調節生物活性的雙特異性結合劑的制作方法

專利名稱：：調節生物活性的雙特異性結合劑的制作方法調節生物活性的雙特異性結合劑相關申請的交叉參考本申請要求2005年2月23日提交的美國臨時申請號60/655,836的優先權，將其內容納入本文作為參考。關于在聯邦政府支持下進行研發的發明權利聲明無在光盤上提交的附錄"序列表"、表格或計算機程序清單參考資料。無
背景技術：
：許多疾病和失調是由細胞表面受體的活化(如通過與受體特異性配體結合)使信號轉導通路出現不適當或過度活化而引起的。參與疾病和失調如癌癥和自身免疫病的發生或進展的受體，已成為開發減少或防止受體活化的治療劑的主要靶點。靶受體的例子包括例如表皮生長因子受體("EGFR")、胰島素樣生長因子1受體("IGF1-R")和血小板衍生生長因子受體("PDGFR")，它們在許多疾病中傾向于過量表達或異常活化，例如在大多數常見的實體瘤，包括非小細胞肺癌和乳腺癌、前列腺癌和結腸癌，以及許多自身免疫病，如重癥肌無力、系統性紅斑狼瘡和類風濕性關節炎。受體活化導致自磷酸化，從而驅動導致疾病進展的信號轉導通路。用受體抑制劑進行的開創性研究已明確證明通過防止與疾病相關的受體活化，可改變該疾病的發展。但是，通常，造成疾病的受體在除了患病細胞或組織以外的許多不同細胞和組織上表達。雖然臨床上可以使用受體抑制劑，如靶向ErbB2("HER-2")的賀賽汀@，新的挑戰包括鑒定將有效靶向患病細胞或組織而不靶向未患病細胞和組織的治療劑。將藥物特異性靶向患病細胞的一種方法是采用雙特異性結合劑，本文中有時稱為"bsBA"。雙特異性結合劑包含兩個結合結構域，各自能特異性識別和結合不同分子(為方便起見，各結合結構域特異性結合的分子可以稱為該結合結構域的"配體")。已試驗了雙特異性結合劑一段時間，如SchmidtM.等，"對ErbB-2和EGF受體特異的二價單鏈抗體-毒素"(Abivalentsinglechain-toxinspecificforErbB畫2andtheEGFreceptor),Int.J.Cancer,65(4):538-46(1996)，LuD.等，"用完全人重組雙特異性抗體同時阻斷癌細胞中的表皮生長因子受體和胰島素樣生長因子受體信號傳導途徑"(Simultaneousblockadeofboththeepidermalgrowthfactorreceptorandtheinsulin-likegrowthfactorreceptorsignalingpathwaysincancercellwithafullyhumanrecombinantbispecificantibody)JBiolChem.279(4):2856-65(2004)和FrancoisC.等，"抗小鼠IL-2-Rcx和p鏈的抗體協同作用以消除T-細胞體外增殖和延遲型體內超敏反應"(AntibodiesdirectedatmouseIL-2-RalphaandbetachainactinsynergytoabolishT-cellproliferationinvitroanddelayedtypehypersensitivityreactioninvivo)TransplInt.9(1):46-50(1996)。因為bsBA常常采用抗體作為一個或兩個結合結構域，所以bsBA有時屬于稱為免疫治療的藥物類型。不幸的是，可用作bsBA的耙點的分子有限。僅有相對一小部分分子在患病細胞而非正常細胞上表達，因此可用這些分子使藥物僅靶向患病細胞。又有一些分子在患病細胞上表達得比正常細胞上更多。這些分子可以允許將藥物優先遞送到患病細胞而非正常細胞，這取決于與正常細胞相比，該分子在患病細胞中過量表達的程度。然而，即使靶細胞上靶分子大量過量表達，由于藥物與表達該靶分子的正常細胞結合，遞送靶向治療劑常常伴有副作用。例如，作為FDA-批準的免疫治療劑賀賽汀⑧耙點的HER2(erbB2)受體過量表達，比非癌細胞中HER2受體的表達高約10-100倍。然而，由于賀賽汀與正常細胞結合，一定百分數的患者產生了心律失常和其它副作用。因此，需要通過開發結合耙細胞而不結合非靶細胞的能力提高的bsBA來增加免疫治療劑的治療窗。發明概述本發明提供了調節靶細胞上耙分子的一種或多種生物活性的方法。該方法包括提供一種雙特異性結合劑，所述雙特異性結合劑具有與所述細胞表面上第一靶分子的Kd至少為1(T7M的第一結合結構域和與所述細胞表面上第二耙分子的親和力比所述第一結合結構域的Kd低至少10倍的第二結合結構域；其中所述第一和所述第二靶分子各具有一種生物活性，該活性可相同或不同；以及使所述雙特異性結合劑在允許第一和第二結合結構域分別結合第一和第二靶分子的條件下接觸所述靶細胞，其中所述第一和第二靶分子的結合調節所述靶分子的一種或多種生物活性。一些實施方式中，所述雙特異性結合劑包含兩種抗體。在一些實施方式中，所述抗體是雙抗體、直接連接或通過接頭連接的兩條單鏈Fv、二硫鍵穩定的Fv或其組合。一些實施方式中，所述靶細胞是癌細胞。一些實施方式中，所述第一靶分子是腫瘤相關性抗原、細胞因子受體或生長因子受體。一些實施方式中，所述第一靶分子是選自EGFR或ErbB2的酪氨酸激酶受體。一些實施方式中，所述第二靶分子是ErbB3(HER3)、胰島素樣生長因子-1受體(IGF1-R)、FGF受體1-4中的任何一種、HGF受體、胰島素受體、PDGF受體a或p、C-KIT、或ErbB4。在一些實施方式中，所述第一結合結構域對第一靶分子的Kd為1(T8-1(T12M。在一些實施方式中，所述第二結合結構域對第二靶分子的Kd比所述第一結合結構域對第一靶分子的Kd低至少20倍。在另一組實施方式中，本發明提供了在具有靶細胞和非靶細胞的生物體中調節靶細胞上靶分子的一種或多種生物活性的方法，其中，所述靶細胞在其外部具有第一靶分子并在其外表面具有第二靶分子，且其中，(i)所述第一和第二靶分子不共享共有配體，(ii)所述第一靶分子在所述靶細胞表面上的豐度比也攜帶第二靶分子的非靶細胞表面上的豐度高至少10倍，和(iii)所述第一靶分子和所述第二靶分子各具有一種生物活性，該活性可相同或不同。所述方法包括提供一種雙特異性結合劑，所述雙特異性結合劑具有與第一耙分子的Kd至少為10—7M的第一結合結構域和與第二靶分子的Kd比所述第一結合結構域的Kd低至少10倍的第二結合結構域；和使所述雙特異性結合劑在允許第一和第二結合結構域分別結合第一和第二靶分子的條件下接觸所述靶細胞，其中所述第一和所述第二結合結構域的所述結合分別調節所述第一和所述第二耙分子的一種或多種生物活性。一些實施方式中，所述雙特異性結合劑包含兩種抗體。在這些實施方式中的一些中，所述抗體是雙抗體、直接連接或通過接頭連接的兩條單鏈Fv、二硫鍵穩定的Fv或其組合。一些實施方式中，所述靶細胞是癌細胞。第一耙分子可以是腫瘤相關性抗原、細胞因子受體或生長因子受體。第一靶分子可以是選自EGFR和ErbB2的酪氨酸激酶受體。一些實施方式中，第二靶分子是ErbB3(HER3)、胰島素樣生長因子-1受體(IGF1-R)、FGF受體1-4中的任何一種、HGF受體、胰島素受體、PDGF受體a或p、C-KIT、或ErbB4。一些實施方式中，所述第一結合結構域對第一靶分子的Kd為10-8-l(T12M。一些實施方式中，所述第二結合結構域對第二耙分子的Kd比所述第一結合結構域對第一靶分子的Kd低至少20倍，而在其它實施方式中，它比所述第一結合結構域對第一靶分子的Kd低至少50倍。一些實施方式中，所述生物活性的調節涉及降低酪氨酸激酶受體的活性。在另一組實施方式中，本發明提供了一種雙特異性結合劑(bsBA),其包含與靶細胞上第一靶分子的Kd至少為10'7M的第一結合結構域和與靶細胞上第二靶分子的Kd比所述第一結合結構域對第一靶分子的Kd低至少10倍的第二結合結構域，其中，(i)所述第一和第二靶分子不具有相同的天然配體，(U)所述第一靶分子和所述第二靶分子各具有一種生物活性，該活性可相同或不同，和(iii)所述第一和所述第二結合結構域當結合所述第一和所述第二靶分子時分別調節所述第一和第二靶分子的一種或多種生物活性。一些實施方式中，所述第二結合結構域的Kd比所述第一結合結構域的Kd低至少50倍，而在其它實施方式中，所述第二結合結構域的Kd比所述第一結合結構域的Kd低IOO倍或更多倍。一些實施方式中，所述bsBA包含兩種抗體。在這些實施方式中的一些中，所述抗體是雙抗體、直接連接或通過接頭連接的兩條單鏈Fv、二硫鍵穩定的Fv或其組合。一些實施方式中，所述第一結合結構域結合腫瘤相關性抗原、細胞因子受體或生長因子受體。一些實施方式中，第一結合結構域結合選自EGFR或ErbB2的酪氨酸激酶受體。一些實施方式中，第二結合結構域結合ErbB3(HER3)、胰島素樣生長因子-1受體(IGF1-R)、FGF受體1-4中的任何一種、HGF受體、胰島素受體、PDGF受體a或p、C-KIT、或ErbB4。一些實施方式中，第一結合結構域結合EGFR，而所述第二結合結構域結合ErbB3(HER3)。一些實施方式中，所述第一結合結構域的Kd為1(T8-1(T12M。一些實施方式中，所述第一靶分子在靶細胞上的表達比其在正常細胞上的表達過度至少10倍。再在另一組實施方式中，本發明提供了一種含有(a)雙特異性結合劑(bsBA)和(b)藥學上可接受的載體的組合物，所述雙特異性結合劑包含與靶細胞上第一靶分子的Kd至少為1(T7M的第一結合結構域和與耙細胞上第二耙分子的Kd比所述第一結合結構域的Kd低至少IO倍的第二結合結構域，其中所述第一和第二靶分子不具有相同的天然配體，且其中，(i)所述第一耙分子和所述第二靶分子各具有一種生物活性，該活性可相同或不同，和(ii)所述第一和所述第二結合結構域當結合所述第一和所述第二耙分子時分別調節所述第一和第二靶分子的一種或多種生物活性。一些實施方式中，所述第二結合結構域的Kd比所述第一結合結構域的Kd低至少50倍，而在一些實施方式中，所述第二結合結構域的Kd比所述第一結合結構域的Kd低100倍或更多倍。在一些實施方式中，所述bsBA包含兩種抗體。在這些實施方式中的一些中，所述抗體是雙抗體、直接連接或通過接頭連接的兩條單鏈Fv、二硫鍵穩定的Fv或其組合。一些實施方式中，第一結合結構域結合腫瘤相關性抗原、細胞因子受體或生長因子受體。在一些實施方式中，所述第一靶分子在靶細胞上的表達比其在正常細胞上的表達過度至少10倍。再在另一組實施方式中，本發明提供了雙特異性結合劑(bsBA)在藥物制造中的應用，所述雙特異性結合劑包含與靶細胞上第一靶分子的Kd至少為10^M的第一結合結構域和與靶細胞上第二靶分子的Kd比所述第一結合結構域的Kd低至少10倍的第二結合結構域，其中所述第一和第二靶分子不具有相同的天然配體，其中所述第一靶分子和所述第二靶分子各具有一種生物活性，該活性可相同或不同，且所述第一和所述第二結合結構域當結合所述第一和所述第二靶分子時分別調節所述第一和第二靶分子的一種或多種生物活性。在一些實施方式中，所述第二結合結構域的Kd比所述第一結合結構域的Kd低至少50倍，而在其它實施方式中，它比所述第一結合結構域的Kd低IOO倍或更多倍。在一些實施方式中，所述bsBA包含兩種抗體。在這些實施方式中的一些中，所述抗體是雙抗體、直接連接或通過接頭連接的兩條單鏈Fv、二硫鍵穩定的Fv或其組合。一些實施方式中，所述被第一結合結構域和第二結合結構域結合的靶分子獨立選自腫瘤相關性抗原、細胞因子受體或生長因子受體，前提是第一結合結構域和第二結合結構域不結合相同的腫瘤相關性抗原、細胞因子受體或生長因子受體。在一些實施方式中，所述第一耙分子在耙細胞上的表達比其在正常細胞上的表達過度至少IO倍。在一些實施方式中，所述藥物用于抑制癌細胞增殖。附圖簡述圖1顯示了用于在293T細胞中表達C225-A5雙特異性抗體的兩種表達質粒A5CH/pSTH和C225Ck/pSTZ。圖2顯示了通過流式細胞術得到的C225-A5雙特異性抗體與A431癌細胞的結合。將A431細胞與1ug/mLC225-A5—起或不與抗體一起在冰上培育30分鐘，用AlexaFluor488標記的抗-人IgG抗體檢測并在FACSCalibur儀中量化。圖3顯示了雙特異性抗體濃度對AKT磷酸化的影響。對以高親和力結合EGFR而以低親和力結合ErbB3的C225-A5雙特異性抗體進行劑量反應試驗。將A431細胞與遞升濃度的C225-A5雙特異性抗體一起培育30分鐘，然后用調蛋白剌激5分鐘。然后用洗滌劑裂解腫瘤細胞并分析其AKT磷酸化。試驗數據表示為細胞裂解產物中AKT磷酸化的比例與抗體濃度的繪圖。該比例代表用抗體微陣列測定的樣品中磷酸化AKT的量占總AKT的量的比值。發明詳述概述目前免疫治療劑的一個問題是它們既結合于正常細胞又結合于患病細胞的傾向引起了不良副作用。因此，科學界的一個目標是開發結合于靶細胞(如患病細胞)而不結合非靶細胞(即正常細胞)的能力得到改進的免疫治療劑。本發明提供了組合物和方法，用于提高一類免疫治療劑結合靶細胞的特異性。意外的是，現在己經發現，可通過控制稱為雙特異性結合劑("bsBA")的兩個結合結構域的結合親和力的差異來提高bsBA免疫治療劑靶向患病細胞的特異性。因此，本發明的bsBA可用于提高或降低靶細胞上靶分子的生物活性，從而改進其調節靶細胞的生物活性而降低對非靶細胞相應活性的影響(如果有)的能力。顧名思義，bsBA具有兩個結合結構域，各自對不同的靶分子特異。通常用第一結合結構域使bsBA靶向選擇的細胞，有時稱為"靶細胞"。第二結合結構域結合于耙細胞上的第二靶分子。第二結合結構域與其靶分子的結合旨在調節特定生物作用(即提高或抑制該生物活性)。本領域已知能夠以不同方式調節生物活性的結合結構域。結合結構域與其靶分子的結合常常能抑制生物活性。例如，如果結合結構域結合的分子是細胞因子受體的一部分，那么結合結構域與該受體的結合可阻斷細胞因子到達該受體，從而抑制此結合誘導的生物活性。類似地，結合結構域與受體的結合可防止該受體形成異質二聚體，而異質二聚體的形成是完全活化某些細胞因子受體如白介素("IL")-2受體所必需的。或者，該結合結構域的結合可改變受體的構象，以使其不能結合其天然配體并從而被活化。相反，可選擇結合結構域以能通過結合受體來提高生物活性。例如，結合結構域與受體的結合可模擬天然配體對受體的作用，從而此結合激活了受體，或者結合結構域的結合可誘導構象改變，使低親和力受體變為其天然配體的高親和力受體。由于本發明的bsBA具有兩個結合結構域，因此可對它們進行選擇以實現所需效果。例如，可選擇都抑制酪氨酸激酶受體生物活性的結構域。或者，可選擇一個將抑制激酶受體的生物活性而另一個增強或激活需要其活性的另一種受體。能夠選擇對靶細胞上靶分子的活性具有所需效果的結合結構域提高了本發明方法的適用性。盡管本發明的bsBA的兩個結合結構域都用來調節靶細胞的生物活性，但本發明所述bsBA的第一結合結構域也可使bsBA耙向耙細胞，而第二結合結構域主要用于誘導對靶細胞的作用。因此，為了方便區分這兩個結構域，本文中有時將第一結合結構域稱為"耙向結構域"，而本文中有時將第二結合結構域稱為"效應器結構域"。類似地，為了方便區分這兩個結合結構域結合的分子，有時將效應器結構域的靶分子稱為"效應器耙分子"，而術語"靶分子"本身指靶向結構域的靶點。以前一般用與各相應靶分子具有最高可用親和力的結合結構域構建bsBA。本領域技術人員應理解，一個結構域不可能與另一結構域對相應靶點具有完全相同的親和力，因此，兩個結合結構域的親和力通常有差異。然而，這種差異一般不大，對結合的試劑作用可能顯著或不顯著。但是，在本發明方法和組合物中，選擇與其配體的結合親和力比效應器結構域與其配體的親和力高至少一個數量級的靶向結構域。即靶向結構域與它識別和結合的分子的親和力比效應器結構域與它識別和結合的分子的親和力高至少IO倍或更多。在一些實施方式中，耙向結構域與其配體的親和力比效應器結構域高至少15倍，在其它情況下高20倍或更多，在其它實施方式中，高25倍或更多，在一些實施方式中，它的親和力比效應器結構域與其靶的親和力高30倍、40倍、50倍、甚至100倍或更高，更優選較高的親和力。由于本發明bsBA的兩個結合結構域的結合親和力至少相差一個數量級，所以本文偶爾將bsBA稱為"高-低(hi-lo)"bsBA。相對于現有雙特異性分子，耙點結合結構域和效應器結合結構域之間結合親和力的有意和顯著差異提供了意外和以前未識別的優點。如上所述，以前已知的雙特異性物質具有與靶配體的親和力盡可能高的結合部分。但是，與本發明組合物和方法相比，具有親和力相似的結合部分的雙特異性分子受限于它們可靶向的分子和它們可應用的情況。通過參照假想范例，可理解本發明的一些優點。考慮具有兩種受體A和B的癌細胞的情況，受體A在癌細胞上過量表達(與正常細胞相比)，受體B在正常細胞上表達的拷貝數與癌細胞上表達的基本相同。具有對兩種受體的親和力大約相等的結合結構域的雙特異性結合劑對癌細胞和正常非癌細胞的作用傾向于基本相等。具體說，在獲得高濃度bsBA的情況下尤其如此，因為bsBA傾向于通過單價結合使兩種受體飽和。相反，本發明bsBA具有耙向受體A的較高親和力靶向結構域和靶向受體B的較低親和力效應器結構域，并且與受體A的親和力比受體B高10倍、20倍、30倍、或甚至更多倍，因此本發明bsBA優先結合于癌細胞，并且通過正常的動力學相互作用，本發明bsBA將結合于更大量的癌細胞(與正常細胞相比)。因此，效應器結構域不會不加選擇地結合于攜帶受體B的細胞(包括大量正常細胞)，而是被選擇性遞送至癌細胞。因此，本發明能夠更有選擇地將效應器結構域靶向耙細胞。而且，親和力較高的結合結構域與受體A的結合使親和力較低的效應器結構域接近細胞表面，在接近細胞表面的地方它才能夠與受體B相互作用一段時間。這使效應器結構域能夠結合受體B，即使如果以"游離形式"(freestanding)、單價(或"一價")實體提供效應器結構域時，它與受體B相對低的親和力通常可能不足以使其維持在受體上。本領域技術人員將理解，抗體或其它配體的解離常數("Kd")由配體的k結合k解離確定。即，Kd代表抗體或其它配體結合于靶分子的時間和抗體或其它配體不結合的時間之間的平衡。因此，親和力低的結合結構域常常具有低親和力，因為它非常傾向于與其靶分子解離。在平衡期間，布朗運動、液體流動或其它動力學作用力作用于結合結構域分子可使未栓牢的結合結構域脫離其靶分子。bsBA的高親和力結構域栓住低親和力結構域有助于維持低親和力結構域接近其靶受體，從而有助于增加低親和力結構域能夠在任何時間點上結合其靶分子的概率。由于在此假想情況下本發明bsBA的低親和力結構域的耙分子是受體激酶，這有助于提高bsBA結合于靶受體激酶的能力，從而增加它們對耙細胞的生物學作用。在優選實施方式中，本發明bsBA的兩個結合結構域結合于通常不與相同配體結合的靶分子。本領域技術人員了解，一些配體如白介素IL-2被兩條不同的受體鏈結合，結合有IL-2的這兩條鏈然后相互作用形成有完全生物活性的單元。雖然指向這兩條受體鏈的bsBA可因此防止這種受體的完全活化，但此bsBA的兩個結合結構域當然指向同一受體。此外，雖然靶向相同受體兩條鏈的bsBA會千擾由該受體介導的生物活性，但靶向兩種不同受體的bsBA可調節這兩種受體的生物活性。據信，對兩種受體活性的影響會立即提供比干擾僅其中一種的活性更加有力的對靶細胞的影響。最后，bsBA與通過結合結構域結合的這兩個靶分子之間形成的三聚體具有額外優點使靶分子緊密地互相結合和防止通常它們通過細胞膜的脂質雙層擴散。相信bsBA使不同受體交聯本身有助于bsBA對耙細胞的細胞毒作用或細胞抑制效應。在一組實施方式中，bsBA的靶向結構域結合于優先在與疾病或失調相關的靶細胞(如乳腺癌細胞)上表達或過量表達的細胞表面受體，效應器結構域結合于在耙細胞和非靶細胞上不加選擇地或普遍表達的細胞表面受體。本發明bsBA可靶向的示范性細胞表面受體在下文中描述。在優選實施方式中，使靶向結構域結合的分子在耙細胞上表達的水平高于該分子被效應器結構域結合的水平。因此，本發明bsBA和方法特別可用于提高效應器分子特異性遞送至含有靶分子的細胞，所述靶分子會被常規抗體或雙特異性試劑或二者不加選擇地結合。本領域技術人員熟知，與另一種不同癌癥類型的細胞相比，不同的癌細胞可過量表達不同的抗原或不同程度地過量表達相同抗原。因此，在設計本發明bsBA中，考慮到實施者可選擇耙向結構域，該耙向結構域能靶向在具體bsBA靶向的具體細胞上過量表達的細胞表面受體。在一些實施方式中，bsBA的靶向結構域結合于第一細胞表面受體，該受體優先在與疾病或失調相關的靶細胞(如癌細胞)上表達或過量表達，效應器結構域結合于與正常細胞相比、在患病細胞(如癌細胞)上過量表達的第二細胞表面受體，但第二細胞表面受體的表達水平低于第一細胞表面受體。在這些實施方式中，第一和第二細胞表面受體表達水平的差異再一次改進了效應器分子向含有靶分子的細胞的特異性遞送。如背景部分所述，即使HER2在乳腺癌細胞中過量表達的水平是正常細胞上表達水平的約10-100倍，但仍然觀察到患者中免疫治療劑賀賽汀@與正常細胞結合引起的一些副作用。因此，即使靶分子大量過量表達也不一定足以保持高親和力結合劑不與正常細胞結合而產生副作用。相反，本發明bsBA中選擇的靶向結構域與其靶分子的親和力比效應器結構域與其靶分子的親和力高至少10倍、常常高更多倍。靶向結構域與其靶分子的解離常數優選為1(T8-1(T12M。選擇耙分子是因為它不存在于正常細胞上，或者因為與正常細胞相比它在癌細胞上高度過量表達，優選比正常細胞上的表達過量至少20倍，甚至更優選100倍。如上所述，由于靶向結構域與靶分子的親和力高，它傾向于使bsBA優先結合于耙細胞。因此，預計效應器結構域可耙向正常細胞上表達的耙分子，仍能實現選擇性結合，提供大于常規bsBA的治療窗。本領域技術人員應理解，具體說，癌細胞傾向于上調許多正常蛋白的表達，包括具有維持正常細胞體內穩態的作用的許多蛋白。因此，即使通常認為不是癌或腫瘤抗原的蛋白質在癌細胞上也傾向于上調。例如，與正常細胞相比，不認為是腫瘤抗原的胰島素受體在腫瘤細胞中常常上調3-5倍(參見例如Milazzo等，CancerRes.52(14):3924-30(1992》。又例如，與正常細胞相比，ErbB3受體在一些癌細胞上有些過量表達。然而，當耙向結構域指向過量表達程度更高的耙分子時，ErbB3受體可用作bsBA的效應器靶分子。實施例公開了本發明示范性bsBA，其中靶向結構域指向EGFR，效應器結構域靶向ErbB3。需要靶向結構域指向在靶細胞上過量表達的靶分子(如癌抗原)，而效應器結構域指向表達水平低于靶向結構域的靶分子的分子(如受體激酶)。雖然僅需要靶分子的表達水平高于效應器結構域靶向的分子，通常，靶分子表達和效應器分子表達之間的顯著性差異是有利的，因為在bsBA濃度低于靶向結構域的Kd時可使效應器分子飽和。通常，靶向結構域的靶分子的過量表達水平比非靶細胞上該分子的表達水平優選高10倍、20倍、50倍、IOO倍或更多倍，更優選較高水平。通常，還優選效應器分子表達水平等于非靶細胞上的表達水平，或者，如果效應器分子過量表達，它的過量表達水平是非耙細胞的2-5倍。換句話說，相對于效應器結構域結合的分子，革巴向分子表達(或過量表達)水平優選較高。當靶細胞是患病細胞如癌細胞時，相對于與癌細胞起源的組織類型相同的正常細胞上相同分子的表達來衡量靶分子的表達水平。即，如果該患病細胞是乳腺癌細胞，就相對于正常乳腺細胞衡量表達水平，而相對于正常卵巢細胞上的表達水平衡量卵巢癌細胞中分子的表達水平。通常，采用細胞群體，測定表達水平的平均值(如每個細胞上表達的分子數)。而且，在一些優選實施方式中，選擇具有可通過效應器結構域結合來調節其生物活性的效應器結構域識別和結合的細胞表面抗原。例如，效應器結構域靶向的細胞表面抗原可以是細胞因子或生長因子受體，用結構域阻斷所述抗原將有助于使靶細胞恢復正常表型。用這種方法，baBA的治療效果可超過單獨使用單個結構域產生的效果。例如，當采用上述示例性bsBA時，這兩個結構域各阻斷不同的細胞因子受體。預計受體的阻斷將導致被受體活化的通路下調，降低細胞的增殖速率。如上所述，也知道抗體可用作細胞因子受體等的激動劑；g卩，它們的作用能提高耙分子活性。因此，根據實施者選擇的靶分子和結合劑，本發明bsBA的一個結合結構域可抑制其耙分子的活性，而另一結合結構域可增強其耙分子的活性。在其它實施方式中，選擇的兩個結合結構域將抑制其各自的分子的活性，而在其它實施方式中，選擇的結合結構域將增強它們各自的靶分子的活性，所述靶分子可以是相同或不同的。能夠選擇提高或降低效應器結構域的靶分子活性的結合結構域為實施者提供了設計有效用于一系列情況的bsBA的相當大的彈性。為了說明在實施者看來可通過明智地選擇結合劑而提高或降低耙分子的活性，本文中有時將bsBA對靶分子的作用稱為"調節"靶分子的活性。例如，一些癌癥由編碼用作酪氨酸激酶的受體的基因突變引起，導致受體變成組成性活化或過量表達，以致于細胞比具有正常受體或具有以正常量表達的受體的情況下增殖得更多。為了降低此受體活性，在此范例中，實施者可選擇結合劑，其中已知該結合劑能通過結合而改變組成性活化受體的構象以降低其活性，或者在過量表達受體的情況下，僅阻斷它與其天然配體的結合，從而防止過量表達導致的靶細胞中信號轉導的不適當增加。相反，如果耙分子是需要提高其活性的分子，實施者可選擇已知其結合能用作該活性的激動劑的結合劑。使用具有一個高親和力結合結構域的bsBA足以特異性結合感興趣的細胞。研究證明，含有指向一個靶分子的兩個高親和力結合結構域的結合劑的親和力僅約為含有同一結合結構域的一價結合劑的親和力的3倍。Nielsen,U.等，CancerRes.60(22):6434-40(2000)。單位結合劑的Kd通常為納摩爾濃度。由于治療劑的給予量一般高到微摩爾濃度，它是結合劑Kd的一千倍，所以相對于高親和力靶向結構域的Kd，高濃度的結合劑預期可允許結合劑與攜帶耙分子的耙細胞結合。因此，預期本發明bsBA的高親和力靶向結構域能在給藥條件下提供bsBA的特異性結合。預計實施者可選擇耙向結構域和效應器結構域的靶分子的適當組合。雖然以下描述了許多優選的靶分子和效應器靶分子，但列舉出一些優選的靶分子和效應器靶分子可能是有幫助的。一些優選的耙分子是EGFR和ErbB2。一些優選的效應器耙分子是ErbB3、ErbB4、成纖維細胞生長因子(FGF)受體1-4中的任何一種、肝細胞生長因子受體、胰島素樣生長因子1受體(IGF1-R)、胰島素受體、血小板衍生生長因子(PDGF)受體a和p、或C-KIT。本領域已知這些分子，在隨后的章節中用SWISS-PROT數據庫中的參比號碼標識各分子。定義以S國際單位制聯合會(SI)接受的形式表示單位、前綴和符號。數字范圍包括限定該范圍的數字。除非另有說明，核酸從左至右是5，至3'取向；氨基酸序列從左至右是氨基至羧基取向。本文提供的標題并不限制本發明的各個方面或實施方式，它們可參考整個說明書。因此，以下所定義的術語更全面的定義需參照整個說明書。本文未限定的術語具有本領域技術人員所理解的通常含義。一般根據解離常數或"Kd"說明結合劑的"親和力"。有用的結合劑的Kd—般是納摩爾濃度級。本領域技術人員應了解，Kd為10—SM的抗體的親和力是Kd為10^M的抗體的10倍，是Ka為10^M的抗體的親和力的IOO倍。因此，親和力較高的物質的Kd數值較小(即數值10-8小于1(T6)。"抗體"以完整的免疫球蛋白或以許多通過各種肽酶消化而產生的充分表征的片段存在。因此，例如，胃蛋白酶在絞鏈區的二硫鍵之下消化抗體從而產生Fab的二聚體F(ab)'2，Fab本身是通過二硫鍵與VH-CH結合的輕鏈。F(ab)'2在溫和條件下可被還原，絞鏈區中的二硫鍵被打斷從而將F(ab)'2二聚體轉變成Fab'單體。Fab'單體實質上是帶有部分絞鏈區的Fab(參見W.E.Paul編的《基礎免疫學》(FundamentalImmunology),RavenPress,N.Y.(1993)，以了解關于這些片段及其它抗體片段更詳細的描述)。盡管已經根據對完整抗體的消化定義了各種抗體片段，本領域的技術人員將了解，可通過化學方法或利用重組DNA法從頭合成這種Fab'片段。為了方便敘述，除非文中另有說明，本文所用術語"抗體"包括完整抗體、通過修飾完整抗體而產生或用重組DNA方法從頭合成的保留了抗原識別和結合能力的抗體片段、單克隆抗體、多克隆抗體和抗體模擬物。抗體可以是IgM、IgG(如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4)、IgD、IgA或IgE。術語"抗體片段"指包含完整抗體的一部分(通常是完整抗體的抗原結合區或可變區)的分子。抗體片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；螺旋-穩定的抗體(參見例如，Amdt等，JMolBiol312:221-228(2001);雙抗體(見下)；單鏈Fv("scFv"，參見例如，美國專利號5,888,773);二硫鍵穩定的抗體("dsFv"，參見例如，美國專利號5,747，654)和結構域抗體("dAb"，參見例如，Holt等，TrendsBiotech21(11):484-490(2003)，Ghahroudi等，FEBSLett.414:521-526(1997)，Lauwereys等，EMBOJ17:3512-3520(1998)，Reiter等，J.Mol.Biol.290:685-698(1999)，Davies和Riechmann，Biotechnology，13:475-479(2001))。術語"雙抗體"指具有兩個抗原-結合位點的小抗體片段，該片段包含可變重鏈結構域(Vh)，其在同一多肽鏈(VH-VL)中連接于可變輕鏈結構域(VL)。采用太短以致于不能使同一鏈上這兩個結構域之間配對的接頭，強迫這兩個結構域與另一條鏈的互補結構域配對，產生兩個抗原-結合位點。以下文獻中更全面地描述了雙抗體，例如，EP404,097;WO93/11161;和Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90:6444-6448(1993)。免疫球蛋白一般含有重鏈和輕鏈。重鏈和輕鏈各自含有恒定區和可變區(這些區域也稱為"結構域")。輕鏈和重鏈可變區含有由三個高變區(也稱為"互補決定區"或"CDR")間隔開的"構架"區。已限定了構架區和CDR的區域。參見，Kabat和Wu，同上。不同輕鏈或重鏈的構架區序列在物種內相對保守。抗體的構架區，即組成性輕鏈和重鏈的構架區組合，用于在三維空間中定位和排列CDR。CDR主要負責結合于抗原表位。各鏈的CDR—般稱為CDR1、CDR2和CDR3(從N末端開始依次編號)，一般也用具體CDR所在鏈識別。因此，VHCDR3位于發現它的抗體重鏈的可變區中，而VlCDR1是發現它的抗體輕鏈的可變區的CDR1。提到"VH"時或"V!;'指免疫球蛋白重鏈可變區，包括Fv、scFv、dAb、dsFv或Fab。提到"VL;'時或"VL"指免疫球蛋白輕鏈可變區，包括Fv、scFv、dsFv、dAb或Fab。術語"單鏈Fv"或"scFv"指傳統雙鏈抗體的重鏈和輕鏈的可變結構域連接在一起形成一條鏈的抗體。任選地，將接頭(通常是肽)插入兩條鏈之間以進行適當的折疊并產生活性結合位點。"雙特異性結合劑"或"bsBA"是能夠同時特異性結合一種以上類型的靶分子的結合分子。"結合劑"是能夠特異性結合靶分子的任何分子，包括抗體、抗體片段、適體、肽(如，Williams等，JBiolChem266:5182-5190(1991))和抗體模擬物，如可由第十種纖連蛋白III型結構域產生的模擬物(參見例如，Xu，L.，等，ChemBiol.9(8):933-42(2002)，Koide等，JMolBiol284:1141-1151，Skerra，JMolRecognit13:167-187(2000)，Main等，Cell,71:671-678(1992)和Dickinson等，JMolBiol，236:1079-1092(1994》，可包括天然蛋白質和經修飾或工程改造包含非天然殘基的蛋白質。在一組略為次優選的實施方式中，bsBA的一種或兩種結合結構域的"結合劑"可以是某受體的天然配體或者是該天然配體的保留了特異性結合該受體能力的片段(例如，IL-13可用作結合IL-13受體的結合劑)。"適體"通常指一種序列確定的寡核苷酸或所述寡核苷酸的混合物，其中所述混合物保持了特異性結合于耙分子的特性。因此，本文所用"適體"指一個或多個寡核苷酸序列。從結構上說，本發明適體是特異性結合的寡核苷酸。寡核苷酸不僅包括具有常規堿基、糖殘基和核苷酸間連接的寡核苷酸，也包括這三部分中任一部分或所有部分被修飾的寡核苷酸。納入本文作參考的美國專利號5,756,291描述了適體、制備和測試適體的方法，及其應用。本文所用"靶分子"指由本發明雙特異性結合劑的結合結構域特異性結合的分子。本文所用術語"第一靶分子"和"第二靶分子"指兩種不同分子種類的分子，而不是相同分子種類的兩種分子。這種分子種類可以是(例如)兩種不同的受體酪氨酸激酶(如堿性成纖維細胞生長因子受體1和肝細胞生長因子受體)。一些細胞因子受體和其它受體由稱為"鏈"的亞基組成，在一些情況下一旦該受體的配體結合于這些鏈之一后通過征集鏈使這些受體完全活化。如本文所用，認為具體受體(如IL-2受體)的所有鏈都來自相同的分子種類；因此，如果給定受體的鏈是本發明bsBA的第一結合結構域結合的"第一靶分子"，"第二靶分子"不可能是同一受體的第二條鏈。本文所用"生物活性"指耙分子進行的確定的已知活性。最常見的，被本發明bsBA靶向的分子的生物活性是信號轉導。例如，本說明書靠后一部分列舉了許多生長因子受體，作為可以是耙分子的分子。這些受體一般具有細胞胞外表面上的配體結合結構域、跨膜結構域和具有酪氨酸激酶酶活性的胞漿結構域。酪氨酸激酶活性一般由配體與配體結合結構域結合而激活。然后，受體激酶活性啟動信號級聯反應。因此，這些靶分子的生物活性是信號轉導。本領域技術人員將理解，靶分子的生物活性最終會影響靶分子所在細胞。例如，通過活化過量表達生長因子受體的癌細胞中的該受體而啟動的信號轉導級聯反應可能增加該細胞的生長和增殖，而抑制該受體的活性可能抑制或減慢其增殖。因此，本文所用術語"生物活性"也可更寬泛地與細胞活性聯用，與靶分子活性形成對比。在具體上下文中會明確指出其含義。出于本發明目的，可通過以下方式確定細胞表面上的給定分子是否具有生物活性。可將攜帶細胞表面分子的人細胞培養物分開形成兩份單獨培養物。使第一組培養物接觸特異性結合于細胞表面分子并且預計能阻斷任何天然配體與該分子結合的結合結構域。另一組培養物不接觸該結構域。然后在其它條件完全相同的情況下培養這兩組培養物。出于本發明目的，如果結合劑與該分子結合沒有引發細胞增殖、細胞活力、凋亡、激活下游激酶、轉錄激活、表面粘附或在軟瓊脂中產生集落的能力出現可觀察到的差異，則認為該靶分子沒有"生物活性"。可通過本領域熟知的標準試驗測定這些培養物在這些方面是否存在差別，下面會更加詳細地討論其中一些試驗。本文所用生物活性的"調節"指按實施者所需提高或抑制靶分子的生物活性。例如，如果靶分子是認為能增加癌細胞增殖的受體(如ErbB3受體)，那么實施者可能想用結合結構域結合于受體來抑制受體活性，阻斷該受體的天然配體與該受體結合。這些靶分子常常是與天然配體結合后用作酪氨酸激酶的受體。相反，如果靶分子的生物活性是實施者想要增加的一種活性，那么實施者可以(例如)用本領域已知抗體作為結合結構域，用作該耙分子的激動劑。結果應有利于治療的疾病或病癥；如治療惡性腫瘤和一些自身免疫病，所需作用通常是抑制細胞生長或誘導凋亡，或者可能是誘導某種細胞類型(如治療自身免疫病的T調節性T細胞)增殖。應理解，細胞表面受體具有特異性結合于這些受體的配體。因此，對于給定的受體，術語"天然配體"指在正常生理過程中結合于該受體的分子。例如，白介素("IL")-13是IL-13受體的天然配體，IL-2是IL-2受體的天然配體，表皮生長因子是EGF受體的天然配體，等等。術語"有效量"或"有效……的量"或"治療有效量"包括足以產生所需結果的藥物劑量，所需結果是例如抑制至少50%的細胞蛋白質合成或殺傷細胞。"效應器分子"定義為可用于在與結合分子如本發明bsBA的效應器結構域接觸時，通過(例如)信號轉導、磷酸化、誘導增殖或誘導細胞死亡而調節細胞行為的細胞表面受體。"Kd"是以下反應類型的反向速率常數和正向速率常數之比A+B=AB平衡時，平衡常數(K)等于反應物濃度除以產物濃度的結果，具有濃度單位。K^(濃度AX濃度B)/(濃度AB)與例如具有兩個結合結構域的完整免疫球蛋白G分子相反，"一價結合劑"和"一價結合組合物"定義為具有一個結合細胞表面標記的結構域的結合分子。一價結合劑一般是形成雙特異性抗體的兩個結合結構域之一的分離片段，如scFv、Fab'、單結構域抗體等。"耙細胞"是本發明雙特異性抗體結合劑以其高親和力靶向結構域優先結合的細胞。術語"接觸"包括布置上具有直接物理聯系。本領域通常理解，細胞以含有脂質雙層的質膜(通常稱為"細胞膜")為界，各種蛋白質如轉運蛋白、離子通道和細胞因子受體位于質膜中。通常參見Alberts等，MolecularBiologyoftheCell,GarlandPublishing,Inc.,紐約(第3版，1994)，第10章。可以認為細胞膜具有面向胞漿或細胞內部的表面和面向細胞外部或胞外空間的表面。跨膜蛋白常常是兩親性分子，即它們具有疏水性區域和親水性區域。通過膜的區域是疏水性區域，并且與包括雙層的脂質分子的疏水尾相互作用。親水性區域接觸膜的胞槳側或胞外側的水。跨膜蛋白的跨膜結構域是a螺旋或多條P鏈。參見例如Lodish等，MolecularCellBiology,W.E.Freeman&Co.，紐約(第4版，2000),第3早。"細胞因子"是一種細胞群體釋放的作為細胞間介質作用于同一細胞群體(自分泌)或另一細胞群體(旁分泌)的蛋白質的總稱。所述細胞因子的例子是淋巴因子、單核因子和傳統多肽激素。細胞因子包括生長激素如人生長激素、N-甲硫氨酰基人生長激素和牛生長激素；甲狀旁腺激素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素如促卵泡激素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH)、黃體生成素(LH);肝生長因子；成纖維細胞生長因子；促乳素；胎盤催乳素；腫瘤壞死因子(X和(3;米勒管抑制物；小鼠促性腺素相關肽；抑制素；活化素；血管內皮生長因子(VEGF);整聯蛋白；血栓形成素(TPO);神經生長因子如NGF-p;血小板衍生生長因子(PDGF);轉化生長因子(TGF)如TGF-a和TGF-P;胰島素樣生長因子(IGF)如IGF-I和IGF-II;紅細胞生成素(EPO);成骨誘導因子；干擾素如干擾素-a、-|3和-"集落刺激因子(CSF)如巨噬細胞-CSF(M-CSF);粒細胞-巨噬細胞-CSF(GM-CSF)和粒細胞-CSF(G-CSF);白介素(IL)如IL-1、IL隱la、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL9、IL-ll、IL-12;以及其它多肽因子，包括LIF和kit配體(KL，也稱為"青灰因子")。除非另有說明，本文提到抗體重鏈或輕鏈的氨基酸位置指采用"Kabat和Wu"系統的氨基酸編號。參見Kabat，E.等，《免疫學感興趣的蛋白質序列》(S叫uencesofProteinsofImmunologicalInterest)，U.S.GovernmentPrintingOffice，NIH出版號91-3242(1991)，納入本文作參考(在本文中Kabat和Wu的數據庫和編號系統也稱為"Kabat"系統和編號)。Kabat和Wu數據庫是本領域中最廣泛采用的抗體氨基酸殘基編號系統，現在該數據庫太大以致于不能方便地印刷。現在該數據庫以在線訂閱服務來維持，可通過輸入"11://"然后是'4111111皿0.1511^.11稱丄￡111/"找到。給定的重鏈或輕鏈的殘基以Kabat和Wu系統編碼的殘基編號不一定對應于從該鏈氨基末端計算出編號術語"殘基"或"氨基酸殘基"或"氨基酸"包括摻入蛋白質、多肽或肽(總稱為"肽")的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，除非另有限制，氨基酸可包括與天然存在的氨基酸作用方式相似的天然氨基酸類似物。當描述蛋白質時，"保守取代"指基本上不改變蛋白質活性的蛋白質的氨基酸組成改變。因此，具體氨基酸序列的"保守修飾的變異"指對蛋白質活性來說不重要的氨基酸的氨基酸取代或用具有相似特性的其它氨基酸進行氨基酸取代(如酸性、堿性、帶正電或帶負電、極性或非極性等)，以致即使取代了重要氨基酸也不顯著改變活性。本領域熟知提供功能上相似的氨基酸的保守取代表。以下表A中的六組各自含有互為保守取代的氨基酸表A1)丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T);2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q);4)精氨酸(R)、賴氨酸(K);5)異亮氨酸(1)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V);和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。也參見，Creighton，Proteins,W.H.FreemanandCompany,紐約(1984)。提到抗原時，術語"選擇性反應"和"選擇性結合"指整個或部分抗體優先與攜帶該抗原的細胞或組織結合，而不與缺少該抗原的細胞或組織結合。當然應了解，在分子與非靶細胞或組織之間可發生某種程度的非特異性相互作用。然而，可通過由抗原的特異性識別來介導而區分出選擇性反應。雖然選擇性反應抗體結合抗原，但它們的結合可能是低親和力結合。另一方面，特異性結合導致抗體和攜帶該抗原的細胞之間比結合抗體與缺少該抗原的細胞之間的結合得強得多。與缺少某靶抗原或標記的細胞或組織相比，特異性結合一般導致與攜帶該靶抗原或標記的細胞或組織結合的抗體量(每單位時間)多2倍、優選多5倍、更優選多10倍、最優選多100倍。在這種條件下特異性結合于蛋白質需要根據其對具體蛋白的特異性而選擇的抗體。多種免疫測定形式適合用于選擇與具體蛋白有特異性免疫反應性的抗體。例如，固相ELISA免疫測定通常用于選擇與某蛋白有特異性免疫反應性的單克隆抗體。參見Harlow和Lane，《抗體，實驗室手冊》(Antibodies,ALaboratoryManual),ColdSpringHarborPublications,紐約(1988)，其中描述了可用于測定特異性免疫反應性的免疫測定形式和條件。術語"免疫反應條件"包括以下條件針對具體表位產生的抗體結合于該表位的程度可檢測性高于與基本上所有其它表位結合的程度、和/或基本排除與基本上所有其它表位的結合。免疫反應條件取決于抗體結合反應的形式，一般是免疫測定方案中所用條件或體內所處條件。參見Harlow和Lane，同上，其中描述了免疫測定形式和條件。用于本發明方法的免疫反應條件優選為"生理條件"，包括活哺乳動物或哺乳動物細胞內的一般條件(如溫度、滲透壓、pH)。雖然了解一些器官可處于極端條件下，但生物體內和細胞內的環境通常約為pH7(即pH6.0-pH8.0，更一般是pH6.5-7.5)，含有水作為主要溶劑，并存在于0'C以上和5(TC以下的溫度中。滲透壓在支持細胞存活和增殖的范圍內。將bsBA偶聯于治療劑或標記雖然bsBA與其配體的結合本身可通過(例如)阻斷細胞因子接觸其受體來調節靶細胞的生物活性，但可通過將治療劑偶聯于bsBA來增強bsBA對生物活性的作用。因此，在一些實施方式中，使bsBA衍生化，以引入允許連接治療劑的官能團。可使bsBA衍生化，以引入(例如)以酰肼、肼、伯胺或仲胺基團為末端的側鏈。可通過(例如)席夫堿(Schiffsbase)連接、腙或酰腙鍵、或酰肼接頭偶聯治療劑(參見例如，美國專利號5,474,765和5,762,918，特別將各文獻納入本文作參考)。本領域熟知許多適合用于將治療劑與本發明bsBA偶聯的化學方法，如Hermanson，G.，《生物偶聯技術》(BioconjugateTechniques),AcademicPress,加利福尼亞州圣地亞哥(1996)所述。治療劑可選自例如抗腫瘤劑、抗代謝劑、放射性物質、細胞毒劑或化療劑。細胞毒劑包括抗癌劑，例如吉西他濱；甲氨蝶呤；5-FU;FUDR;FdUMP;羥基脲；多西他賽；discodermolide;大環內酯類；長春新堿；長春堿；長春瑞濱；meta-pac;伊立替康；SN-38;10-OH喜樹堿；拓撲替康；依托泊甙；多柔比星；黃酮吡醇；順鉑；卡鉑；博來霉素；絲裂霉素C;普卡霉素；卡培他濱；阿糖胞苷；2-氯-2'脫氧腺苷；米托蒽醌；米托唑胺；噴司他丁和雷替曲塞。還可修飾或標記本發明bsBA以有利于診斷或治療應用。例如，可檢測性標記如放射性標記、熒光標記、重金屬標記或其它標記可偶聯于本發明bsBA。bsBA的單標記、雙標記或多標記可能是有利的。例如，bsBA可以是通過以下方式雙標記的放射性碘化一個或多個殘基并且通過螯合基團將(例如fV與含胺-側鏈或反應性基團偶聯。此組合標記可用于特殊診斷需要，如鑒定廣泛散布的小腫瘤細胞團塊。放射性標記本發明bsBA的放射性同位素包括可偶聯或連接于bsBA殘基的任何放射性同位素。放射性同位素可選自發射P或Y射線的放射性同位素，或者，可修飾肽物質使其含有(例如)可共價連接于該類似物的賴氨酸殘基的螯合基團。然后可修飾該螯合基團，使其含有各種放射性同位素，如鎵、銦、锝、鐿、錸或鉈(如125I、67Ga、川Iti、"m丁c、169Yb、186^)。可用螯合基團將可檢測標記或其它分子間接偶聯于本發明bsBA。例如，可通過防止埃德曼降解的異硫氰酸酯卩-丙氨酸或合適的非a-氨基酸接頭將雙功能穩定螯合劑連接于一個或多個末端或內部氨基酸反應性基團。本領域已知的螯合基團的例子包括例如，亞氨基羧基(ininocarboxylic)反應性基團和聚氨基聚羧基反應性基團、DTPA(N,N-雙[2-[雙(羧甲基)氨基]乙基]甘氨酸)和DOTA(l,4,7,10-四氮雜環十二垸-1，4,7,10-四乙酸)。在癌癥診斷和治療方面，可用本發明bsBA制備診斷和成像組合物，以及將bsBA用于診斷和成像方法(如體內和體外診斷方法)的試劑盒。例如，可用診斷有效量的連接于體內診斷成像劑的bsBA使血管化腫瘤成像，所述bsBA至少包含結合于腫瘤細胞、腫瘤血管或腫瘤基質的可及(accessible)組分的第一結合分子。在疾病或失調是癌癥的另一優選實施方式中，可通過以下方式在癌癥治療前進行預成像(a)給予動物或患者診斷有效量的包含可檢測標記的本發明bsBA的藥物組合物，所述bsBA具有以高親和力結合于高表達的腫瘤細胞特征性受體、或者結合于腫瘤血管或腫瘤基質的第一結合分子，和以低至少一個數量級的親和力與第二普遍表達的受體(如ErbB3或ErbB4)結合的第二結合分子；和(b)然后檢測結合于腫瘤細胞、腫瘤血管或腫瘤基質的可檢測標記的bsBA;從而獲得腫瘤、腫瘤血管和/或腫瘤基質的圖像。不希望受限于理論，bsBA可通過與天然配體競爭與細胞表面受體的結合而降低、阻斷或抑制細胞信號轉導。在這種情況下，bsBA通過阻斷配體結合后誘導的細胞信號轉導而起作用。bsBA也可通過誘導細胞表面受體的內在化/下調而起作用。內在化/下調引起的細胞表面受體數量減少導致活化受體減少，這降低或防止了沿這些受體的信號轉導通路進行細胞信號轉導。最后，在需要受體二聚化進行信號轉導的情況下，bsBA可通過防止兩種細胞表面受體二聚化而起作用。選擇用作靶點和效應器的細胞標記用于靶向bsBA的細胞標記在靶細胞上的表達水平一般高于非靶細胞，或者不在非靶細胞上表達。例如，與非靶細胞相比，靶標記可在具體癌癥中高度過量表達，或者在非癌性細胞上不表達。優選地，靶標記參與涉及所需生物效應的細胞的生物功能。用作效應器的細胞標記一般參與細胞信號轉導，如生長因子、細胞因子或趨化因子受體，在給定病理條件下調節這些效應器是有利的。由于本發明高-低bsBA提供的選擇性，bsBA效應器結構域結合的標記的表達不需要被限定于靶細胞，也可以在生物的其它細胞上表達。測定Kd可用本領域已知的方法測定bsBA的結合分子的結合親和力，如納入本文作參考的美國專利號6,703,020所述。可通過競爭性結合試驗測定bsBA的第一和第二結合分子與其相應靶受體的結合親和力以及bsBA-受體復合物的脫離速率。競爭性結合試驗的一個例子是放射性免疫試驗，該試驗包括在遞增量的未標記受體的存在下，將(例如？H或1251標記的一種或兩種受體與感興趣的bsBA—起孵育，并檢測結合于標記受體的bsBA。可通過(例如)Scatchard圖分析從數據中確定感興趣bsBA與具體受體的親和力和結合脫離速率。也可用流式細胞術測定Kd，如Nielsen等(CancerRes.60(22):6434-40(2000))所述。實施例中列出了用于測定Kd的示范性試驗。I在優選方法中，通過用BIAcore表面等離振子共振系統(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)測定的結合和解離速率常數來確定bsAb的受體結合親和力。一般通過將合適量(如500共振單位)的bsBA固定在生物傳感器芯片(BIAcore)上測定bsBA與配體分子的親和力。一般在PBS中通過以下方法測定bsBA的結合和解離速率將25嗎/ml的bsBA注射到芯片表面上5分鐘，然后用緩沖溶液在芯片上沖洗5分鐘使結合劑質解離。可用(例如)BIAevaluation2.1軟件(BIAcore)分析結合動力學。出于測定具體bsBA是否屬于本發明范圍的目的，在形成bsBA后測定bsBA的結合結構域的親和力(與將其置入bsBA中之前單獨測定結構域的親和力相反)，以便測定結合結構域的相對親和力。測定所需生物學作用優選首先在體外測定本發明bsBA的所需治療或預防活性。例如，可用于證明bsBA的治療或預防用途的體外試驗包括bsBA對細胞系或患者組織樣品的作用。可用本領域技術人員已知的技術測定bsBA對細胞系和/或組織樣品的作用，包括例如細胞增殖試驗、細胞活力試驗、蛋白質磷酸化試驗、蛋白激酶活性試驗、凋亡試驗和蛋白質合成抑制研究等。可用抗體微陣列測定對蛋白通路中多種蛋白的作用。如Nielsen等(ProcNatlAcadSciUSA.，100(16):9330-5.(2003))("Nielsen2003")所述。然后在開始人類臨床試驗之前，測定bsBA在非人動物體內的功效。產生一價結合組合物當通過化學交聯產生bsBA時，非交聯片段本身是一價結合片段。在遺傳連接(即重組表達)的bsBA的情況下，可通過將單獨的結合蛋白克隆入可以表達和分離單價結合蛋白的表達載體中產生單價結合組合物。然后，可如上所述測定這種一價結合組合物的親和力。測定等效Kd可通過上述方法、用一價結合組合物測定等效Kd。比較bsBA和一價結合組合物的結合可對一價結合組合物和bsBA進行生物活性試驗，例如以評價其作為治療劑的有效性并比較bsBA的有效性。本領域已知這種試驗并取決于靶抗原。例子包括用調蛋白或其它生長因子活化后用ELISA或免疫印跡測定AKT磷酸化，生長抑制試驗(如WO89/06692所述)；或凋亡試驗。為了測定磷酸化，可用標準的免疫印跡測定結合分子對(例如)效應器分子本身或下游激酶活化的作用，或可采用抗體試驗，如Nielsen2003(同上)所詳述。為了測定凋亡，可在體外用標準電泳或檢測凋亡細胞中DNA缺口的TUNEL(末端脫氧核苷酸轉移酶dUTP缺口末端標記)試驗檢測DNA片段化。一旦細胞被固定，可用哺乳動物末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)原位檢測DNA鏈斷裂，TdT以不依賴模板的方式使標記的核苷酸共價結合于這些DNA片段的3'-羥基端。可用各種化學和生物試劑監測細胞活力和增殖。例如，細胞周期相關標記的抗體或基于熒光的細胞活力和增殖試驗如氣標記的胸苷試驗、臺盼藍排除試驗、ATCCBioproductsTMMTT細胞增殖試驗(美國模式培養物保藏所，弗吉尼亞州馬納薩斯)、或€^丁^1"-811^@細胞活力試驗(？1"01^§&，威斯康星州麥迪遜)。采用bsBA結合生長因子受體本發明bsBA的效應器結構域可結合許多分子。在一系列重要的實施方式中，效應器結構域結合細胞表面上的生長因子受體，如酪氨酸激酶受體。已知許多重要的生長因子受體和其配體(如屬于表皮生長因子(EGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、胰島素樣生長因子(IGF-I)、血小板衍生生長因子(PDGF)和血管內皮生長因子(VEGF)家族的受體和配體)的過量表達或不適當活化與疾病和失調如癌癥和自身免疫病的發生和發展相關或造成了這些疾病和失調。人們認為，這些生長因子以自分泌和/或旁分泌方式起作用，以刺激患病細胞的存活、增殖或遷移。生長因子與其受體結合導致該受體通過(例如)受體二聚化而活化，這導致受體自磷酸化，然后通過一系列不同信號轉導分子進行信號轉導。干擾這些細胞中生長因子的結合活性或酪氨酸激酶受體的活化可恢復非癌表型或降低患病細胞的增殖速率。即受體與本發明bsBA接觸能阻斷配體如生長因子與其細胞表面受體結合后產生的信號。bsBA通過防止或減少配體與受體結合，或通過防止或降低配體誘導的受體二聚化而防止或降低信號轉導通路的活化。可與bsBA效應器結構域結合以產生本發明方法中的有用結果的示范性酪氨酸激酶受體(括號中顯示了替代名稱)包括ALK(間變性淋巴瘤激酶)，間變性大細胞淋巴瘤(ALCL)中表達為嵌合NPM-ALK蛋白的一部分的酪氨酸激酶受體；盤蛋白結構域受體(DDR)，通過與凝集素盤蛋白I同源的獨特胞外結構域區分的受體酪氨酸激酶(盤蛋白受體酪氨酸激酶)(酪氨酸-蛋白激酶CAK)(細胞粘附激酶)(TRKE)(蛋白酪氨酸激酶RTK6)(CD167a抗原)；盤蛋白結構域受體2前體(受體蛋白-酪氨酸激酶TKT)(酪氨酸-蛋白激酶TYROIO)(神經營養性酪氨酸激酶，受體相關3);表皮生長因子受體(受體蛋白-酪氨酸激酶ErbB-l);受體蛋白-酪氨酸激酶erbB-2(pl85erbB2)(NEU原癌基因)(C-erbB-2);受體蛋白-酪氨酸激酶erbB-3前體(c-erbB3)(酪氨酸激酶型細胞表面受體)；受體蛋白-酪氨酸激酶erbB-4(pl80erbB4)(酪氨酸激酶型細胞表面受體)；堿性成纖維細胞生長因子受體l(FGFR-I)(bFGF-R)(Fms樣酪氨酸激酶-2)(c-fgr);FL細胞因子受體(酪氨酸-蛋白激酶受體FLT3)(干細胞酪氨酸激酶l)(STK-l)(CD135抗原)；肥大細胞/干細胞生長因子受體(SCFR;K原癌基因酪氨酸-蛋白激酶Kit)(C-Kit)(CD117抗原)；白細胞酪氨酸激酶受體(蛋白酪氨酸激酶-l);肝細胞生長因子受體(Met原癌基因酪氨酸激酶)(c-met)(HGF受體)(HGF-SF受體)；蛋白-酪氨酸磷酸酶-n(R-PTP-ri)(HPTPn)(J型蛋白-酪氨酸磷酸酶受體)(密度提高的磷酸酶-l)(DEP-l)(CD148抗原)；原癌基因酪氨酸-蛋白激酶受體ret(C-ret);酪氨酸-蛋白激酶跨膜受體RORl(神經營養性酪氨酸激酶，受體相關1);酪氨酸-蛋白激酶跨膜受體R0R2(神經營養性酪氨酸激酶，受體相關2);酪氨酸-蛋白激酶受體Tie-l;促血管生成素1受體(酪氨酸-蛋白激酶受體TIE-2)(酪氨酸-蛋白激酶受體TEK)(P140TEK)(內膜內皮細胞激酶)(CD202b抗原)；高親和神經生長因子受體(TRK1轉化酪氨酸激酶蛋白)(pl40-TrkA)(Trk-A);BDNF/NT-3生長因子受體(TrkB酪氨酸激酶)(GP145-TrkB)(Trk-B);NT-3生長因子受體(TrkC酪氨酸激酶)(GP145-TrkC)(Trk-C);血管內皮生長因子受體l(VEGFR-l)(血管通透性因子受體)(酪氨酸-蛋白激酶受體FLT)(Flt-l)(酪氨酸-蛋白激酶FRT)(Fms樣酪氨酸激酶1);血管內皮生長因子受體2(VEGFR-2)(激酶插入結構域受體)(蛋白-酪氨酸激酶受體Flk-l);禾口血管內皮生長因子受體3前體(EC2.7丄112)(VEGFR-3)(酪氨酸-蛋白激酶受體FLT4)。以下討論描述了關于尤其可用于與效應器結構域結合的酪氨酸激酶受體，以及可用本發明方法調節的其它受體家族的更具體信息。表皮生長因子受體(EGFR)/ErbB受體一次跨膜的酪氨酸激酶受體EGFR/ErbB家族由四個成員組成表皮生長因子受體(EGFR)、ErbB2(HER2/neu)、ErbB3(HER3)和ErbB4(HER4)。鑒定了能結合并激活ErbB受體的許多配體，它們都是不同基因的產物。這些受體和配體在正常細胞生長和分化中起到關鍵作用。異常信號轉導和/或ErbB受體蛋白活化不受調節與許多癌癥的發生和發展相關。可在各種上皮來源的實體瘤中發現功能障礙的ErbB受體通路介導的不受控制的細胞增殖，數據將腫瘤ErbB受體表達、過量表達和/或調節異常與晚期疾病、轉移性表型、化療耐藥性和總體預后較差相關聯。而且，數據也表明，ErbB受體涉及腫瘤入侵增加、抑制細胞凋亡、細胞粘附增加和新生血管發生。具體說，在更具侵襲性的乳腺癌、膀胱癌、肺癌和胃癌等癌癥中觀察到EGFR表達增力[](Modjtahedi和Dean，Int.J.Oncol.4:277-296，(1994))。人ErbB2過量表達與乳腺癌和卵巢癌(Slamon等，Science235:177-182(1987)和Slamon等，Science244:707-712(1989))以及胃癌、子宮內膜癌、唾液腺癌、肺癌、腎癌、結腸癌和膀胱癌相關。ErbB3水平顯著提高與某些人乳房腫瘤細胞系相關，這說明與ErbBl和ErbB2相似，ErbB3在人惡性腫瘤中起作用。具體說，發現ErbB3在乳腺癌(Lemoine等，Br.J.Cancer66:1116-1121，1992)、胃腸癌(Poller等，J.Pathol.168:275-280，1992;Rajkumer等，J.Pathol.170:271-278，1993;和Sanidas等，Int丄Cancer54:935-940，1993)和胰腺癌(Lemoine等，J.Pathol.168:269-273，1992和Friess等，ClinicalCancerResearch1:1413-1420，1995)中過量表達。最后，ErbB4表達增加也與人類癌癥如上皮來源的癌(包括乳腺癌)緊密相關。在許多情況下，在配體誘導受體異質二聚化后發生蛋白受體ErbB家族介導的信號轉導。異質二聚化后發生的"受體串話(cross-talking)"導致ErbB受體激酶結構域激活和ErbB受體交叉磷酸化，已知受體串話在(例如)EGFR和ErbB2、ErbB2和ErbB3以及ErbB2和ErbB4之間發生(參見例如，Wada等，Cell61:1339-1347(1990);Plowman等，Nature336:473-475(1993);Carraway和Cantley，Cell78:5-8(1994);Riese等，Oncogene12:345-353(1996);Kokai等，Cell58:287-292(1989);Stern等，EMBOJ.7:995-1001(1988);禾PKing等，Oncogene4:13-18(1989))。其中一個結合結構域結合ErbB2而另一個結合ErbB3的BsBA不是十分優選的。用于制備本發明bsBA的優選結合分子參見例如美國專利號5,183,884、5,480,968、5,968,511、5,977,322和6,512,097;Kraus等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:9193-9197(1989);歐洲專利申請號444,961Al;禾卩Kraus等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:2900-2904(1993)，各自納入本文作參考。治療方法的實施方式包括癌癥以及除了癌癥以外的疾病，如免疫病、神經病如神經纖維瘤病和周圍神經病、以及心臟病如心臟肥大。胰島素受體(IR)和胰島素樣生長因子受體(IGF-R)胰島素受體和IGF-1受體是緊密相關的蛋白質，它們是開發兩種主要疾病(糖尿病和癌癥)的新型治療劑的重要靶點。糖尿病是越來越重要的全球健康問題。它是世界衛生組織分類為流行病的唯一一種非感染性疾病。全球糖尿病發病率為2-3%，在美國和其它西方國家提高到6%。越來越多的證據證明，胰島素樣生長因子受體(IGFR)在某些癌癥和牛皮癬中起重要作用。通過這些受體下調信號轉導與以下發病機理有關，例如，腎母細胞瘤發生(Wilm'stumorigenesis)、肝母細胞瘤、肝癌、結直腸癌、乳腺癌、腺皮質癌、多發性骨髓瘤、淋巴瘤、白血病、前列腺癌和肺癌，它們對放療和化療有抗性。胰島素和IGF受體與ErbB受體家族緊密相關。胰島素樣生長因子受體(IGFR)參與維持身體許多細胞的正常功能。腫瘤細胞通常表達IGF-II受體，該受體可用作自分泌生長因子；偶爾甚至到達靶組織并引起腫瘤誘導的低血糖癥。在許多癌癥中通常過量表達IGF-I受體，許多最近的研究鑒定到從影響癌細胞增殖、粘附、遷移和細胞死亡的IGF-I受體開始的新信號傳導途徑；對癌細胞存活和轉移很重要的功能(參見例如，LeRo他等，CancerLett.195:127-137(2003))。仍未將IGF-I受體看作癌癥治療劑的可能耙點，因為許多正常細胞也表達此受體。科學證據說明，IGF-I受體抑制影響了與細胞增殖或腫瘤發生相關的多種胞內信號，并提供了解釋IGF-I受體抑制如何使腫瘤細胞對常規化療或其它抗癌劑更敏感的可能機制。也許最重要的是，抑制IGF-I受體的信號轉導在多發性骨髓瘤和其它惡性血液腫瘤的臨床相關小鼠模型中抑制腫瘤生長、延長患者存活期和提高化療的抗腫瘤作用。因此，應理解，以低親和力結合分子結合于IGF-I受體的bsBA將克服優先靶向IGF-I受體的現有技術治療劑的缺陷(即通過避免非靶、未患病細胞的IGF-I受體信號轉導的抑制)。在這種情況下，bsBA的高親和力結合分子優選結合于使bsBA特異性靶向患病細胞(如需要抑制IGF-I受體受過度刺激的細胞)的細胞表面受體。一旦優先靶向患病細胞后，bsBA的低親和力結合分子可結合于IGF-I并抑制與疾病相關的不適當的細胞信號轉導。晚期乳腺癌患者的治療方案常常包括釆用細胞毒性化療。IGF-I受體是細胞周期調節中的關鍵因子，它在晚期乳腺癌中常常過量表達，代表了這些癌癥中的主要靶點。也注意到，用抗-HER2/neu受體單克隆抗體(曲妥珠單抗，也稱為賀賽汀@)(它能抑制過量表達ErbB2的乳腺癌細胞生長)治療乳腺癌的患者，通常會產生對該抗體的抗性。觀察到活化細胞存活信號的胰島素樣生長因子-I(IGF-I)千擾了曲妥珠單抗的生長抑制作用。用本發明bsBA通過IGF-I受體而阻斷、降低或抑制細胞信號轉導后，可以恢復曲妥珠單抗誘導的生長抑制作用(參見例如，Lu等，J.Natl.CancerInst.93:1852-1857，2001)。因此，本發明bsBA的一個可能用途是靶向IGF-I受體信號轉導，以防止或延遲對曲妥珠單抗或者其它現有或未來的抗癌治療劑產生抗性。中樞神經系統(CNS)非典型畸胎樣/桿狀腫瘤(ATT/RhT)屬于預后最差和可能致死的兒科惡性腫瘤。迄今仍不能解釋它們對細胞抑制藥物和放療的顯著抗性。IGF-I受體在細胞存活、增殖、轉化和調節凋亡中起到重要作用。IGF-I受體保護癌細胞免受各種抗癌藥和射線誘導的凋亡，但當該受體被抑制劑如反義方案、顯性負突變體或形成三螺旋而阻礙時，腫瘤細胞會大量凋亡，導致在實驗動物模型中抑制腫瘤發生和轉移。靶向IGF-I受體的本發明bsBA可用于防止或降低通過活化IGF-I受體發生的信號轉導，從而治療疾病如癌癥。胰島素樣生長因子(IGF)-和雌激素受體(ER)-信號轉導途徑之間的串話導致協同生長。雌激素通過誘導IGF-I受體及其下游信號轉導分子和胰島素受體底物(IRS)-I和IRS-2的表達而增強了IGF信號轉導。雌激素誘導IGF-I受體和IRS表達導致IGF-I刺激后IRS-I的酪氨酸磷酸化增加，然后是促分裂原活化的蛋白激酶活化增加。這說明，IGF-I受體活化參與了雌激素-介導的生長和乳腺癌發病(參見例如，Lee等，Mol.Endocrinol.13:787-796，1999)。因此，耙向IGF-I受體的本發明bsBA可用于防止或降低通過活化IGF-I受體而發生的信號轉導，從而治療雌激素-誘導的乳腺癌。血管內皮生長因子受體(VEGFR)血管內皮生長因子(VEGF)是缺氧和癌基因突變誘導的多功能細胞因子。VEGF是在胚胎發生中產生和維持血管網絡的主要刺激物。它用作強效滲透性誘導劑、內皮細胞趨化齊U、內皮存活因子和內皮細胞增殖因子(Thomas，J.Biol.Chem.271:603-606，1996;禾口Neufeld等，FASEBJ.13:9-22，1999)。VEGF是在許多生理和病理過程中驅動新生血管發生或血管生成的重要因子，這些生理和病理過程包括傷口愈合(Frank等，1995;Burke等，1995)、糖尿病性視網膜病(Alon等，1995;Malecaze等，1994)、牛皮癬(Detmar等，1994)、動脈粥樣硬化(Inoue等，1998)、類風濕性關節炎(Harada等，1998;Nagashima等，1999)和實體瘤生長(Plate等，1994;Claffey等，1996)。多種細胞和組織都產生VEGF。VEGF二聚體以高親和力結合于兩種良好表征的受體VEGFRl(FLT-1)和VEGFR2(KDR/Flk-1)，它們在內皮細胞上選擇性表達(Flt-l和Flk-l是小鼠類似物)。VEGF與VEGFRl和VEGFR2結合的Kd分別為15-100pM和400-800pM(Terman等，1994)。最近鑒定到的第三種細胞表面蛋白一神經氈蛋白-1也以高親和力結合VEGF(如Soker等，Cell.92(6):735-45(1998))。VEGFRl和VEGFR2是III型受體酪氨酸激酶(RTKIII)家族的成員，該家族的特征是七個胞外IgG-樣重復、一次跨膜結構域和胞內分裂的酪氨酸激酶結構域(Mustonen和Alitalo，JCellBiol129:895-898(1995))。直到最近，認為VEGFRl和VEGFR2幾乎僅在內皮細胞上表達(同前)。最近的研究證明，VEGF、VEGFRl和VEGFR2各自是血管生成、新生血管發生和胚胎發育所必需的。VEGFRl對VEGF的親和力高于VEGFR2，但它的酪氨酸激酶活性較低。相信VEGF二聚體與VEGF受體結合能誘導受體二聚化。然后，受體二聚化引起特定酪氨酸殘基的自身轉磷酸化，這導致信號轉導級聯反應。仍不太清楚VEGF-誘導的信號轉導中再下游的胞內事件，但許多研究小組證明，在VEGF活化VEGFR2后產生一氧化氮(NO)(Kroll和Waltenberger，BiochemBiophysResCommun.252(3):743-6(1998))。也已證明，VEGF活化VEGFR2而非VEGFRl能激活Src和Ras-MAP激酶級聯反應，包括MAP激酶、ERK1禾tl2(Kroll和Waltenberger,JBiolChem.272(51):32521-7(1997))。用于制備本發明bsBA的優選結合分子參見例如，美國專利號5,840,301、5,874,542、6,703,020和WO99/40118，各自納入本文作參考。用于制備bsBA的優選結合分子是單克隆抗體2C3(ATCCPTA1595)。抗VEGF受體的RNA適體、反義分子和核酶也可用作bsBA中的結合分子。優選的RNA反義分子、適體和核酶參見例如，Saleh等，CancerRes.56(2):393-401(1996);Cheng等，ProcNatlAcadSciUSA.93(16):8502-7(1996);Ke等，IntJOncol.12(6):1391-6(1998);和Parry等，NucleicAcidsRes.27(13):2569-77(1999);各自納入本文作參考。使用本發明的組合物和方法尤其可用于患有以下疾病或處于發生以下疾病的風險中的動物和患者(如人患者)任何形式的血管化腫瘤；黃斑變性，包括與年齡相關的黃斑變性；關節炎，包括類風濕性關節炎；動脈粥樣硬化和動脈粥樣硬化斑塊；糖尿病性視網膜病和其它視網膜病；甲狀腺增生，包括格雷夫斯病；血管瘤；新生血管性青光眼和牛皮癬，這些疾病與VEGF受體的不適當或過度活化相關。使用本發明的組合物和方法還可用于治療患有以下疾病或處于發生以下疾病的風險中的動物和患者動靜脈畸形(AVM)、腦膜瘤和血管再狹窄，包括血管成形術后再狹窄，也與VEGF受體的不適當或過度活化相關的疾病。所考慮的治療方法和應用的其它靶點是患有以下VEGF受體相關性疾病或處于發生這種疾病的風險中的動物和患者血管纖維瘤、皮炎、子宮內膜異位、血友病性關節、肥厚性瘢痕、炎性疾病和失調、化膿性肉芽腫、硬皮病、滑膜炎、沙眼和血管粘附。上述治療組并未窮舉可用本發明bsBA治療的疾病。納入本文作為參考的美國專利號5,712,291公開了當效應器結構域指向VEGF受體之一時可用本發明bsBA有效治療的許多其它疾病的鑒定方法。而且，可用具有結合VEGFR的效應器結構域的本發明bsBA治療的其它疾病可參見(例如)美國專利號6,703,020，納入本文作參考。腫瘤壞死因子受體(TNFR)腫瘤壞死因子(TNF)a和(3是通過TNF受體調節許多生物學過程(包括保護免受感染以及誘導休克和炎性疾病)的細胞因子。TNF分子屬于"TNF-配體"超家族，與其受體或反配體('TNF-受體"超家族)一起起作用。迄今為止，鑒定了TNF配體超家族的九個成員，表征了TNF受體超家族的十個成員。這些配體包括TNF-、淋巴毒素-(LT-，也稱為TNF-p)、LT-P(在復合型異質三聚體LT-2-(3中發現)、FasL、CD40L、CD27L、CD30L、4-lBBL、OX40L和神經生長因子(NGF)。TNF受體超家族包括p55TNF受體、p75TNF受體、TNF受體相關蛋白、FAS抗原或APO-I、CD40、CD27、CD30、4-lBB、OX40、低親和p75和NGF-受體(參見例如，A.Meager，Biologicals22:291-295，1994)。活化的T細胞使TNF-配體超家族的許多成員得以表達，說明它們是T細胞與實現細胞個體發生和功能的其它細胞類型相互作用所必需的。(Meager1994，同上)。對TNF受體家族幾個成員的必要功能的深入了解獲自鑒定和產生了消除這些蛋白表達的突變。例如，FAS抗原和其配體中天然產生的突變引起淋巴組織增生病(參見例如，Watanabe-Fukunaga等，Nature356:314，1992)，可能反映出程序化細胞死亡失敗。CD40配體的突變引起X-聯鎖免疫缺陷疾病，特征是血漿中高水平的免疫球蛋白M和低水平的免疫球蛋白G，表明錯誤的T細胞依賴性B細胞活化(參見例如，R.C.Allen等，Science259:990，1993)。低親和神經生長因子受體的耙向突變引起一種疾病，其特征是外圍結構的錯誤的感受創新(sensoryinnovation)(參見例如，Lee等，Ce歸:737，1992)。TNFR配體TNF和LT-能夠結合于兩種TNF受體(55-和75-kdTNF受體)。TNF和LT-(通過它們的受體)引發的大量生物學作用包括移植腫瘤的出血性壞死、細胞毒性、在內毒素性休克中的作用、炎癥、免疫調節、增殖和抗病毒反應、以及保護免受電離輻射的有害作用。TNF和LT-參與了多種疾病的發病機理，包括內毒素性休克、腦型瘧、腫瘤、自身免疫病、AIDS和移植物-宿主排斥(Beutler和VonHuffel，Science264:667-668，1994)。p55受體中的突變引起對微生物感染的易感性增加。另一種TNFR，TNF-相關性凋亡誘導配體或"TRAIL"在許多人組織中表達(如脾、肺、前列腺、胸腺、卵巢、小腸、結腸、外周血淋巴細胞、胎盤、腎)。據證明，TRAIL獨立于FAS配體起作用，并快速激活凋亡，其激活凋亡的時間范圍類似于Fas/Apo-lL死亡信號途徑，但比TNF-誘導的凋亡快得多。已知腫瘤壞死因子(TNF)家族配體屬于最多效的細胞因子，誘導許多細胞應答，包括細胞毒性、抗病毒活性、免疫調節活性和幾種基因的轉錄調節。對TNF-家族配體的細胞應答不僅包括正常生理應答，還包括與凋亡增加或凋亡抑制相關的疾病。凋亡-程序性細胞死亡是參與清除免疫系統的外周T淋巴細胞的生理機制，其失調可導致許多不同的病理過程。與細胞存活增加或凋亡抑制相關的疾病包括癌癥、自身免疫病、病毒感染、炎癥、移植物抗宿主病、急性移植排斥和慢性移植排斥。與凋亡增加相關的疾病包括AIDS、神經變性疾病、骨髓發育異常綜合征、局部缺血傷口、毒素誘導的肝病、感染性休克、惡病質和食欲缺乏。可制備本發明bsBA，使兩個結合結構域中至少一個特異性結合于TNFR。那么，這種bsBA可通過活化TNFR如結合TNFR，而促進凋亡以及防止或降低不適當的細胞生長(如在癌癥的情況下)，從而可用于治療以下疾病的方法中癌癥、自身免疫病、病毒感染、炎癥、移植物抗宿主病、急性移植排斥和慢性移植排斥。在優選實施方式中，bsBA的結合分子之一結合于TNFR，第二結合分子結合于已知在耙細胞上表達的第二受體(如第二不同的TNFR，或疾病特異性受體)。在癌癥的情況下，優選的第二受體是ErbB家族的受體，如ErbB2。優選的是，結合TNFR的bsBA結合分子的親和力比第二結合分子對其受體的親合力低。或者，可制備本發明bsBA，以使bsBA的兩個結合分子中至少一個特異性結合于TNFR，(例如)通過阻斷配體與TNFR結合防止和減少了TNFR活化。那么，這種bsBA可通過(例如)防止和減少配體與TNFR結合而防止和減少TNFR活化，從而防止或減少凋亡，從而用于治療以下疾病的方法中AIDS、神經變性疾病、骨髓發育異常綜合征、局部缺血傷口、毒素誘導的肝病、感染性休克、惡病質和食欲缺乏。優選地，用兩種結合分子中至少一種特異性結合于TNFR的bsBA治療顯示出凋亡增加的疾病(如局部缺血傷口)。在優選實施方式中，bsBA的靶向結構域指向靶細胞上表達的抗原或第二受體(即除了TNFR以外的受體)，它用于使bsBA耙向耙細胞。成纖維細胞生長因子受體(FGFR)成纖維細胞生長因子(FGF)信號傳導途徑是正常發育和傷口愈合的重要部分。FGF通過細胞表面受體產生其作用，其是酪氨酸激酶家族成員。在人類中鑒定了4種不同的成纖維細胞生長因子受體(FGFR)(FGFR1-FGFR4)。FGFR在二聚化后通過自磷酸化而活化。在硫酸乙酰肝素的存在下配體結合后發生二聚化，導致FGFR的胞質結構域中幾個酪氨酸殘基磷酸化。FGFR的磷酸化激活激酶活性并導致MAPK、PD激酶和Statl/3通路激活。FGFR基因中的突變一般產生獲能(gain-of-function)突變，造成由于受體被不適當活化引起的疾病或失調。FGFR突變與幾種發育失調相關，包括例如發否綜合征、杰-韋綜合征(Jackson-WeissSyndrome)、克魯宗綜合征、阿佩爾綜合征、Beare-StevensonCutisGyrata綜合征、塞-科綜合征、軟骨發育不全、侏儒性發育不良、軟骨發育不良、Muenke綜合征以及嚴重性軟骨發育不全伴發發育遲緩和黑棘皮病(SADDAN)的發育異常。通過免疫組化與正常組織比較時也發現FGFR在許多腫瘤樣品中過量表達。例如，在原發性結直腸癌、胰腺癌、乳腺癌和結腸癌中鑒定到FGFR過量表達。FGF分子用作促分裂原因子、新生血管發生因子和抗凋亡因子，并可能參與了癌癥發生。可制備本發明bsBA，以使bsBA的兩個結合分子中至少一個特異性結合于FGFR，(例如)通過阻斷配體與FGFR結合或者防止或減少FGFR二聚化而防止和減少FGFR的活化。那么，這種bsBA可用于通過防止或減少FGFR活化而治療以下疾病的方法中發否綜合征、杰-韋綜合征、克魯宗綜合征、阿佩爾綜合征、Beare-StevensonCutisGyrata綜合征、塞-科綜合征、軟骨發育不全、侏儒性發育不良、軟骨發育不良、Muenke綜合征以及嚴重性軟骨發育不全伴發發育遲緩和黑棘皮病(SADDAN)的發育異常、原發性結直腸癌、胰腺癌、乳腺癌和結腸癌。在優選實施方式中，bsBA的靶向結構域指向靶細胞上表達的第二受體(即除FGFR以外的受體)，該耙向結構域用于使bsBA靶向靶細胞。血小板衍生生長因子受體(PDGFR)PDGFR家族能活化下游信號轉導酶，這些酶刺激結締組織細胞如血管平滑肌細胞(VSMC)、少突膠質細胞(包裹神經纖維的組織的細胞)和軟骨細胞的生長和運動。PDGFp受體是指導VSMC分化所必需的。PDGFR通路的過量表達與多種嚴重疾病(包括動脈粥樣硬化和癌癥)相關，這些疾病與PDGFR的不適當活化或活化增加有關。或者，可能需要促進PDGFR活化，以促進骨、牙周組織、韌帶和軟骨的修復。可制備本發明bsBA，以使bsBA的兩個結合分子中至少一個特異性結合于PDGFR，(例如)通過阻斷配體與PDGFR結合而防止和減少PDGFR活化。那么，這種bsBA可用于通過防止或減少PDGFR活化而治療以下疾病的方法中如動脈硬化和癌癥。在優選實施方式中，bsBA的第二結合分子指向靶細胞上表達的第二受體(即除了PDGFR以外的受體)，它用于使bsBA靶向靶細胞。優選地，結合PDGFR的bsBA結合分子的親和力比第二分子與其受體的親和力低。或者，可制備本發明bsBA,以使bsBA的兩個結合分子中至少一個特異性結合于并活化PDGFR。那么，此種bsBA可用于通過活化PDGFR而促進骨、牙周組織、韌帶和軟骨的修復的方法。在優選實施方式中，bsBA的效應器結構域結合PDGFR，靶向結構域結合于已知在耙細胞上表達的抗原或第二受體(如第二不同的PDGFR，或骨-、牙周組織-、韌帶-或軟骨-特異性受體)。C-Kit受體(也稱為青灰因子受體)C-Kit原癌基因是黑色素細胞發育和增殖中重要的跨膜酪氨酸激酶類型的受體。原癌基因C-Kit編碼的跨膜酪氨酸激酶受體與血小板衍生生長因子PDGF/CSF-1(c-fms)受體亞家族有關。發現C-Kit在胚胎黑色素母細胞的正常生長和分化中起核心作用。黑色素細胞的惡性轉化和人黑色素瘤的進展與缺少C-Kit原癌基因表達有關。在腫瘤生長和人黑色素瘤侵入期間，C-Kit原癌基因編碼的酪氨酸激酶受體的表達逐漸降低。可制備本發明bsBA，以使bsBA的兩個結合分子中至少一個特異性結合于和活化C-Kit受體。那么，此種bsBA可用于治療(例如)黑色素瘤的方法中。在優選實施方式中，bsBA的靶向結構域指向耙細胞上表達的抗原或第二受體(即除了C-Kit受體以外的受體)，它用于使bsBA耙向耙細胞。Fc受體(FcR)Fc受體是抗原-抗體復合物或聚集的免疫球蛋白的特異性細胞表面受體，其結合免疫球蛋白分子Fc部分中的位點，并可能對具體免疫球蛋白類型具有特異性。在B細胞、K細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和嗜伊紅粒細胞上，以及在一些發育階段的T細胞上發現FcR;在K細胞、巨噬細胞和中性粒細胞上的FcR結合于與抗原結合的調理抗體并引發抗原的吞噬作用。已知人FcR與自身免疫病(如系統性紅斑狼瘡、自身免疫性血小板生成性紫癜、重癥肌無力、多發性硬化、葡萄膜炎和甲狀腺相關性眼病)和對過敏原的過敏反應的發生和發展相關。FcR的天然抑制負責維持外周耐受，從而防止發生自身免疫和自身免疫病。相反，FcR活化的缺陷產生保護性表型，將自身免疫與自身免疫病分開。可制備本發明bsBA，以使bsBA的兩個結合分子中至少一個特異性結合于FcR，(例如)通過阻斷FcR與免疫細胞上的Ig分子結合而防止和減少FcR的活化。那么，此種bsBA可用于治療以下疾病的方法中例如，自身免疫病，如系統性紅斑狼痛、自身免疫性血小板生成性紫癜、重癥肌無力、多發性硬化、葡萄膜炎和甲狀腺相關性眼病。bsBA的靶向結構域一般指向靶細胞上表達的抗原或第二受體(即除FcR以外的受體)，它用于使bsBA耙向耙細胞。用bsBA結合細胞因子受體在一組重要的實施方式中，可用靶向結構域或效應器結構域或者這兩者結合細胞表面上的細胞因子受體。可按需與bsBA的靶向結構域或效應器結構域結合以產生本發明方法的有用結果的示范性細胞因子受體(括號中顯示了可選名稱)包括細胞因子受體共同含有的y鏈(y-c)(白介素-2受體y鏈)(il-2ry鏈)(p64)(cd132抗原)；白介素-10受體a鏈(IL-10r-A)(IL-10r1);白介素-10受體p鏈(IL-10R-B)(IL-10R2)(n型細胞因子受體CRF2-4);白介素-12受體p-l鏈(IL-12R-(31)(白介素-12受體p)(IL-12受體(3組分)(IL-12RB1);白介素-12受體P-2鏈(IL-12受體P-2)(IL-12R-P2);白介素-13受體a-l鏈(IL-13R-a-l)(IL-13RA-l)(CD213al抗原)；白介素-13受體a-2鏈(白介素-13結合蛋白)；白介素-17受體(IL-17受體)；白介素-17B受體(IL-17B受體)(IL-17受體同源物l)(IL-17Rhl)(IL17Rhl)(細胞因子受體CRL4)(UNQ2501/PRO19612);白介素21受體前體(IL-21R);白介素-1受體，I型(IL-lR-l)(IL-lR-a)(P80)(抗原CD121a);白介素-1受體，II型(IL-lR-2)(IL-lR-[3)(抗原CDwl21b);白介素-1受體拮抗性蛋白(IL-lra)(IRAP)(ILl抑制物)(IL-1RN)(ICIL-1RA);白介素-2受體a鏈(IL-2受體a亞基)(P55)(TAC抗原)(CD25抗原)；白介素-2受體|3鏈(IL-2受體)(P70-75)(高親和力IL-2受體(3亞基)(CD122抗原)；白介素-3受體a鏈(IL-3R-a)(CD123抗原)；白介素-4受體a鏈(IL-4R-a)(CD124抗原)；白介素-5受體a鏈(IL-5R-a)(CD125抗原)；白介素-6受體a鏈(IL-6R-a)(IL-6Rl)(CD126抗原)；白介素-6受體(3鏈(IL-6R-p)(白介素6信號轉導物)(膜糖蛋白130)(gpl30)(制瘤素M受體)(CDwl30)(CD130抗原)；白介素-7受體a鏈(IL-7R-a)(CDwl27)(CD127抗原)；高親和力白介素-8受體A(IL-8RA)(IL-8受體1型)(CXCR-l)(CDwl28a);高親和力白介素-8受體B(IL-8RB)(CXCR-2)(GRO/MGSA受體)(IL-8受體2型)(CDwl28b);白介素-9受體(IL-9R);白介素-18受體l(ILl受體-相關蛋白)(IL-lRrp);白介素-1受體-樣1前體(ST2蛋白)；白介素-1受體-樣2(IL-lRrp2)(白介素-l受體相關蛋白2)(ILlR-rp2);Toll樣受體1(Toll/白介素-l受體-樣)(TIL);Toll樣受體2(Toll/白介素1受體樣蛋白4);Toll樣受體5(Toll/白介素-l受體樣蛋白3);CX3C趨化因子受體1(C-X3-CCKR-I)(CX3CRl)(Fractalkine受體)(GPR13)(V28)(P趨化因子受體樣l)(CMK-BRL-l)(CMKBLRl);C-X-C趨化因子受體3型(CXC-R3)(CXCR-3)(CKR-L2)(CD183抗原)；C-X-C趨化因子受體4型(CXC-R4)(CXCR-4)(基質細胞衍生因子1受體)(SDF-I受體)(融蛋白)(白細胞衍生的七次跨膜結構域受體)(LESTR)(LCR1)(FB22)(NPYRL)(HM89)(CD184抗原)；C-X-C趨化因子受體5型(CXC-R5)(CXCR-5)(伯基特淋巴瘤受體1)(單核細胞衍生的受體15)(MDR15);C-X-C趨化因子受體6型(CXC-R6)(CXCR-6)(G蛋白偶聯受體bonzo)(G蛋白偶聯受體STRL33);趨化因子結合蛋白2(趨化因子-結合蛋白D6)(C-C趨化因子受體D6)(趨化因子受體CCR-9)(CC-趨化因子受體CCR10);C-C趨化因子受體1型(C-CCKR-1)(CC-CKR-1)(CCR-1)(CCR1)(巨噬細胞炎性蛋白-la受體)(MIP-la-R)(RANTES-R)(HM145)(LD78受體)；C-C趨化因子受體2型(C-CCKR-2)(CC-CKR-2)(CCR-2)(CCR2)(單核細胞化學引誘物蛋白1受體)(MCP-1-R);C-C趨化因子受體3型(C-CCKR-3)(CC-CKR-3)(CCR-3)(CCR3)(CKR3)(嗜伊紅粒細胞趨化蛋白受體)；C-C趨化因子受體4型(C-CCKR-4)(CC-CKR-4)(CCR-4)(CCR4)(K5-5);C-C趨化因子受體5型(C-CCKR-5)(CC-CKR-5)(CCR-5)(CCR5)(HIV-I融合共同受體)(CHEMR13)(CD195抗原)；C-C趨化因子受體6型(C-CCKR-6)(CC-CKR-6)(CCR-6)(LARC受體)(GPR-CY4)(GPRCY4)(趨化因子受體樣3)(CKR-L3)(DRY6);C-C趨化因子受體7型前體(C-CCKR-7)(CC-CKR-7)(CCR-7)(MIP-3p受體)(EBV誘導的G蛋白偶聯受體1)(EBI1)(BLR2);C-C趨化因子受體8型(C-CCKR-8)(CC-CKR-8)(CCR-8)(GPR-CY6)(GPRCY6)(趨化因子受體樣1)(CKR-Ll)(TERl)(CMKBRL2)(CC-趨化因子受體CHEMR1);C-C趨化因子受體9型(C-CCKR-9)(CC-CKR-9)(CCR-9)(GPR-9-6);C-C趨化因子受體10型(C-CCKR-10)(CC-CKR-10)(CCR-10)(G-蛋白偶聯受體2);C-C趨化因子受體11型(C-CCKR-11)(CC-CKR-11)(CCR-11)(趨化因子受體樣1)(CCRL1)(CCXCKR);趨化因子受體樣1(G-蛋白偶聯受體DEZ)(G蛋白偶聯受體ChemR23)，趨化因子受體樣2(IL8-相關受體DRY12)(流動誘導的內皮G蛋白偶聯受體)(FEG-1)(G蛋白偶聯受體GPR30)(GPCR-BR);趨化因子XC受體1(XC趨化因子受體l)(淋巴細胞趨化蛋白受體乂G蛋白偶聯受體5)。用bsBA結合腫瘤相關性抗原在一組特別重要的實施方式中，bsBA的靶向結構域結合于腫瘤相關性抗原。顧名思義，腫瘤相關性抗原(TAA)—般是具體腫瘤細胞上表達的抗原，但這些抗原一般不在正常細胞中表達。TAA常常是僅在生物發育的特定階段上(如胎兒發育期間)在細胞中正常表達的抗原和在生物目前的發育階段中不適當表達的抗原，或者是在現在表達該抗原的器官的正常組織或細胞中不表達的抗原。本領域已知許多TAA，包括MART-1、癌胚抗原("CEA")、gp100、MAGE-1、HER-2和LewisY抗原，以及(例如)美國專利號5,922,566和6,020,478以及WO2004/016643A2中鑒定的抗原。適合用本發明bsBA靶向的其它腫瘤相關性抗原包括-造血分化抗原--通常與分化群(CD)分組相關的糖蛋白，如CD5、CD19、CD20、CD22、CD33、CD45、CD52和CD147;-細胞表面分化抗原，包括糖蛋白，如癌胚抗原(CEA，Swiss-Prot編號P06731)，唾液酸Tn糖蛋白(TAG-72)，多態性上皮粘蛋白(PEM)，上皮細胞粘附分子(Ep-CAM)，MUC-1，A33，G250，E-鈣粘著蛋A，前列腺特異性膜抗原(PSMA，Swiss-Prot編號Q04609)和前列腺特異性抗原(PSA)，糖脂，如神經節苷脂，如GD2、GD3、GM2)和糖，如血型相關抗原，包括LEY和LEb(LEY是"LewisY"，也稱為"CD174";它是在糖脂和糖蛋白的2型血型寡糖上發現的二巖藻糖基化四糖)；-生長因子受體，包括表皮生長因子受體(EGFR，ErbBl，Swiss-Prot編號P00533)和其突變形式EGFRvIII、ErbB2(HER-2/neu，Swiss-Prot編號P04626)、ErbB3(HER-3，Swiss-Prot編號P21860)和IL-2受體。-新生血管發生和基質抗原，包括成纖維細胞活化蛋白(FAP)、血管內皮生長因子受體(VEGFR)、腱生蛋白和整聯蛋白；和-Frizzled受體家族(如Fz-2)在一些實施方式中，bsBA的靶向結構域靶向結合TAA，而效應器結構域結合于生長因子受體。在一些優選實施方式中，靶向結構域靶向選自下組的分子CEA(Swiss-Prot編號P06731)、ErbB2(Swiss陽Prot編號P04626)、EGFR(Swiss-Prot編號P00533)、LewisY、MUC-l(Swiss-Prot編號P15941)、EpCAM(mAb17-1A(依決洛單抗，Panorex,GlaxoWellcomeGmbH)的耙點)、CA125(Swiss-Prot編號Q96RK2)、PSMA(Swiss-Prot編號Q04609)、TAG72抗體的耙點、CD20(Swiss-Prot編號PI1836)、CD19(Swiss-Prot編號P15391)、CD22(Swiss-Prot編號P20273)和CD36(Swiss-Prot編號P16671)。在一些優選實施方式中，效應器結構域結合于選自下組的分子ErbB3(Swiss-Prot編號P21860)、ErbB4(Swiss-Prot編號Q15303)、FGF受體l-4(Swiss-Prot編號P22455、P11362、P21802、P22607)、HGF受體(Swiss-Prot編號P08581)、IGFl誦R(Swiss-Prot編號P08069)、胰島素受體(Swiss-Prot編號P06213)、PDGF受體a和|3(Swiss-Prot編號分別為P16234、P09619)或C-KIT(Swiss-Prot編號P10721)。在一些尤其優選的實施方式中，靶向結構域結合于上一自然段所述分子，效應器結構域結合于本自然段所述分子。適體可如納入本文作參考的美國專利號5,756,291所述，制備結合分子之一或二者是適體的BsBA。通常通過"SELEX"("配體通過指數富集進行系統進化"的縮寫)法制備適體。這是重復的過程，用于鑒定所選擇分子靶點的適體。一開始，產生一個大的核酸分子"文庫"。在選擇步驟中，分離與感興趣耙點親和力最大的分子。使此核苷酸序列文庫暴露于細胞表面蛋白，孵育一段時間。洗掉文庫中與耙點親和力弱或無親和力的分子，從靶點上純化掉靶點結合分子(其中是親和力最高的適體)，用于SELEX方法的后續步驟。用酶學方法拷貝或"擴增"捕獲的純化序列，產生新的分子文庫，該文庫中大量富集了可結合靶點的分子。用富集的文庫啟動新一輪選擇、劃分和擴增。整個過程進行5-15個循環后，該分子文庫從1015個獨特序列減少到與感興趣細胞表面蛋白緊密結合的少量序列。然后，分離混合物中的單個分子，測定它們的核苷酸序列，并測定它們的結合親和力特性(主要是與抗體的結合親和力)。還常常提純適體，以清除不產生耙點結合或適體結構的核苷酸。截短至其核心結合結構域的適體的長度一般為15-60個核苷酸。可通過核苷酸接頭或化學交聯連接兩種適體，形成雙特異性適體，或者類似地，可將一種適體連接于抗體或抗體片段，形成嵌合抗體-DNA分子。通過化學交聯產生雙特異性BA可用本領域技術人員已知的常規偶聯方法連接雙特異性阻斷劑如雙特異性抗體的兩種結合分子，如Hermanson，同上所述。在一些實施方式中，用化學連接連接bsBA的這兩種結合分子。用化學連接制備的現有雙特異性抗體的一個例子見Brennan等，(Science,229:81(1985))，也可用于制備本發明bsBA。蛋白酶水解切割完整抗體，產生F(ab')2片段。在二巰基絡合劑亞砷酸鈉的存在下還原這些片段，以穩定鄰近的二巰基并防止形成分子間二硫鍵。然后將產生的Fab，片段轉變為硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后，再通過巰基乙胺還原將Fab'-TNB衍生物之一轉化為Fab'-硫醇，將其與等摩爾量的其它Fab'-TNB衍生物混合形成雙特異性抗體。產生的雙特異性抗體可用作選擇性固定酶的試劑。另一優選的化學連接采用雙馬來酰亞氨基己垸或雙馬來酰亞氨基乙烷來交聯。也可用重組方法制備含有-SH基團用于交聯的抗體片段(如Shalaby等，J.Exp.Med.，175:217-225(1992))，以避免蛋白酶水解切割全長抗體。通過重組或合成技術產生bsBA也可用重組技術制備BsBA。可通過任何合適方法制備編碼bsBA的核酸序列，這些方法包括例如，克隆合適序列或通過以下方法直接化學合成例如Narang等，Meth.Enzymol.68:90-99(1979)的磷酸三酉旨法；Brown等，Meth.Enzymol.68:109-151(1979)的磷酸二酯法；Beaucage等，Tetra.Lett.22:1859-1862(1981)的二乙基亞磷酰胺法；Beaucage和Caruthers，Tetra.Letts.22(20):1859-1862(1981)所述的固相亞磷酰胺三酯法，如采用自動化合成儀，例如Needham-VanDevanter等，Nucl.AcidsRes.12:6159-6168(1984)所述；以及，美國專利號4，458，066的固體支持物法。化學合成產生單鏈寡核苷酸。可通過與互補序列雜交，或用此單鏈為引物以DNA聚合酶聚合，將它轉變成雙鏈DNA。本領域技術人員應了解，雖然化學合成DNA僅限于約IOO個堿基的序列，但可通過連接較短序列獲得較長序列。在優選實施方式中，用克隆技術制備編碼bsBA的核酸序列。合適的克隆和測序技術的例子以及足以指導技術人員進行許多克隆操作的說明參見Sambrook等，《分子克隆實驗室手冊》(MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL)(第二版)，1-3巻，ColdSpringHarborLaboratory(1989》，Berger和Kimmel(編)，《分子克隆技術指南》(GUIDETOMOLECULARCLONINGTECHNIQUES),AcademicPress,Inc.,SanDiegoCA(而))，或Ausubel等(編)，《新編分子生物學指南》(CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY),GreenePublishingandJohnWiley&Sons,Inc.,(1987，1995增干U)(Ausubel))。生物試劑和實驗設備的生產商提供的產品信息也提供有用信息。這些生產商包括SIGMA化學品公司(密蘇里州圣路易斯)、R&D系統(明尼蘇達州明尼阿波利斯)、PharmaciaAmersham(新澤西州皮斯卡塔市)、CLONTECHLaboratories,Inc.(PaloAlto，CA)、ChemGeneCorp.、Aldrich化學品公司(威斯康星州密爾沃基)、GlenResearch,Inc.、GIBCOBRLLifeTechnologies,Inc.(馬里蘭州蓋瑟斯堡)、FlukaChemica-BiochemikaAnalytika(FlukaChemieAG，Buchs，瑞士)、Invitrogen(加利福尼亞州圣地亞哥)和AppliedBiosystems(加利福尼亞州福斯特城)，以及本領域技術人員已知的許多其它商業來源。一旦克隆了編碼bsBA的核酸后，可以在重組工程改造的細胞如細菌、植物、酵母、昆蟲和哺乳動物細胞中表達所需蛋白。預計本領域技術人員了解，許多表達系統可用于表達蛋白質，包括大腸桿菌(Eco//)、其它細菌宿主、酵母和各種更高級的真核細胞如COS、CHO、HeLa和骨髓瘤細胞系。不再贅述已知用于在原核細胞或真核細胞中表達蛋白的各種方法。本領域技術人員將認識到，可對編碼bsBA的核酸進行修飾，而不降低其生物活性。可進行一些修飾以幫助克隆、表達或將靶分子摻入融合蛋白。本領域技術人員已知這些修飾，包括例如終止密碼子，在氨基末端加入甲硫氨酸以提供啟動位點，在兩個末端各加入其它氨基酸以產生方便定位的限制性位點。除了重組方法以外，也可用標準肽合成技術構建整個或部分bsBA。可通過以下方法固相合成長度少于約50個氨基酸的本發明多肽將該序列的C-末端氨基酸連接于不溶性支持物，然后依次加入該序列中其余的氨基酸。固相合成技術見Barany和Merrifield，《肽分析、合成、生物學》(ThePeptides:Analysis,Synthesis,Biology),第2巻"肽合成中的特殊方法"(SpecialMethodsinPeptideSynthesis),部分A，3-284頁；Merrifield等，J.Am.Chem.Soc.85:2149-2156(1963)和Stewart等，《固相肽合成》(SolidPhasePeptideSynthesis),第二版，PierceChem.Co.，Rockford，111(1984)。可通過縮合較短片段的氨基和羧基末端來合成較長的蛋白。通過活化羧基末端(如采用偶聯試劑N,N，-二環己基碳二亞胺)形成肽鍵的方法是本領域技術人員已知的。一旦表達后，可根據本領域標準方法純化重組bsBA，包括硫酸銨沉淀、親和柱、柱層析等(通常參見R.Scopes,《蛋白質純化》(ProteinPurification),Springer-Verlag，紐約(1982))。藥用中優選均一性至少約為90-95%的基本上純的組合物，最優選均一性為98-99%或更高的組合物。一旦部分純化或純化至所需均一性后，如果打算用于治療性目的，該多肽應基本不含內毒素。已經描述和熟知由細菌如大腸桿菌表達單鏈抗體和/或再折疊成合適活性形式(包括單鏈抗體)的方法，可將它們施用于本發明bsBA，尤其是采用抗體的方法。參見Buchner等，Anal.Biochem.205:263-270(1992);Pluckthun，Biotechnology9:545(1991);Huse等，Science246:1275(1989)和Ward等，Nature341:544(1989)，將所有文獻納入本文作參考。大腸桿菌或其它細菌的功能性異源蛋白常常分離自包含體，并且需要用強變性劑溶解和后續再折疊。在溶解步驟期間，如本領域所熟知，必須存在還原劑以分離二硫鍵。含有還原劑的示范性緩沖液是0.1MTrispH8，6M胍，2mMEDTA，0.3MDTE(二硫赤蘚糖醇)。可在還原形式和氧化形式的低分子量巰基試劑的存在下再氧化二硫鍵，如納入本文作參考的Saxena等，Biochemistry9:5015-5021(1970)所述，尤其是Buchner等，同上所述。一般通過將變性和還原的蛋白質稀釋(如100倍)到再折疊緩沖液中完成復性。示范性緩沖液是0.1MTris，pH8.0，0.5Ml-精氨酸，8mM氧化性谷胱甘肽(GSSG)和2mMEDTA。作為對雙鏈抗體純化方法的修改，獨立地溶解和還原重鏈和輕鏈區，然后在再折疊溶液中混合。當一種蛋白比另一種蛋白摩爾過量不超過5倍時，以此摩爾比混合的兩種蛋白獲得優選產率。氧化還原改組完成后，需要將過量的氧化性谷胱甘肽或其它氧化性低分子量化合物加入再折疊溶液。基于BsBA的治療應用本發明還涉及基于bsBA的治療，該治療包括將本發明bsBA給予動物，優選哺乳動物，最優選人類患者，以治療一種或多種所述疾病或失調。本發明治療性化合物包括但不限于本發明bsBA。本發明bsBA可用于治療、抑制或預防與細胞表面受體的異常表達和/或活性相關的本文所述疾病和失調。治療和/或預防與細胞表面受體的異常表達和/或活性相關的疾病和失調包括但不限于緩解與這些疾病和失調相關的癥狀。可在本領域所知或本文所述藥學上可接受的組合物中提供本發明bsBA。通過本文提供的內容，本領域普通技術人員將知道如何將本發明bsBA用于診斷、監測或治療目的而無需過多實驗。本發明bsBA可單獨給予或與其它類型治療(如放療、化療、激素治療、免疫治療和抗腫瘤劑)聯合給予。基于bsBA的治療/預防組合物及其給藥本發明提供了通過給予對象有效量的本發明bsBA，優選本發明雙特異性抗體來治療、抑制和預防的方法。在優選方面，bsBA是基本純化的(如基本不含限制其作用或產生不良副作用的物質)。對象優選為動物，包括但不限于諸如牛、豬、馬、雞、貓和狗等動物，優選哺乳動物，最優選人。已知各種遞送系統可用于給予本發明bsBA，如包裹入脂質體、微顆粒、微膠囊中，能夠表達bsBA的重組細胞，受體介導的胞吞作用(參見例如Wu和Wu，J.Biol.Chem.262:4429-4432，1987)，構建核酸作為逆轉錄病毒或其它載體的一部分等。引入方法包括但不限于皮內、肌肉內、腹膜內、靜脈內、皮下、鼻內、硬膜外和口腔途徑。可通過任何方便途徑給予bsBA，例如通過輸注或推注、通過上皮或粘膜皮膚內層(如口腔粘膜、直腸和腸粘膜等)吸收，并且可以與其它生物活性物質一起給予。給藥可以是全身給予或局部給予。此外，可能需要通過任何合適途徑將本發明bsBA引入中樞神經系統，這些途徑包括心室內和鞘內注射；借助(例如)連接于貯存庫如Ommaya貯存庫的心室內導管可能有助于心室內注射。也可采用肺部給藥，如采用吸入器或噴霧器，以及含有霧化劑的制劑。在具體實施方式中，可能需要將本發明bsBA局部給予需要治療的部位；這可通過以下方式實現，例如但不限于在手術期間局部輸注、局部施用如術后與傷口敷料聯用、注射、導管方式、栓劑方式或植入方式，所述植入物是多孔性材料、非多孔性材料或明膠材料，包括膜如唾液酸膜(sialasticmembrane)或纖維。優選地，當給予本發明bsBA如抗體時，必須注意采用bsBA不吸附的材料。在另一實施方式中，可在囊泡，具體是脂質體中遞送bsBA(參見Langer，Science249:1527-1533，1990;和Treat等，《感染性疾病和癌癥治療中的脂質體》(LiposomesintheTherapyofInfectiousDiseaseandCancer),Lopez-Berestein禾口Fidler(編)，Liss，紐約，353-365頁，1989)。在又一實施方式中，可在控釋系統中遞送bsBA。在一個實施方式中，可采用藥泵(參見Langer，同上；Sefton，CRCCrit.Ref.Biomed.Eng.14:201，(1987);Buchwald等，Surgery88:507，1980;Saudek等，N.Engl.J.Med.321:574，1989)。在另一實施方式中，可采用聚合材料(參見《控釋的醫學應用》(MedicalApplicationsofControlledRelease),Langer和Wise(編)，CRCPres.，BocaRaton，Fla.(1974);《控制的藥物生物利用度、藥物產品設計和性能》(ControlledDrugBioavailability,DrugProductDesignandPerformance),Smolen和Ball(編)，Wiley,紐約(1984);Ranger和Peppas，J.，Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61(1983);也參見Levy等，Science228:190(1985);During等，Ann.Neurol.25:351(1989);Howard等，J.Neurosurg.71:105(1989))。在又一實施方式中，可將控釋系統安置在治療靶點(如患病的身體器官，如腦、肺、腎、肝、卵巢、睪丸、結腸、胰、乳腺和皮膚)附近，因此僅需要全身劑量的一部分(參見例如，Goodson，《控釋的醫學應用》(MedicalApplicationsofControlledRelease),同上，第2巻，115-138頁)。Langer的綜述(Science249:1527-1533(19%))討論了其它控釋系統。本發明也以藥物組合物提供了bsBA。這種組合物包含治療有效量的bsBA和藥學上可接受的載體。在具體實施方式中，術語"藥學上可接受的"指經聯邦政府或州政府的管理機構批準、或列于美國藥典或其它普遍認可的藥典中可用于動物(更具體是人)。術語"載體"指與治療劑一起給予的稀釋劑、佐劑、賦形劑或運載體。這種藥物載體可以是無菌液體，如水和油，包括石油、動物、植物或合成來源的油，如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。在靜脈內給予藥物組合物時，水是優選的載體。鹽溶液和水性右旋糖和甘油溶液也可用作液體載體，尤其用于可注射溶液。合適的藥物賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，該組合物也可含有少量濕潤劑或乳化劑，或pH緩沖劑。這些組合物可取溶液、懸液、乳液、片劑、丸劑、膠囊、粉末、緩釋制劑等形式。可將該組合物制成含有傳統的粘合劑和載體如三甘油酯的栓劑。口服制劑可包含標準載體如藥品級的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。合適的藥物載體的例子見《雷明頓藥物科學和實踐》(Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy),A.R.Gennaro編，LippincottWilliams禾口Wilkins，賓西法尼亞州費城(第20版，2003)。這種組合物含有治療有效量的化合物和合適量的載體以提供適合給予患者的形式，其中化合物優選為純化形式。該制劑應適合給藥方式。在優選實施方式中，根據常規方法將組合物制成適合靜脈內給予人的藥物組合物。靜脈內給藥的組合物一般是無菌等滲水性緩沖液的溶液。需要時，組合物也可包含增溶劑和局部麻醉劑如利多卡因，以緩解注射部位的疼痛。通常，分別提供這些成分或將這些成分混合在單位劑型中，例如，成為說明活性物質含量的密封容器如安瓿或藥囊中的凍干粉末或無水濃縮物。當通過輸注給予組合物時，可用含有無菌藥品級水或鹽水的輸注瓶分散該組合物。當通過注射給予組合物時，可提供含有用于注射的無菌水或鹽水的安瓿，以便在給藥前混合這些成分。制成藥物組合物時，bsBA可制成中性形式或鹽形式。藥學上可接受的鹽包括與陰離子如衍生自鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的陰離子形成的鹽，和與陽離子如衍生自氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、組氨酸或普魯卡因的陽離子形成的鹽。可通過標準臨床技術確定能有效治療、抑制或預防與細胞表面受體的異常表達和/或活性相關的疾病或失調的本發明bsBA的量。此外，可任選地用體外試驗幫助鑒定最優劑量范圍。用于制劑的準確劑量也取決于給藥途徑和疾病或失調的嚴重程度，并且應該根據實踐者的判斷和各患者的具體情況決定。可從衍生自體外或動物模型測試系統的劑量-反應曲線外推有效劑量。對于bsBA，給予患者的劑量一般為0.1-100mg/kg患者體重。給予患者的劑量優選為0.1-20mg/kg患者體重，更優選1-10mg/kg患者體重。通常，由于對外來多肽的免疫應答，人抗體在人體內的半衰期比其它物種的抗體長。因此，衍生自人抗體的bsBA的給藥劑量可以較少，給藥頻率較低。而且，通過修飾如脂化提高抗體的攝取量和組織穿透性，從而可降低給予本發明bsBA的劑量和頻率。試劑盒本發明還包括試劑盒，用于在體內或生物樣品中檢測表達或過量表達靶分子的細胞。在一些優選實施方式中，該試劑盒包括雙特異性scFv抗體靶向的bsBA。根據應用，可用接頭或螯合劑或二者使抗體官能化，以偶聯于效應器(如放射性部分、脂質體、細胞毒素、另一種抗體等)，如本文所述。該試劑盒還任選地包括用于檢測bsBA的緩沖液和組合物。該試劑盒也可包括說明材料，說明抗體用于檢測(如)癌細胞的用途、和/或說明抗體與官能化試劑的組合或說明官能化抗體在成像和/或治療應用中的用途。在某些實施方式中，提供了用接頭和/或螯合劑(在一個容器中)官能化的bsBA以及一種或多種效應器如細胞毒素、放射性標記(在第二個容器中)，從而可分別給予這兩種組分(如預先靶向方法)，或者可在臨用前給予這兩種組分。某些說明性材料提供了推薦的劑量方案、禁忌癥(counterindication)等。說明性材料一般包括手寫或印刷的材料，本發明也考慮了能夠儲存這些說明材料并將它們傳達給最終用戶的任何媒體。這種媒體包括但不限于電子存儲媒體(如磁盤、磁帶、盒式磁帶、芯片)、光學媒體(如CDROM)等或提供說明書的互聯網址。本發明也提供包括一個或多個容器的藥包或藥盒，所述容器中充滿了本發明藥物組合物的一種或多種成分。任選與這種容器相聯系的是由管理藥物或生物制品生產、使用或銷售的政府機構所頒發形式的通知，該通知反映了政府機構批準以人用產品進行生產、使用或銷售。實施例實施例1雙抗體和(scFv)2雙抗體的產生參見例如EP404,097;WO93/11161;和Hollinger等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90:6444-6448(1993))。用接頭由抗體片段(通常由兩個scFv)構建雙抗體，所述接頭太短，以致于不能在相同鏈的兩個結構域之間進行配對；強迫結構域與另一條鏈的互補結構域配對，產生兩個抗原-結合位點。或者，可用遺傳編碼的接頭連接兩條scFv(共價連接這兩個分子)，從而形成(ScFv)2，即二價抗體。實施例2可用不同類型的"二聚化結構域"使兩個抗體片段異質二聚化。例如，用遺傳方法通過絞鏈區將雙特異性/二價雙抗體與IgG的CH(3)結構域N末端融合(Lu等，JImmunolMethods,2003-08;279(1-2):219-32)，產生稱為"雙-雙抗體"的構建物。結果是絞鏈區與CH(3)結構域之間二聚化產生四價雙抗體二聚體。也可通過將單鏈Fv(scFv)與抗原結合特異性不同的Fab片段的輕鏈或重鏈的C末端遺傳融合，從而用抗體的天然CH1結構域使兩個抗體片段異質二聚化(Lu等，ImmunolMethods,267(2):213-26(2002》。也可采用IgG重鏈和輕鏈之間的天然二聚化機制。兩條特異性不同的單鏈Fv(scFv)可與人k鏈的恒定結構域(C(L))和人重鏈的第一恒定結構域(C(H1))融合，形成兩條多肽，分別為(scFv)(l)-C(L)和(scFv)(2)-C(H1)-C(H2)-C(H3)。在哺乳動物細胞中共表達兩條多肽導致形成具有雙特異性的共價連接的IgG樣異質-四聚體Bs(scFv)(4)-IgG(Zuo等，ProteinEng.13(5):361-7(2000)，Lu等，J.BiolChem.23;279(4):2856-65(2004))。也可通過二聚化結構域中的非共價相互作用強迫兩個抗體片段之間形成異質二聚體，如采用形成異質二聚體的亮氨酸拉鏈Fos和Jun，當它們分別與兩種不同的Fab'片段融合時介導形成雙特異性F(ab，)2(Tso等，JHematother.4(5):389-94(1995))。實施例3測定合適的靶標記和效應器標記可用許多方式確定合適的靶標記，這些方式是例如耙組織和非耙組織的mRNA分布型分析，以鑒定靶組織中過量表達的靶分子；或通過蛋白質組學方法如耙細胞和非靶細胞的2D電泳來比較蛋白質表達水平，然后通過質譜鑒定。例如，mRNA分布型分析一般采用Affymetrix微陣列，如Cao等所述進行(BMCGenomics.27;5(1):26(2004))，比較由靶組織和非靶組織(如腫瘤和鄰近的正常組織)產生的cRNA。在蛋白質組學方法中，一般是裂解或勻漿靶細胞和非耙細胞，然后進行二維電泳。然后將蛋白質固定在凝膠中，染色觀察。來自靶細胞和非耙細胞的凝膠圖像分析可顯示差異表達的蛋白質點。然后，可通過剪下蛋白質點、在凝膠中用胰蛋白酶消化和質譜分析鑒定這些點。該過程參見例如，VanGreevenbroek等，45，1148-54(2004)。可以許多方式鑒定合適的效應器標記，如用推定的磷酸化位點鑒定受體。蛋白質或DNA序列可獲自GenBank或其它公共數據庫，可用公眾可用的搜索引擎預測可能的磷酸化位點，如ScanSite(通過輸入"http:〃"，然后是"scansite.mit.edu/"在線搜索)或NetPhos(通過輸入"www."，然后是"cbs.dtu.dk/services/NetPhos/"找到該網頁)。含有磷酸化位點的受體更可能是良好的效應器標記，因為這些受體常常參與信號轉導。或者，可通過將靶細胞與細胞標記的抗體相接觸、然后如上所述測定所需生物活性來鑒定合適的效應器標記。實施例4:測定一價和二價結合結構域為了測定結合結構域或雙特異性結合分子的一價親和力，如上所述產生bsBA。為通過表面等離振子共振測定結合動力學，可按照廠商(BIAcore)說明書用鹽酸N-乙基-N，-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化生物傳感器芯片用于共價偶聯受體。然后，(例如)注入10mM乙酸鈉緩沖液(pH4.5)來偶聯該標記，以獲得理想的固定材料反應單位(RU)低于400的信號。為了測定動力學，在25。C下，將用PBS/吐溫緩沖液(0.05。/。吐溫-20的磷酸鹽緩沖鹽水溶液)兩倍連續稀釋的一價或雙特異性結合結構域注射到抗原芯片上，所用流速為20pl/分鐘。然后將解離數據擬合成單位點模型，獲得k^，可計算各結合曲線的假一階速率常數(ks)，并作為蛋白質濃度的函數作圖，獲得k結合+As.e。然后，可通過k解離/k結合計算SPR測定的平衡解離常數Kd。必須對密度不同(如100、200和400RU)的幾種表面進行上述測定，以確定不存在實驗假象，如解離bsBA的再結合。或者，也可通過流式細胞術測定它們的親和力，如Nielsen等(CancerRes.60(22):6434-40(2000))所述。實施例5:在細胞中測定效應器功能可通過將培養物中生長的靶細胞與不同濃度的效應器結合結構域接觸例如30分鐘，測定結合結構域的效應器功能。此時，在一些情況下用外源性生長因子刺激細胞以促進該分子想要改變的生物作用。通過如下方法制備6孔或12孔組織培養板中培養的處理細胞的抽提物在冰上使細胞在含有蛋白酶抑制劑(lmMPMSF，1pg/mL亮抑肽酶，1|ig/mL胃蛋白酶抑制劑)的裂解緩沖液(20mMTris(pH7.5)，150mMNaCl，lmMEDTA，lmMEGTA，1%TritonX陽100，0.5%NP40，10mM卩-甘油磷酸酯，10mMNaF，1mMNa3V0》中通過27G針頭5次。裂解前，用冷的PBS洗滌細胞兩次。然后，通過(例如)用磷酸化特異性抗體進行免疫印跡來分析裂解物用7.5%SDS-PAGE預澆鑄凝膠(Invitrogen，加利福尼亞州卡爾斯巴德)電泳分析全細胞蛋白質抽提物(50嗎總蛋白質/泳道)，轉移到硝酸纖維素濾膜上，與檢測該標記的活化或下游相關蛋白的抗體一起孵育。或者，可通過抗體微陣列分析裂解物，如Nielsen等(ProcNatlAcadSciUSA，100(16):9330-5(2003))所述。也可通過所需生物功能的其它讀出方法，如細胞增殖試驗，測定結合結構域的效應器功能。可在含有DMEM和5%FCS和不同濃度的結合結構域的96孔板中以5X10V孔接種靶細胞。72小時后，裂解細胞，可根據廠商說明通過CellTiter-Glo發光細胞活力試驗(Promega，Madison，WI)測定ATP量。可將抑制程度作為濃度對數的函數對磷酸化和增殖試驗的結果作圖，通過擬合到下述等式測定效應器和靶向結構域的IC50:^(頂部-底部)y=肽部+1+loL。gEC50-X實施例6:測定BsBA為了測定bsBA阻斷、降低或抑制ErbB受體介導的細胞信號轉導的能力，將癌細胞如A431(雌激素依賴性乳腺癌細胞系，國立生物信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)登錄GDS121)與各種濃度的bsBA—起孵育30分鐘，然后用生長因子(如調蛋白或EGF)刺激細胞長達兩小時。然后用Triton緩沖液裂解細胞，再超聲處理。然后，通過免疫印跡或采用對蛋白質磷酸化敏感的抗體微陣列來分析裂解物中的磷酸化改變(參見例如Nielsen等，2003，PNAS100:9330)。BsBA可用于抑制表達合適抗原的癌生長。可通過將小分子藥物與bsBA偶聯來加強bsBA的作用。藥物可以是(例如)標準的細胞毒劑，如化療劑或酪氨酸激酶抑制劑，如格列衛，伊馬替尼甲磺酸鹽)。實施例7:ErbBBsBA計算機模擬A431細胞中調蛋白(HRG)-誘導的ERK和AKT活化顯示，如果bsBA的ErbB受體結合分子之一與其受體的親和力低于其它ErbB結合分子與其受體的親和力，則這種ErbBbsBA最有效。如果本發明bsBA的低親和力結合分子涉及ErbB3或ErbB4，bsBA的高親和力結合分子涉及另一種ErbB受體(如ErbBl或ErbB2)，那么相信bsBA是通過將ErbB3或ErbB4螯合成由ErbB3或ErbB4受體、bsBA和ErbBl或ErbB2受體組成的三聚體復合物(即ErbB3/4:bsBA:ErbBl/2)而降低、阻斷或抑制ErbB受體介導的細胞信號轉導。bsBA的結合分子也可涉及ErbB3和ErbB4。相信這種bsBA能抑制這些ErbB受體與ErbBl或ErbB2的二聚化。因為ErbB3或ErbB4與ErbBl或ErbB2的二聚化是信號轉導所必需的，所以bsBA通過阻斷二聚體形成而有效阻斷、減少或抑制細胞信號轉導。此bsBA的低親和力結合分子優選結合于ErbB3。可制備bsBA的結合分子，以使它們結合于ErbBl和ErbB2，從而交聯這兩種受體。此bsBA通過減少、防止或抑制ErbBl和ErbB2與ErbB3或ErbB4的二聚化起作用，如上所述，ErbBl和ErbB2與ErbB3或ErbB4的二聚化是信號轉導所必需的。優選地，此bsBA的低親和力結合分子優選結合于ErbBl。示范性bsBA包括結合于ErbB3的低親和力結合分子和(結合于)EGFR、ErbB2或ErbB4的高(親和力)結合分子。BsBA也可用于將細胞毒劑或化療劑定位于表達ErbB受體的細胞。這些物質具有各自對不同ErbB受體特異的兩種結合分子，和偶聯于bsBA的細胞毒劑或化療劑(如皂草毒蛋白、抗-干擾素-oc、長春花屬生物堿、蓖麻毒蛋白A鏈、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)。BsBA可制備成全長抗體或抗體片段(如F(ab')2或(Fv)2雙特異性抗體)、雙抗體或制備成具有兩個不同結合分子的適體。用ErbB受體家族測定該模型。用EGF或HRG刺激ErbB受體使導致ERK和AKT磷酸化的通路被同時激活，在信號級聯反應內的各個水平串話。分析的靈敏度使我們能夠將該模型輸出的不確定性分攤到模型輸入中不確定性的不同來源。由于腫瘤細胞的特征是受體表達水平不同，當HRG是配體時，我們將ErbB3和ErbB4鑒定為非常靈敏的耙點。通常，當bsBA的結合分子是抗體或其片段時，可用生化方法良好表征這些結合分子，因為不難測定它們的解離常數或者甚至是結合和解離速率。同樣，不難用數學模型描述抗體作用機制，可在計算機上測定采用已知抗體作為抑制劑的效果。采用我們的計算機模型，我們測試了采用雙特異性抗體(即具有兩個不同的結合分子的抗體，其中各結合區結合不同的ErbB受體)阻斷ErbB細胞信號傳導途徑的想法。計算機結果證實，對兩種不同的ErbB受體具有結合特異性并且對一種ErbB受體的結合親和力大于對另一種ErbB受體的結合親和力的抗體，能理想地阻斷或防止通過ErbB通路的細胞信號轉導。采用計算機方法，我們比較了靶向兩種不同的ErbB受體的雙特異性抗體在ErbB受體表達有差異(表l)的三種不同細胞系中阻斷或防止ErbB信號傳導途徑活化的能力與僅靶向一種ErbB受體的常規抑制劑的能力。用計算機對雙特異性抗體以及現有治療性單特異性抗體在各細胞系中的信號抑制建模。我們的模型預計，對兩種不同的ErbB受體親和力不同的雙特異性抗體對細胞信號轉導的抑制比傳統的單受體抑制劑介導的細胞信號轉導的抑制高得多。我們的計算機建模產生的數據見表2。根據腫瘤中存在的受體比例，預計具有高親和力結合分子和低親和力結合分子的不同bsAb是比單特異性抗體或兩個結合分子以相同結合親和力結合于各自抗原的雙特異性抗體強得多的抑制劑。表1:ErbB受體在不同細胞系上的受體表達概況<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>表2:BsBA與傳統單特異性受體抑制劑的抑制作用的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>我們將抗ErbBl(高親和力)和ErbB3或ErbB4(低親和力)的雙特異性抗體鑒定為在所有刺激條件下防止由于ErbB通路活化進行的信號轉導的最有效阻斷劑。在所有刺激條件下，ErbBl-ErbB2bsAb作為ErbB細胞信號轉導阻斷劑也相當有效。當HRG用作激活劑時，ErbB3-ErbB4或ErbB2-ErbB3/4bsAb是非常有效的ErbB途徑阻斷劑。因此，優選的bsBA是阻斷試劑的至少一個特征是能夠靶向ErbB3或ErbB4受體(采用低親和結合分子)的bsBA。實際上，借助于計算機模型，我們已經鑒定了ErbB3/4具有強信號轉導特性。ErbB3/4與其本身交聯，或與更典型的癌抗原如ErbBl或ErbB2交聯，其作用機制是通過同時抑制兩種受體或螯合二受體而抑制ErbB3/4信號轉導。與采用bsBA而非傳統單特異性阻斷劑如單特異性抗體相關的優點之一是雙特異性阻斷劑形成穩定的三聚體(即ErbB受體-雙特異性阻斷劑-ErbB受體)。因此，bsBA的效率比傳統單受體抑制劑高得多，如表2所示。通過結合于兩種不同的ErbB受體，本發明bsBA通過與相同或不同的ErbB受體相互作用而螯合ErbB受體。bsBA形成非常穩定(不可逆)的三聚體復合物，它能防止、降低或抑制結合的ErbB受體的細胞信號轉導活性。bsBA與ErbBl、ErbB2、ErbB3或ErbB4的初始結合步驟可以是可逆步驟，與其余ErbB受體的第二結合步驟導致形成非常穩定的三聚體。或者，bsBA與ErbBl、ErbB2、ErbB3或ErbB4的第一結合步驟可以是不可逆步驟，第二結合步驟可以是可逆步驟，從而允許bsBA形成多種不同的三聚體復合物。ErbB受體:bsBA:ErbB受體三聚體的形成產生不可誘導細胞信號轉導的復合物。而且，通過螯合ErbBl、ErbB2、ErbB3禾卩ErbB4，bsBA防止、減少或抑制這些ErbB受體與相同或不同ErbB受體的二聚化。優選的是，bsBA與ErbBl或ErbB2的親和力較高，與ErbB3或ErbB4的親和力較低。形成不完全的bsBA-ErbB受體二聚物(bsBA的兩個結合分子中僅有一個參與結合)不產生妨礙細胞信號轉導的復合物；只有形成了三聚體復合物(即ErbB受體:bsBA:ErbB受體)才能阻斷信號轉導。而且，bsBA結合的兩個ErbB受體之間不可能形成三聚體。bsBA的其它特征包括一個結合結構域能夠通過與天然配體如HRG競爭ErbB受體而減少、阻斷或抑制細胞信號轉導。我們的計算機數據證明，在阻斷細胞信號轉導方面，ErbB3-ErbB4bsBA比單特異性ErbB3或ErbB4抑制劑更有效。僅針對ErbB3或ErbB4的單特異性抑制劑不能像ErbB3-ErbB4bsBA那樣有效地抑制AKT磷酸化，主要是由于ErbB3和ErbB4的細胞表面表達水平高。僅當同時采用ErbB3和ErbB4單特異性抑制劑時才能防止AKT磷酸化。我們的計算機分析還證實了bsBA結合ErbB2和ErbB3受體的有效性。當用細胞被HRG刺激時ErbB2-ErbB3bsBA在阻止細胞信號轉導方面比單特異性ErbB2或ErbB3抑制劑更加有效。在缺少三聚體形成穩定作用時ErbB2-ErbB3bsBA三聚體復合物的功效被降低。如果bsBA的兩種結合分子與它們的受體的結合親和力相等，則ErbB2-ErbB3bsBA三聚體在阻斷AKT磷酸化方面將不太有效。因為bsBA在未結合狀態或僅與一種ErbB受體形成二聚體復合物時不具有任何抑制作用，所以抑制劑濃度增加，以致于用bsBA飽和了ErbB受體，導致bsBA的抑制效果降低。可通過提供對ErbB2的親和力提高的bsBA逆轉此作用，從而bsBA對ErbB2的結合親和力大于ErbB3或ErbB4(即KdErbB2>KdErbB3或ErbB4)。上述bsBA在HRG占優勢的(dominanted)方案中特別有效。通常，與僅靶向一種受體的ErbB受體抑制劑相比，bsBA在低得多的劑量下有效。例如，當濃度為0.1nM時，本發明的ErbB2/ErbB3bsBA促進對AKT磷酸化的抑帝ij，而具有與bsBA具有相同Kd的ErbB2或ErbB3單特異性抑制劑在濃度為0.1nM時則不同樣有效。本發明另一優選實施方式是bsBA，其中bsBA的一個結合分子具有與ErbBl的結合特異性(高親和力結合)、另一個結合分子具有與ErbB3或ErbB4的結合特異性(低親和力結合)。通常，腫瘤細胞表達大量ErbBl(即常常大于100,000個受體/細胞)，而ErbB3和ErbB4的受體表達范圍是5,000-20,000個受體/細胞。拮抗配體結合的bsBA成功抑制了受體信號轉導，即使受體表達水平相差IO倍以上。我們的計算機分析證實了雙特異性ErbBl/ErbB3和ErbBl/ErbB4bsBA的有效性。對于ErbBl，bsBA如雙特異性scFV抗體可與天然ErbBl配體競爭相同的結合結構域，這使得bsBA在EGF或TGF-a占優勢的方案中非常有效。在HRG占優勢的方案中，抑制ErbB3受體抑制了信號轉導。根據我們對ErbB細胞信號傳導途徑進行的計算機分析，我們將ErbBl結合分子鑒定為具有低解離常數KD<lnM的高親和結合位點，但其結合不是不可逆結合。ErbB3和ErbB4受體的表達水平比ErbBl受體低得多。因為bsBA結合于ErbBl和ErbB3/ErbB4受體，并且因為bsBA對豐度更高的ErbBl受體具有較高親和力，所以bsBA在比常規單特異性ErbB抑制劑低得多的濃度下可有效阻斷ErbBl與ErbB3或ErbB4的二聚化介導的信號轉導。bsBA對ErbBl的高親和力導致低bsBA濃度下的高有效性。我們的方法利用計算機建模鑒定用于交聯的最優受體以及兩種結合分子的所需親和力。bsBA的兩種結合分子的不同親和力將bsBA有效耙向受體如ErbB3，所述受體被認為不是癌細胞特異的。將ErbB3與更典型的癌抗原如ErbBl交聯提供了特異性靶向癌細胞和在這些細胞中調節ErbB3受體活性的方式。采用我們的計算機模型，我們了解到bsBA的兩種結合分子具有不同親和力的必要性。親和力差異有助于bsBA三聚體復合物的穩定。通常，與失活或活性較低的結合分子相比，bsBA的活性結合分子應該具有較低的親和力。如果bsBA的兩種結合分子都失活或活性較低，那么靶向表達較高的信號轉導受體或較強的信號轉導受體的結合分子應該具有較高的親和力。對耙向的受體之一的親和力有差異導致以下結果如果給予bsBA的濃度高于較高親和力相互作用(如ErbBl)的Kd，但低于較低親和力相互作用(如ErbB3)的Kd，bsBA僅應該聚集在表達親和力相互作用較高的抗原的細胞上。bsBA的另一端可用于與這些細胞上的低親和力抗原相互作用，以干擾其生物功能(如ErbB3;阻斷下游信號轉導)。哪一種受體是低親和力相互作用或高親和力相互作用取決于受體具體的信號轉導強度(作為耙點的重要性)和bsBA的作用方式。實施例8該實施例描述了具有上述特征的示例性抗-EGFR/ErbB3bsBA的產生。#柳膽細胞系。小鼠雜交瘤細胞系225、293T細胞系和人乳腺癌乳腺癌細胞系A431獲自美國模式培養物保藏所(Manassas，VA)。所有細胞系培養在添加有10%胎牛血清或低IgG胎牛血清(FBS)的DMEM培養基(Invitrogen)，或如上所述并添加有2mM谷氨酰胺、100U/mL青霉素和100pg/mL鏈霉素的不含CD293血清的培養基(Invitrogen)("生長培養基")。V、/貧恭五G尸i拔沐游克蘑用RNAeasy試劑盒(QIAGEN)按照制造商的描述從細胞系ATCCNo.HB-8508中提取RNA。第一鏈cDNA采用cDNA合成試劑盒(AmershamBiosciencesCorp.,Piscataway，NJ)按照制造商的描述用該試劑盒中提供的RT-引物一pd(N)6合成。C225抗體的重鏈用以下小鼠引物的混合物從cDNA擴增TDNO:l);IDNO:2);VH3:CTAGCTAGCGGGGCCATGGCCCAGGTRCAGCTGAAGGAGTC(SEQIDNO:3);rDNO:4);IDNO:5);VH6:CTAGCTAGCGGGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGAAGSASTC(SEQIDNO:6);VH7:CTAGCTAGCGGGGCCATGGCCGAGGTGCAGSKGGTGGAGTC(SEQIDNO:7);EDNO:8);V股CTAGCTAGCGGGGCCATGGCCGAKGTSVAGCTTCAGGAGTC(SEQIDNO:9);VH10:CTAGCTAGCGGGGCCATGGCCGAGGTGAASSTGGTGGAATC(SEQIDNO:10);IDNO:11);VH12:CTAGCTAGCGGGGCCATGGCCGARGTGAAGCTGRTGGAGTC(SEQIDNO:12);VH13:IDNO:13);VII14:IDNO:14);VH15:CTAGCTAGCGGGGCCATGGCCCARGTTACTCTGAAAGAGT(SEQIDNO:i5);.THl-mGAP:cctggtttcccagaaccgetctgcgcgccgCTCGAGACGGTGACCGTGGTCCC(SEQIDNO:16);JH2-mGAP:cctggtttcccagaaccgetctgcgcgccgCTCGAGACTGTGAGAGTGGTGCC(SEQIDNO:17);JH3-mGAP:cctggtttcccagaaccgetctgcgcgccgCTCGAGACAGTGACCAGAGTCCC(SEQIDNO:18);JH4-mGAP:cctggtttcccagaaccgetctgcgcgccgCTCGAGACGGTGACTGAGGTTCC(SEQIDNO:19).然后采用下述引物對擴增產物進行第二次PCR:Hind3-C225-VH-5'(5'-CTAGCTAGCGGGAAGCTTCAGGTACAACTGCAGGAGTCA-3，(SEQIDNO:20))禾口C225陽VH陽3，(5，-AGAGGAAACGGTGACCGTGGT-3，(SEQIDNO:21))。C225抗體的輕鏈用以下引物的混合物從cDNA擴增VK1:VK2:VK3:TATTCGTCGACGGAAAATGTGC丁CACCCAGTC(SEQIDNO:24);VK4:TATTCGTCGACGGAYATTGTGATGACACAGTC(SEQIDNO:25);VK5:TATTCGTCGACGGACATCCAGATGACACAGAC(SEQIDNO:26);VK6:TATTCGTCGACGGAYATTGTGCTSACYCARTC(SEQIDNO:27);VK7:TATTCGTCGACGGACATCCAGATGACYCARTC(SEQBDNO:竭；VK8:TATTCGTCGACGCAAATTGTTCTCACCCAGTC(SEQIDNO:29);JK1/2:TTTCTCGTGCGGCCGCACGTTTKATTTCCAGCTTGG(SEQIDNO:30);JK4:TTTCTCGTGCGGCCGCACGTTTTATTTCCAACTTTG(SEQIDNO:3";JK5:TTTCTCGTGCGGCCGCACGTTTCAGCTCCAGCTTGG(SEQIDNO:32》.然后采用下述引物對擴增產物進行第二次PCR:C225-VH-Link-VL-UP(ACCACGC225陽VL-Xho-His6-Notl(CCCGCCTGCGGCCGCTCAGTGGTGGTGGTGGTG34))。所有PCR采用標準PCR方法和儀器進行。PCR產物用QIAquick按照制造商的說明純化，將純化的重鏈和輕鏈產物各100ng混合并在沒有引物時進行7輪PCR然后與引物Ncol-C225(CAGCCGGCCATGGCCcaggtacaactgcaggagtc(SEQIDNO:35》和C225-Xhol-3,(GATCTCGAGCTTGGTCCCAGC(SEQIDNO:36》一起再進行25輪PCR以將它們裝配成scFvC225。用QIAquick按照制造商的描述從瓊脂糖凝膠純化約750bp的條帶，然后用TOPOTA克隆試劑盒(Invitrogen)也按照制造商的描述進行克隆。用標準方法將克隆產物轉化入大腸桿菌菌株XL1并用標準DNA測序技術進行測序。用以下引物從獲自人白細胞(按上述方法獲得)的cDNA克隆Ck(kIDNO:37》和Ck-Apal-3'(CGCGGGCCCTCAACACTCTCCCCTGTTGAAGC(SEQIDNO:38))。用以下引物克隆CH(重鏈恒定區)5，-CHl-Yl(CCAAGAGCACCTCTGGGG(SEQIDNO:39))和HuIgG-Xho-Xba-3克隆產物用作第二次PCR的模板，第二次PCR采用以下引物5'-NotlNhelCHl(gtggcggccgetageaceaagggcccateggtcttccccctggcaccctectecaagageacetctgggg(SEQIDNO:41))和HuIgG-Xho陽Xba-3，產物用QIAquick純化試劑盒(Qiagen)按照制造商推薦的方法純化，然后用TOPOTA克隆試劑盒克隆，最終的構建物通過DNA測序檢驗。然后將CH產物亞克隆入pSecTaq2AHygro載體(Invitrogen)的Notl和Xhol位點之間以制造CH/pSecTaq2AHygro(CH/pSTH)，并將Ck亞克隆入pSecTaq2A載體的Xhol和Apal位點之間以制造Ck/pSecTaq2A(Ck/pSTZ)。最后，將A5抗-ErbB3scFv(由加州大學舊金山分校的JamesMarks博士惠贈)亞克隆入CH/pSTH構建物的Sfil和Notl位點之間以形成A5CH/pSTH，并將C225scFv亞克隆入CK/pSTZ的Sfil和Xhol位點之間以形成C225Ck/pSTZ。置資6"6游表送瞬時轉染293T細胞。293T細胞系用FuGeneTM轉染試劑(RocheAppliedScience,Indianapolis,IN)按照制造商的描述用A5CH/pSTH和C225Ck/pSTZ共轉染(在DMEM中用超低IgGFBS轉染細胞，轉染1天后換成不含CD293血清的培養基)。轉染的細胞在生長培養基中培養5天，然后在ProteinG(PierceBiotechnology,Inc.,Rockford，IL)上按照制造商推薦的方法純化以形成C225-A5Ig-scFv融合物。絲錄會游魔《微^e督將A431細胞與1ug/mLC225-A5Ig-scFv融合物一起在冰上培育30分鐘，然后用洗滌緩沖液(磷酸緩沖鹽水、2%FBS、0.1%疊氮化物)洗滌兩次，用AlexaFluor488(Invitrogen)標記的抗-人IgG抗體檢測其結合并在FACSCalibur儀(Becton-Dickinson，FranklinLakes,NJ)上量化。顏u膽長鮮遂，ir錄艦腳劍為進行抗體的劑量-反應試驗，將A431細胞與不同量的C225-A5Ig-scFv融合物儀器在DMEM(無血清)上培育30分鐘，然后用50ng/mL調蛋白-p(R&DSystemsInc.,Minneapolis,MN)或50ng/mLEGF(PeproTech，Inc.,RockyHill，NJ)刺激細胞5分鐘。細胞用裂解緩沖液(20mMTris，pH7.4;150mMNaCl;2mMEDTA;1mMEGTA;1mMNaF;lOmM卩-甘油磷酸；1%TritonX-100;蛋白酶抑制劑混合物(Sigma-AldrichCorp.,St.Louis，MO);lmM原釩酸鈉；50pM苯胂；10bpV和100ug/mlDNA酶)裂解，按照Nielsen等，ProcNatlAcadSciUSA100(16):9330-9335(2003)的描述用抗體微陣列試驗測定生長因子刺激的AKT磷酸化有無減少。AKT抗體獲自CellSignalingTechnology(Beverly,MA)。實施例9該實施例描述了具有上述特征的示例性抗-EGFR/ErbB3bsBA的測試結果。錄菜通過共轉染兩種表達質粒A5CH/pSTH和C225Ck/pSTZ(描述于圖ll)在293T細胞中表達雙特異性抗體C225-A5Ig-scFv融合物。從上清液中純化表達的C225-A5Ig-scFv融合物并通過流式細胞術評價其與癌細胞系A431的結合。A431細胞過表達EGF受體，且正如所料，C225-A5Ig-scFv融合物與這些細胞良好結合，如圖2所示。隨后在癌細胞系A431中檢測表達的C225-A5-Ig-scFv對生長因子誘導的的AKT磷酸化抑制。細胞與不同濃度的C225-A5Ig-scFv融合物一起預培育30分鐘，然后用調蛋白(HRG)或EGF刺激5分鐘。再用含有洗滌劑的緩沖液裂解以檢測AKT的磷酸化。結果如圖3所示。C225-A5Ig-scFv融合物在對EGF的反應中抑制了AKT的磷酸化，其IC5o約為2nM。調蛋白是導致包括AKT在內的一些胞內激酶活化的ErbB3受體的配體。盡管抗-ErbB3抗體A5的親和力相對較低(約700nM)，C225-A5Ig-scFv融合物抑制調蛋白誘導的活化作用，其IC5o約為0.2nM。這證明，"高-低"雙特異性試劑(即對第一抗體具有高親和力而對第二抗體具有低親和力的試劑)可非常有力地抑制抗體所靶向的激酶的活性。應理解，本文所述實施例和實施方式僅為了說明，本領域技術人員能夠根據它們作出各種修改和改變，這些修改和改變應包括在本申請的構思和范圍以及所附權利要求書的范圍內。將本文引用的所有發表物、專利和專利申請全文納入本文作參考用于所有目的。權利要求1.一種調節靶細胞上靶分子的一種或多種生物活性的方法，所述方法包括(a)提供一種雙特異性結合劑，所述雙特異性結合劑具有與所述細胞表面上第一靶分子的解離常數(“Kd”)至少為10-7M的第一結合結構域和與所述細胞表面上第二靶分子的親和力比所述第一結合結構域的Kd低至少10倍的第二結合結構域；其中所述第一和所述第二靶分子各具有生物活性，所述活性相同或不同；和(b)在允許第一和第二結合結構域分別結合第一和第二靶分子的條件下使所述雙特異性結合劑與所述靶細胞接觸，其中所述第一和第二靶分子的結合調節所述靶分子的一種或多種生物活性。2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述雙特異性結合劑包含兩種抗體。3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述抗體是雙抗體、直接連接或通過接頭連接的兩條單鏈Fv、二硫鍵穩定的Fv或其組合。4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶細胞是癌細胞。5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一靶分子是腫瘤相關性抗原、細胞因子受體或生長因子受體。6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一靶分子是受體酪氨酸激酶。7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二靶分子選自ErbB3、ErbB4、FGF受體1-4中的任何一種、HGF受體、IGF1-R、PDGF、受體a和卩以及C-KIT。8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一結合結構域對第一靶分子的Kd為1(T8-10-12M。9.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二結合結構域對第二靶分子的Kd比所述第一結合結構域對第一靶分子的Kd低至少20倍。10.—種在具有耙細胞和非靶細胞的生物體中調節靶細胞上靶分子的一種或多種生物活性的方法，其中，所述靶細胞在其外部具有第一靶分子并在其外表面具有第二靶分子，且其中，(i)所述第一和第二靶分子不共享共有配體，(ii)所述第一靶分子在所述耙細胞表面上的豐度比也攜帶第二靶分子的非靶細胞表面上的豐度高至少10倍，和(iii)所述第一靶分子和所述第二靶分子各具有生物活性，所述活性相同或不同，所述方法包括(a)提供一種雙特異性結合劑，所述雙特異性結合劑具有與第一靶分子的Kd至少為10—7M的第一結合結構域和與第二靶分子的Kd比所述第一結合結構域的Kd低至少IO倍的第二結合結構域；和(b)在允許第一和第二結合結構域分別結合第一和第二耙分子的條件下使所述雙特異性結合劑與所述耙細胞接觸，其中所述第一和所述第二結合結構域的所述結合分別調節所述第一和所述第二靶分子的一種或多種生物活性。11.如權利要求IO所述的方法，其特征在于，所述雙特異性結合劑包含兩種抗體。12.如權利要求ll所述的方法，其特征在于，所述抗體是雙抗體、直接連接或通過接頭連接的兩條單鏈Fv、二硫鍵穩定的Fv或其組合。13.如權利要求IO所述的方法，其特征在于，所述靶細胞是癌細胞。14.如權利要求IO所述的方法，其特征在于，所述第一靶分子是腫瘤相關性抗原、細胞因子受體或生長因子受體。15.如權利要求IO所述的方法，其特征在于，所述第一靶分子是受體酪氨酸激酶。16.如權利要求15所述的方法，其特征在于，所述第二靶分子是ErbB3(HER3)、胰島素樣生長因子-1受體(IGF1-R)、FGF受體1-4中的任何一種、HGF受體、胰島素受體、PDGF受體a或p、C-KIT、或ErbB4。17.如權利要求IO所述的方法，其特征在于，所述所述第一結合結構域對第一靶分子的Kd為1(T8-1(T12M。18.如權利要求IO所述的方法，其特征在于，所述第二結合結構域對第二靶分子的Kd比所述第一結合結構域對第一靶分子的Kd低至少20倍。19.如權利要求IO所述的方法，其特征在于，所述第二結合結構域對第二靶分子的Kd比所述第一結合結構域對第一靶分子的Kd低至少50倍。20.如權利要求IO所述的方法，其特征在于，所述調節是降低受體酪氨酸激酶的活性。21.—種雙特異性結合劑(bsBA)，其包含與靶細胞上第一靶分子的Kd至少為10—7M的第一結合結構域和與耙細胞上第二耙分子的Kd比所述第一結合結構域對第一靶分子的Kd低至少IO倍的第二結合結構域，其中，(i)所述第一和第二靶分子不具有相同的天然配體，(ii)所述第一靶分子和所述第二靶分子各具有生物活性，所述活性相同或不同，且(iii)所述第一和所述第二結合結構域當其結合所述第一和所述第二靶分子時分別調節所述第一和第二耙分子的一種或多種生物活性。22.如權利要求21所述的bsBA，其特征在于，所述第二結合結構域的Kd比所述第一結合結構域的Kd低至少50倍。23.如權利要求21所述的bsBA，其特征在于，所述第二結合結構域的Kd比所述第一結合結構域的Kd低100倍或更多倍。24.如權利要求21所述的bsBA，其特征在于，所述bsBA包含兩種抗體。25.如權利要求24所述的bsBA，其特征在于，所述抗體是雙抗體、直接連接或通過接頭連接的兩條單鏈Fv、二硫鍵穩定的Fv或其組合。26.如權利要求21所述的bsBA，其特征在于，所述第一結合結構域結合腫瘤相關性抗原、細胞因子受體或生長因子受體。27.如權利要求21所述的bsBA，其特征在于，所述第一結合結構域結合受體酪氨酸激酶。28.如權利要求21所述的bsBA，其特征在于，所述第二結合結構域結合ErbB3(HER3)、胰島素樣生長因子-1受體(IGF1-R)、FGF受體1-4中的任何一種、HGF受體、胰島素受體、PDGF受體a或(3、C-KIT、或ErbB4。29.如權利要求21所述的bsBA，其特征在于，所述第一結合結構域結合EGFR，而所述第二結合結構域結合ErbB3(HER3)。30.如權利要求21所述的bsBA，其特征在于，所述所述第一結合結構域的Kd為1(T8-1(T12M。31.如權利要求21所述的bsBA，其特征在于，所述第一耙分子在耙細胞上的表達比其在正常細胞上的表達過度至少10倍。32.—種組合物，含有(a)雙特異性結合劑(bsBA)和(b)藥學上可接受的載體，所述雙特異性結合劑包含與靶細胞上第一靶分子的Kd至少為10—〒M的第一結合結構域和與耙細胞上第二靶分子的Kd比所述第一結合結構域的Kd低至少10倍的第二結合結構域，其中所述第一和第二耙分子不具有相同的天然配體，其中，(i)所述第一靶分子和所述第二靶分子各具有生物活性，所述活性相同或不同，且(ii)所述第一和所述第二結合結構域當其結合所述第一和所述第二靶分子時分別調節所述第一和第二靶分子的一種或多種生物活性。33.如權利要求32所述的組合物，其特征在于，所述第二結合結構域的Kd比所述第一結合結構域的Kd低至少50倍。34.如權利要求32所述的組合物，其特征在于，所述第二結合結構域的Kd比所述第一結合結構域的Kd低100倍或更多倍。35.如權利要求32所述的組合物，其特征在于，所述bsBA包含兩種抗體。36.如權利要求35所述的組合物，其特征在于，所述抗體是雙抗體、直接連接或通過接頭連接的兩條單鏈Fv、二硫鍵穩定的Fv或其組合。37.如權利要求32所述的組合物，其特征在于，所述第一結合結構域結合腫瘤相關性抗原、細胞因子受體、生長因子受體或受體酪氨酸激酶。38.如權利要求32所述的組合物，其特征在于，所述第一靶分子在靶細胞上的表達比在也帶有第二靶分子的非靶細胞上的表達過度至少10倍。39.—種雙特異性結合劑(bsBA)在藥物制造中的應用，所述雙特異性結合劑包含與耙細胞上第一耙分子的Kd至少為1(T7M的第一結合結構域和與靶細胞上第二靶分子的Kd比所述第一結合結構域的Kd低至少10倍的第二結合結構域，其中所述第一和第二耙分子不具有相同的天然配體，其中所述第一靶分子和所述第二靶分子各具有生物活性，所述活性相同或不同，且所述第一和所述第二結合結構域當其結合所述第一和所述第二靶分子時分別調節所述第一和第二靶分子的一種或多種生物活性。40.如權利要求39所述的應用，其特征在于，所述第二結合結構域的Kd比所述第一結合結構域的Kd低至少50倍。41.如權利要求39所述的應用，其特征在于，所述第二結合結構域的Kd比所述第一結合結構域的Kd低100倍或更多倍。42.如權利要求39所述的應用，其特征在于，所述bsBA包含兩種抗體。43.如權利要求42所述的應用，其特征在于，所述抗體是雙抗體、直接連接或通過接頭連接的兩條單鏈Fv、二硫鍵穩定的Fv或其組合。44.如權利要求39所述的應用，其特征在于，所述被第一結合結構域和第二結合結構域結合的靶分子獨立選自腫瘤相關性抗原、細胞因子受體或生長因子受體，前提是第一結合結構域和第二結合結構域不結合相同的腫瘤相關性抗原、細胞因子受體或生長因子受體。45.如權利要求39所述的應用，其特征在于，所述藥物用于抑制癌細胞增殖。46.如權利要求39所述的應用，其特征在于，所述第一靶分子在靶細胞上的表達比在也帶有第二靶分子的非靶細胞上的表達過度至少10倍，或者更多倍。47.—種試劑盒，其裝有-(a)容器，禾口(b)雙特異性結合劑(bsBA)，其包含與靶細胞上第一靶分子的Kd至少為10^M的第一結合結構域和與靶細胞上第二靶分子的Kd比所述第一結合結構域對第一靶分子的Kd低至少10倍的第二結合結構域，其中，(i)所述第一和第二靶分子不具有相同的天然配體，(ii)所述第一靶分子和所述第二靶分子各具有生物活性，所述活性相同或不同，且(iii)所述第一和所述第二結合結構域當其結合所述第一和所述第二靶分子時分別調節所述第一和第二靶分子的一種或多種生物活性。48.如權利要求47所述的試劑盒，其特征在于，所述第二結合結構域的Kd比所述第一結合結構域的Kd低至少50倍。49.如權利要求47所述的試劑盒，其特征在于，所述第二結合結構域的Kd比所述第一結合結構域的Kd低100倍或更多倍。50.如權利要求47所述的試劑盒，其特征在于，所述bsBA包含兩種抗體。51.如權利要求47所述的試劑盒，其特征在于，所述抗體是雙抗體、直接連接或通過接頭連接的兩條單鏈Fv、二硫鍵穩定的Fv或其組合。52.如權利要求47所述的試劑盒，其特征在于，所述第一結合結構域結合腫瘤相關性抗原、細胞因子受體、生長因子受體或受體酪氨酸激酶。53.如權利要求47所述的試劑盒，其特征在于，所述第二結合結構域結合ErbB3(HER3)、胰島素樣生長因子-l受體(IGF1-R)、FGF受體1-4中的任何一種、HGF受體、胰島素受體、PDGF受體a或p、C-KIT、或ErbB4。54.如權利要求47所述的試劑盒，其特征在于，所述第一結合結構域結合EGFR，而所述第二結合結構域結合ErbB3(HER3)。55.如權利要求47所述的試劑盒，其特征在于，所述所述第一結合結構域的Kd為10-8-l(T12M。56.如權利要求47所述的試劑盒，其特征在于，所述第一靶分子在靶細胞上的表達比其在正常細胞上的表達過度至少10倍。全文摘要描述了提高雙特異性結合組合物特異性結合能力的方法。所述雙特異性結合組合物能夠通過靶細胞表面標記的親和力高的靶向結構域和特異性結合第二細胞表面標記的親和力低的靶向結構域靶向細胞，其中，各結構域與其各自的細胞表面標記的結合根據需要提高或降低了各自的細胞表面標記的生物活性。本發明還提供了雙特異性結合劑在所述方法中的應用以及它們在試劑中的應用。文檔編號A61K39/395GK101163501SQ200580049292公開日2008年4月16日申請日期2005年5月5日優先權日2005年2月23日發明者B·M-·舍貝爾,U·B·尼爾森申請人:梅里麥克制藥股份有限公司