的50%-90%。蛋白最好 是以顆粒形式制備,平均顆粒大小小于10 p (微米),最優選0.5至5 ^m,以最有效的輸送到遠側的肺。
氣霧劑輸送的目標是顯著增加治療性藥劑例如干擾素包括IFN-Y向人
深肺的輸送。
一個特別優選的慢呼吸和深吸氣的方法與標準(潮式呼吸)
相比可以增加肺外周的沉積效率,直至大約50倍。
與潮式呼吸(圖1)相比,使用慢速深吸氣方法的特定呼吸模式顯示 出吸氣流降低,吸氣時間大幅延長。這種模式示于圖2。慢吸氣允許氣霧 劑顆粒繞過上氣道從而使他們可在肺部沉積。延長的吸氣時間可使氣霧劑 在肺外周合適的沉淀下來。延長的吸氣時間和更好的沉淀在剩余顆粒被呼 出之前促進"吸氣沉積"。在這種情形下,可能有接近100%的吸入顆粒在 呼出前沉積下來。這個過程可通過使用相對較大的顆粒(例如大約4.5 pm)而進一步加強,所述大顆粒通常會在口咽處沉積。慢速深呼吸的延 長的吸氣特別適合輸送藥物到病人的肺部他們的外周氣道病理學導致常 規的小氣霧劑沉積減少以及避免口咽沉積。可通過這種方法治療的肺外周 疾病包括例如特發性肺纖維變性和肺氣腫。這兩種實體均導致氣室增大, 從而導致潮式呼吸中最小限度的沉積。
這種吸氣和沉積的技術可以加強藥物的外周輸送,目的是通過肺毛細 血管促進全身性吸收進入全身循環。圖3代表了一個人類個體中的沉積模 式,其以慢速深呼吸模式吸入4.5 pm的氣霧劑。圖像表明氣霧劑在上氣 道的最小限度(小于10%)的沉積,以胃中少量的活性闡明。沉積圖像代 表了放射性標記的氣霧劑沉積在以慢速深模式(吸氣時間大約8秒)呼吸 3次后的人類個體肺外周。圖4是同一個體以潮式呼吸20次吸入1.5 pm 顆粒(現行標準吸入模式)的說明性掃描。圖像分析表明包含使用大顆 粒、慢吸氣和延長吸氣時間的慢速深呼吸方法的每次呼吸在肺中氣霧劑顆 粒的沉積效率高51倍。
生產可以實現慢速深度操作的設備是復雜的,但可以實現這一功能的 設備原型正在研制并已經應用(Profile Therapeutics Inc., 28 State Street, Ste. 1100, Boston, MA 02109,為總部在英國的Profile Therapeutics的子公司)。
肺薄壁組織疾病導致肺外周的幾何變化,會使吸入顆粒物的沉積最小 化。與全身性輸送相同藥物相比,直接將治療劑輸送到病變位置(肺外 周)更加有效。慢速深度吸入干擾素例如IFN-Y氣霧劑的方法特別適用于 治療肺纖維化患者肺泡中的疾病。
人類沉積研究表明,慢速深度吸氣方法大約比氣霧劑輸送的常規系統
效率高50倍。這種呼吸模式允許臨床試驗設計為測試氣霧劑治療肺病的 效力,所述肺病例如是阻塞性肺病,包括例如特發性肺纖維變性或哮喘, 所述治療通過使用一種藥劑例如干擾素包括例如IFN-y的已有制劑以寬范 圍的劑量將這種藥劑運用至肺外周。肺部沉積的數量可通過呼吸模式控 制,因為事實上沒有氣霧劑被呼出。
鼻部輸送
鼻部輸送蛋白同時亦是一個考慮。鼻部輸送可在鼻部施以治療產品后 使蛋白直接進入血流,沒有必要使產品在肺部沉積。適合鼻部輸送的制劑 包括那些帶有葡聚糖或環狀糊精的制劑。
劑量
應該了解,隨著進一步研究的展開,關于治療各種患者中各種病變的 合適的劑量水平的信息將會出現,本領域技術人員考慮受體的治療情況、 年齡和一般健康狀況之后,可以決定合適的劑量。大體上,注射或者輸注 的干擾素-Y劑量為250嗎生物活性蛋白(只計算蛋白本身質量,不算化學 修飾)至750叱(同上計算),每周三次。更優選地,劑量可以是500 pg,每周三次。大體上,注射或者輸注干擾素-a劑量是250-750微克,每 周施用1至5次,優選地大約500微克每周施用三次。對于干擾素-P,劑 量大體上是0.10至1 mg,每周1至3次,優選地是大約0.25 mg,每周三 次。劑量可變,依賴于蛋白的循環半衰期,以及所用的制劑。
同其它化合物一起施用
在本發明的另一個方面,可將干擾素和一或多種用于治療肺病的藥物 組合物聯合施用。并且,抗炎劑或免疫抑制劑可共同施用,例如環磷酰 胺、硫唑嘌呤或皮質類固醇。施藥可同時或連續進行。
有研究表明,皮下施用250嗎IFN-Y三天后,并沒有IFN-y的BAL水 平增高或者肺泡巨噬細胞的改變,然而外周血單核細胞出現上調(Jaffe "
a/. (1991) ■/ C//". /we成88:297-302)。 而且,氣霧劑IFN-y已經被用作肺 結核患者的輔助治療。
在以下描述的研究中,對常規免疫抑制治療無反應的IPF患者用氣霧 劑化IFN-Y治療。
本發明可通過參考以下實施例更好的理解,實施例的目的是作為本發 明的示例而不是限制本發明。
實施例
以下列出的實施例是為本領域技術人員提供如何制備和使用本發明的 治療方法、化合物和藥物組合物的完整揭示和描述,不是為了限制發明人 所認為的發明范圍。所用數字(例如數量、溫度等)己經盡力確保是精確 的,但需要考慮一些實驗錯誤和偏差。除非另有指出,份數是重量份數, 分子量是平均分子量,溫度是攝氏度,壓力是等于或接近大氣壓。
實施例l 病人群體
研究主體是患特發性肺纖維變性(IPF)的病人,根據American Thoracic Society標準A或B (如下)診斷。病人群體對用皮質類固醇、環 磷酰胺和/或硫唑嘌呤進行的常規治療無反應或者不是這些常規治療的候 選。病人群體用氣霧劑化IFN-Y治療12周。
確定手術活組織檢查表現UIP,這三個條件必須滿足
1. 其它導致間質性肺病的已知原因被排除,例如某些藥物毒性、環境 暴露和結締組織疾病。
2. 肺功能測試異常,包括限制性(肺活量降低,經常伴隨Fevl/FVC 比率升高)和/或受損的氣體交換(02的肺泡-動脈梯度升高或CO的彌散 量降低)。
3. 雙側基部網狀異常伴隨最小限度的HRCT掃描磨玻璃混濁。 在沒有肺手術活組織檢查的情況下,在免疫活性成人中,可以假設診
斷為IPF,如果
I. 以上三個標準都滿足。
II. 經支氣管肺活檢(TBBx)或支氣管肺泡灌洗(BAL)表明無其它特征支 持另外的診斷。
III. 以下4個次要標準的其中3個
1. 年齡>50
2. 無法解釋的運動性呼吸困難的起病隱襲
3. 患病持續時間〉三個月
4. 雙側基部吸氣性捻發音。
改善定義為(1)與類固醇治療前獲得的FVC相比,FVC預測值比基 準值增加10%。 (2)盡管接受治療,病人的FVC比基準值增加多于10% 然后回復至基準值。
適合本研究的病人如下定義
(1) 按照可接受標準(參上)篩選三年內確診為IPF的病人;
(2) 年齡20-70;
(3) 強的松試驗(有或無環磷酰胺/硫唑嘌呤)失敗或禁忌接受類固醇 或細胞毒素劑治療的病人;
(4) 開始研究前接受0-15mg強的松或等價物28天而且愿意保持同樣劑
量皮質類固醇的病人;
(5) 篩選時FVC大于或等于50%并小于或等于90%的預測基準值;
(6) 在室內休息狀態Pa02 > 60 mm Hg ;
(7) 病人能夠理解并同意簽署書面授權同意書并同意遵守所有研究中 包含的步驟的要求;
(8) 病人符合科研性支氣管鏡檢要求并愿意接受相關程序;
(9) 病人能夠每周三次至ljBdlevue醫院的GCRC部接受藥物治療。 不適合接受本研究的病人定義如下(1)病人不愿意或不能夠接受
科研性支氣管鏡檢;(2)已知患有哮喘或嚴重COPD的病人;(3)需要 接受氧氣治療以維持足夠的動脈充氧的病人;(4)對研究藥物治療或其 它組成的藥物治療高反應性的病人;(5)己知患嚴重心臟病、嚴重外周 血管病或癲癇病,可能因接受研究藥物治療(按照包裝說明書禁忌接受藥
物治療)而加劇的病人;(6)懷孕或哺乳期婦女。育齡婦女需要妊娠試 驗呈陰性并需要采取可接受的避孕方式(研究持續期間節欲是最優選的方 法);(7)有證據表明治療前一周內受到活性感染;(8)除IPF以外的 任何可導致病人進入研究后1年內死亡的病癥;(9)異常血清實驗值, 包括(a)肝功能超過特定限制篩選時,總膽紅素大于正常上限1.5 倍;丙氨酸轉氨酶大于正常上限3倍;堿性磷酸酶大于正常上限3倍;白 蛋白小于3.0: (b) CBC在特定限制以外WBC小于2500/mm、血細胞 比容小于30或大于59;血小板小于100000/mm3; (c)篩選時肌酸肝大于 正常上限1.5倍;(10)過去六周內接受肺纖維化藥物治療,不包括皮質 類固醇、環磷酰胺和/或硫唑嘌呤;(11)以往任何種類的干擾素藥物治 療;(12)過去28天內用于任何指征的調查性治療。
實施例2
最初,從IPF登記處招入10個病人進入氣霧劑化干擾素i的標簽公 開的初步研究中。這10個病人滿足適合和排除標準。收集的數據包括過 去病歷,包括身高、體重和生命指征;個人過往的所有藥物史及完整的職 業和吸煙歷史,體檢,EKG, CBC,電解質檢驗,肝酶和凝血譜,CXR, 胸CT, PFT, ABG及孕期婦女妊娠測試。
毎個病人在研究開始時完成一份肺纖維化調査問巻,詳細詢問病人一 生對煙草、環境的暴露及藥物使用情況。每個病人還會完成一份癥狀調查 問巻以確定對IFN-y的耐受性及可能的副作用。
病人會接受基準支氣管肺泡灌洗(BAL)的支氣管鏡檢來評估某些促 纖維化和炎癥細胞因子的水平。步驟如下
每個病人按照Bdlevue Hospital Protocol接受支氣管鏡檢。每個檢查 包括Hgb、血小板、BUN/CR、凝血檢驗、ABG (P02大于等于75 mm Hg) 、 EKG、 CXR。支氣管鏡檢禁忌包括病人不合作、近期心肌梗塞、 惡性心律失常、不可矯正的低氧血癥、不穩定的支氣管哮喘、肺性高血 壓、部分氣管阻塞或聲帶麻痹、出血素質及尿毒癥。病人在支氣管鏡檢前 至少8小時必須NPO。設立靜脈線,實施補充供氧和持續的脈搏血氧測定
及血壓監測。
病人IM前驅用藥60mg的可待因,粘性利多卡因會被應用到鼻部, 使用利多卡因漱口及噴霧器(局部麻醉支氣管鏡檢)。在步驟進行中,會 施用咪達唑侖和/或嗎啡以使鎮靜及減少咳嗽反射。這些藥物是支氣管鏡 檢中常規應用的。支氣管鏡檢經過鼻部和聲帶,并進行支氣管內檢測。然 后施用50ml分裝的無菌生理鹽水進行BAL,共300ml,緩吸以實現最大 回流。
從病人獲得BAL液后,以處理所有BAL標準化步驟在GCRC中心實 驗室處理。BAL液經無菌紗布過濾。用血細胞計數器進行分類總細胞計 數。以臺盼藍方法確定細胞存活。每葉BAL液制備20個細胞離心載玻 片,貯存于-70。C。 24小時以106細胞/1111的濃度收集上清液,進行細胞因 子ELISA檢測。上皮細胞襯液的體積通過蛋白質方法測定。離心后, BAL液上清使用AMICON過濾方法濃縮10-50倍。細胞因子測試用商售 試劑盒(R&D Systems, Minneapolis, MN)進行。所有樣品重復三次,細胞 因子的量在測試最后由微量滴定板讀數器定量。按照前述方法(Raghu a a/. (1989) Z ev. / e平D/s. 140:95-100)處理經支氣管活組織樣品以分離成 纖維細胞,然后通過將3H脯氨酸摻入膠原蛋白來分析膠原產生。在 GCRC中的程序結束后由臨床護士觀測4小時每個病人可能的支氣管鏡檢 副作用,包括但不限于發燒、呼吸短促、咯血、氣胸。記錄合并用藥情況 于病人的病歷中。
每個病人保持他們穩定的皮質類固醇或免疫抑制劑的劑量。當病人還 在進行本研究時不允許進行調查性治療。臨床前大鼠研究已經表明,胃腸 外IFN-y降低了肝微粒體細胞色素P450的濃度。這可能導致已知利用這 個降解途徑的藥物的代謝降低。如果一個病人正在接受任何已知的由這個 途徑代謝的藥物,則需要實行合適的監控程序。
IFN-Y通過手持噴霧器施用,每周3次持續12周。在每種劑量施用 前,會由施藥的醫生進行檢査。進行峰流量測量,三次中的最好結果記錄 為治療前值。以常規方式準備Aeroeclipse或AerotechII噴霧器,在噴霧器 中放入500pg的藥物。治療通過壓縮空氣(墻式或可移動式)進行,同時
病人坐于固定位置,戴鼻夾,正常呼吸。治療最后,再次由進行研究的醫 生對病人進行檢查并在病房觀察1個小時。施藥l個小時后,測量并記錄
峰流量讀數。第一次氣霧劑治療后,每個病人需要在病房多停留4小時, 再次進行肺檢查和峰流量測量。在施用IFN-y的過程中對每個病人進行副 作用監測,包括但不限于發燒、疲勞、GI異常、頭痛、咳嗽、呼吸短 促、氣喘和化驗異常。
毒性以"普通毒性標準(The Common Toxicity Criteria)"定級。劑量 調整相應進行。對于I級毒性,病人可根據醫生的判斷繼續治療。對于II 級毒性(根據立即重復的異常實驗參數證實),停止病人劑量直至回復小
于或等于i級毒性,這時可恢復治療。如果n級或更嚴重毒性出現,病人 將撤出研究。對于m級或iv級毒性,病人撤出研究。異常實驗參數需要 確認。
實施例3 臨床功效
一個38歲具有慢性過敏史的海地婦女表現為1年半的進行性漸強的 呼吸短促和運動性呼吸困難。這個病人的PFT表現為低彌散量為主導性的 限制模式,疑似間質性肺病。她進行了胸部CT掃描,證實了她的PFT結 果,顯示為胸膜下纖維化和蜂窩變化,主要在肺基部。開肺活檢表明與 UIP/IPF—致的模式。
病人開始接受氣霧劑化IFN-Y。她報告呼吸困難減輕并能夠恢復工 作。她已經保持三年臨床穩定(參見表1)。客觀發現列于表2。運動表 現方面有改善,表現為最大耗氧量增加、每分鐘通氣量減少及氧氣去飽和 度降低。她的呼吸困難分值降低(UCSD SOBQ)。她的肺功能測試在氣 霧劑治療期間保持穩定。沉積圖像如圖5所示,代表54pg的IFN-y在肺 薄壁組織沉積。圖6顯示氣霧劑治療前后,從BAL測量的TGF-卩水平。 TGF-p的活性有顯著降低,與IFN-y氣霧劑的效果一致。
表1治療前后PFT結果
曰期歷史%預測值 TLC FEV1FVCDLCO/VA
4月-02 第一次PFT53495951
7月誦02 開肺Bx+之后;強的松和硫51575564
唑嘌呤Txt開始
8月-02 由于fLFT的硫唑嘌呤D/C;60545254
強的松漸少至10 mg/天;參考
研究研究;Txt前PFT
12月-02 INF-y Tx卞后61666065
6月-03 持續氣霧劑治療54676161
恢復工作
12月-03 持續氣霧劑治療57615371
7月-04 持續氣霧劑治療53585168
fBx-活組織檢査;1Tx =治療
表2運動測定、呼吸困難評分和肌肉力量的結果
變量_Tx卞前_Tx卞后(3個月)
VE,最大L/min
V02最大值,L/min 0.655 (42%) 0.746 (46%)
最小02飽和度(%) 35 54
UCSD SOBQ* 63 44
* University of California at San Diego, Shortness Of Breath Questionnaire 卞Tx-治療
實施例4
BAL液用于測定蛋白及IFN-Y檢測,用病毒抑制測試來確定輸送的藥 物的量。用ELISA (R&D, Minneapolis)來測定濃縮的BAL液和24小時 細胞培養上清中的細胞因子化-1|3、 IL-4、 IL-6、 IL-8和TNF-a。無細胞的 BAL上清以ELISA和螢光素酶報告測定來測定TGF-卩活性。經支氣管活 檢(TBBX)樣品以半定量RT-PCR來測定TGF-P基因轉錄。從TBBX樣品 獲取成纖維細胞,以RT-PCT測定膠原I、 III和纖連蛋白RNA的量。從
TBBX或TBBX的細胞培養物獲取RNA(10pg),進行Northern印跡分析。 用BAL液,BAL上清和TBBX樣品以分光光度法測定羥脯氨酸蛋白含 量。計算每個病人的治療前樣本和治療后樣本BAL液細胞數。取得每個 病人的血液樣本儲存。
實施例5
每個病人被要求參加(需單獨同意)通過手持式噴霧器施用IFNi的 沉積研究。這個沉積研究如下設計來研究氣霧劑化IFN-y。藥物以99mTc 標記并通過氣霧劑噴霧器施用。利用"衰減技術",計算輸送到肺各個部位 的IFN-y的劑量。最初所用劑量為500嗎IFN-y,因為這個劑量在以往表 明是安全的。根據每個病人個體沉積研究調整劑量。在治療末期,用上述 的步驟進行一次跟蹤支氣管鏡檢。通過肺沉積圖像引導BAL,以使最大 量藥物沉積的區域得到分析并與最低量藥物輸送區域和前氣霧劑IFN-Y樣 品比較。通過這種方式,可以計算并確定肺每個區域的總劑量。按照臨床 反應及BAL數據,可調整劑量以反映最優化臨床和沉積參數。如果可 能,將嘗試進行治療前后相似片段的抽樣。每個病人在治療一個月后接受 跟蹤檢査。所有程序、實驗室檢測、放射性研究和肺生理測試的結果均記 錄于病人的病歷。所有研究測試在NYU醫學中心的GCRC進行。
本研究中使用一種商售呼吸驅動式噴霧器AemEclipse,其顆粒的產生 依賴于病人通過噴霧器的呼吸。它只在吸氣時產生氣霧劑。
IFN-y以^锝二亞乙基三胺五乙酸("mTc-DTPA)放射性標記來進行體 內和體外研究。對于AeroEclipse,使用2管(250mg的IFN-力來達到最終 體積2mL。用Pari Master空氣壓縮器(PARI Respiratory Equipment, Inc. Monterey, CA)來操作AeroEclipse 。
以臨床應用的方式將噴霧器連接到電路。用T連接器(Tconnectoreascade, Hudson Respiratory Care, Temecula, CA)連接一個十級低流量(l.OL/m)級 聯沖擊器(California measurements, Sierra Madre, CA)。 一個可以阻隔顆粒 物在呼氣時進入級聯沖擊器的吸氣過濾器被置于活塞泵和級聯沖擊器之 間。第二個過濾器(泄漏過濾器)被置于系統中以捕獲多余的導入吸氣過
濾器而沒有導入沖擊器的顆粒。為評估病人通氣可能引起的效應,用一個
活塞泵(Harvard Apparatus, Millis, MA)模擬病人的呼吸過程。
吸入前在實驗臺在兩個條件下研究氣霧劑-駐云(standing cloud);級聯沖擊器在沒有活塞泵(泵與電路斷開)產生任何 通氣的情況下直接從1 Lpm的管中抽取顆粒樣本。為了從AeroEclipse產 生顆粒,在采樣持續過程中手動壓按呼吸驅動闊。
通氣過程中:用Harvard泵在系統中產生正弦流,類似病人的呼吸。使用 潮式體積為750ml;呼吸速率為20/m,工作比為0.5。
測定顆粒的空氣動力學分布及在連接到級聯(T connectorcde)的管道 上的沉積。氣霧劑的彈道特征通過T COnneCtor(;aseade的活性來定量,并以占 級聯沖擊器上捕獲的活性的百分比來表示(%級聯)。用這個沉積來預測 肺沉積。
氙成像和衰減研究用AemEclipse噴霧器研究所有個體的IFN-y沉 積。進行氙成像和衰減研究(參下)。
肺容積和輪廓研究(133氙(133Xe)平衡掃描)病人就坐于一個后向放置 的伽馬攝像機(Picker Dina camera; Northford, CT)前面。經過用,锝(99m Tc)對房間背景取像后,把相機設置到133Xe。以功能殘氣量(FRC)進行潮 式呼吸,病人吸入5-10 mCi的133Xe直至計數率穩定到15秒內穩定 ±10%。攝取1分鐘伽馬圖像(^Xe平衡圖像)并存儲于計算機(Nuclear Mac vl.2/94; Scientific Imaging Inc. Littleton, CO)中分析。這個圖像用來定義肺 的外緣。
氣霧劑沉積研究^Xe成像后,相機轉成",c。然后,病人從噴霧器 中吸入放射性標記的氣霧劑化IFN-Y。為每個裝置準備一個呼氣過濾器來 捕獲呼出的顆粒。噴霧器一直運行直至干涸。最后一次吸氣后,病人喝一 杯水以把材料從口咽沖洗到胃。測定胃活性評估上氣道沉積。
肺衰減研究(灌注掃描)進行肺灌注掃描以計算肺的衰減系數。沉積成 像后立即通過外周靜脈注射5mCi的99mTc白蛋白大團聚體。假定所有大 團聚體穿過心臟右側而按照區域灌注比例分布于肺部。獲取1分鐘成像。 灌注計算為測定的活性值減去上個(沉積)圖像的活性值。肺衰減系數測
定為相機所測活性量除以注入的活性量。肺衰減系數=所測活性/注入活 性。
胃衰減給病人含有已知量99mTc的面包,并在攝取之后進行胃部伽馬 相機照像。胃衰減計算為攝取活性除以伽馬相機所測活性。胃衰減系數= 所測活性/攝取活性。
沉積定量利用計算機,將存儲的133Xe平衡掃描的感興趣的區域可視 化圈出,以定義肺輪廓和包含肺容積。肺中心區域被圈出,其描繪了二維 肺區域的內部的三分之一。定義氙區域后,將同樣的區域置于沉積圖像和 所鑒定的胃活性。然后, 一個描繪胃輪廓的"胃區域"被可視化圈出。如果 胃區域和左肺的氙平衡區域有重疊,重疊區域被定義為"肺上胃(stomach onlimg)"或SOL。為確定整個肺沉積,排除胃和肺上胃區域的放射活 性。
肺沉積以伽馬相機通過對肺區域的活性定量并進行適當的衰減校正測 定。口咽沉積通過從沉積圖像總活性中減掉肺活性確定。對胃衰減做適當 校正。
特異中心相對于外周的比率(sC/P)特異的中心相對于外周肺活性定 義為氣霧劑圖像除以氙平衡圖像。這個比率代表了沉積的氣霧劑的分布, 以區域肺容積做標準化。
氣霧劑沉積的sC/P =(氣霧劑C/P /氙C/P ) 如果氣霧劑作為一種氣體完美作用并按照133Xe分布,sC/P比率應該為 1.0。偏向中心氣道沉積的顆粒產生2.0或更高的sC/P比率。
沉積研究結果顯示出氣霧劑在整個肺部的顯著性沉積。對肺容積作標 準化后,肺部中央區域有比外周相對較多的微粒(sC/P比率=1.618)。有最 小限度的上氣道沉積。
實施例6 氣霧劑IFN-y的作用
不利作用我們用氣霧劑化IFN卞冶療了 15個個體(正常的志愿者和 肺結核患者)。氣霧劑施用被很好的耐受,很少病人抱怨偶爾咳嗽或肌
痛。最長施藥時間為3個月,不利作用沒有增加。而且,Jaffe發現給予正 常個體氣霧劑化IFN-y是安全的,沒有全身性副作用,并能夠激活肺泡巨 噬細胞而不是PBMC,這與胃腸外輸送rIFN-Y相反,其效果只能在外周血 體現(Jaffe W a/.' (1991) JC7/" /"veW 88(1): 297-302)。
沉積研究我們研究了 IFN-Y的氣霧劑沉積特點。展示了一個沉積圖 像,揭示出放射性活性(氣霧劑)在肺的所有正常區域沉積。病變和腔區 域被省略。灌注掃描也顯示腔區域的灌注為最小限度。用質量平衡技術和 氙(如圖)進行的沉積測定揭示出10%-20%范圍的氣霧劑劑量被輸送到 肺。我們做出結論,將藥物靶向輸送到肺部可引起藥物在肺正常薄壁組織 的沉積(Condos " (1998)爿m Ji &s;^ CW/ Qire 157(3): A187)。
支氣管肺泡灌洗發現我們以前已經證明以IFN-Y治療一組患嚴重多藥 抗性結核病患者有臨床改善。病人在治療前和治療后進行放射線攝影相關 區域的BAL的支氣管鏡檢。24小時細胞培養上清及BAL液經ELISA測 試,發現其隨時間而降低的TNF-a水平(平均172到117 pg/ml)、 ILl-b水 平(平均25到8pg/ml)以及不可評估的IFN-y水平(平均3.3到2.5 pg/ml)。 我們做出結論,施用IFN-y與疾病部位局部產生的TNF-a降低相關。這可 部分解釋IFN-y在晚期MDR-TB中的有益效果(Condos " a/., (1998)爿m J 及e一 O/f Owe 157(3): Al 87)。
實施例7 特發性肺纖維變性的成功治療
在一個對5個IPF患者的氣霧劑rIFN-Y的研究中,我們發現治療被很 好的耐受。不利作用,包括疲勞、咳嗽和低燒(n=l)。研究期間進行的 常規化驗未發現任何異常。所有病人均報告其呼吸短促有主觀性改善。在 3個月治療的末期,研究中的病人其總肺活量具有統計學上顯著的提高。 圖7表明在接受治療的5個病人中的3個,其治療后增加的百分率預測總 肺活量。5個研究病人的2個也有大于200 cc(分別是200和500 cc)的最大 肺活量的改善。圖8表明在接受治療的5個病人中的3個,其治療后增加 的百分率預測最大肺活量。這些生理變化都伴隨從支氣管肺泡灌洗
(BAL)液(從肺內皮層洗出的液體)回收的活化TGF-p水平的降低。圖 9表明接受治療的5個病人中,其tgf-j3在總蛋白中所占部分減少。tgf-P是肺纖維化中主要介導物之一。它的激活導致膠原產生。其水平降低應 該引起較少的膠原沉積和較少的肺纖維化。而且,我們測量了氣霧劑治療 前后病人bal液中干枕素-y的水平,發現施用氣霧劑藥物和其升高相 關。圖IO表明了結核病人和特發性肺纖維變性病人在干擾素-Y氣霧劑治
療前后在其肺部所測干擾素-Y的量。
與之前進行的皮下研究相反,我們能夠表明以氣霧劑輸送rIFN-Y,肺 功能有生理性改善。與Intermune皮下試驗中病人接受1年治療相比,這 種改善發生在3個月的治療期間。這種生理性改善與肺部IFN-y水平升高 相關,引起從接受氣霧劑治療后的病人肺部回收的活化tgf-卩的水平降 低。這個數據證明了輸送藥理學上重要量的干擾素-y到肺的能力。皮下施 藥后未檢測到可測肺部干擾素-Y水平(參J , Jaffe " W., / C7z'" /"ve比88, 297-302 (1991)。在一個進一步確定肺劑量的嘗試中,5個病人中的2個進 行了沉積研究。這些研究確定了大約40mcg的rIFN-Y沉積到肺外周。在 皮下rIFN-Y試驗中未檢測到或報告rIFN-y的肺部劑量或肺部水平的測量。
實施例8 細胞因子基因調節
在本研究中,對轉錄因子豐度、磷酸化和dna結合活性的研究驗證 了一種假設,即氣霧劑ifn-Y治療影響細胞信號轉導途徑以激活潛在的 STAT-1并誘導IRF-1的重新合成。我們在從IFN-Y治療前后肺結核病人受 影響和未受影響的肺部區域的BAL細胞上進行了這些實驗(Condos W "/., (1999) J及es/^ CnY Care MW (付梓待刊))。純化和克隆IRF-1是由 Richard Pine博士與Jamese E Darnell, Jr在洛克菲勒大學分子細胞生物學實 驗室進行的首創性工作的主要部分(Pine a a/., (1990) M / Ce//所o/ 10(6): 2448-57)。與本項目目標3所建議的相同或相似的免疫印跡及電泳遷移率 變動分析也在上述工作中得到應用。
肺結核病人的未受影響的肺的細胞因子基因操作的結果是最相關的。
結果顯示在BAL細胞的粘附細胞(主要是肺泡巨噬細胞)和非粘附性細 胞(淋巴細胞和多形核細胞)部分,在氣霧劑IFN-Y治療后,均有特異性 IRF-DNA和STAT-1-DNA復合物的量增加。
實施例10 哮喘治療的效力
我們將招募30名輕度-中度哮喘病人接受IFN-Y氣霧劑治療并對比標 準治療。本研究為隨機、安慰劑對照、交叉、雙盲r IFN-Y氣霧劑輸送研 究,在患有輕度-中度持續性哮喘、需要中等劑量吸入的皮質類固醇作為 癥狀控制的個體中進行。
病人必須為18至65歲,可為任何種族和性別。他們現時必須為非吸 煙者,具有吸煙<10包年史。滿足NAEPP關于哮喘診斷指南的病人會被 招入。我們將招募輕度-中度持續性哮喘的病人,其1秒用力呼氣量 (FEV1)基準水平大于預測值的70%,并有可逆性證據(支氣管擴張藥治 療后FEV1改善大于或等于15%)。這些病人需要間歇性使用吸入式b2-激 動劑和低劑量的吸入式皮質類固醇。低劑量的吸入式皮質類固醇應用包括 168-500 mcg/天的丙酸倍氯米松,200-400 mcg/天的布地奈德DPI, 500-1000 mcg/天的氟尼縮松,或400-1000 mcg/天的曲安奈德。
懷孕的、對纖維光導支氣管鏡檢禁忌的、現時抽煙的、或具有吸煙 >10包年史的病人將被排除。任何具有控制不佳的或嚴重哮喘史的、最近 全身性使用皮質類固醇歷史的、近期加劇或感染歷史的病人也將被排除。
我們會引入一個月的"清洗(wash-in)"期以保證所有招入的病人以相 同的基準劑量的吸入式皮質類固醇(丙酸倍氯米松4-12 puffs/天)開始。每 個病人在基準線有
1) 完整的病歷及身體檢査,和常規化驗,
2) 肺功能檢測(FEV1, FVC,和PEFR),
3) 以靜脈棒抽取50 ml肝素化血液,
4) 獲取血液樣本用于總IgE、對確定過敏原特異性的IgE及嗜曙紅細 胞計數,
5) BAL的纖維光導支氣管鏡檢,細胞計數/分化分析及用ELISA方法 分析24小吋培養上清的IFN-y、 IL-4、 IL-5、 GM-CSF、 IL-IO、 IL-12和 IL-13的水平。
我們然后將向15個病人施用氣霧劑rlFN-Y(500 mcg),每周3次,共 8周。以隨機方式向15個病人施用等量的霧化鹽水。在8周內我們將進行 1個月的洗出期并將個體交叉至臨床試驗的第二部分(arm)。病人每次 治療到訪將會進行
1) 簡短的對跡象和病癥的問巻調査
2) 檢查日志卡和監控b-激動劑應用
3) 氣霧劑治療前后峰流量測定
4) 每周進行的簡短病歷和身體檢査
5) 個體將在氣霧劑化IFN-Y治療前、中、后在日志中記錄癥狀特征。 他們會對咳嗽、氣喘、呼吸短促癥狀在刻度表中評級。他們也將記錄每日 峰流量測定。
在試驗的每一部分完成時(氣霧劑化IFN-Y治療或對照鹽水治療8周) 個體將會有
1) 完整的病歷及身體檢查,和常規化驗,
2) 肺功能檢測(FEV1, FVC,和PEFR),
3) 以靜脈棒抽取50 ml肝素化血液,
4) 獲取血液樣本用于總IgE、對確定過敏原特異性的IgE(RAST)及嗜 曙紅細胞計數,
5) 在最后一次IFN-y治療或無治療后的一天將進行BAL的纖維光導支 氣管鏡檢。我們將分析BAL細胞計數/分化及用ELISA方法對24小時培 養上清的IFN-y、 IL-4、 IL-5、 GM-CSF、 IL-IO、 IL-12和IL-13的水平。
6) 每個月在哮喘診所對所有的病人進行繼續跟進
a) 完整的病歷及體檢
b) 常規化驗
c) 肺活量和峰流量測定 我們選擇研究使用低劑量的吸入式皮質類固醇的輕度-中度持續性哮
喘的病人有一些原因。第一,只包括輕度間歇性癥狀的病人可能不會使我 們在這樣一個群體中靈敏地發現生理性、癥狀性或免疫性改變。第二,我 們不能要求任何需要使用吸入式類固醇的病人為了這個試驗而中斷治療。
而且,本試驗的目的是確定氣霧劑化IFN-y能否作為己經確定的治療方案 的輔助。我們明白使用吸入式類固醇可能擾亂我們的研究,因為皮質類固 醇會影響細胞因子水平。我們引入"清洗"期以使所有個體在同一基準開 始。
實施例11
對哮喘患者肺功能的作用
為測定氣霧劑r IFN-Y對肺功能測試的作用,我們獲得了每個病人氣霧 劑治療前的1秒內用力呼氣量(FEV1)的肺活量值、最大肺活量(FVC)值、 呼氣速率峰值和肺容積包括肺總氣量(TLC)值和功能殘氣量(FRC)值。這些 會在Bellevue Hospital Pulmonary Function Laboratory進行。
我們預期在施用氣霧劑化r IFN-Y后會立即發現峰流量測量值的輕微改 善,如我們在治療沒有哮喘的肺結核病人中所觀察到的一樣。如今,仍然 不清楚為什么IFN-Y會有支氣管擴張劑作用。我們也預期在8個星期氣霧 劑IFN-Y治療后FEV1和FVC改善,反映氣道炎癥減少。
我們特別選取跟蹤FEV1因為其對個體病人來說是可再現的。這些值 對大氣道阻塞是特異的。如果我們在本研究的開始部分發現小氣道疾病的 其它變量受到影響,我們會使用比氣道傳導率、氣道阻力或用力呼氣量值 的25%-50%作為終點。如果需要更靈敏的氣道阻力測定,我們可進行頻 率依賴性順應性研究。我們也可以進行乙酰甲膽堿支氣管激發研究來研究 氣道高反應性。因為個體差異性及個體間差異性,這些額外研究并不十分 可信。實驗設計為交叉試驗可避免個體間差異性。
實施例12 對BAL樣本的效果
從30個哮喘病人獲取BAL樣本。我們將向這些病人中的15個施用
氣霧劑IFN-y 8周以測定IFN-y是否調節細胞因子的產生。從這些病人治療 前后抽取BAL和血液。
方法纖維光導支氣管鏡檢個體將以病歷和身體檢查、肺活量測定、 血氧測定、支氣管高反應性檢測,凝血檢驗(PT,PTT,血小板)和CBC及化 學篩選進行初篩。在程序進行中病人會有持續的心率和02飽和度監 測、主觀癥狀和用藥劑量記錄、靜脈內導管安置、吸入式b-激動劑的前驅 給藥、皮下阿托品(0.4mg)和鎮靜劑(咪達唑侖,iv)和補充氧氣。在輕微的前 驅給藥和鼻及上氣道局部麻醉后進行纖維光導支氣管鏡檢。支氣管鏡尖楔 入右中葉或小舌的分段(segmental)或次分段(subsegmental)支氣管。 以20 ml等分將100 ml的37。C生理鹽水灌注到支氣管。加溫的鹽水可避 免在哮喘個體中熱致支氣管痙攣。用和緩的間歇性吸收來回收流出物。預 計在輕度哮喘患者中有60%-80%的液體回收。在中度到嚴重病癥的個體 中回收減少至50% [Jarjour, 1998 #62]。脈搏血氧測定和病人狀態的臨床評 估在程序結束后進行。出院指導將包括一周內的跟蹤預約和電話聯絡。
肺泡巨噬細胞(AM)和BAL細胞以標準技術進行支氣管肺泡灌洗 (BAL)收集細胞,并按照如下所述準備培養把液體以一層無菌紗布過濾 以除去粘液凝塊。用血球計數器進行總細胞計數,所數共500個細胞用改 良Wright-Giemsa染色劑染色的細胞離心載玻片進行細胞分類。用臺盼藍 排除法確定細胞存活,在所有情況下用于實驗的回收細胞其存活大于 90%。從每一葉的BAL制備20個細胞離心載玻片, 一旦以10°/。福爾馬林 固定即存貯于-70'C。洗滌BAL細胞并以106細胞/毫升的濃度在補充了 10。/。的熱滅活胎牛血清(FCS)、 100u/mL青霉素、100mcg/ml鏈霉素的 RPMI(GIBCO)中培養24小時(37'C)。
外周血在IFN-y治療前和結束后,在每天的固定時間以靜脈棒采血。 從肝素化靜脈血中以Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離PBMC。肝素化 靜脈血于Ficoll-Hypaque中分層并以2500rpm離心20分鐘。PBMC的低密 度層將被吸出并以磷酸緩沖鹽水(PBS)洗滌,以106細胞/毫升的濃度重懸 于補充了 10%的熱滅活FCS、 100u/mL青霉素及100mcg/ml鏈霉素的 RPMI(GIBCO)中。然后細胞培養物在37'C和5% 0)2中保溫24小時。收
集細胞上清并以ELISA測定細胞因子。
收集血清樣本以測定對過敏原特異的IgE(RAST),所述過敏原(屋塵 螨(D. pteronyssinus )、美洲塵螨(D. farinea )、 德國蜚蠊(B. germanica -German cockroach ) 禾口美洲裴賺 (P. americana -American cockroach))與城市哮喘相關。
對從特應性哮喘患者和正常對照所獲得的PBMC進行額外的研究。這 需要在相同的補充RPMI培養基中分離PBM細胞培養物,如上所述。然 后這些培養的細胞將會用非特異性刺激物(LPS)或已知過敏原刺激。然后 培養上清通過ELISA分析細胞因子。這些水平將會與靜止細胞細胞因子 水平對比。可通過這個評估篩選一個大的城市哮喘群體,用于招募基準 IFN-Y反應差的病人進入氣霧劑化IFN-Y治療試驗。
細胞因子評估我們用ELISA(Endogen)測定24小時后收集的BAL細 胞上清(106細胞/毫升)中的IFN-y、 IL-4、 IL-5、 IL-IO、 el-12、 IL-13和 GM-CSF。我們收集了 5管106細胞/毫升,所以我們可以對每個細胞因子 以一式三份測量樣品。因為我們每個肺段平均30-40xl(^個BAL細胞,我 們預計可以評估每個病人的BAL細胞上清。我們將不會測量BAL液中的 細胞因子,因為我們會在BAL之后的樣品中回收IFN-Y,而且我們旨在研 究從BAL細胞中自發釋放出來的細胞因子。
實施例13 IFN-Y治療影響基因調控的機理
臨床治療程序將對調節應答IFN-y的基因表達的轉錄因子的豐度和活 性有清晰的作用,并且這些數據與細胞因子譜的關聯將擴展用來評估哮喘 中免疫應答的標準。而且,所獲得的這些數據將可對來自細胞因子產生和 細胞因子及其它基因表達的分析的結果進行作用機理闡釋。
本項目的設計加入了幾個對照以幫助確定氣霧劑IFN-Y治療的效果, 區分于其它任何變量。這包括在治療過程前后獲取BAL和血液樣本,以 及收集受影響和未受影響的葉的BAL樣品。為此所有實驗將會用從BAL 或PBM細胞制備的蛋白提取物進行。胞質和核蛋白將會分別獲取和分
析。為取得更多確定性的結果,BAL細胞將被分成粘附性和非粘附性群。 前者將主要包括肺泡巨噬細胞。后者將主要包含淋巴細胞和粒細胞。 PBMC將被提取而不作進一步分離。
本項目對轉錄因子豐度和DNA結合活性的研究將驗證一個假設,即 氣霧劑IFN-Y治療的臨床程序將影響細胞信號轉導路徑以激活潛在的 STAT-1并誘導IRF-1和CIITA的重新合成。獲得的數據將把調節基因表 達的分子機制聯系到初步的臨床發現。用氣霧劑IFN-Y進行體內治療的有 限治療過程的結果當與證明對治療有分子應答的數據結合進行解釋時,可 對用于將來試驗的設計產生更大的預測性效果。
決定轉錄因子STAT-1 、 IRF-1和CIITA的豐度
對治療程序前后這些轉錄因子的總量進行定量是有價值的,主要原因 有兩個。這些數據對全面解釋針對IFN-Y治療的受調控應答是關鍵性的。 它將得出關于可利用的蛋白被磷酸化的程度和具有DNA結合活性的總蛋 白比例的結論。而且,蛋白的豐度是編碼這些因子的基因受調控表達的最 終測量,因此為將來進一步整合激發的免疫應答的功能性和調節性方面的 研究提供了基礎。
免疫印跡檢測將會是首選的技術。最高5 x 106個細胞的胞質和核提取 物被用來作每個分析。按照以上所述獲取的細胞將為每個病人產生10個 樣品。 一個病人的所有PBMC和BAL細胞提取物將會包括在一個單獨實 驗中,以有利于一組樣品內的相對定量。每個實驗中也會包括從培養的細 胞系制備的胞質和核提取物對照。基于以前的研究,這些樣品已知含有靶 蛋白,因此可提供免疫印跡檢測的陽性對照。而且,他們可被用來證實取 得的數據是定量的或者揭示定量檢測的局限性。
蛋白通過SDS-PAGE分離,然后轉移到膜。膜用檢測STAT-l、 IRF-1 和CIITA的試劑顯影,逐個進行。膜最后被探査以檢測b-微管蛋白,其在 胞質和核蛋白提取物中均存在,因此可作為實驗內或實驗間的胞質或核提 取物的定量比較的內部標準。所需的所有抗體可在實驗室獲得或者巿面有 售,并且已知對免疫印跡程序有效。為了依次檢測不同的蛋白,膜被處理 以破壞抗體結合,但不釋放靶蛋白。可通過重復順序檢測每個靶蛋白并比
較第一輪和第二輪獲得的信號來證明這種方法有效。每個蛋白的檢測特異 性的陰性對照由抗體(相對另外兩個)提供。而且,最后膜將進行不包括 一抗的顯影。
如果可獲得的細胞數目不夠,或特定的轉錄因子的豐度太低,信號則
不會被檢測到。對這些蛋白進行ELISA測試可能會獲得更大的靈敏度, 但是免疫印跡方法的更高的可靠性和特異性將會失去。但是,這些潛在的 問題都不會是顯著的。所需要的細胞數目通常應該只是每個BAL樣品的 一小部分。任何靶蛋白的低豐度將會是一個導致有意義結論的生理學相關 結果。但是,應該注意,如果每個細胞中有100-1000拷貝的靶蛋白,即 相當于在所分析等份中有不超過8毫微微摩爾(0.5-1.5ng),試劑和檢測系 統將會產生一個信號。
STAT-1、 IRF-1和CIITA的酪氨酸和絲氨酸磷酸化的特征 轉錄因子磷酸化的改變經常是所述因子從存在到發揮功能間的聯系。 即使DNA結合活性不由磷酸化直接改變,這一點也是正確的(David (1995) 5We"ce 269(5231 ):1721-3; Wen, Z. " (1995) CW/ 82(2): 241-50; Pine ef a/" (1994)五m&o /13(1): 158-67; Cho " a/" (1996) J/m畫o/ 157(11): 4781-9; David & a/., (1996) J所o/ C/zew 271(27): 15862-5; Gupta " a/., (1995) Sde"ce 267(5196):389國93; Hibi " a/" (1993) Dev 7(11): 2135-48;
Parker " a/" (1996) Mo/ Ce〃 5/o/ 16(2): 694-703; Schindler ef a/" (1992) 5Wewce 257(5071): 809-13; Shuai(1992) 5We"ce 258(5089): 1808-12)。 如上所述,STAT-1的酪氨酸和絲氨酸磷酸化均可調控和控制其活性。 IRF-1是一個磷蛋白,但其自然發生的磷酸化的改變從沒有被記錄, CIITA的磷酸化很少被研究。這里描述的實驗將通過檢測PBMC和BAL 細胞提取物的磷酸化事件(以前主要在細胞培養系統中記錄)來提供關于 STAT-1體內調控的數據。所取得的關于IRF-1和CIITA的數據將超過以 前所確定的。
這個系列實驗的最簡明的設計是從細胞提取物中通過免疫沉淀定量回 收耙蛋白,通過SDS-PAGE分離回收的蛋白,然后通過免疫印跡分析分離 的蛋白檢測磷酸化。商售的抗磷酸酪氨酸抗體已經廣被接受為可用作進行
免疫印跡并確定酪氨酸磷酸化的存在和程度,很少依賴或不依賴于特定的 靶蛋白。抗磷酸絲氨酸的抗體也可在市面買到,但不確定他們能夠檢測意 向靶蛋白中的這種殘基。因此,本方法的成功應用有一些不確定性。除了 以上描述的陰性和陽性對照的類型外,在溶液中包括磷酸氨基酸并觀察到 沒有獲得信號可表明特異性檢測到磷酸酪氨酸和磷酸絲氨酸。
雖然經SDS-PAGE變性的蛋白很可能會與抗磷酸絲氨酸抗體反應,但 如果免疫印跡檢測絲氨酸磷酸化無效,ELISA仍然可能是成功的替代。如 果是那樣,將在孔內包被靶蛋白的抗體,蛋白將被結合,檢測步驟將會利 用抗磷酸絲氨酸的一抗,所述抗體來自與靶蛋白抗體來源不同的物種。免 疫印跡所用對照基本上也可用于ELISA系統。
還有另外一個替代方式用于STAT-1絲氨酸磷酸化分析。可基于已知 的受調控的磷酸化的絲氨酸位點,Ser277,來制備(參見方法)特異性的 抗磷酸STAT-1 (P-Ser)抗體(Wen, Z. " a/" (1995) Ce〃 82(2): 241-50)。這 很可能成功,因為已經獲得了特異于幾種蛋白的磷酸化形式的市售抗體 (New England Biolabs),所述抗體這樣獲得以合適的磷肽免疫,然后用 蛋白-a、肽及磷肽親和基質純化特異性抗體。本項目會應用類似的方法。 以"P-正磷酸鹽代謝標記細胞、然后特異性免疫沉淀耙蛋白和磷酸氨基酸 分析不適合本項目,因為靶蛋白在代謝標記必需的培養期間可能被修飾, 以及能獲得的材料的量不足以進行這樣的方式。雖然對任何靶蛋白進行絲 氨酸磷酸化變化的測定可能不能輕易實現,但受調控的翻譯后修飾的可能 的重要性強烈支持作這樣的嘗試。
這些數據將被用來建立在這個系統內這些因子的豐度和其作用的聯 系。STAT-1絲氨酸磷酸化的程度將決定激活的水平而因此設定DNA結合 活性的最大和最小水平。如上所述,絲氨酸磷酸化的改變可能調節DNA 結合活性并對STAT-1功能有其它效應。增加的STAT-1的豐度和磷酸化 基準水平也有可能被檢測到。這一結果將意味著,體內反應總體上與長時 間暴露于IFN-Y的培養的細胞的反應類似,而且反映出翻譯后修飾(磷酸化 和去磷酸化)的時間進程以及作為針對IFN-Y的分子應答的STAT-1的重新 合成。IRF-1或CIITA磷酸化改變的數據將作為體內針對IFN-y的分子應
答的新標記物,并為將來測定這些改變的功能意義的基礎研究提供有力的 理論基礎。如果豐度改變而磷酸化不變,則可能是在這個系統中這些因子
的磷酸化不被調控,或者,對于STAT-1可能是在獲取樣本時沒有持續的 凈變化。有必要將來在其它系統中研究以區分這些可能性。
測定STAT-1、 STAT-4、 STAT-5、 STAT-6和IRF-1的DNA結合活性 測定DNA結合活性將提供所需的最后數據以評估針對治療程序的分子應 答的調控。以實驗樣品的電泳遷移率變動分析檢測并定量STAT家族和 IRF-1轉錄因子將通過已建立的步驟完成。在這些測試中將包括從培養細 胞制備的提取物作為陽性對照。用于特異性的對照和對所研究的因子的鑒 別將通過進行包括競爭性寡核苷酸或抗血清的反應來提供。將同時應用非 特異性和特異性寡核苷酸或抗血清。
與細胞培養系統(其整個群體在同一時刻開始暴露于加入的細胞因子 并持續同樣的時間)的同步性相反,從BAL或血液樣品獲得的細胞將代表 反復氣霧劑IFN-y治療的總效果,所述治療為疊加于不同步的起始,而個 別細胞的暴露時間是由它們自己在暴露位置處進出所決定。在細胞培養模 型中,IFN-y在幾分鐘內激活STAT-1 DNA結合活性。在一些細胞系中, 這個活性很快衰減。在其它包括單核細胞系NB4、 U937和THP-1中,其 可持續幾小時(R. pine and E. Jackson,未發表)。由于STAT-1調節IRF-1基 因,IFTsky誘導IRF-1 DNA結合活性典型地只在1-2小時后被檢測到,然 后則持續至少16小時。因此,STAT-1和IRF-1 DNA結合活性可能同時存 在,但也可能只有一個或另一個被檢測到。
從實驗樣品獲得的結果可能揭示出STAT-1和IRF-1 DNA結合活性都 存在,因此表明數天間歇性劑量的體內凈結果等價于細胞培養系統中的中 等時間的暴露。這與已經報道的Bcr/abl轉化細胞系或白血病患者的 PBMC中的STAT因子的組成型激活不同(Carlesso"a/., (1996) J Exp Med 183(3): 811-20; Gouilleux-Gruart " a/" (1996) 87(5): 1692-7)。而且,
這樣的結果有力地表明對IFN-Y的全部應答在獲取樣本時仍在進行。或 者,只有STAT-1或IRF-1 DNA結合活性可被檢測。似乎不會出現只有 STAT-1被檢測,因為延長的IRF-1誘導是標準的,而STAT-1的激活典型
地是瞬時的。沒有STAT-1 DNA結合活性存在情況下,出現IRF-1 DNA 結合活性將意味著治療激活了一個反應,此反應與在培養的細胞中經IFN-Y過夜處理所見到的相同。生理學上,這與以下情況相一致IFN-y的存在 持續了足夠長時間以致激活了生理活性終點例如由單核細胞向巨噬細胞分 化或ThlT細胞應答的建立。
對STAT-4、 -5和-6的測定將為T細胞針對IL-2的應答以及關鍵Thl 或Th2細胞因子的出現和功能提供分子標記物。最近很多的報道已經表明 IL陽2激活STAT-5, IL-12激活STAT-4, IL-4激活STAT-6 (Cho & a/., (1996) //wmw"o/ 157(11): 4781-9; Gilmour & a/., (1995) 7Voc M3f/ 腦92(23): 10772-6; Schindler "a/" (1992) 5We"ce 257(5071): 809-13)。這 里獲得的數據本身不能證明這樣的判斷,因為幾乎每一個STAT家族成員 都由一個以上的細胞因子激活,而且幾乎每個細胞因子都能激活一個以上 的STAT。特別地,STAT-4也由IFN-a激活,STAT-5也由IL-7、 IL-15、 促泌素和生長激素激活,STAT-6也由IL-13激活(Ivashkiv, L. B. (1995) /畫畫' 3(1): l隱4; Darnell (1996)//onw 7 ey 51:391-403; Cho " a/" (1996, //附mzmo/ 157(11): 4781-9)。也應該注意STAT-1可被IL-6和 IL-10以及IFN-y激活。但是,對這個數據的分析將由上述細胞因子基因表 達分析所支持。而且,對STAT-4、 -5和-6DNA結合活性的測定將通過提 供細胞內分子效應的數據顯著地延申那些觀察,所述細胞內分子效應與確 定的細胞因子譜協同發生。
方法
我們用GITC和超速離心從10x106個BAL細胞中提取mRNA。由于 RT-PCR可對如此小量的細胞進行,總RNA也將被提取,貯存于-7(TC, 分析IRF-1的基因表達。PCR引物將基于己發表的序列,對于細胞因子基 因利用所述的RT-PCR,以b-肌動蛋白或GAPDH作對照比較轉錄強度。 由于IRF-1有基礎性表達,需要一個定量的方法來進行RT-PCR。根據標 準方法,來自BAL細胞的總RNA將用oligo-d(T)和PCR進行逆轉錄。第 一輪PCR將會以20%的cDNA進行,使用以下寡核苷酸正向引物5'-GTCAGGGACTTGGACAGGAG-3, , 逆 向 弓l 物 5,國AGCTCGGGGGAAATGTTAGT-3'。 IRF-1的表達將以GAPDH的表達進 行標準化。
細胞提取物的制備將來自BAL的細胞加入無血清的RPMI培養液, 如上所述,然后計數,然后轉移到組織培養板。置于37-C下2小時后,用 培養液取出非粘附細胞,然后再次計數。粘附細胞的數目將以這兩次細胞 計數的差值獲得。將PBMC加入無血清的RPMI培養液,如上所述,然后 計數。所有剩余的步驟將在0-4'C進行。懸浮的細胞將被離心(200 x g, 10 分鐘),然后吸掉上清,把沉淀重懸于磷酸緩沖液(PBS)。重復這一步驟, 這些細胞將被再次離心,最終的PBS上清被吸掉。加入然后吸掉PBS以 洗滌附著的細胞單層。再次加入PBS,單層將通過刮擦被分離。細胞和 PBS將被轉移到離心管進行離心,然后吸掉PBS。洗滌過的細胞沉淀懸于 裂解緩沖液(20 mM Hepes'Na, pH 7.9, 0.1 mM EDTA'Na, 0.1 M NaCl, 0.5% NP-40, 10%甘油,1 mM DTT, 0.4 mM PMSF, 3 pg/ml抑肽酶,2嗎/ml亮抑 酶肽,1 ng/ml抑胃酶肽,100 pM Na3V04, 10 mM Na2P207, 5 mM NaF) (3 pi 每105個細胞)并孵育5分鐘進行裂解。離心回收核(500 x g, 10分鐘)。取 出上清,然后離心以澄清(13,000 x g, 15分鐘)。回收所得的上清作為胞質 提取物,冷凍于碎干冰或液氮,然后存貯于-80'C。核沉淀將重懸于洗滌 緩沖液(沒有NP-40的裂解緩沖液),然后通過離心回收。吸掉上清,然后 沉淀懸于提取緩沖液(洗滌緩沖液,只是0.3M NaCl代替0.1M)(3pl每105 個細胞)并混合30分鐘。提取的核通過離心沉淀,回收的上清作為核提取 物,按照上述冷凍存貯。測定蛋白濃度以使在一個實驗中可使用數量相當 的不同提取物。這通常需要每個提取物使用相同的體積,因為使用提取緩 沖液體積/細胞個數的固定比率通常會在一個提取物組內或從不同制備物 產生一致的核和胞質提取物的蛋白濃度。
免疫化學程序如下進行免疫印跡:提取物和蛋白質大小標準與用于 SDS-PAGE的濃縮Laemmli上樣緩沖液混合,將其加到按照標準程序用 8%分離膠和4%的濃縮膠制備的不連續Tris-甘氨酸凝膠系統。這個凝膠百 分比將溶解所有感興趣的蛋白。以恒定電壓進行電泳直至染料標記物到達 凝膠底部。把凝膠用轉移緩沖液(Tris-甘氨酸加10%甲醇)平衡,然后用相
同的緩沖液以半干裝置(BioRad Transblot, SD)把蛋白轉移至硝化纖維膜。 膜以標準程序顯影。簡單來說,這需要封閉(用于Tris緩沖液加Tween20 去污劑中的脫脂奶粉孵育)、與特異性一抗孵育、以^t閉液洗滌幾次、以 酶聯二抗孵育、以無封閉劑的緩沖液洗滌、與酶底物孵育。對化學發光底 物來說,信號將通過X射線膠片測定。或者,可利用PHRI的一個 Molecular Dynamics Storm 860裝置來檢測化學發光底物的信號。按照實驗 設計,本項目將使用先前測定為轉移STAT-1和IRF-1所必需的最優化條 件,如以前測定那些病人每人的最佳發展條件那樣(Pine^"/., (1994) /13(1): 158-67; Pine " a/" (1990) Mo/ CW/ 5/o/ 10(6): 2448-57; Pine未 發表)。對CIITA來說,最優化檢測條件,包括封閉試劑的選擇、去污劑 的濃度、每個步驟孵育的時間和檢測方法將用從培養的細胞制備的對照提 取物以經驗決定。STAT-1和IRF-1的免疫沉淀將如前述進行,有微小修 改。特別的,用金黃色葡萄球菌fl""^)細胞回收與抗IRF-1抗體結 合的IRF-1已經被應用蛋白-a-瓊脂糖取代。
如果需要ELISA檢測轉錄因子的豐度或測定磷酸化,基于標準程序 的詳細方法將用從培養的細胞制備的對照提取物以經驗決定。為增加靈敏 度,優選的方法需要將捕獲抗體結合到微培養皿的孔中,然后封閉,然后 以需要的提取物孵育。進一步洗滌后,使用特異性二抗,然后使用針對二 抗的酶聯抗體,進行底物孵育。每次抗體孵育后進行洗滌。對于STAT-1,可以用兔多克隆抗血清提供捕獲抗體,鼠單克隆抗體用于檢測,或反 之亦然,因為對蛋白和磷酸酪氨酸或磷酸絲氨酸,二者均可獲得。對IRF-l和CIITA來說,只有針對蛋白的兔多克隆抗體可獲得,所以需要用針對 磷酸酪氨酸和磷酸絲氨酸的鼠單克隆抗體。檢測這些蛋白需要用提取物包 被微培養皿的孔,然后以特異性一抗和酶聯二抗孵育。如果合適,實驗樣 品測試中針對特異性的對照將包括略去一抗血清和/或加入磷酸氨基酸。
電泳遷移率變動分析已經為所指每個STAT家族成員和IRF-1發展 了 (Pine and Gilmour,前述)最佳分析。反應將包括非特異性和特異性競爭 物,或非特異性和特異性抗體。每個反應將用5Hg的蛋白提取物進行,通 常為2-3^d。對于有競爭物的反應,在放射性標記的探針與提取物混合時
加入那些寡核苷酸。對用抗體的反應,蛋白-DNA結合反應將按常規進 行,然后加入抗血清,繼續孵育。當孵育完成時,將反應物加到天然聚丙 烯酰胺凝膠,然后在4'C電泳。凝膠經干燥后,通過放射自顯影或以 Molecular Dynamic Phospholmager獲取結果。
我們將以Student's paired t檢驗比較在基線獲得的數據和r IFN-y治療 后的數據,以平均值士SEM表示。基于以往的研究,我們將需要檢測 FEV1中0.3L的差異,及3xl()S個細胞/毫升的差異。用30個個體,我們 將有80%的把握度。因此我們將在每組招募15個個體。
個體群體將對400個哮喘個體進行體檢。30個輕度-中度持續性過敏 性哮喘病人將隨機接受IFN-Y氣霧齊U(n-15)或者標準治療(n-15)。病人必須 接受肺功能和支氣管刺激檢測。必須沒有纖維光導支氣管鏡檢禁忌。本研 究群體的主要部分將從Bellevu Hospital Primary care Asthma Clinic招募。 我們的病人群體的人口統計學特征為90%少數民族(主要是西班牙和非洲 裔美國人),年齡為18-79歲(中位數為39),男性女性比例為l: 2。
潛在的風險總體來說,干擾素-y(IFN-力的風險和副作用的嚴重性與 給藥的量相關。在本研究所用的劑量(50 mcg/m"下,最常見的可能的副作 用包括發燒、頭痛和不適。高劑量下有報道會出現偶爾的反胃和惡心。氣 霧化與不利反應不相關,雖然可能預計有頭痛、咳嗽和發燒。如果出現嚴 重癥狀,將停止用藥。有一個以前未知的IFN-y的副作用的風險,其與哮 喘病無關。個體有可能對IFN-y的蛋白部分產生過敏性反應,這種情況下 將中止。
風險管理方案為最小化任何風險,支氣管肺泡灌洗在體檢后進行, 排除有心臟病或心絞痛歷史的個體。進行了胸X光和包括流血參數的血液 研究。支氣管肺泡灌洗將由肺科人員在科室指導下進行。依照程序,研究 對象保持3小時NPO,每30分鐘記錄生命體征,持續3小時。所有的病 人在程序進行中將進行心臟監測,并于程序進行時和結束后接受鼻部供氧 2小時以防止血氧不足。所有的病人數據將被鎖在肺研究辦公室。病人如 果出現不利作用,將有一個"救護推車"跟隨纖維光導支氣管鏡檢,包括氣 管內管、可注射的利多卡因和腎上腺素等,所有的程序在醫院進行,住院
醫師和CPR小組待命。所有的支氣管肺泡灌洗程序將定期審査以發現任 何不良反應發生率的增加并鑒別他們的起因。
實施例14
所有接受氣霧劑干擾素-Y的病人進行了肺活量測定以評定可逆氣道疾 病。大多數病人具有無可逆性跡象的阻塞性氣道疾病。在每次氣霧劑治療 中,病人在每次治療前后進行峰流量的監測。所有病人的數據示于圖 11。峰流量測定的百分比變化的總結性數據示于圖12。氣霧劑干擾素i后 平均峰流量值增加,在一些病人中有顯著增加。這些數據表明氣霧劑干擾 素-Y在氣道疾病患者中是安全并良好耐受的。
權利要求
1. 一種治療患肺病的個體中的肺病的方法,包括施以治療有效量的氣霧劑化干擾素。
2. 權利要求1的方法,其中所述肺病是阻塞性肺病。
3. 權利要求1的方法,其中所述肺病是特發性肺纖維變性。
4. 權利要求1的方法,其中所述肺病是哮喘。
5. 權利要求1的方法,其中所述疾病改善至相對于治療前預測的FVC值 增加至少10%。
6. 權利要求1的方法,其中所述患肺病的個體對一或多種皮質類固醇、 環磷酰胺和硫唑嘌呤治療無反應。.
7. 權利要求1的方法,其中所述氣霧劑化干擾素以大約250至750pg的 劑量施用,每周三次。
8. 權利要求1的方法,其中所述氣霧劑化干擾素以大約500pg的劑量施 用,每周三次。
9. 權利要求1的方法,其中所施用的氣霧劑化干擾素的量經過計算和優化。
10. 權利要求1的方法,其中所述施用引起干擾素在肺病患者的肺部沉積。
11. 權利要求1的方法,其中所述施用引起肺功能測試的改善。
12. 權利要求1的方法,其中所述干擾素是干擾素a。
13. 權利要求1的方法,其中所述干擾素是干擾素P。
14. 權利要求1的方法,其中所述干擾素是干擾素Y。
15. —種治療換肺病的病人的方法,包括與治療有效量的免疫抑制劑或 抗炎劑組合輸送治療有效量的氣霧劑化干擾素。
16. 權利要求15的方法,其中所述免疫抑制劑或抗炎劑選自如下一組 皮質類固醇、硫唑嘌呤和環磷酰胺。
17. 權利要求15的方法,其中所述肺病是阻塞性肺病。
18. 權利要求15的方法,其中所述肺病是特發性肺纖維變性。
19. 權利要求15的方法,其中所述肺病是哮喘。
20. 權利要求15的方法,其中所述疾病改善至相對于治療前預測的FVC 值增加至少10%。
21. 權利要求15的方法,其中所述患肺病的個體對一或多種皮質類固 醇、環磷酰胺和硫唑嘌呤治療無反應。
22. 權利要求15的方法,其中所述氣霧劑化干擾素以大約250至750pg 的劑量施用,每周三次。
23. 權利要求15的方法,其中所述氣霧劑化干擾素以大約500Mg的劑量 施用,每周三次。
24. 權利要求15的方法,其中所施用的氣霧劑化干擾素的量經過計算和 優化。
25. 權利要求15的方法,其中所述施用引起干擾素在肺病患者的肺部沉積。
26. 權利要求15的方法,其中所述施用引起肺功能測試的改善。
27. 權利要求15的方法,其中所述干擾素是干擾素(x。
28. 權利要求15的方法,其中所述干擾素是干擾素|3。
29. 權利要求15的方法,其中所述干擾素是干擾素Y。
30. —種治療患肺病的病人的藥物組合物,其包含治療有效量的氣霧劑 化干擾素。
31. 權利要求30的藥物組合物,進一步包含一種免疫抑制劑或抗炎劑。
32. 權利要求30的藥物組合物,其中所述免疫抑制劑或抗炎劑選自如下 一組皮質類固醇、硫唑嘌呤和環磷酰胺。
33. 權利要求30的藥物組合物,其中所述肺病是阻塞性肺病。
34. 權利要求30的藥物組合物,其中所述肺病是特發性肺纖維變性。
35. 權利要求30的藥物組合物,其中所述肺病是哮喘。
36. 權利要求30的藥物組合物,其中所述患肺病的個體對一或多種皮質 類固醇、環磷酰胺和硫唑嘌呤治療無反應。.
37. 權利要求30的藥物組合物,其中所述干擾素是干擾素a。
38. 權利要求30的藥物組合物,其中所述干擾素是干擾素卩。
39. 權利要求30的藥物組合物,其中所述干擾素是干擾素Y。
全文摘要
本發明提供了一種治療肺病如特發性肺纖維變性(IPF)和哮喘的方法,包括施用治療有效量的氣霧劑化干擾素例如干擾素α、干擾素β或干擾素γ。本發明同時也提供了一種或多種氣霧劑化干擾素的藥物組合物。
文檔編號A61K38/21GK101378774SQ200580052105
公開日2009年3月4日 申請日期2005年9月20日 優先權日2005年9月20日
發明者G·斯馬爾多內, R·康多斯 申請人:紐約大學;紐約州立大學研究基金會