專利名稱：植物提取物及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及來自欖仁物種，例如阿江欖仁的植物部分的某些提取物，它們被指出在諸如肥胖、心血管病、某些癌癥、糖尿病和相關疾病的治療中可能有用。另外，本發(fā)明涉及含有欖仁物種的提取物，例如阿江欖仁物種的提取物的預防性組合物。
提取物命名簡介 植物提取物的命名
1.AV-Avesthagen的頭兩個字母。
2.植物名稱使用的植物均指定一個唯一的3位數(shù)，016代表阿江欖仁。
3.植物的部分/組織使用的各植物部分均有一個兩個字母的標志。例如，Ba表示樹皮，F(xiàn)r表示全果實。
4.溶劑用于提取的溶劑也被指定一個兩位數(shù)字，01代表丙酮，02代表苯，03氯仿，04乙醇，05己烷，06甲醇，07石油醚，08水，09乙酸乙酯。用來提取的溶劑的百分含量在括號內給出，(20)表示20％的該溶劑。例如，如果用20％的乙醇進行提取，則是04(20)。
5.提取方法連續(xù)提取用Su表示，而直接提取表示成Di，提取溫度寫在括號內。例如，Su(65)表示在65℃連續(xù)提取。
6.提取物類型，g膠狀物，ng非膠狀物。
表和圖的簡述 表1提取物AV016BaDi(65)04(100)的HPLC指紋圖譜 表2提取物AV016BaDi(28)04(20)的HPLC指紋圖譜 表3提取物AV016BaSu(65)09(100)的HPLC指紋圖譜 表4提取物AV016BaSu(65)01(100)的HPLC指紋圖譜 表5提取物AV016BaSu(65)01(100)ng的HPLC指紋圖譜 表6提取物AV016BaSu(65)01(100)g的HPLC指紋圖譜 表7提取物AV016BaSu(65)04(100)的HPLC指紋圖譜 表8提取物AV016BaSu(65)06(100)的HPLC指紋圖譜 表9提取物AV016BaSu(105)08(100)的HPLC指紋圖譜 表10提取物AV016Fr(105)08(100)的HPLC指紋圖譜 表11提取物AV016BaDi(28)04(20)的LC/MS指紋圖譜(TIC譜(Q1-ve模式)) 表12提取物AV016BaDi(28)04(20)的LC/MS指紋圖譜(TIC譜(Q1-ve模式)) 表13提取物AV016BaDi(65)04(100)的LC/MS指紋圖譜(TIC譜(Q1-ve模式)) 表14提取物AV016BaDi(65)04(100)的LC/MS指紋圖譜(TIC譜(Q1-ve模式)) 表15提取物AV016BaSu(65)09(100)的LC/MS指紋圖譜(TIC譜(Q1-ve模式)) 表16提取物AV016BaSu(65)01(100)的LC/MS指紋圖譜(TIC譜(Q1-ve模式)) 表17提取物AV016BaSu(65)01(100)的LC/MS指紋圖譜(TIC譜(Q1-ve模式)) 表18提取物AV016BaSu(65)01(100)ng的LC/MS指紋圖譜(TIC譜(Q1+ve模式)) 表19提取物AV016BaSu(65)01(100)g的LC/MS指紋圖譜(TIC譜(Q1+ve模式)) 表20提取物AV016BaSu(65)04(100)的LC/MS指紋圖譜(TIC譜(Q1+ve模式)) 表21提取物AV016BaSu(65)06(100)的LC/MS指紋圖譜(TIC譜(Q1+ve模式)) 表22提取物AV016BaSu(105)08(100)的LC/MS指紋圖譜(TIC譜(Q1+ve模式)) 表23提取物AV016FrDi(65)04(100)的LC/MS指紋圖譜(TIC譜(Q1+ve模式)) 表24提取物AV016FrSu(105)08(100)的LC/MS指紋圖譜(TIC譜(Q1+ve模式)) 表25由阿江欖仁樹的不同部分得到的提取物的α-葡糖苷酶抑制活性的IC50值 表26胰島素和阿江欖仁提取物對于3T3-L1脂肪細胞攝入葡萄糖的影響 表27阿江欖仁提取物的抗肥胖能力 表28阿江欖仁提取物對CHO-K1細胞中脂質含量的影響 表29阿江欖仁樹皮的20％乙醇提取物AV016BaDi(28)04(20)對HMG-CoA還原酶活性的影響 表30阿江欖仁樹皮的100％乙醇直接提取物AV016BaDi(65)04(100)對HMG-CoA還原酶活性的影響 表31阿江欖仁提取物對HepG2細胞的細胞生存力的影響。
圖1阿江欖仁的乙醇直接提取物AV016BaDi(65)04(100)和AV016BaDi(28)04(20)抑制α-葡糖苷酶的能力。
圖2阿江欖仁果實提取物AV016FrDi(65)04(100)和AV016FrSu(65)08(100)抑制α-葡糖苷酶的能力。
圖3阿江欖仁連續(xù)提取物AV016BaSu(65)01(100)g、AV016BaSu(65)01(100)ng和AV016BaSu(65)04(100)抑制α-葡糖苷酶的能力。
圖4阿江欖仁的甲醇和水連續(xù)提取物AV016BaSu(65)06(100)和AV016BaSu(105)08(100)抑制α-葡糖苷酶的能力。
圖5阿江欖仁連續(xù)提取物AV016BaSu(65)09(100)抑制α-葡糖苷酶的能力。
發(fā)明詳述 本發(fā)明的第一方面提供了一種治療哺乳動物的疾病的方法，該方法包括向哺乳動物施用有效和無毒性數(shù)量的至少一種本文定義的阿江欖仁提取物。優(yōu)選該哺乳動物是人類。有經驗的讀者會理解，對哺乳動物“治療疾病”意味著治療，即，減輕疾病的癥狀，并且還可意味著在下述意義上處置某種疾病防止該疾病發(fā)展，即變得更糟或者變得更具侵襲性，或者減慢疾病的進展速度。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種用來防止哺乳動物發(fā)生疾病的方法，該方法包括對哺乳動物施用在食物制品中的有效和無毒性數(shù)量的本文定義的阿江欖江提取物，用來預防選自糖尿病、肥胖、心血管病和癌癥的某種疾病的發(fā)生。最好是，該哺乳動物是人，提取物中含有如本文詳述的得自阿江欖仁某個植物部分的單獨一種提取物或是幾種提取物的組合。因此，本發(fā)明還涉及可以從阿江欖仁樹的不同部分，例如樹皮和果實，分離出的提取物，這些提取物的制備，含有這些提取物的藥物，以及這些提取物和成分對于制備藥物的應用。
本發(fā)明的提取物可以利用常規(guī)的有機溶劑萃取法和超臨界萃取技術，從欖仁樹，例如阿江欖仁樹中分離出來。一般來說，這里概述的能以預防或治療方式起作用的本發(fā)明的提取物，可以根據對提取物要求的最終用途，從阿江欖仁樹的任何組織，例如樹皮或果實中，提取出來。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種從阿江欖仁樹的各部分制備本發(fā)明的提取物的方法，該方法包括 (1)將所選擇的植物材料粉碎成粉末； (2)對粉狀植物材料進行溶劑萃?。? (3)將得到的提取物冷凍干燥。
所選擇的植物材料可以是任何類型，但優(yōu)選選自阿江欖仁樹的樹皮或果實。
溶劑萃取法可以選自直接提取或者連續(xù)提取，例如在索氏萃取器中或在燒瓶中于室溫下或在更高的溫度，用極性和/或非極性溶劑從植物部分中萃取。通常，提取過程如這里所簡述的一樣。
有經驗的讀者會理解，在具有活性的本發(fā)明提取物的分離中，用于每一步驟的溶劑或溶劑混合物的選擇，正如在這里所指出的和/或實施例中所示，可以根據分離級分的生物測定分析結果進行。
在本發(fā)明的范圍內還包括一種適合用來治療選自糖尿病、肥胖、心血管病和癌癥的疾病的藥物制劑，其中包含至少一種與可藥用的載體混合的從欖仁樹物種，例如阿江欖仁樹中分離出的提取物。該至少一種提取物優(yōu)選根據計劃和所關心的疾病選自在表1-24(含首尾)中列出的那些。優(yōu)選該至少一種提取物選自表25-30(含首尾)中定義的提取物，同樣取決于最終用途。自然，有經驗的讀者會理解，這些組合物可以含有能產生療效的任何濃度的兩種或多種本發(fā)明提取物。因此，治療組合物可以含有基本上沒有不良的污染化合物的欖仁樹植物提取物。該植物提取物可以例如經過多次溶劑萃取步驟，基本上將不良組分與所要的組分，例如在實施例和上述表格中提到的組分，分離開來。
本發(fā)明還提供了一種治療哺乳動物，包括人的選自肥胖、癌癥、心血管病和糖尿病的疾病的方法，該方法包括使用臨床有效數(shù)量的表1-24(包括首尾)、優(yōu)選表25-30(包括首尾)中列出的提取物，以藥學上適用的形式，一天一次或幾次，或者按照其它合適的時刻表，口服或靜脈內施用，或者以干燥或“濕”噴霧方式向肺部釋藥。
為有效治療上述疾病所需的提取化合物的數(shù)量當然會隨所治療的疾病而變，最終要由醫(yī)師或獸醫(yī)確定。要考慮的因素包括所治療的癥狀，用藥途徑，制劑性質，哺乳動物的體重、表面積、年齡和一般狀況，以及要服用的具體化合物。本發(fā)明提取物的合適的有效劑量一般處在約0.01至約120mg/kg體重的范圍內，例如0.1至約120mg/kg體重，優(yōu)選約0.1-50mg/kg，例如0.5-50mg/kg?？側談┝靠梢砸淮谓o藥或多次給藥，例如每天2-6次給藥。例如，對于75kg的哺乳動物(例如人)，劑量范圍約為每天8-9000mg。典型的劑量可以是每天約50mg。如果需要分開的多次給藥，一般是15mg式(1)化合物每天最多施用4次。
雖然活性提取物可以單獨服用，但活性提取物最好是存在于藥物制劑中。用作藥物的本發(fā)明的制劑含有本發(fā)明的提取物和一種或多種可藥用的載體以及任選存在的其它治療成分。載體在與制劑中其它成分相容的意義上應當是可藥用的，并且對其接受者應當基本上無不利作用。
因此，本發(fā)明還提供了一種藥物制劑，其中含有至少一種選自表1-24(首尾在內)中列出的提取物，優(yōu)選選自表25-30(首尾在內)中提到的提取物，及其可藥用的載體。在一項優(yōu)選的方案中，藥物制劑中含有至少一種根據所治療的疾病類型選自表25-30列出名單的一種提取物。自然，有經驗的讀者會理解，當為了治療任何單獨一種疾病而選擇上述表中列出的不止一種提取物時，要選擇適合該疾病類型的提取物。例如，為治療糖尿病，要從該表中選擇適合此用途的提取物。
當然，有經驗的讀者會理解，含有本發(fā)明活性提取物的任何藥物制劑可以包括從某一種的欖仁樹物種的提取物純化得到的至少一種活性提取物。因此，藥物組合物可以包含從兩種或多種欖仁樹物種衍生得到的一種以上活性提取物。
還提供了一種制備藥物制劑的方法，包括將一種本發(fā)明提取物與其可藥用的載體相結合。
本發(fā)明的制劑包括適合口服或靜脈內給藥的制劑。
包含至少一種本發(fā)明的提取物的靜脈內制劑也可以以合適的脂質體或非離子型表面活性劑囊泡制劑的形式或其它合適的釋藥載體的形式施用。
適合用在本發(fā)明制劑中的乳化劑和乳狀液穩(wěn)定劑包括Tween60，Span80，十六/十八烷醇，十四烷醇，甘油單硬脂酸酯和十二烷基硫酸鈉。
這些制劑可以方便地配制成單位劑型，并可按照藥學領域熟知的任何方法配制。所有方法均包括將活性提取物與構成一種或多種輔助成分的載體結合。一般來說，制備制劑的方法是將活性提取物與液體載體或者細分的固體載體，或者與二者一起均勻地充分混合，然后如有必要，將產品成型制成所要的制劑。
適合口服的本發(fā)明的制劑可以是分離單元的形式，例如膠囊、香囊劑、片劑、錠劑，在調味的基料(常常是蔗糖和阿拉伯樹膠或黃蓍膠)中含有活性成分；在惰性基料(例如明膠和甘油，或蔗糖與阿拉伯膠)中含有活性成分的軟錠劑；以及在合適的液體載體中含有活性成分的漱口劑。各制劑通常含有預定數(shù)量的活性提取物；其形式為粉末或顆粒，或是在水或非水液體中的溶液或懸浮液，例如漿劑、酏劑、乳劑或者飲劑等。
片劑可以任選地與一種或多種輔助成分一起壓制或模塑制成。壓制片劑的制備方法可以是用合適的機械壓制自由流動形式的活性提取物，例如粉末或顆粒，可以任選地與一種粘合劑(例如聚維酮、明膠、羥丙基甲基纖維素)、潤滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑、崩解劑(例如淀粉羥乙酸鈉、交聯(lián)的聚維酮、交聯(lián)的羧甲基纖維素鈉)、表面活性劑或分散劑混合。模塑片劑可以通過在合適的機械內將用惰性液體稀釋劑濕化的粉狀提取物模塑制得。片劑可任選地包衣或刻痕，并可配制成緩慢或可控地釋放其中的活性成分，例如使用比例變化的羥丙基甲基纖維素以提供所希望的釋放型式。
糖漿劑可以通過向糖(例如蔗糖)的濃水溶液中加入活性提取物來制備，其中還可以加入任何必要的成分。這些輔助成分可包括增香劑，延遲糖結晶的試劑，或增加任何其它成分的溶解度的試劑，例如多元醇，如甘油或山梨醇。
除了上述成分之外，本發(fā)明的制劑還可以包含選自稀釋劑、緩沖劑、增香劑、粘合劑、表面活性劑、增稠劑、潤滑劑、防腐劑(包括抗氧化劑)等的一種或多種輔助成分。
或者是，組合物是適合人和動物消費的飲食補充劑、食品組合物或飲料組合物。
本發(fā)明描述了阿江欖仁樹各部分的直接和連續(xù)溶劑提取物的HPLC數(shù)據和質譜結果，從而對每種提取物給出了自身識別特征。用于連續(xù)提取的各種溶劑是按照從非極性到極性的次序，即，己烷、石油醚、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇和水。在直接提取的情形，使用單獨的醇類溶劑和其與水的混合物作為萃取溶劑。
本發(fā)明還包括參照表1-24(包括首尾)中確定的HPLC和MS數(shù)據定義的，由阿江欖仁植物不同部位分離出的新的提取物，這些提取物的制備，含有該提取物的藥物，以及這些提取物和組分在制備藥物方面的應用。
在本發(fā)明的另一方面，用于預防、治療或控制糖尿病和與糖尿病有關的疾病的藥物制劑含有單獨的或組合的下述提取物阿江欖仁樹皮用100％乙醇溶劑和20％乙醇溶劑的直接提取物[AV016BaDi(65)04(100)]和[AV016BaDi(28)04(20)]，阿江欖仁樹皮用乙酸乙酯溶劑的連續(xù)提取物[AV016BaSu(65)09(100)]，阿江欖仁樹皮用丙酮溶劑的連續(xù)提取物[AV016BaSu(60)01(100)g]，阿江欖仁樹皮用丙酮溶劑的連續(xù)提取物[AV016BaSu(65)01(100)ng]，阿江欖仁樹皮用乙醇溶劑的連續(xù)提取物[AV016BaSu(65)04(100)]，阿江欖仁樹皮用甲醇溶劑的連續(xù)提取物[AV016BaSu(65)06(100)]和阿江欖仁樹皮用水溶劑的連續(xù)提取物[AV016BaSu(105)08(100)]，阿江欖仁果實用乙醇溶劑的直接提取物[AV016FrDi(65)04(100)]和阿江欖仁果實用水溶劑的連續(xù)提取物[AV016FrSu(105)08(100)]。如本文中所述，這些藥物制劑可以含有可藥用的載體、賦形劑或稀釋劑。
在本發(fā)明的另一方面，用于預防、治療或控制肥胖和與肥胖有關的疾病的藥物組合物含有單獨的或組合的以下提取物阿江欖仁樹皮用100％乙醇溶劑和20％乙醇溶劑的直接提取物[AV016BaDi(65)04(100)]和[AV016BaDi(28)04(20)]，阿江欖仁樹皮用乙酸乙酯、丙酮、乙醇和甲醇的連續(xù)提取物AV016BaSu(65)09(100)，AV016BaSu(65)01(100)g，AV016BaSu(65)01(100)ng，AV016BaSu(65)04(100)，AV016BaSu(65)06(100)和AV016FrDi(65)04(100)。如本文中所述，這些藥物制劑可以含有可藥用的載體、賦形劑或稀釋劑。
在本發(fā)明的另一方面，用于預防、治療或控制心血管病(CVD)和與CVD有關的疾病的藥物制劑含有單獨的或組合的以下提取物阿江欖仁樹皮用100％乙醇溶劑和20％乙醇溶劑的直接提取物[AV016BaDi(65)04(100)]和[AV016BaDi(28)04(20)]，阿江欖仁樹皮用乙酸乙酯的連續(xù)提取物[AV016BaSu(65)09(100)]和用丙酮的連續(xù)提取物[AV016BaSu(65)01(100)]。如本文中所述，這些藥物制劑可以含有可藥用載體、賦形劑或稀釋劑。
在本發(fā)明的另一方面，用于預防、治療或控制癌癥和與癌癥有關的疾病的藥物制劑含有阿江欖仁樹皮的單獨或組合的以下連續(xù)提取物乙酸乙酯提取物[AV016BaSu(65)01(100)]，丙酮提取物[AV016BaSu(65)01(100)]，乙醇提取物[[AV016BaSu(65)04(100)]，甲醇提取物[AV016BaSu(65)06(100)]和水提取物[AV016BaSu(105)08(100)]。這些藥物制劑可以如本文所述，含有可藥用載體、賦形劑或稀釋劑。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種食物，也就是說，一種含有至少一種本發(fā)明提取物的食物，該提取物通常是干的形式，例如選自表1-24，特別是表25-30中列出的提取物的冷凍干燥形式。有經驗的讀者會理解，這些食物可以含有一種以上的本發(fā)明提取物并可被使用。這些食物可以以預防的方式使用，并可含有與最先加入的提取物功能相似的其它提取物，或者可以加入具有不同的預防功能的其它提取物。因此食物中可以含有使食物具有單一功能的提取物，例如具有預防糖尿病發(fā)生的提取物，或是食物可以有對抗兩種或更多種疾病的多功能預防作用。一般認為，含有兩種或多種提取物的藥物制劑也能夠具有類似的多功能作用，若是這些提取物具有計劃用于預防或者治療哺乳動物(尤其是人)的一種以上的疾病的不同的治療或預防性能。
其中可以加入至少一種本發(fā)明提取物的食物或食品的類型包括任何加工的食品，例如，糖果，烘烤產品，包括面包如枕形面包和扁平面包，例如空心圓面包、印度式面包等，糕點，快餐食品，例如穆茲利塊、壓制的果脯塊、餅干，奶制品，例如酸奶、牛奶和奶制品，例如蛋奶甜羹，稀奶油，奶酪，奶油和弗拉茨稀奶油，仿制的奶制食品，例如人造黃油、基于橄欖油的糊狀制品和低脂奶油代用品，例如Elmlea產品(稀奶油代用品)，水果和蔬果汁，充氣飲料，例如碳酸化軟飲料和非充氣飲料，例如帶果肉的鮮果汁，豆奶，牛奶糊和椰子奶等，意大利面食、面條、蔬菜、種子和堅果油，如水果調味的油，例如葵花子油，菜籽油，橄欖油，胡桃油，榛子油和芝麻油等，以及冷凍的甜食，例如冰淇淋，冰凍酸奶等。
食品中包含的本發(fā)明提取物的合適的有效劑量一般為每Kg體重約0.01-120mg，例如每Kg體重0.1-約120mg，優(yōu)選約0.1-50mg/kg，例如0.5-50mg/kg?？側談┝靠梢悦刻煲淮谓o藥或多次給藥，例如每天2-6次。
本發(fā)明的另一方面提供了選自表1-24，特別是表25-30的提取物在制備于治療糖尿病、癌癥、心血管病和肥胖等疾病的藥物方面的應用。
因此，提供了選自以下的一種提取物在制備用于治療或預防糖尿病和/或相關疾病的藥物中的應用AV016BaDi(65)04(100)，AV016BaDi(28)04(20)，AV016BaSu(65)09(100)，AV016BaSu(65)01(100)g，AV016BaSu(65)01(100)ng，AV016BaSu(65)04(100)，AV016BaSu(65)06(100)，AV016BaSu(105)08(100)，AV016FrDi(65)04(100)和AV016FrSu(105)08(100)。
另外，還提供了選自以下的一種提取物在制備用于治療或預防肥胖癥的藥物中的應用AV016BaDi(65)04(100)，AV016BaDi(28)04(20)，AV016BaSu(65)09(100)，AV016BaSu(65)01(100)g，AV016BaSu(65)01(100)ng，AV016BaSu(65)04(100)，AV016BaSu(65)06(100)和AV016FrDi(65)04(100)。
另外，還提供了以下的單獨一種提取物或其一種或多種的組合在制備用于治療或預防心血管病的藥物中的應用AV016BaDi(65)04(100)，AV016BaDi(28)04(20)，AV016BaSu(65)09(100)，AV016BaSu(65)01(100)。
另外，還提供了以下的單獨一種提取物或其一種或多種組合在制備用于治療或預防癌癥的藥物中的應用AV016BaSu(65)09(100)，AV016BaSu(65)01(100)，AV016BaSu(65)04(100)，AV016BaSu(65)06(100)和AV016BaSu(105)08(100)。
現(xiàn)在將參照以下實施例部分和附表及圖，示例說明本發(fā)明。應該清楚，這些實施例不要被認為是以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
實施例部分 實施例1阿江欖仁樹的提取 阿江欖仁樹各部分的提取用直接提取法及連續(xù)提取法在室溫下及在索氏提取器中利用有關的液-液提取技術進行，隨后冷凍干燥。
1.連續(xù)提取 用索氏萃取器進行阿江欖仁樹皮的連續(xù)提取。所用的溶劑按照其極性順序由非極性至極性，即，己烷、石油醚、氯仿、丙酮、乙醇、甲醇和水，溫度為65℃。
詳細過程給出如下 1.稱量100g粉狀植物材料加入提取器(索氏萃取器主體)中，索氏萃取器的底部放置棉花。在頂上用棉花覆蓋。向圓底燒瓶中加入1000ml溶劑(從己烷開始)，放在加熱套中，在其中加入幾小片陶瓷。在材料上加100ml溶劑將其剛好潤濕。
2.將萃取器放在燒瓶上，萃取器本身又與冷凝管連接。
3.讓冷自來水在冷凝管中連續(xù)循環(huán)。該裝置緊密吻合，就像制成整件裝置一樣。
4.令加熱套加熱，設定在65℃。來自燒瓶的溶劑蒸汽將通過萃取器的入口并被冷凝。冷凝(蒸餾)的溶劑匯集在萃取器(主體)中，萃取其中的化合物。
5.當植物材料完全被溶劑充滿時，它會泄放到燒瓶中。這一過程是連續(xù)的，只要有穩(wěn)定的加熱和循環(huán)水。
6.繼續(xù)提取8小時，每小時循環(huán)4-5次。
7.用真空冷凍干燥法將收集在燒瓶內的提取物濃縮。
8.按照與上述相同的步驟，依次用以下溶劑進行提取石油醚、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇和水。
II.直接提取 a.基于索氏萃取器用100％乙醇溶劑的提取步驟 1.稱量100g粉狀植物材料放在布袋中，轉移到該提取器(索氏萃取器主體)中。用棉花蓋住頂部。(確保材料的水平面比蒸汽進口管低一英寸)。
2.向圓底燒瓶中加入1升溶劑(從石油醚開始)，將燒瓶放在加熱套中，加幾個陶瓷片。在材料上加100ml溶劑剛好將其潤濕。
3.將萃取器放在燒瓶上，它本身又與冷凝器連接。
4.讓冷自來水在冷凝器中連續(xù)循環(huán)。該裝置吻合緊密得如同制成一個整體裝置。
5.起動加熱套，設定在65℃。來自燒瓶的溶劑蒸汽將通過萃取器入口并冷凝。冷凝(蒸餾)的溶劑將匯集在萃取器(主體)中，從而提取其中的化合物。
6.當植物材料被溶劑完全充滿時，它會泄放到燒瓶中。此過程是連續(xù)的，只要有穩(wěn)定的加熱和循環(huán)水。
7.繼續(xù)萃取8小時，每小時循環(huán)4-5次。
8.用真空冷凍干燥法將收集在燒瓶中的提取物濃縮。
b.室溫下用20％乙醇溶劑提取阿江欖仁樹皮 1.稱量已知量(100g)的粉狀植物材料放入錐形瓶中，用鋁箔蓋住瓶口以防溶劑蒸發(fā)。
2.向錐形瓶中加入已知體積(500ml)20％乙醇(100ml乙醇+400ml水)，將其放入軌道搖蕩器上，設定速度為210rpm，室溫28℃，進行提取。
3.提取該植物材料4小時，徹底排走溶劑。
4.將濾液在1000rpm離心10分鐘。收集上清液，冷凍干燥。
5.用250ml溶劑再萃取2×2小時。
6.將濾液在1000rpm下離心10分鐘。
7.在真空下用冷凍干燥機將萃取液濃縮。
實施例2阿江欖仁提取物的代謝指紋分析 得自阿江欖仁樹各部分的所有直接和連續(xù)提取物的代謝指紋分析是用HPLC和LC/MS技術進行的。
IHPLC指紋圖譜分析 用直接/連續(xù)提取法得到的植物提取物進行HPLC分析。高效液相色譜法(HPLC)是這樣一種技術，其中少量的樣品在高壓下被注入到一根C-18柱上，各組分由于它們與柱的相互作用和在柱中的停留時間而被分離。HPLC分析的主要目的是發(fā)現(xiàn)該植物提取物中的組分總數(shù)。
將適量的提取物溶于甲醇中，配制用于HPLC分析的樣品。將這些樣品過濾并收集在總回收HPLC小瓶中。這些樣品用Waters2695HPLC儀進行分離，然后被分析。
運行條件 1.用于HPLC分析的軟件是Water Millennium32。
2.用于分離的HPLC柱是WaterμBondpack C-18，5μ，4.6×150mm。
3.柱溫保持25℃。
4.溶劑流量設定為每分鐘1.0ml。HPLC條件包括梯度色譜—使用的溶劑是乙腈(溶劑A)，甲醇(溶劑B)和水(溶劑C和D)。
阿江欖仁提取物和HPLC運行條件 1.阿江欖仁提取物 1.AV016BaDi(65)04(100) 2.AV016BaDi(28)04(20) 3.AV016BaSu(65)04(100) 4.AV016FrDi(65)04(100) 5.AV016BaSu(65)06(100) 1.方法乙醇_11 壓力范圍高限 4000psi 低限 0psi 程序化流動 泵送模式梯度 在2分鐘內加速至10ml/min (5ml/min/min)
A乙腈，B甲醇，C水 2.阿江欖仁提取物 1.AV016BaSu(65)01(100) 2.AV016BaSu(65)01(100)g 3.AV016BaSu(65)01(100)g II.方法乙酸乙酯_10a 壓力范圍 高限 4000psi 低限 0psi 程序化流動 泵送模式梯度 在2分鐘內加速至10ml/min (5ml/min/min) A乙腈，B甲醇，C水 3.阿江欖仁提取物 1.AV016BaSu(65)09(100) III.方法乙酸乙酯_4a 壓力范圍 高限 4000psi 低限 0psi 程序化流動 泵送模式梯度 在2.0分內加速至10ml/min(5ml/min/min)
A乙腈，B甲醇，C水 4.阿江欖仁提取物 1.AV016BaSu(105)08(100) 2.AV016FrSu(105)08(100) IV.方法Gy_水_12 壓力范圍 高限 4000psi 低限 0psi 程序化流動 泵送模式梯度 在2.0分內加速至10ml/min (5ml/min/min) A乙腈，B甲醇，C水 II.液相色譜質譜(LG/MS)指紋圖譜分析 質譜法是一種可以測定分子質量的儀器方法。質譜儀的5個基本組件是真空系統(tǒng)、樣品加入裝置、離子化源、質量分析器和離子檢測器。將這些組件相結合，質譜儀通過離子化、按照質量-電荷比(m/z)分離和測定分子離子，確定化合物的分子量。
對于阿江欖仁的LC/MS表征，使用的運行條件如下 1.使用Applied Biosystems的Q-Trap LC/MS儀器。用于LC/MS分析的軟件是Analyst。
2.用于分離的HPLC柱是
5C18-MS-II填充柱18，5μm，4.6mm內徑×150mm。
3.柱溫保持在25℃。
4.溶劑流量設定為每分1.0ml。HPLC條件包括梯度色譜法—使用的溶劑是乙腈(溶劑C)、甲醇(溶劑B)和水(溶劑D)。
1.阿江欖仁提取物 AV016BaSu(65)09(100)，AV016BaSu(65)01(100)，AV016BaSu(65)01(100)g， AV016BaSu(65)01(100)g，AV016BaSu(65)04(100)，AV016BaSu(65)06(100)， AV016BaSu(65)06(80)，AV016BaDi(65)04(100)，and AV016FrDi(65)04(100) a.所有上述阿江欖仁樣品的LC/MS樣品運行條件 質譜儀 QTrap 0MASS SPEC 配置表版本 01 固件版本 M401400 B4T0301 M3L1400B3 T0300 部件名稱 線性離子阱四極LC/MS質譜儀 部件標識 QTrap 制造商 AB Sciex Instrum ents 型號 027170-C S/N M1100301 開始后時間＝0.0500min 質譜儀 QTrap 0 MASS SPEC 開始運行-詳細狀態(tài) 真空狀態(tài) 施壓 真空度 (10e-5Torr) 0.7 前級泵 Ok 雙渦輪泵 正常 樣品加入狀態(tài) 備好 離子源/離子通道電路 開 離子源類型 渦動噴霧 源溫(在設定點) 400.0C 離子源排出泵 Ok 界面加熱器 備好 質譜儀 QTrap 0 MASS SPEC 運行結束-詳細狀態(tài) 真空狀態(tài) 施壓 真空度(10e-5Torr)0.7 前級泵 Ok 雙渦輪泵正常 樣品加入狀態(tài)備好 離子源/離子通道電路 開動 離子源類型 渦動噴霧 源溫(在設定點) 400.0C 離子源排出泵Ok 界面加熱器 備好 離開始的時間＝61.4833min PE LC-200 泵法性能 PE LC-200 四級泵 最小壓力 (psi)0.0 最大壓力 (psi) 6100.0 停車時間(min)999.9 分步表 步 總時間 流速 梯度型式A(％) B(％) C(％) D(％) TE#1 TE#2 (min) (μl/min) 0 0.5 1000.00 1.00.00.010.090.0 開 開 1 1.0 1000.00 1.00.00.010.090.0 開 開 2 15.01000.00 1.00.00.015.085.0 開 開 3 40.01000.00 1.00.00.025.075.0 開 開 4 50.01000.00 1.00.00.035.065.0 開 開 5 60.01000.00 1.00.00.050.050.0 開 開 定量測定信息 樣品類型 Unknown 稀釋因子 1.000000 常規(guī)數(shù)據 定量測定表 第1期 -------------- 期內掃描次數(shù)2243 相對起始時間 0.00msec 期間實驗數(shù) 1 第1期實驗1 ---------------------------- 掃描類型 Q1MS(Q1) 極性 正 掃描方式 一維掃描 分辨率 Q1 UNIT 強度閾 0.00cps 置位時間 0.0000ms MR停頓 5.0070ms MCA無 中心/寬度 無 步大小 0.10amu 起始(amu)停止(amu) 時間(sec)參量 起始 停止 50.001700.00 1.60 CEP 6.47 66.65 參量表(第1期實驗1) CUR 20.00 TEM 400.00 GS1 20.00 GS2 50.00 ihe ON IS 4500.00 DP 90.00 EP 10.00 2.阿江欖仁提取物 AV016BaSu(105)08(100)，AV016FrSu(105)08(100)and AV016BaDi(28)04(20). a.所有上述阿江欖仁樣品的LC/MS樣品運行條件 質譜儀 QTrap 0 MASS SPEC 配置表版本 01 固件版本M401400 B4T0301 M3L1400 B3T0300 部件名稱線型離子阱四級LC/MS/MS質譜儀 部件標識QTrap 制造商 AB Sciex Instruments 型號027170-C S/N M1100301 起始后時間＝2.1000min 質譜儀 QTrap 0 MASS 起始運行-詳細狀態(tài) 真空狀態(tài) 施壓 真寬度(10e-5Torr) 0.7 前級泵 Ok 雙渦輪泵 正常 樣品加入狀態(tài) 備好 離子源/離子通道電路接通 離子源類型 渦動噴霧 源溫(在設定點) 400.0C 離子源排出泵 Ok 界面加熱器 備好 起始后時間＝2.1167min 質譜儀 QTrap 0 MASS SPEC 運行結束-詳細狀態(tài) 真空狀態(tài) 施壓 真空度(10e-5Torr) 0.7 前級泵 Ok 雙渦輪泵 正常 樣品加入狀態(tài) 備好 離子源/離子通道電路接通 離子源類型 Turbo Spray 源溫(在設定點) 400.0C 離子源排出泵 Ok 界面加熱器 備好 起始后時間＝42.9333min PE LC-200泵方法性質 PE LC-200四級泵 最小壓力(psi)0.0 最大壓力 (psi) 6100.0 停車時間 (min)999.9 分步表 步 總時間(min) 流速(μl/min) 梯度型式 A(％) B(％) C(％) D(％) TE#1 TE#2 0 0.5 750.00 1.0 0.05.05.0 90.0 開 開 1 1.0 750.00 1.0 0.05.05.0 90.0 開 開 2 20.0 750.00 1.0 0.015.0 25.0 60.0 開 開 3 26.0 750.00 1.0 0.05.070.0 25.0 開 開 4 30.0 750.00 1.0 0.05.05.0 90.0 開 開 5 40.0 750.00 1.0 0.05.05.0 90.0 開 開 模擬/數(shù)字轉換器性能 間隔(sec) 0.200 速度(pts/sec) 5 極性 雙極性 通道總結 No.名稱 判讀值原樣大小 判讀單位 電壓(volts)狀態(tài) 1100.0 ％ 1.0 Used 定量測定信息 樣品類型 Unknown 稀釋因子 1.000000 常規(guī)數(shù)據 定量測定表 第1期 ------------- 期內掃描數(shù) 1495 相對起始時間 0.00msec 期內實驗數(shù) 1 第1期實驗1 掃描類型 Q1 MS(Q1) 極性 正 掃描方式 一維掃描 分辨率 Q1 UNIT 強度閾0.00cps 置位時間 0.0000ms MR停頓5.0070ms MCA No 中心/寬度 No 步大小0.10amu 起始(amu) 停止(amu) 時間(sec) 參量 起始停止 50.00 1700.00 1.60 CEP 6.47 66.65 參量表(第1期實驗1) CUR20.00 TEM400.00 GS120.00 GS250.00 iheON IS 4500.00 DP 90.00 EP 10.00 實施例3阿江欖仁提取物的生物治療能力的測定 I.抗糖尿病能力 進餐后血糖急劇升高是與多種葡萄糖介導的組織缺陷、氧化應激、糖基形成和糖化最終產物形成有關，其結構和功能后果已經遍及實際上每一個人體器官系統(tǒng)。只有同時降低餐后和餐前的血漿葡萄糖水平，才能將糖基化血紅蛋白降低到防止或者延緩這些并發(fā)癥發(fā)生的程度。
小腸中的α-葡糖苷酶復合物參與了糖的吸收。例如，α-葡糖苷酶的抑制劑將限制飲食中的碳水化合物的吸收，這又抑制了餐后高血糖。因此，α-葡糖苷酶抑制劑是有希望的治療和預防糖尿病的候選藥物。α-葡糖酶抑制劑(阿卡波糖，伏格列波糖，米格列醇)已在延緩碳水化合物的消化和吸收方面顯示有效，從而能不損失熱量地減小餐后血糖水平的起伏。
1.α-葡糖苷酶測定 α-葡糖苷酶水解末端非還原性的1，4-連接的α-D-葡萄糖殘基，釋放出α-D-葡萄糖。在此測定中，通過測量由于對硝基苯基-α-D-吡喃葡糖苷水解釋放出對硝基苯酚而引起的400nm處吸收的增加，確定酶的活性。
a.試劑 ·磷酸鉀緩沖液0.1M，pH6.8 ·PNPG4mM ·碳酸鈉0.2M ·0.2％BSA/緩沖溶液 ·酶1.2v/ml，在0.2％BSA中 b.步驟 緩沖劑 600μl 抑制劑 100μl 酶 25μl ↓ 在37℃溫育15分鐘 ↓ PNPG 25μl ↓ 在37℃溫育15分鐘 ↓ 加入Na2CO3 750μl ↓ 讀取400nm處的吸收 c.結果和討論 對于從阿江欖仁樹皮和果實的連續(xù)和直接提取物，分析其抑制α-葡糖苷酶的能力。結果表明阿江欖仁提取物顯示出劑量依賴性的對α-葡糖苷酶的抑制作用。IC50被定義為對酶活性產生50％抑制所需的提取物數(shù)量。
如IC50值所示(表25)，所有的阿江欖仁提取物均比市售的阿波糖有更高的抑制α-葡糖苷酶的能力。
2.葡萄糖攝入測定 脂肪細胞(3T3-L1)的脫氧葡萄糖攝入測定有助于鑒別促進脂肪細胞增加攝入葡萄糖的提取物/生物活性物質。分化的3T3-L1細胞在其由增生性成纖維細胞轉化為非增生性脂肪細胞期間，顯示出胰島素刺激的葡萄糖轉運速度的急劇增加。Green和Kehinde(1975)最早證實了融合的3T3-L1細胞可以在6-9天內被激素誘發(fā)分化成脂肪細胞。
因此此項測定有助于篩選出會促使糖尿病個體迅速除掉血流中的葡萄糖并同時幫助脂肪細胞建立更好的能量儲存的那些植物提取物。
3T3-L1的氚化的脫氧葡萄糖攝入是用于體外篩選具有抗糖尿病活性的活性成分的最通用的測定方法之一。
a.3T3-L1細胞培養(yǎng)物 3T3-L1成纖維細胞在37℃和5％CO2氣氛中，于含10％FCS、NEAA、谷氨酰胺、抗生素、抗真菌劑等的DME-F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將成纖維細胞培養(yǎng)至融合。按3天的間隔，用胰蛋白酶-EDTA溶液處理得到傳代培養(yǎng)物。
b.成纖維細胞成熟為脂肪細胞 用含0.5mmol/L3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、4mg/ml地塞米松、1mg/ml胰島素和10％FCS的葡萄糖(4.5g/L)極限培養(yǎng)基處理細胞48小時以誘發(fā)分化。將細胞在含有前述的標準補加物的DMEM培養(yǎng)基中再培養(yǎng)6-10天。只有至少95％的細胞通過脂滴積累顯示出脂肪細胞表型的那些細胞才被使用。這些細胞被取來用于用氚化葡萄糖進行的葡萄糖攝入研究。
c.測定步驟 將50,000個分化的3T3-L1脂肪細胞分配在一只新的96孔板的各孔中。在37℃用KRH緩沖液溫育10分鐘。分別加入胰島素10nM，25nM和50nM。對于實驗組，在試驗化合物(333.0μg)存在下用或者不用10nM胰島素處理，隨后在37℃再溫育15分鐘。用KRH緩沖液洗池一次。加入含2-脫氧[H]葡萄糖(最終濃度12.2Kbq/ml)的0.1mM2-脫氧葡萄糖引發(fā)葡萄糖攝取反應。在37℃溫育1小時。加入40μM細胞松馳素B終止試驗。用冰冷的KRH緩沖液洗池三次。將細胞增溶在20μL的1％Triton X中，在37℃溫育10分鐘。在微量滴板放射性計數(shù)器上計數(shù)放射性。
d.結果和討論 通過測定含有2.2KBq/ml脫氧氚化葡萄糖的0.1mM脫氧葡萄糖的攝入，分析葡萄糖攝入活性。
如從表26可見，用100％乙醇溶劑直接提取的阿江欖仁樹皮提取物[AV016BaDi(65)04(100)]在胰島素不存在時刺激指數(shù)為3.0，在10nM胰島素存在時為2.0。這些數(shù)據表明AV016BaDi(65)04(100)具有有效的胰島素模擬能力。
2.抗肥胖能力 研究表明，中心性肥胖比一般肥胖更強烈地與脂/脂蛋白反常有關。肥胖會由于心肌細胞中的脂質積累而引起心臟功能不良，還會誘發(fā)II型糖尿病。肥胖個體中的這些不利的脂/脂蛋白情況是重要的，因為它們可能是造成心血管病(CVD)危險性增加的原因。
此測定是用來定量確定脂肪組織分化，從而確定細胞在植物提取物存在或不存在下經受分化刺激后的細胞內脂質與甘油三酯含量的一種半定量方法。
a.測定原理 油紅染色是用來測定脂肪組織分化的一種半定量方法。用油溶性染料染色是基于染料在脂性物質中的溶解度大于在通常的醇類染料溶劑中的溶解度。油溶O是一種親脂性紅染料，它能將胞內脂滴染色。脂質的定量測定可以在用有機溶劑萃取胞內脂質后進行。因此它被用來估測細胞在經過植物提取物刺激后的脂質和甘油三酯的含量。
b.分析方案 按照每孔105細胞的密度，用分化培養(yǎng)基和提取物(0.33mg)接種3T3-L1細胞，并在37℃和5％CO2下溫育24小時。24小時后除去培養(yǎng)基，加入新鮮的分化培養(yǎng)基，將細胞在培養(yǎng)基中再保持24小時。從第1天開始的48小時后除去培養(yǎng)基，加入只含胰島素的培養(yǎng)基(DMEMF12+FBS+胰島素)，將細胞保持24小時。24小時后抽吸走培養(yǎng)基，進行油溶紅染色。
c.油紅染色 各孔中的試劑總體積為500μL/孔。除去培養(yǎng)基，用PBS洗細胞3次。為固定細胞，將其用4％福爾馬林溫育1小時，除去福爾馬林，再用PBS洗2次。為了用油紅O染色，將其用該染色劑溫育1小時。1小時后除去該染色劑，用PBS洗，干燥10分鐘。加4％NP40。在分光光度計上讀出520nm處的吸收。
d.結果和討論 用3T3-L1細胞進行的抗肥胖試驗表明，阿江欖仁提取物對脂質積累顯示出抑制作用。正如從表27看到的，阿江欖仁樹皮的100％和20％乙醇直接提取物AV016BaDi(65)04(100)和AV016BaDi(28)04(20)與對照樣相比，顯示出76.3％和64.3％的抑制作用。
在阿江欖仁樹皮的乙酸乙酯、丙酮(膠狀)、丙酮(非膠狀)、乙醇和甲醇連續(xù)提取物AV016BaSu(65)09(100)，AV016BaSu(65)01(100)g，AV016BaSu(65)01(100)ng，AV016BaSu(65)04(100)和AV016BaSu(65)06(100)，與對照樣相比，顯示出61.9、58.5、86.8、49.4和57.9％的抑制作用。阿江欖仁果實的100％乙醇直接提取物AV016FrDi(65)04(100)與對照樣比較顯示41.9％的抑制作用。
與對照樣相比，正對照測定顯示104％的抑制作用。
3.心血管病 膽固醇增高與動脈粥樣硬化及心血管的危險大于平常值相聯(lián)系。高甘油三酯血本身不引起動脈粥樣硬化，但是在甘油三酯中富集的脂蛋白也含有膽固醇，它在很多高甘油三酯的人中引起動脈粥樣硬化。因此，高甘油三酯可以是對CHD有貢獻的脂蛋白問題的一個跡象。
1.基于細胞的脂積累水平檢測試驗 a.測定原理 在缺乏脂蛋白的血清存在下生長細胞會誘發(fā)細胞內的脂質生物合成。對于在缺乏脂蛋白的血清中生長誘發(fā)的細胞進行測定，隨后用油紅染色法估計總脂量。油紅O是一種用來對細胞內中性脂質染色的親脂性紅色染料。染色量與細胞內脂的數(shù)量成正比。對于用提取物處理組和對照組檢測脂含量，用光度法測定染料的數(shù)量并從而得到脂含量。
b.分析步驟 CHO-K1細胞按照105細胞/孔接種在12孔板中。將細胞在37℃和5％CO2環(huán)境下于含有10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、1.5g/L碳酸氫鈉和抗真菌劑以及青霉素和鏈霉素的DMEM-F12培養(yǎng)基中生長至80％融合。溫育2天后，將培養(yǎng)基換成含10％缺脂蛋白血清、2mM谷氨酰胺、1.5g/L碳酸氫鈉和抗真菌劑以及青霉素和鏈霉素的DMEM-F12培養(yǎng)基，在37℃和5％CO2環(huán)境下再生長24小時。在24小時后，向提取物處理組以0.5mg/mL的濃度加入阿江欖仁提取物，而對照組用載體(DMSO)處理。再繼續(xù)培養(yǎng)4小時，隨后用無菌的PBS緩沖液洗，固定，并用油紅O染色。
c.油紅O染色 每孔內試劑總體積為500μl/孔。除去培養(yǎng)基，用PBS洗細胞3次。為了固定細胞，將其與4％福爾馬林一起溫育1小時。除去福爾馬林，再用PBS洗2次。為了用油紅O染色，將細胞與該染色劑一起溫育1小時。1小時后除去染色劑，用PBS洗，干燥10分鐘。加入4％NP40。在光度計上讀取520nm處的吸收。
d.結果和討論 由表28可見，阿江欖仁提取物顯示出用提取物處理的細胞中總脂量顯著減少。與對照組相比，阿江欖仁樹皮連續(xù)提取物AV016BaSu(65)09(100)和AV016BaSu(65)01(100)顯示出22％和21％的抑制作用。與對照組相比，阿江欖仁乙醇直接提取物AV016BaDi(65)04(100)和AV016BaDi(28)04(20)在總脂含量方面顯示31％和28％的抑制作用。
2.HMG-CoA還原酶測定 3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶是膽固醇生物合成途徑中的第一個關鍵步驟。在膽固醇生物合成中作為限速步驟酶的HMG-CoA還原酶已成為降低總血漿膽固醇，特別是LDL-膽固醇的最成功的治療藥物。
a.測定原理 HMG-CoA還原酶測定是以在來自肝微粒體級分的固定濃度HMG-CoA還原酶催化下NADpH氧化成NADP的反應為基礎。
NADPH氧化成NADP+伴隨著340nm處吸收的減小，并且與樣品中HMG-CoA還原酶活性成正比。
b.結果和討論 檢驗阿江欖仁樹皮的100％乙醇和20％乙醇直接提取物AV016BaDi(28)04(20)和AV016BaDi(65)04(100)的HMG-CoA還原酶抑制能力。與對照組相比，AV016BaDi(28)04(20)和AV016BaDi(65)04(100)顯示出對HMG-CoA的93％(表29)和63.1％(表30)的抑制作用。
4.抗癌測定 通過體外篩選植物提取物對于人肝細胞系Hep G2的細胞毒性，確定阿江欖仁植物提取物的抗癌潛力。
a.實驗細節(jié) 將細胞按每ml2.5×105細胞的密度接種在24孔板中。讓細胞附著2小時，然后按10μg/ml的濃度加入提取物。用載體(即DMSO)、抗壞血酸和提取物AV016BaSu(65)09(100)、AV016BaSu(65)01(100)、AV016BaSu(65)04(100)溫育48小時。24小時后測定的細胞生存力。
b.測定方案 按照每ml2.5×105細胞的細胞密度接種HepG2。加入抗壞血酸和阿江欖仁提取物至最終濃度為10μg/ml。在5％CO2培養(yǎng)箱中于37℃溫育48小時。加胰蛋白酶以消化細胞。與1份臺盼藍和4份PBS混合，計數(shù)吸收臺盼藍的細胞(非活體細胞)和排斥臺盼藍的細胞(活體細胞)，得到存活的和死亡的細胞數(shù)目。
c.結果和討論 結果發(fā)現(xiàn)，與未處理組或用DMSO處理組相比，在藥物處理組的情形，用阿江欖仁連續(xù)提取物乙酸乙酯AV016BaSu(65)09(100)、丙酮AV016BaSu(65)01(100)和乙醇AV016BaSu(65)04(100)處理HepG2細胞，減少了細胞總計數(shù)和存活細胞的數(shù)目。
表1提取物AV016BaDi(65)04(100)的HPLC指紋圖譜
表2提取物AV016BaDi(28)04(20)的HPLC指紋圖譜
表3提取物AV016BaSu(65)09(100)的HPLC指紋圖譜
表4提取物AV016BaSu(65)01(100)的HPLC指紋圖譜
表5提取物AV016BaSu(65)01(100)ng的HPLC指紋圖譜
表6提取物AV016BaSu(65)01(100)g的HPLC指紋圖譜
表7提取物AV016BaSu(65)04(100)的HPLC指紋圖譜
表8提取物AV016BaSu(65)06(100)的HPLC指紋圖譜
表9提取物AV016BaSu(105)08(100)的HPLC指紋圖譜
表10提取物AV016Fr(105)08(100)的HPLC指紋圖譜
表11提取物AV016BaDi(28)04(20)的LC/MS指紋圖譜(TIC譜(Q1+ve模式)峰值表 表12提取物AV016BaDi(28)04(20)的LC/MS指紋圖譜(TIC譜(Q1+ve模式)峰值表 表13提取物AV016BaDi(65)04(100)的LC/MS指紋圖譜(TIC譜(Q1+ve模式)峰值表 表14提取物AV016BaDi(65)04(100)的LC/MS指紋圖譜(TIC譜(Q1-ve模式)峰值表 表15提取物AV016BaSu(65)09(100)的LC/MS指紋圖譜(TIC譜(Q1+ve模式)峰值表 表16提取物AV016BaSu(65)01(100)的LC/MS指紋圖譜(TIC譜(Q1+ve模式)峰值表 表17提取物AV016BaSu(65)01(100)的LC/MS指紋圖譜(TIC譜(Q1-ve模式) 表18提取物AV016BaSu(65)01(100)ng的LC/MS指紋圖譜(TIC譜(Q1+ve模式) 表19提取物AV016BaSu(65)01(100)g的LC/MS指紋圖譜(TIC譜(Q1+ve模式) 表20提取物AV016BaSu(65)04(100)的LC/MS指紋圖譜(TIC譜(Q1+ve模式) 表21提取物AV016BaSu(65)06(100)的LC/MS指紋圖譜(TIC譜(Q1+ve模式) 表22提取物AV016BaSu(105)08(100)的LC/MS指紋圖譜(TIC譜(Q1+ve模式) 表23提取物AV016FrDi(65)04(100)的LC/MS指紋圖譜(TIC譜(Q1+ve模式) 表24提取物AV016FrSu(105)08(100)的LC/MS指紋圖譜(TIC譜(Q1+ve模式)峰值表 表25.阿江欖仁樹不同部分的提取物抑制α-葡糖苷酶活性的IC50值
表26胰島素和阿江欖仁提取物對葡萄糖在3T3-L1脂肪細胞中攝入的影響
刺激指數(shù)＝{(樣品的平均值-對照樣(只用細胞)的平均值)/對照樣(只用細胞)的平均值} 表27阿江欖仁提取物的抗肥胖能力 抑制％＝{(對照樣平均值-樣品平均值)/對照樣平均值}*100 表28.阿江欖仁提取物對CHO-K1細胞中脂質含量的影響
抑制％＝{(對照樣-提取物處理樣)/對照樣}*100} 表29.阿江欖仁樹皮的20％乙醇提取物 AV016BaDi(28)04(20) 對HMG-CoA還原酶活性的影響 抑制％＝{(對照樣-提取物處理樣)/對照樣}*100 表30.阿江欖仁樹皮的100％乙醇直接提取物 AV016BaDi(65)04(100)對HMG-CoA還原酶活性的影響 抑制％＝{(對照樣-提取物處理樣)/對照樣}*100 表31阿江欖仁提取物對HepG2細胞的細胞生存力的影響
權利要求
1.一種治療哺乳動物中選自肥胖癥、癌癥、心血管病和糖尿病的一種疾病的方法，該方法包括向哺乳動物施用有效和無毒數(shù)量的至少一種選自表1-24中定義的阿江欖仁提取物。
2.根據權利要求1的方法，其中該疾病是肥胖癥，提取物選自AV016BaDi(65)04(100)、AV016BaDi(28)04(20)、AV016BaSu(65)09(100)、AV016BaSu(65)01(100)g、AV016BaSu(65)01(100)ng、AV016BaSu(65)04(100)、AV016BaSu(65)06(100)和AV016FrDi(65)04(100)，或它們中兩種或多種的組合。
3.根據權利要求1的方法，其中該疾病是癌癥，提取物選自AV016BaSu(65)09(100)、AV016BaSu(65)01(100)和AV016BaSu(65)04(100)或其兩種或多種的組合。
4.根據權利要求1的方法，其中該疾病是心血管病，提取物選自AV016BaDi(65)04(100)、AV016BaDi(28)04(20)、AV016BaSu(65)09(100)和AV016BaSu(65)01(100)或其兩種或多種的組合。
5.根據權利要求1的方法，其中該疾病是糖尿病，提取物選自AV016BaDi(65)04(100)、AV016BaDi(28)04(20)、AV016BaSu(65)09(100)、AV016BaSu(65)01(100)g、AV016BaSu(65)01(100)ng、AV016BaSu(65)04(100)、AV016BaSu(65)06(100)、AV016BaSu(105)08(100)、AV016FrDi(65)04(100)和AV016FrSu(105)08(100)或其兩種或多種的組合。
6.根據權利要求1的方法，其中該疾病是糖尿病、肥胖癥和心血管病，提取物是選自AV016BaDi(65)04(100)和AV016BaDi(28)04(20)或二者的組合。
7.根據權利要求1-6中任一項的方法，其中的治療是預防性治療。
8.一種用于治療選自糖尿病、肥胖癥、心血管病和癌癥的一種疾病的藥物制劑，其中含有至少一種表1-24中列出的從阿江欖仁樹分離出的提取物，和與其混合的一種可藥用的載體。
9.權利要求8的一種用于治療糖尿病的制劑，其中包含至少一種以下提取物或其兩種或多種的組合AV016BaDi(65)04(100)、AV016BaDi(28)04(20)、AV016BaSu(65)09(100)、AV016BaSu(65)01(100)g、AV016BaSu(65)01(100)ng、AV016BaSu(65)04(100)、AV016BaSu(65)06(100)、AV016BaSu(105)08(100)、AV016FrDi(65)04(100)和AV016FrSu(105)08(100)或其兩種或多種的混合物。
10.根據權利要求8的用于治療癌癥的制劑，其中含有至少一種選自AV016BaSu(65)09(100)、AV016BaSu(65)01(100)和AV016BaSu(65)04(100)的提取物或其兩種或多種的組合。
11.根據權利要求8的用于治療心血管病的制劑，其中含有至少一種選自AV016BaDi(65)04(100)、AV016BaDi(28)04(20)、AV016BaSu(65)09(100)和AV016BaSu(65)01(100)的提取物或其兩種或多種的組合。
12.根據權利要求8的用于治療肥胖癥的制劑，其中含有至少一種選自AV016BaDi(65)04(100)、AV016BaDi(28)04(20)、AV016BaSu(65)09(100)、AV016BaSu(65)01(100)g、AV016BaSu(65)01(100)ng、AV016BaSu(65)04(100)、AV016BaSu(65)06(100)和AV016FrDi(65)04(100)的提取物或其兩種或多種的組合。
13.根據權利要求8的用于治療糖尿病、肥胖癥和心血管病的制劑，其中含有至少一種選自AV016BaDi(65)04(100)和AV016BaDi(28)04(20)的提取物或二者的組合。
14.根據權利要求8-13中任一項的用于預防用途的制劑。
15.一種制備藥物制劑的方法，包括將至少一種本發(fā)明的提取物和其可藥用的載體相結合。
16.一種阿江欖仁提取物，選自具有表1-24中所示的HPLC和/或MS特征的提取物。
17.一種食物，其中含有至少一種選自具有表1-24中所示HPLC和/或MS特征的提取物的阿江欖仁提取物。
18.根據權利要求17的食物，其中含有至少一種用于預防癌癥的提取物。
19.根據權利要求17的食物，其中含有至少一種用于預防心血管病的提取物。
20.根據權利要求17的食物，其中含有至少一種用于預防糖尿病的提取物。
21.根據權利要求17的食物，其中含有至少一種用于預防肥胖癥的提取物。
22.根據權利要求17的食物，其中含有至少一種選自AV016BaDi(65)04(100)和AV016BaDi(28)04(20)的提取物，以單獨的或其一種或多種組合物的形式，用于預防糖尿病、肥胖癥和心血管病。
23.選自具有表1-24中所示HPLC和/或MS特征的提取物的一種提取物在制備用于治療糖尿病、癌癥、心血管病和肥胖癥的藥物中的應用。
24.根據權利要求23的選自AV016BaDi(65)04(100)、AV016BaDi(28)04(20)、AV016BaSu(65)09(100)、AV016BaSu(65)01(100)g、AV016BaSu(65)01(100)ng、AV016BaSu(65)04(100)、AV016BaSu(65)06(100)、AV016BaSu(105)08(100)、AV016FrDi(65)04(100)和AV016FrSu(105)08(100)的提取物在制備用于治療或預防糖尿病和/或有關疾病的藥物中的應用。
25.根據權利要求23的選自AV016BaDi(65)04(100)、AV016BaDi(28)04(20)、AV016BaSu(65)09(100)、AV016BaSu(65)01(100)g、AV016BaSu(65)01(100)ng、AV016BaSu(65)04(100)、AV016BaSu(65)06(100)和AV016FrDi(65)04(100)的提取物在制備用于治療或預防肥胖癥的藥物中的應用。
26.根據權利要求23的選自AV016BaDi(65)04(100)、AV016BaDi(28)04(20)、AV016BaSu(65)09(100)和AV016BaSu(65)01(100)的提取物，單獨地或其一種或多種組合物，在制備用于治療或預防心血管病的藥物中的應用。
27.根據權利要求23的選自AV016BaSu(65)09(100)、AV016BaSu(65)01(100)和AV016BaSu(65)04(100)的提取物，單獨地或其一種或多種組合物，在制備用于治療或預防癌癥的藥物中的應用。
28.根據權利要求23的提取物AV016BaDi(65)04(100)和AV016BaDi(28)04(20)，單獨地或其一種或多種組合物，在制備用于治療或預防糖尿病、肥胖癥和心血管病的藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有阿江欖仁提取物的藥物組合物和食物，和用于預防或治療哺乳動物例如人的以下疾病的方法心臟病、糖尿病、變性神經病、癌癥、與年齡有關的疾病如淀粉樣變、急性胰腺炎、關節(jié)炎、動脈粥樣硬化、癌狀、心血管病、炎性腸病、心肌梗死、老年癡呆、視網膜變性和老年性白內障及相關病癥，及其應用。
文檔編號A61P9/00GK101443024SQ200580049480
公開日2009年5月27日 申請日期2005年2月23日 優(yōu)先權日2005年2月23日
發(fā)明者M·P·維盧, V·德魯夫德夫 申請人:阿維斯塔金格蘭技術有限公司