綴合產物的制作方法

專利名稱：：綴合產物的制作方法
技術領域：
：本發明涉及可用于治療血管生成和癌癥相關疾病的新型肽。更具體地講，本發明涉及胞外基質肽及其衍生物，尤其是包含DGR基序及其異構體的肽。本發明也涉及修飾的細胞因子，尤其是能夠"歸巢，，血管生成性血管的細胞因子衍生物。
背景技術：
：胞外基質是細胞和組織行為的重要調節劑。纖連蛋白、玻連蛋白、膠原蛋白和層粘連蛋白等胞外基質蛋白可結合多種細胞受體，控制許多在醫學上具有重要意義的生物學現象，例如血管生成、細胞遷移、組織修復、癌細胞分化、血小板聚集和免疫系統細胞歸巢和耙位點的神經元加工。一個重要的能結合胞外基質的受體家族就是整聯蛋白。纖連蛋白是大的胞外基質糖蛋白(450KDa),參與整聯蛋白的結合。它們是由二硫鍵連接的兩個基本相同的亞基組成，每個亞基由3類重復同源組件(稱為FN-I、FN-II和FN-III重復序列)組成。另外，也可存在可變剪接組件(稱為EDA、EDB和mCS)(Mohri，1997;Pankov和Yamada,2002)。單組件或多組件可含有不同分子的結合位點，包括硫酸化糖胺聚糖(sulfatedglycosaminoglycans)、DNA、明膠、肝素和血纖蛋白(Mohri,1997;Pankov和Yamada,2002;Yamada,1989)。此外，纖連蛋白含有約半數已知細胞表面整聯蛋白受體的結合位點(Johansson等，1997;Plow等，2000)。具體地講，FN-III!。重復序列含有能結合ct3f5pccsppoJ5p0^|33、(35、oJ36、OCgP!和odlbP3整聯蛋白的RGD位點，而FN-IIl9重復序列含有所謂的"協同位點"PHSRN,其在oc5^和allbp3的結合中可與RGD協同作用(Busk等，1992;Dedhar和Gray,1990;Gardner和Hynes,1985;Johansson等，1997;Pankov和Yamada,2002;Plow等，1985;Pytela等，1985;Smith等，1990;Takada等，1987;Vogel等，1990;Weinacker等，1994)。FN-m14-mcs區含有3個位點(稱為cs,、cSs和hj,其特征是存在LDV基序和輔助REDV和IDA位點，并且參與a4^和064|37的識別(Johansson等，1997;Pankov和Yamada,2002)。此外，FN-IIl5重復序列含有能結合a4(^和014|37的KLDAPT序列(Moyano等，1997),而FN-Il9和FN-IIl2含有可與oc5(^相互作用的尚未鑒定的位點(Hocking等，1998)。人纖連蛋白的一級和三級結構分析表明，該蛋白質含有兩個GNGRG環，位于FN-Is和FN-l7組件內，它們在牛、鼠、大鼠、兩棲動物和魚類中是保守的(DiMatteo等)。保守性更低的兩個額外NGR位點也存在于人FN-II,和FN-III9中。目前的實驗工作表明，含有NGR基序的肽可抑制as(^和(^介導的細胞與纖連蛋白的粘附(Koivunen等，1993)。細胞表面錨定的整聯蛋白與胞外基質組分之間的相互作用與血管生成有關，這在新生動物生長和以下多種臨床疾病發病機制方面都是重要過程組織炎癥、關節炎、腫瘤生長、糖尿病性視網膜病、視網膜新生血管形成所致黃斑變性等病癥。已經知道，(^(53整聯蛋白即玻連蛋白受體，在血管生成中起到關鍵性作用(Hynes,2002)。已知能夠抑制該整聯蛋白與胞外基質蛋白相互作用的化合物能抑制血管生成和腫瘤生長(Brooks等，1994;Brooks等，1995;Friedlander等,1995;Friedlander等，1996;Hammes等，1996)。然而，與這些抑制劑有關的問題是它們與多種整聯蛋白都有交叉反應性。為了增加對胞外基質在生物學過程和疾病發生中的作用的認識，仍然需要靶向該領域的新型治療藥。本發明正是致力于該需求。某些細胞因子的抗腫瘤活性是眾所周知的，并已有記載。一些細胞因子也已用于人類治療(Fiers等，1995)。例如，已經知道諸如白介素-2(IL-2)和干擾素a(IFNa)之類的細胞因子在患有不同類型腫瘤的患者體內顯示出有效的抗腫瘤活性，所述腫瘤類型例如腎轉移癌、毛細胞白血病、卡波西肉瘤(Kaposisarcoma)、黑素瘤、多發性骨髓瘤(multiplemieloma)等。已經表明，IFN(3、腫瘤壞死因子(TNT)a、TNFB、IL-1、IL-4、IL-6、IL-12、IL-15和集落刺激因子(CFS)等其它細胞因子對某些種類的腫瘤也有一定的抗腫瘤活性，因此是進一步研究的對象。一般而言，細胞因子的全身毒性極大限制了它們的治療應用。例如，最初發現TNF能夠誘導某些胂瘤的出血性壞死(Carswell等，1975),并發現它在體外對不同腫瘤系具有細胞毒性效應(Helson等，1975)，但后來證明它具有強烈的促炎活性，在過量產生的情況下對人體有危險(Tracey等，199》。由于全身毒性是藥理學上活性數量的細胞因子在人體內應用的基本問題，因此新的衍生物和治療策略目前正在評價之中，旨在降低這類生物學效應物的毒性效應，同時又保持其療效。例如，WO01/61017/>開了TNF或IFNy與CD13受體的配體之間的一種綴合產物；WO03/093478公開了包含細胞因子與腫瘤靶向部分的綴合物的藥物組合物，其中細胞因子的含量不誘導負反饋機制；WO03/092737公開了不同細胞因子與胂瘤靶向部分的綴合物。本發明提供具有治療潛力的新型細胞因子綴合物。發明概述天冬酰胺(N)脫酰胺作用，一種非酶促蛋白翻譯后修飾作用，通常被認為是與蛋白質衰老有關的有害事件。在本申請中，我們證明，胞外基質的天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸(NGR)序列可促進內皮細胞粘附，即通過基于天冬酰胺的非酶促脫酰胺而生成天冬氨酸和異天冬氨酸(isoasparticacid)的異常機制，產生新的細胞粘附基序。具體地講，我們證明該脫酰胺作用與"功能獲得(gainoffimction)"有關；脫酰胺基的片段能夠抑制內皮細胞與玻連蛋白的粘附，抑制0^3整聯蛋白并抑制腫瘤生長。具體地講，我們已經證明，與其它異構體形式相比，dsoDGR和dDGR異構體的細胞粘附結合和抗癌特性增加。這令人驚奇地證明，絕大多數的肽都包含天冬氨酸的L對映體。通過基因表達所產生的肽全都包含L對映體。我們已經知道，與脫酰胺基的NGR肽綴合的細胞因子具有令人驚奇的活性。我們先前已經知道，可以通過與包含NGR基序的配體偶聯而顯著改進某些細胞因子的治療指數并增強其免疫治療特性，所述配體例如氨肽酶-N受體(CD13)的修飾配體。CD13是150kDa的跨膜糖蛋白，在不同物種中高度保守。它在正常細胞以及骨髓瘤細胞系、血管生成性內皮和某些上皮細胞表面表達。CD13受體通常鑒定為"NGR"受體，因為其肽配體共享氨基酸的"NGR"基序。我們已經驚奇地發現，用修飾配體可達到類似或確切的改進結果，其中NGR基序中的天冬酰胺酰(Asn或N)殘基通過脫酰胺被修飾為天冬氨酰(Asp或D)，即"DGR"基序。TNF與這樣的CD13受體的修飾配體和IFNy偶聯，也可起到協同作用，使得當按照低于單用的有效量的劑量聯合用藥時，可觀察到有效的抗腫瘤活性。另外，我們已經發現，給予IFNy,能增加修飾TNF與其它抗腫瘤藥聯用的抗腫瘤活性，所述其它抗腫瘤藥例如美法侖(mephalan)或多柔比星或順鉬或吉西他濱或泰素。發明聲明按照本發明的第一方面，提供能選擇性抑制(^(33整聯蛋白的肽，所述肽包含具有NGR基序的肽的脫酰胺產物。按照本發明的另一方面，提供能抑制內皮細胞與玻連蛋白粘附的肽，所迷肽包含具有NGR基序的肽的脫酰胺產物。按照本發明的另一方面，提供包含胞外基質蛋白脫酰胺產物的肽，所述胞外基質蛋白例如但不限于纖連蛋白、玻連蛋白、膠原蛋白或層粘連蛋白或其片段或衍生物。優選的片段包含脫去酰胺基的基質蛋白的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或100個連續氨基酸，優選包含所述蛋白質的脫去酰胺基的NGR基序。優選的肽包含纖連蛋白或其片段或衍生物的脫酰胺產物，更優選纖連蛋白的FN-l5、FN-I7、FN-II,或FN-IIl9組件或其片段或衍生物的脫酰胺產物，更優選纖連蛋白的FN-Is組件或其片段或衍生物的脫酰胺產物，或者纖連蛋白的FN-l7組件或其片段或衍生物的脫酰胺產物。優選的片段包含纖連蛋白的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或100個連續氨基酸，優選包含所述蛋白質的脫去酰胺基的NGR基序。在一個實施方案中，所述肽由胞外基質蛋白或其片段或衍生物的脫酰胺產物組成。按照本發明的另一方面，提供肽的脫酰胺產物，所述肽包含序列XNGRX，，其中X選自L、V、A、C、G、Y、P、H、K、Q和I，X，選自C、G、H、L、E、T、Q、R、S和P。優選的肽包含具有選自以下序列的肽的脫酰胺產物CNGRCVSGCAGRC、NGRAHA、GNGRG、CVLNGRMEC、CNGRC、CNGRCG、LNGRE、YNGRT、LQCICTGNGRGEWKCELQCISTGNGRGEWKCE、CICTGNGRGEWKC、CISTGNGRGEWKC、MRCTCVGNGRGEWTCY、MRCTSVGNGRGEWTCYCTCVGNGRGEWTC和CTSVGNGRGEWTC。在一個實施方案中，所述肽由具有選自以下序列的肽的脫酰胺產物組成CNGRCVSGCAGRC、NGRAHA、GNGRG、CVLNGRMEC、CNGRC、LNGRE、YNGRT、LQCICTGNGRGEWKCE、LQCISTGNGRGEWKCE、CICTGNGRGEWKC、CISTGNGRGEWKC、MRCTCVGNGRGEWTCY、MRCTSVGNGRGEWTCYCTCVGNGRGEWTC和CTSVGNGRGEWTC。優選的肽包含具有選自以下序列的肽的脫酰胺產物環狀CVLNGRMEC、線狀CNGRC、環狀CNGRC、線狀CNGRCG和環狀CNGRCG。在一個實施方案中，所述肽由具有選自以下序列的肽的脫酰胺產物組成環狀CVLNGRMEC、線狀CNGRC、環狀CNGRC、線狀CNGRCG和環狀CNGRCG。按照本發明的另一方面，提供具有DGR基序的肽，其中所述肽選擇性抑制a^3整聯蛋白。按照本發明的另一方面，提供具有DGR基序的肽，其中所述肽抑制內皮細胞與玻連蛋白的粘附。優選的肽包含序列XDGRX，，其中X選自L、V、A、C、G、Y、P、H、K、Q和I，X，選自C、G、H、L、E、T、Q、R、S和P。優選的肽包含選自以下的序列CDGRCVSGCAGRC、DGRAHA、GDGRG、CVLDGRMEC、CDGRC、CDGRCG、LDGRE、YDGRT、LQCICTGDGRGEWKCE、LQCISTGDGRGEWKCE、CICTGDGRGEWKC、CISTGDGRGEWKC、MRCTCVGDGRGEWTCY、MRCTSVGDGRGEWTCY、CTCVGDGRGEWTC或CTSVGDGRGEWTC,更優選選自以下的序列環狀CVLDGRMEC、線狀CDGRC、環狀CDGRC、線狀CDGRCG和環狀CDGRCG。在一個實施方案中，所述肽由選自以下的序列組成CDGRCVSGCAGRC、DGRAHA、GDGRG、CVLDGRMEC、CDGRC、CDGRCG、LDGRE、YDGRT、LQCICTGDGRGEWKCE、LQCISTGDGRGEWKCE、CICTGDGRGEWKC、CISTGDGRGEWKC、MRCTCVGDGRGEWTCY、MRCTSVGDGRGEWTCY、CTCVGDGRGEWTC或CTSVGDGRGEWTC,更優選選自以下的序列環狀CVLDGRMEC、線狀CDGRC、環狀CDGRC、線狀CDGRCG和環狀CDGRCG。按照本發明的另一方面，提供包含isoDGR基序的肽。優選的肽包含序列XisoDGRX，，其中X選自L、V、A、C、G、Y、P、H、K、Q和I,X，選自C、G、H、L、E、T、Q、R、S和P。優選的肽包含選自以下的序列CisoDGRCVSGCAGRC、isoDGRAHA、GisoDGRG、CVLisoDGRMEC、CisoDGRC、CisoDGRCG、LisoDGRE、YisoDGRT、LQCICTGisoDGRGEWKCE、LQCISTGisoDGRGEWKCE、CICTGisoDGRGEWKC、CISTGisoDGRGEWKC、MRCTCVGisoDGRGEWTCY、MRCTSVGisoDGRGEWTCY、CTCVGisoDGRGEWTC或CTSVGisoDGRGEWTC,更優選選自以下的序列環狀CVLisoDGRMEC、線狀CisoDGRC、環狀CisoDGRC、線狀CisoDGRCG和環狀CisoDGRCG。在一個實施方案中，所述肽由選自以下的序列組成CisoDGRCVSGCAGRC、isoDGRAHA、GisoDGRG、CVLisoDGRMEC、CisoDGRCCisoDGRCG、LisoDGRE、YisoDGRTLQCICTGisoDGRGEWKCE、LQCISTGisoDGRGEWKCE、CICTGisoDGRGEWKC、CISTGisoDGRGEWKC、MRCTCVGisoDGRGEWTCY、MRCTSVGisoDGRGEWTCYCTCVGisoDGRGEWTC和CTSVGisoDGRGEWTC,更優選選自以下的序列環狀CVLisoDGRMEC、線狀CisoDGRC、環狀CisoDGRC、線狀CisoDGRCG和環狀CisoDGRCG。按照本發明的另一方面，提供包含!JsoDGR基序的肽。優選的肽包含序列XLisoDGRX'序列，其中X選自L、V、A、C、G、Y、P、H、K、Q或I，X，選自C、G、H、L、E、T、Q、R、S或P。優選的肽包含選自以下的序列CjsoDGRCVSGCAGRC、LisoDGRAHA、GLisoDGRG、CVLLisoDGRMEC、CLisoDGRC、CLisoDGRCG、LLisoDGRE、YLisoDGRT、LQCICTGLisoDGRGEWKCE、LQCISTGLisoDGRGEWKCE、CICTGLisoDGRGEWKC、CISTGLisoDGRGEWKC、MRCTCVGLisoDGRGEWTCY、MRCTSVGLisoDGRGEWTCY、CTCVGLisoDGRGEWTC和CTSVGLisoDGRGEWTC,更優選選自以下的序列環狀CVLLisoDGRMEC、線狀CLisoDGRC、環狀CLisoDGRC、線狀CLisoDGRCG和環狀CLisoDGRCG。在一個實施方案中，所述肽由選自以下的序列組成CLisoDGRCVSGCAGRC、LisoDGRAHA、GLisoDGRG、CVLLisoDGRMEC、CLisoDGRC、CLisoDGRCG、LLisoDGRE、YLisoDGRT、LQCICTGLisoDGRGEWKCE、LQCISTGLisoDGRGEWKCE、CICTGLisoDGRGEWKC、CISTGLisoDGRGEWKC、MRCTCVGLisoDGRGEWTCY、MRCTSVGLisoDGRGEWTCY、CTCVGLisoDGRGEWTC和CTSVGjsoDGRGEWTC,更優選選自以下的序列環狀CVLLisoDGRMEC、線狀CLisoDGRC、環狀CLisoDGRC、線狀CLisoDGRCG和環狀CLisoDGRCG。按照本發明的另一方面，提供具有oDGR基序的肽。優選的肽包含序列XuDGRX',其中X選自L、V、A、C、G、Y、P、H、K、Q或I，X，選自C、G、H、L、E、T、Q、R、S或P。優選的肽包含選自以下的序列CdDGRCVSGCAGRC、dDGRAHA、GdDGRG、CVLdDGRMEC、CdDGRC、CdDGRCG、LDDGRE、YpDGRT、LQCICTGdDGRGEWKCE、LQCISTGDDGRGEWKCE、CICTGdDGRGEWKC、CISTGDDGRGEWKC、MRCTCVGDDGRGEWTCY、MRCTSVGDDGRGEWTCY、CTCVGDDGRGEWTC和CTSVGdDGRGEWTC,更優選選自以下的序列環狀CVLdDGRMEC、幾狀CdDGRC、壞狀CdDGRC、殘狀CdDGRCG和環狀CDDGRCG。在一個實施方案中，所述肽由選自以下的序列組成CdDGRCVSGCAGRC、dDGRAHA、GdDGRG、CVLdDGRMEC、CDDGRC、CDDGRCG、LdDGRE、YdDGRT、lqcictgddgrgewkce、lqcistgddgrgewkce、cictgddgrgewkc、cistg。dgrgewkc、MRCTCVGdDGRGEWTCY、盧CTSVGdDGRGEWTCY、CTCVGdDGRGEWTC和CTSVGdDGRGEWTC，更優選選自以下的序列環狀CVLdDGRMEC、線狀CdDGRC、環狀CdDGRC、線狀CdDGRCG和環狀CDDGRCG。在一個實施方案中，包含isoDGR基序、LisoDGR基序或DDGR基序的肽包含胞外基質蛋白或其片段或衍生物的脫酰胺產物，所述胞外基質蛋白例如但不限于纖連蛋白、玻連蛋白、膠原蛋白或層粘連蛋白，更優選脫酰胺產物纖連蛋白或其片段或衍生物，更優選纖連蛋白的FN-Is、FN-I7、FN-II!或FN-IIl9組件或其片段或衍生物的脫酰胺產物。優選的片段包含胞外基質蛋白或組件的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或100個連續氨基酸。本發明優選的肽選擇性抑制0^3整聯蛋白和/或抑制內皮細胞與玻連蛋白的粘附。優選的肽抑制o^3,但是不抑制o^5、a5^和a!(3！。優選肽對0433抑制的IC5Q<0.5|jM,優選0.2iuM。按照材料與方法所述，優選ICs。所用的測定方法是采用鏈霉抗生物素-過氧化物酶綴合物復合物來測定的。優選肽對aJ3s和/或oc5(^和/或oqf^的IC50〉1.0|liM,更優選〉2.0iuM、>3.0|liM、>4.0pM。優選本發明的肽抑制腫瘤生長。優選本發明的肽抑制血管生成。在一個實施方案中，本發明的肽不含額外治療藥，包括抗癌藥或細胞因子。在一個實施方案中，本發明的肽包含至多350、100、50、25、15、IO或5個氨基酸。按照本發明的另一方面，提供包含本發明肽的綴合產物。優選的綴合產物是本發明肽與藥物、細胞因子、細胞因子片段、毒素、凋亡肽、生物反應調節劑、放射性核素、病毒顆粒、基因或造影化合物的綴合產物。在一個實施方案中，所述藥物是抗癌藥，例如多柔比星、美法侖、順鉑、吉西他濱或泰素。按照本發明的另一方面，提供一種藥物組合物，所述組合物包含藥用有效量的本發明的肽或綴合產物，優選包含藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。優選的組合物基本上不包含具有NGR基序的肽或綴合物。具體地講，當組合物包含脫去酰胺基的肽時，其優選基本上不含前體肽，即基本上不包含原料。優選組合物中的肽或綴合物含有40%、30%、20%、15%、10%、5%、3%或1%以下的原料。包含具有DGR基序的肽和綴合物的本發明優選的組合物基本上不包含具有相應NGR基序的相應肽和綴合物。優選含DGR肽占總舦(即含有DGR和NGR的肽)的比例超過60%、更優選超過70%、更優選超過80%、更優選超過85%、更優選超過90%、更優選超過95%、更優選超過97%、更優選超過99%(以重量百分比計)。本發明的組合物可以呈注射用溶液劑或混懸劑或輸注用液體制劑的形式。本發明的組合物可以呈脂質體的形式。按照本發明的另一方面，提供治療或診斷患有{33相關疾病的患者的方法，所述疾病例如但不限于骨質疏松、關節炎、糖尿病性視網膜病、黃斑變性、再狹窄或血管瘤；所述方法包括給予本發明的肽、綴合產物或藥物組合物。按照本發明的另一方面，提供治療或診斷患有以下疾病的患者的方法骨質疏松、關節炎、糖尿病性視網膜病、黃斑變性、再狹窄或血管瘤，所述方法包括給予本發明的肽、綴合產物或藥物組合物。按照本發明的另一方面，提供治療或診斷癌癥患者的方法，所述癌癥例如但不限于肺癌、胰腺癌、乳癌、結腸癌、喉癌或卵巢癌，所述方法包括給予本發明的肽、綴合產物或藥物組合物。按照本發明的另一方面，提供本發明的肽與細胞因子的綴合產物。4姿照本發明的另一方面，提供細胞因子與包含NGR基序的脫酰胺產物的把向部分的綴合產物。按照本發明的另一方面，提供細胞因子與包含DGR基序的耙向部分的綴合產物，DGR基序包括但不限于CDGRCVSGCAGRC、DGRAHA、GDGRG、CVLDGRMEC、CDGRC、CDGRCG、LDGRE、YDGRT、LQCICTGDGRGEWKCE、LQCISTGDGRGEWKCE、CICTGDGRGEWKC、CISTGDGRGEWKC、MRCTCVGDGRGEWTCY、MRCTSVGDGRGEWTCY、CTCVGDGRGEWTC或CTSVGDGRGEWTC，更優選環狀CVLDGRMEC、線狀CDGRC、環狀CDGRC、線狀CDGRCG或環狀CDGRCG。優選DGR基序是isoDGR基序、更優選jsoDGR。在一個實施方案中，DGR基序是dDGR。本發明綴合物所用的細胞因子的非限制性列表是TNFa、TNF(3、IFNa、IFNp、IFNy、IL國1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、EMAPII、血管內皮生長因子(VEGF)、PDGF、PD-ECGF或趨化因子。優選綴合物的細胞因子選自TNP、IFNy、IL-12、IP-IO、IL-7或EMAPII。更優選細胞因子選自TNF、IFNy或IL-12。優選TNF是TNFa或TNF(3。在一個實施方案中，細胞因子用聚乙二醇或酰基殘基來衍生。在另一實施方案中，細胞因子還與選自以下的化合物綴合抗體、抗體片段和生物素，其中所述抗體或其片段針對選自以下的化合物腫瘤抗原、肺瘤血管生成性標記或胞外基質組分。在另一實施方案中，細胞因子是TNF并與所述扭向部分和選自以下的化合物綴合抗體、抗體片段和生物素。按照本發明的另一方面，提供藥物組合物，所述組合物包含有效量的本發明的TNF綴合產物和有效量的IFNy或其編碼多核普酸。優選本發明的肽或綴合物不同于當含有NGR基序的肽或綴合物代謝而在體內形成的肽或綴合物。按照本發明的另一方面，提供通過熱處理而獲得的本發明的肽或綴合物。本發明的組合物還可包含其它抗腫瘤藥，例如但不限于多柔比星或美法侖或順鉑或吉西他濱或泰素或診斷用腫瘤造影化合物。發明詳述實施方案。除非另有說明，否則本發明的實踐將會采用化學、分子生物學、孩1生物學、重組DNA和免疫學等常規技術，這些技術都在所屬領域普通技術人員能力范圍之內。這些技術在文獻上都有解釋。參見例i口J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatis,1989，A/o/ecw/arC7om力g:爿丄a60raf0/7M"認/,第2版,第1-3冊,ColdSpringHarborLaboratoryPress;Ausubel,F.M.等(1995和定期增子寸)；Cz^re"f尸rafoco/sM/ecw/ar萬/o/ogy,笫9、13和16章,JohnWiley&Sons,NewYork,N.Y.);B.Roe,J.Crabtree和A.Kahn，1996,ZWJ/yo/a"'owSegwewcz>2g:i雄油'a/rec/2m'拜s,JohnWiley&Sons;J.M.Polak和JamesO'D.McGee,1990,甜wT/;yZ^/(i/z加.亂尸n'腦》/es朋d尸rac"ce;OxfordUniversityPress;M.J.Gait(編著)，1984，C%owMc/eof/cfe一^es^:爿尸rac"'ca/^4/;raac/，MPress;以及D.M.J.Lilley和J.E,Dahlberg,1992,她決O(is1o/五拜膨/ogy:Z)濕5^w"wrePo7t」5y"決e^G"d/V2戸'cof/^4"g/戸'so/D崩她f/2cxis15wz戸o/ogy，AcademicPress。這些普通教科書分別通過引用結合到本文中。DGR基序眾所周知，天冬氨酸可以不同的結構異構體形式存在，稱為異天冬氨酸(參見圖14)。天冬氨酸和異天冬氨酸各為手性分子，其不同異構體可稱為rAsp(LD)、LisoAsp(LisoD)、DAsp(dD)和DisoAsp(DisoD)，其中LisoD和DisoD代表異天冬氨酸對映體，而LD和DD代表天冬氨酸對映體。當現有技術是指DGR時，它本質上是指LDGR。本文所用的術語DGR是指DGR基序，其包含dD和/或!JsoD或其混合物，并且其還可包含iP和DisoD。優選的DGR是由相應NGR基序脫酰胺而產生的。在一個實施方案中，所述DGR基序包含至少10%(重量/重量)的LisoDGR。在另一實施方案中，DGR基序包含至少10%(重量/重量)的dDGR。至于包含isoDGR基序的肽或靶向部分，是指這樣的肽或靶向部分其中所述DGR基序基本上呈isoDGR的形式。從本質上講，是指相對于含有總DGR的肽或靶向部分來說，含有isoDGR基序的肽或把向部分的重量百分比大于55%、更優選大于60%、更優選大于65%、更優選大于70%、更優選大于75%、更優選大于80%、更優選大于85%、更優選大于90%、更優選大于95%、更優選大于97%、更優選大于99%。isoDGR可包含L/DisoD這兩種對映體，但優選包含至少5%、更優選至少10%、更優選至少30%、更優選至少40%、更優選至少50。/。LisoD(以重量計)。至于包含IsoDGR基序的肽或靶向部分，是指這樣的肽或靶向部分其中所述DGR基序基本上呈LisoDGR的形式。從本質上講，是指相對于含有總DGR的肽或靶向部分來說，含有jjsoDGR基序的肽或靶向部分的重量百分比大于55%、更優選大于60%、更優選大于65%、更優選大于70%、更優選大于75%、更優選大于80%、更優選大于85%、更優選大于90%、更優選大于95%、更優選大于97%、更優選大于99%。至于包含DDGR基序的肽或靶向部分，是指這樣的肽或靶向部分其中所述DGR基序基本上呈dDGR的形式。從本質上講，是指相對于含有總DGR的肽或靶向部分來說，含有DDGR基序的肽或靶向部分的重量百分比大于55%、更優選大于60%、更優選大于65%、更優選大于70%、更優選大于75%、更優選大于80%、更優選大于85%、更優選大于90%、更優選大于95%、更優選大于97%、更優選大于99%。本發明的DGR基序優選包含涉及G和R殘基的轉角。當通過相應的NGR基序脫酰胺得到DGR基序時，優選NGR基序包含涉及G和R殘基的轉角。有關含NGR基序的線狀肽和環狀肽的結構-活性關系以及它們靶向腫瘤的能力的討論，參見Colombo等，J.Biol.Chem.,2002,49,47891-47897。在動物模型中進行的實驗表明，GNGRG和CNGRC都可將TNF耙向胂瘤。環狀CNGRC的分子動態模擬顯示，二硫橋(disulphidebridge)的形成可以穩定殘基存在的Gly^Arg4的彎曲幾何結構。相同的肽、但沒有二硫鍵限制的分子動態模擬表明，最常見和熱力學優先的構型的特征在于存在涉及殘基Gly^ArgA的(3-轉角。這些結果表明，NGR基序具有在線狀肽中形成p-轉角的強烈傾向，并且可以解釋以下發現GNGRG肽可將TNF靶向胂瘤，盡管比CNGRC的程度稍低。纖連蛋白結構域FN-I5的三維結構分析顯示，GNGRG基序形成一個暴露的環，可能接近水和受體(參見圖IB)。帶有半胱氨酸側鏈的NGR-肽(CNGRC)的分子動態模擬，用于本申請，作為纖連蛋白NGR基序的分子替代物，表明其結構能與FN環的結構重疊(DiMatteo等，2002)。脫酰胺天冬酰胺殘基的脫酰胺導致轉化成異天冬氨酸和天冬氨酸。過程見圖14。在本領域技術人員容易確定的合適條件下，可以進行本文所述的脫酰胺。本發明的脫酰胺在體外進行。在一個實施方案中，通過加熱含有NGR的肽，進行脫酰胺。所需溫度可因肽的具體性質而異，本領域技術人員容易確定所需溫度。優選的溫度足以引發天冬酰胺殘基的脫酰胺，但又不會過高而引起肽的變性或破壞。合適溫度可以是例如介于25-50°C、30-40。C或35-40。C之間。也可將肽在堿性條件(通常約pH8)下孵育，例如在碳酸氫銨溶液中孵育，進行脫酰胺。堿性條件的具體性質因肽的具體性質而異，但是本領域技術人員容易確定這樣的條件。優選的堿性條件足以引起天冬酰胺殘基的脫酰胺，但又不會讓其余的肽變性或石皮壞。合適》咸性條件可以是例如介于pH7.5-9.0、pH8.0-9.0或pH8.0-8.5之間。在一個優選的實施方案中，脫酰胺是在堿性溶劑中，在加熱條件下進行的。勝本文所用的術語"肽"包括多肽和蛋白質。術語"多肽"包括單鏈多肽分子以及多個多肽復合物，其中單組分的多肽通過共價或非共價方式連接起來。術語"多肽"包括長度為兩個氨基酸以上的肽，通常具有5、10、20、30、40、50或IOO個以上的氨基酸。本發明的肽可以治療性給予患者。最好使用不僅由天然存在的氨基酸組成的肽、而且由對所述天然存在的氨基酸進行了修飾的氨基酸組成的肽，所述修飾例如降低免疫原性、延長在患者體內的循環半壽期、提高生物利用度和/或增強功效和/或特異性。已經使用了多種方法來修飾用于治療應用的肽。一種方法是將所述肽或蛋白連接在各種聚合物上，所述聚合物例如聚乙二醇(PEG)和聚丙二醇(PPG),參見例如美國專利第5,091,176號、笫5,214,131號和美國專利笫5,264,209號。也可以用各種非編碼氨基酸或修飾氨基酸(例如D-氨基酸和N-甲基氨基酸)取代天然存在的氨基酸，用于修飾肽。另一種方法是使用雙官能交聯劑，例如3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀酰亞胺酯、6-[3-(2-吡咬基二硫基)丙酰胺基]己酸琥珀酰亞胺酯和6-[3-(2-吡啶基二硫基)丙酰胺基]己酸磺基琥珀酰亞胺酯(參見美國專利5,580,853)。最好使用本發明肽的衍生物，所述衍生物在構象上是受約束的。構象約束是指肽所呈現的三維形狀的穩定性和優選構象。構象約束包括局部約束、區域約束和總體約束，其中局部約束涉及限制肽內單個殘基的構象靈活性；區域約束涉及限制一組殘基的構象靈活性，所述殘基可形成一些二級結構單位；而總體約束涉及整個肽結構。可以通過共價修飾(例如環化)或通過摻入，內酰胺或其它形式的鍵，來穩定所述肽的活性構象。例如側鏈可以與主鏈環化，使得在相互作用位點的每側上產生L-Y-內酰胺部分。一般參見Hruby等,"ApplicationsofSyntheticPeptides,"SyntheticPeptides:AUser'sGuide:259-345(W.H.Freeman&Co.1992)。也可以通過例如形成半胱氨酸橋、末端氨基酸各自的氨基端基團和羧基端基團偶聯、或Lys殘基或相關同系物的氨基與Asp、Glu或相關同系物的羧基偶聯，達到環化。也可以理解，使用碘代乙酸酐將多肽oc-氨基與賴氨酸殘基的s-氨基偶聯。參見Wood和Wetzel,1992,Int'lJ.P印tideProteinRes.39:533-39。美國專利5,891,418中記載的另一種方法包括肽結構中金屬離子配位主鏈。通常，優選的金屬-肽主鏈一般是基于給定的配位金屬離子的配位層所需的特定配位基的必需數目。一般而言，大多數可證明是有用的金屬離子的配位數為4-6。肽鏈中配位基的種類包括胺、酰胺、咪唑或胍基官能團的氮原子；硫醇或二硫化物的硫原子；以及鞋基、酚基、羰基或羧基官能團的氧原子。另外，可以使肽鏈或各個氨基酸發生化學變化，使之包含配位基，例如肟基、肼基、巰基、磷酸酯基、氰基、吡啶子基、哌啶子基或嗎啉代。肽構建體可以是線狀或環狀，然而，通常最好是線狀構建體。線狀小肽的一個實例是Gly-Gly-Gly-Gly,在其主鏈中具有4個氮(&配位系統)，可以與配位數為4的金屬離子配位。改進治療肽特征的另一項技術是使用非肽的肽模擬物。可以采用各種有用技術闡明肽的精細結構。這些技術包括氨基酸測序、x射線晶體學、質譜法、核磁共振波譜法、計算機輔助分子建模、肽作圖和它們的組合。肽的結構分析一般提供大量數據，其中包含肽的氨基酸序列及其原子組成的三維位置。根據這些信息，可以設計出具有治療活性所需化學官能團、但是更穩定(例如對生物性降解敏感性降低)的非肽的肽模擬物。在美國專利5,811,512中提供了該方法的實例。本發明治療肽的化學合成技術描述于以上參考文獻中，有關綜述參見Borgia和Fields,2000,TibTech18:243-251并詳細描述于其中包含的參考文獻中。肽的變異體、衍生物和片段涉及本發明的氨基酸序列時，術語"變異體"或"衍生物"包括對序列或來自該序列的一個(或多個)氨基酸的任何取代、變異、修飾、置換、缺失或添加，條件是得到的氨基酸序列最好具有靶向活性、優選具有序列表所示多肽活性的至少25-50%、更優選具有至少基本相同的活性。因此，序列可以經修飾用于本發明。通常，只要保留所述序列的活性，就可以對其進行修飾。因此，在一個實施方案中，可以進行氨基酸取代，例如從1個、2個或3個到10個、20個或30個取代，條件是經修飾序列保留活性的至少約25-50%、或基本相同的活性。然而，在一個可選實施方案中，可以有意修飾本發明多肽的氨基酸序列，以降低所述多肽的生物學活性。例如可以使用保留結合靶分子的能力但失去功能性效應物結構域的截短的多肽。一般而言，與序列表所示的相應區比較，變異體或衍生物的氨基酸殘基的改變最好是20%以下、10%以下或5%以下。氨基酸取代可以包括使用非天然存在的類似物，例如以增加治療性給予多肽的血漿半壽期(更多細節參見以下用于治療的肽衍生物生產)。可以例如按照下表進行保守取代。在第2列同一格的氨基酸可以相互取代，優選在笫3列的同一行的氬基酸可以相互取4、脂族氨基酸非極性氨基酸GAPILV極性不帶電荷氨基酸CSTMNQ極性帶電荷氨基酸DEKRH芳族氨基酸FWY本發明的多肽也包括上述多肽及其變異體的片段、包括序列片段。優選的片段包括含表位或結合結構域的片段。合適的片段長度至少約5個氨基酸，例如10個、12個、15個或20個氨基酸。它們的長度也可以少于200個、100個或50個氨基酸。蛋白和等位基因及其種屬變異體的多肽片段可以含有一個或多個(例如2個、3個、5個或10個)取代、缺失或插入，包括保守取代。當通過例如重組技術的方式，進行取代、缺失和/或插入時，優選序列表所示氨基酸殘基的改變是20%以下、10%以下或5%以下。本發明的多肽和綴合物一般通過如下所述的重組技術進行制備。然而，也可以采用技術人員熟知技術例如固相合成，通過合成而制備。用于化學合成肽的各種技術有關綜述參見Borgia和Fields,2000,TibTech18:243-251并詳細描述于其中包含的參考文獻中。多核苷酸本發明所用的多核苷酸包含編碼本發明肽和綴合物的核酸序列。具體地講，多核苷酸可編碼具有NGR基序的前體肽或綴合物，當脫酰胺時，使得肽和綴合物包含相應DGR基序。技術人員可以理解，由于遺傳密碼的簡并性，許多不同的多核苷酸都可編碼同一多肽。另外，應當知道，技術人員可使用常規技術，進行核苷酸取代，而不影響本發明多核苷酸所編碼的多肽序列，以反映表達本發明多肽的任何特定宿主生物的密碼子使用。本發明的多核苷酸可包含DNA或RNA。它們可以是單鏈或雙鏈的。它們也可以是其中含有合成或修飾核苷酸的多核苷酸。寡核苷酸的各種不同類型的修飾是本領域已知的。這些修飾包括曱基膦酸酯和硫代磷酸酯主鏈，在分子的3'和/或5'端添加吖啶或聚賴氨酸鏈。對于本發明，應當知道，本文所述的多核苷酸可以通過適于本發明領域的任何方法來修飾。進行這樣的修飾，是為了使多核苷酸的體內活性或半壽期增加。本發明的多核苷酸可以摻入到重組復制型栽體中。這樣的載體可用于在相容的宿主細胞中復制核酸。因此，在另一實施方案中，本發明提供制備本發明多核苷酸的方法即通過將本發明的多核苷酸引入復制型載體內，再將載體引入相容的宿主細胞中，并在使載體復制的條件下培養宿主細胞。可以從宿主細胞中回收載體。合適的宿主細胞包括細菌(例如大腸桿菌(五.co/z')、酵母菌、哺乳動物細胞系和其它真核細胞系(例如昆蟲Sf9細胞)。優選載體中的本發明多核苷酸與控制序列操作性連接，所述控制序列能讓宿主細胞表達編碼序列，即載體是表達載體。術語"操作性連接"是指所述組分的關系允許它們按其預定方式起作用。調節序列與編碼序列"操作性連接"是以這樣的方式連接使得在控制序列相容的條件下可進行編碼序列的表達。可以修飾調節序列，例如通過添加額外轉錄調節元件，使得由控制序列指導的轉錄水平對轉錄調節劑更具反應性。可按下文所述，將本發明的載體轉化或轉染到合適宿主細胞中，以表達本發明的蛋白質。該方法可包括在使編碼蛋白質的編碼序列的載體表達的條件下，培養用如上所述的表達載體轉化的宿主細胞，然后任選回收所表達的蛋白質。載體可以是例如具有復制起點、任選具有用于所述多核苷酸表達的啟動子和任選具有啟動子的調節子(regulator)的質粒或病毒載體。載體可含有一個或多個選擇標記基因，例如在細菌質粒的情況下，可以是氨芐青霉素抗性基因，或者對于哺乳動物載體來說可以是新霉素抗性基因。載體可用于例如轉染或轉化宿主細胞。操作性連接本發明蛋白質編碼序列的控制序列包括啟動子/增強子和其它表達調節信號。可選擇這些與宿主細胞相容的調節序列，而表達載體正是設計用于所述宿主細胞的。術語"啟動子"是本領域眾所周知的，所包含的核酸區的大小范圍和復雜性從最小啟動子直到包含上游元件和增強子的啟動子。啟動子通常從在哺乳動物細胞中起作用的啟動子中選取，雖然也可使用原核啟動子和在其它真核細胞中起作用的啟動子。啟動子通常來自病毒基因或真核基因的啟動子序列。例如，可以是來自發生表達的細胞基因組的啟動子。對于真核啟動子而言，它們可以是以普遍存在方式起作用的啟動子(例如a-肌動蛋白、b-肌動蛋白、微管蛋白的啟動子)或者是以組織特異性方式起作用的啟動子(例如丙酮酸激酶基因的啟動子)。也可使用對某些細胞具有特異性的組織特異性啟動子。它們也可以是響應特定刺激的啟動子，例如能結合甾體激素受體的啟動子。也可使用病毒啟動子，例如莫洛尼鼠白血病病毒長末端重復序列(MMLVLTR)啟動子、勞斯肉瘤病毒(RSV)LTR啟動子或人巨細胞病毒(CMV)正啟動子。啟動子為誘導型啟動子，這也具有優勢，使得異源基因表達水平在細胞生命周期中可受到調節。誘導型是指使用啟動子所得表達水平可以被調節。另外，任何這樣的啟動子都可通過添加額外的調節序列而進行修飾，所述調節序列例如增強子序列。也可使用包含來自兩種或更多種不同的上述啟動子的序列元件的嵌合啟動子。可將本發明的載體和多核苷酸導入宿主細胞，以便復制本發明的載體/多核苷酸和/或表達由本發明多核苷酸編碼的本發明蛋白質。盡管本發明的蛋白質可以用原核細胞作為宿主細胞來產生，但是優選使用真核細胞，例如酵母細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞，尤其是哺乳動物細胞。可采用轉染、轉化和電穿孔等本領域已知的各種技術，將本發明的載體/多核苷酸導入合適宿主細胞中。當本發明的載體/多核苷酸給予動物時，若干技術是本領域已知的，例如用重組病毒載體(例如逆轉錄病毒、單純皰疹病毒和腺病毒)進行感染，直接注射核酸和生物射彈轉化。包含本發明多核苷酸的宿主細胞可用于表達本發明的綴合物。可在合適條件下培養宿主細胞，所述條件允許本發明多肽和綴合物的表達。本發明產物的表達可以是組成型的(使得它們能持續產生)或是誘導型的(需要刺激，以誘導表達)。在誘導型表達的情況下，當需要時，可通過例如將地塞米松或IPTG等誘導物添加到培養基中，誘導產生蛋白質。綴合物本發明涉及綴合物，所述綴合物是包含本發明的肽或把向部分以及與其連接的至少一種其它物質的分子，所述其它物質包括但不限于藥物、細胞因子、毒素、凋亡肽、放射性核素、病毒顆粒、基因或造影化合物，所述綴合物是通過遺傳融合或化學偶聯而形成的。本發明綴合物所用的細胞因子的非限制性列表是TNFot、TNFP、IFNa、IFNP、IFNy、IL-1、IL曙2、IL-4、IL-6、IL-7、IL畫12、IL-15、EMAPII、血管內皮生長因子(VEGF)、PDGF、PD-ECGF或趨化因子。綴合物包括融合蛋白、直接合成的蛋白質和偶聯蛋白質；在融合蛋白中，肽或靶向部分是通過其多肽骨架、經過編碼這些蛋白質的DNA分子的遺傳表達而與物質連接；而在偶聯蛋白質中，將預先形成的序列通過交聯劑連接。該術語在本文中也用于包括締合，例如聚集。肽或耙向部分可以與物質直接偶聯或者通過間隔區間接偶聯，所述間隔區可以是單個氨基酸(例如G(甘氨酸))、氨基酸序列或有機殘基，例如6-氨基癸酰基-N-羥基琥珀酰亞胺。在一個實施方案中，肽或靶向部分與細胞因子N-端或C-端連接，因而盡可能小地干擾所修飾的細胞因子與其受體的結合。或者，肽或把向部分可與氨基酸殘基連接，其為酰氨基-或羧基-鍵的受體，它可天然存在于分子中或者用遺傳工程技術人工插入。在一個實施方案中，肽配體優選與細胞因子N-端或C-端連接，因而盡可能小地干擾所修飾的細胞因子與其受體的結合。或者，肽可與氨基酸殘基連接，其為酰氨基-或m-鍵的受體，它可天然存在于分子中或者用遺傳工程技術人工插入。所修飾的細胞因子優選通過使用包含編碼肽的5'-毗連序列的cDNA來制備。按照優選的實施方案，提供TNF與以下肽的綴合產物CDGRC、CisoDGRC、C^isoDGRC或CjjDGRC肽。優選TNF的氨基端與肽連接，優選通過間隔區連接。優選間隔區為G(甘氨酸)。按照另一優選的實施方案，提供IFNy與以下肽的綴合產物CDGRC、CisoDGRC、C"soDGRC或CDDGRC肽。優選TNF的氨基端與肽連接，優選通過間隔區連接。優選間隔區為G(甘氨酸)。按照另一優選的實施方案，提供IL-12與以下肽的綴合產物CDGRC、CisoDGRC、CLisoDGRC或CDDGRC肽。優選TNF的氨基端與肽連接，優選通過間隔區連接。優選間隔區為G(甘氨酸)。通過使用能選擇性結合p75TNFR和p55TNTFR兩種TNF受體之一的TNF突變形式，可以進一步提高TNF/DGR綴合物的治療指數。所述TNF突變體可通過定點誘變而獲得(Loetscher等，1993,VanOstade等，1993)。可通過制備聚乙二醇衍生物，以延長細胞因子本身的血漿半衰期，從而改進本發明修飾細胞因子的藥代動力學。雙功能衍生物雙功能衍生物提供本發明的又一個實施方案，其中本發明的肽或綴合物與針對腫瘤抗原或其它腫瘤血管生成性標記例如整聯蛋白、金屬蛋白酶或血管生長因子的抗體或其片段綴合，或者與針對胞外基質組分，例如抗生腱蛋白抗體或抗纖連蛋白EDB結構域的抗體或其片段綴合。最近，已報道TNF與針對胃癌和卵巢腺癌表達的腫瘤相關TAG72抗原的mAb鉸鏈區之間的融合產物的制備方法(Yang等，1995)。用生物素/抗生物素蛋白系統的肺瘤預先靶向提供本發明的再一個實施方案。按照該方法，在所述腫瘤抗原位點上在不同階段得到三元復合物，所述復合物是由以下組分形成l)生物素化mAb,2)抗生物素蛋白(或鏈霉抗生物素)和3)本發明的肽或綴合物和生物素。大量文獻證明預先靶向方法，與用免疫綴合物的常規靶向相比，實際上可以增加耙上歸巢活性分子與游離活性分子的比率，因而降低了治療毒性(Colombo等，1993;Modorati等，1994;Paganelli等，1995，1991)。該方法用生物素化TNT獲得良好結果，所述生物素化TNT能在體外誘導細胞毒性，而且在其中正常TNF失活條件下降低肺瘤細胞生長(Moro等，1997;Gasparri等，1999)。也可以通過使用雙特異性抗體、用兩相法進行預先靶向方法，所述雙特異性抗體同時結合肺瘤抗原和經修飾的細胞因子。最近，已經描述了使用針對癌胚抗原和TNF的雙特異性抗體作為TNF腫瘤預先耙向工具(Robert等，1996)。按照另一實施方案，本發明包括同時與本發明肽(例如含DGR肽)和抗體或其片段(通過生物素-抗生物素蛋白橋直接或間接)綴合的TNF分子，所述綴合在不同TNF亞基上，其中抗體或其片段針對腫瘤細胞表達的抗原或胂瘤基質的其它組分，例如生腱蛋白和纖連蛋白EDB結構域。這導致對修飾細胞因子胂瘤歸巢特性的進一步改進，并導致后者在腫瘤微環境內通過三聚體-單體-三聚體轉換而緩慢釋放。如先前工作所表明，實際上，TNF綴合物的修飾亞基可從靶向復合物上解離并重新締合，以形成未修飾的三聚體TNF分子，這樣的分子隨后擴散到腫瘤微環境中。已經知道，生物活性TKF的釋放在革巴向后24-48小時內發生(Corti等，l"8)。胞外基質本文所用的術語"胞外基質組分，，(ECM)是指占據組織胞外間隙的分子。在一個實施方案中，所述ECM組分選自纖連蛋白、玻連蛋白、膠原蛋白或層粘連蛋白。優選的ECM組分是纖連蛋白的FN-I5、FN-17、FN-II,或FN-IIl9組件或其片段。優選的片段包含NGR基序，或者脫酰胺后的DGR基序。優選的本發明ECM組分是那些在天冬酰胺殘基脫酰胺后表現出修飾特性的組分例如增加內皮細胞粘附和/或增加整聯蛋白(例如o^3)結合。特別優選的ECM組分是這樣的包含NGR基序的組分它所包含NGR基序在經歷脫酰胺后變為DGR，優選LisoDGR或dDGR。細胞因子藥物進入腫瘤細胞內，是實體瘤化療有效性的關鍵所在。為了到達實體瘤內的癌細胞，化療藥必須進入胂瘤血管，穿過血管壁，最終遷移通過間質。異質性腫瘤灌注、血管通透性和細胞密度、以及間質壓力增加都是限制藥物從腫瘤血管向肺瘤細胞內滲透的關鍵性屏障，因而也是化療療效的關鍵所在。因此，能有效影響這些因素的細胞因子可用于本發明。本發明可用的細胞因子的非限制性列表為TNFa、TNF|3、IFNa、IFN(3、IFNy、IL誦1、IL-2、IL-4、IL國6、IL-7、IL-12、IL-15、IP-IO、EMAPII、血管內皮生長因子(VEGF)、PDGF、PD國ECGF或趨化因子。1NETNF作為炎性細胞因子起作用，具有誘導內皮屏障功能改變、降低腫瘤間質壓力以及增加化療藥滲透性和腫瘤血管石皮壞的效應。當觀察到癌癥患者在細菌感染后偶然表現出腫瘤自發消退時，首次提出了腫瘤壞死分子的存在。在I960年以后進行的研究表明，為響應細菌產物而產生的宿主相關(或內源性)介質，可能造成所觀察的效果。在1975年已經知道，細菌誘導的循環因子具有針對小鼠皮膚內腫瘤植入物的強烈抗腫瘤活性。遂將該因子命名為腫瘤壞死因子(TNF),隨后對其進行分離、克隆，發現它是一組參與免疫調節和炎癥的分子的原型。TNF和TNF超家族其它成員的受體也構成一組相關蛋白質的超家族。TNF相關配體通常共享許多共同特征。這些特征不包括總氨基酸(aa)序列的高度同源性。除了神經生長因子(NGF)和TNF-(3之外，所有配體都合成為II型跨膜蛋白(胞外C-端)，其含有短胞質區段(IO-80個氨基酸殘基)和相對長的胞外區(140-215個氨基酸殘基)。與TNF結構無關的NGF也包括在該超家族中，只因它能結合TNFRSF低親和性NGF受體(LNGFR)。NGF具有典型的信號序列肽并可分泌。相比之下，TNF-p雖然也可完全分泌，但是其一級結構與II型跨膜蛋白相關得多。可認為TNF-P是帶有無功能(即無效)跨膜區段的II型蛋白。一4殳而言，TNFSF成員形成三聚體結構，其單體由排列成兩個片層結構的P鏈組成。因為這些分子的三聚體結構，所以有人建議TNSF和TNFRSF超家族的配體和受體在信號轉導期間經歷了"聚簇(clustering)"。TNF-a:人TNF-a是233個氨基酸殘基的非糖基化多肽，以跨膜蛋白或可溶性蛋白形式存在。當表達為26kDa膜結合蛋白時，TNF-a由29個氨基酸殘基的胞質結構域、28個氨基酸殘基的跨膜區段和176個氨基酸殘基的胞外區組成。可溶性蛋白是通過85kDaTNF-oc轉化酶(TACE)蛋白水解切割事件而產生，得到17kDa的157個氨基酸殘基分子，其通常以同型三聚體形式循環。TOF-(3/LT-a:TNF-卩，亦稱淋巴毒素-a(LT-a),是與TNF-a同時克隆的分子。雖然TNF-P以171個氨基酸殘基、25kDa糖基化多肽形式循環，但已經發現更大形式，長度為194個氨基酸殘基。人TNF-(3cDNA編碼205個氨基酸殘基(在小鼠中為202個)的可讀框，推測某些類型的蛋白水解過程在分泌期間發生。與TNF-a相似，循環TNF-[3以非共價連接的三聚體形式存在，已知它結合的受體與TNF-a所結合的受體相同。在一個實施方案中，TNF是能選擇性結合TNF受體之一的TNF突變形式(LoetscherH等(1993)JBiolChem268:26350-7;VanOstadeX等(1993)Nature361:266-9)。給人推注TNF的最大耐受劑量為218-410|Lig/m2(Fraker等,1995),比給動物的有效量約低10倍。根據得自鼠模型的數據，據信在人體中達到抗腫瘤效果劑量必須至少高10倍(SchraffordtKo叩s等,1998)。在高溫隔離月支體灌注(hyperthermicisolated-limbperfiision)的首次臨床研究中，用獨特劑量的4mgTNF以及美法侖和干擾素Y得到高反應率(Lienard等，1992)。其它工作表明可以去掉干擾素丫，而且甚至更低劑量的TNF都足以誘發治療反應(Hill等，1993;Eggermont等，1996)。因為這兩種細胞因子對內皮細胞發揮協同效應，它們的聯合、選擇性靶向內皮細胞，可能導致更強烈的抗胂瘤活性，因此允許克服癌癥治療中聯用相同細胞因子常見的系統性毒性問題。此外，已經知道TOP可降低內皮內襯血管的屏障功能，因而增加它們對大分子的通透性。因為用本發明修飾TNF分子進行治療具有毒性較低的優勢，及其腫瘤血管歸巢特性方面的優勢，所以一個替代應用是將其用于增加腫瘤血管對其它化合物的通透性，可用于治療或診斷目的。例如修飾TNF可用于在腫瘤的放免閃爍掃描或放免療法中增加放射性標記的抗體或激素(腫瘤造影化合物)的腫瘤攝取。或者，也可增加化療藥、免疫毒素、脂質體攜帶的藥物或基因或其它抗癌藥的攝取，所以可增強其抗腫瘤效果。許多其它炎性細胞因子也具有增加內皮血管通透性的特性，可以理解，本發明可使用這樣的細胞因子，以及增加這類細胞因子表達的物質。炎性細胞因子，亦稱促炎細胞因子，是多種多肽和糖蛋白，分子量介于5kDa和70kDa之間。它們對炎癥反應具有刺激效應。最重要的炎性細胞因子是TNF、IL-1、IL-6和IL-8。分類為炎性細胞因子的某些細胞因子的列表如下炎性細胞因子<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>cxc趨化因子IL-8,PF-4,PBP,NAP-2,(3-TGcc趨化因子MIP-la,MHMp,MCP隱l,MCP-2,MCP-3,RANTESc趨化因子淋巴細胞趨化因子刺激炎性細胞因子IL-12TGF-(3:轉化生長因子，LIF:白血病抑制因子；OSM:制瘤蛋白(oncostatin)M;CNTF:睫狀神經營養因子；PF-4:血小板因子4;PBP:血小板堿性蛋白；NAP-2:嗜中性粒細胞活化蛋白2;|3-TG:P-血小板球蛋白；MIP:巨噬細胞炎性蛋白；MCP:單核細胞趨化蛋白。IL-ll、IFN-a、IFN-p、尤其是趨化因子超家族成員也對炎癥反應進行正調節。在某些情況下，TGF-p具有多種炎性活性，包括對嗜中性粒細胞、T淋巴細胞和失活單核細胞的趨化效應。IFN畫y大量證據表明，干擾素-y(IFNy)是一種多能細胞因子，主要由T-淋巴細胞和自然殺傷細胞產生(Farrar,等，1993;Boehm等，1997),并能促進抗肺瘤反應(Cumis等，2005)。例如，IFNy可誘導針對許多腫瘤細胞類型的抗增殖和促凋亡效應，可抑制腫瘤血管生成和活化自然殺傷細胞和巨噬細胞，以殺傷多種腫瘤細胞靶標。IFNy也是CD4+T輔助細胞的重要調節劑，是主要的生理的巨噬細胞-活化因子，可以增加癌細胞和內皮細胞上MHC-I和II的表達。在腫瘤基質中，IFNy可誘導細胞因子和趨化因子分泌，包括IP-IO(IFN-誘導型蛋白10),這是一種用于淋巴細胞和單核細胞的制管張素蛋白(angiostaticprotein)和化學引誘因子。所得證據表明，腫瘤浸潤的巨噬細胞所產生的IFNy在腫瘤血管破壞中起作用。用IFNY和腫瘤壞死因子-a(TNF)聯合處理內皮細胞，導致協同細胞毒效應，很可能對腫瘤血管破壞是至關重要的。IFNy也可增加活化巨噬細胞所產生的TNF量，并增加不同細胞類型中TNF-受體的表達。由于對腫瘤血管和免疫系統細胞的這些效應，所以IFNy可活化針對已建立的腫瘤的炎性/免疫應答并抑制腫瘤生長。IFNy以兩個非共價結合的多肽亞基的同型二聚體的形式存在。以下文獻已報道野生型人IFNy(huIFNG)的一級序列Gray等，1982;Taya等,1982;Devos等，1982;和Rinderknecht等，1984,以及EP77670、EP89676和EP110044。huIFNG的3D結構見Ealick等(1991)的報道。白介素12(IL-12),亦稱天然殺傷細胞刺激因子("NKSF")或細胞毒性淋巴細胞成熟因子("CLMF"),是一種有效的免疫調節分子，在許多疾病中起作用。人IL-12已經表征為具有獨特結構和多能效應的細胞因子(Kobayashi等，1989;Seder等，1993;Ling等，1995;Podlaski等，1992)。IL-12在一些涉及免疫和炎癥反應的疾病的病理學上起到至關重要的作用。有關IL-12、其生物學活性及其在疾病中的作用方面的綜述可參見Gately等，1998。IL-12在體內的一個重要作用是誘導天然殺傷(NK)細胞和T細胞產生IFNy的能力。從結構上看，IL-12是包含35kDa亞基(p35)和40kDa亞基(p40)彼此通過二硫鍵連接的異型二聚體蛋白(稱為"p70亞基")。該異型二聚體蛋白主要由單核細胞、巨噬細胞和樹突細胞等抗原呈遞細胞產生。相對于p70亞基而言，這類細胞也分泌過量的p40亞基。il-2因為IL-2/IL-2R系統在介導免疫和炎癥反應中起到關鍵作用，顯而易見，對該系統的監測和操作具有重要的診斷和治療意義。已經知道，IL-2有希望成為抗癌藥，因為它能刺激腫瘤攻擊LAK和TIL(胂瘤浸潤淋巴細胞)細胞的增殖和活性。然而，IL-2毒性問題仍需要關注并值得進行進一步研究。本發明解決了該問題。IL畫15白介素15(IL-15)是一種新的細胞因子，它與IL-2具有許多共同的生物學特性，但卻缺乏與IL-2的氨基酸序列同一性。IL-15最初在猴腎上皮細胞系(CVI/EBNA)條件培養基中，根據其對鼠T細胞系CTLL-2的促分裂活性而被鑒定出來。IL-15也作為成人T細胞白血病細胞系(HuT-102)所產生的并刺激T細胞增殖的細胞因子而被獨立發現，遂將其命名為IL-T。因為IL-2有作為T細胞、NK細胞、LAK細胞和TIL刺激物的活性，并且目前正在對其進行臨床試驗以測試其在治療癌癥和病毒感染上的潛在用途。因為IL-15有同樣的生物學活性，因此應當具有同樣的治療潛力。趨化因子趨化因子多半是一類小的分泌型蛋白超家族，在白細胞運輸、募集和再循環中起作用。它們也在許多病理生理過程中起到關鍵作用，所述病理生理過程例如變態反應、感染性疾病和自身免疫性疾病、血管生成、炎癥、腫瘤生長和造血細胞發育。這些蛋白質中約有80%的成熟形式含有66-78個氨基酸。其余部分較大，在蛋白核心上游帶有額外氨基酸或作為延伸C-端區段的一部分。所有趨化因子都通過7個5爭膜結構域G-蛋白偶聯受體進行信號轉導。至少有17種已知的趨化因子受體，這些受體中的許多都表現出混雜的結合特性，因此若干不同趨化因子可通過同一受體進行信號轉導。根據保守氨基酸序列基序，將趨化因子分為亞家族。大多數家族成員具有至少4個保守半胱氨酸殘基，形成兩個分子內二硫鍵。根據前兩個半胱氨酸殘基的位置定義該亞家族a亞家族，亦稱CXC趨化因子，具有一個將前兩個半胱氨酸殘基隔開的氨基酸。根據緊接著第一個半胱氨酸殘基前是否存在glu-leu-arg(ELR)氨基酸基序，可將該組進一步細分。目前有5種CXC特異性受體，分別稱為CXCR1至CXCR5。ELR+趨化因子與CXCR2結合并且通常起到嗜中性粒細胞化學引誘物和激活物的作用。ELR-趨化因子與CXCR3至CXCR5結合，主要作用于淋巴細胞。在撰寫本文時，科學文獻中已經報道了編碼CXC趨化因子的14種不同的人類基因，帶有一些因可變剪接而導致的額外多樣性。在(3亞家族(亦稱CC趨化因子)中，前兩個半胱氨酸彼此鄰接，中間沒有間隔氨基酸。目前有24個不同的人p亞家族成員。將該組的受體稱為CCR1至CCRll。不同CC家族成員的靶細胞包括大多數白細胞類型。有兩種已知蛋白質具有趨化因子同源性，它們都不屬于ot和P亞家族。淋巴細胞趨化因子是Y類的唯一成員(C趨化因子)，它失去了第一和第三個半胱氨酸。淋巴細胞趨化因子受體稱為XCR1。CX3C趨化因子(Fractalkine)是S類中唯一的已知成員(CX3C趨化因子)，它在前兩個半胱氨酸殘基之間具有3個間插氨基酸。該分子在趨化因子中是獨特的，因為它是跨膜蛋白，其N-端趨化因子結構域與長粘蛋白樣柄(longmucin-likestalk)融合。CX3C趨化因子受體稱為CX3CR1。VEGF本發明也可用于血管內皮生長因子(VEGF)。血管生成是新血管從現有血管系統發育的過程。它在胚胎發育、正常組織生長、傷口愈合、雌性生殖周期(即排卵、月經和胎盤發育)中起關鍵性作用，并在許多疾病中起重要作用。具體興趣集中在癌癥上，因為如果沒有新血管供應，胂瘤生長的大小不可能超過幾毫米。血管生成對腫瘤細胞轉移的擴散和生長來說也是必不可少的。一個最重要的內皮生長和存活因子就是VEGF。VEGF誘導血管生成(angiogenesis)和內皮細胞增殖,并在調節血管發生(vasculogenesis)上起重要作用。VEGF是肝素結合糖蛋白，分泌時為45kDa的同型二聚體。大多數細胞類型(但通常并不是內皮細胞本身)都分泌VEGF。因為最早發現的VEGF即VEGF-A是能增加血管通透性，所以稱之為血管通透性因子。另外，VEGF還能引起血管擴張，這部分是通過內皮細胞中的一氧化氮合酶的刺激所致。VEGF也可刺激細胞遷移并抑制細胞凋亡。VEGF-A有若干剪接變異體。主要包括121、165、189和206個氨基酸，各自還含有一個另外的特異性外顯子。踢APIT內皮-單核細胞活化多肽-n(EMAP-n)是一種細胞因子，是腫瘤血管發育中的抗血管生成因子，強烈抑制腫瘤生長。重組人EMAP-II是一個含有166個氨基酸殘基的18.3kDa蛋白。也發現EMAPII能增加內皮血管通透性。已有人提出，血小板衍生生長因子(PDGF)拮抗劑在普通實體瘤中可增加多種抗腫瘤藥的藥物攝取和療效。PDGF是一種30kDA的細胞因子，受傷時由血小板釋放，刺激鄰近細胞生長并修復傷口。正如其名稱所表明的，血小板衍生內皮細胞生長因子(PD-ECGF)最初是根據其在內皮細胞中誘導有絲分裂的能力，而從血小板中分離出來的。其相關蛋白是月交質抑制素。抗體本文所用的"抗體"是指由一個或多個基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段編碼的多肽所組成的蛋白質。抗體可以完整的免疫球蛋白形式存在或以大量片段形式存在，包括由不同肽酶水解產生的已充分表征的片段。盡管不同抗體片段是根據完整抗體的消化而定義，但是技術人員將會理解，抗體片段可以用化學方法或利用重組DNA方法從頭合成。因此，本文所用的術語抗體也體。術語"抗體"的使用中包括的抗體片段包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、Fv、dsFv雙鏈抗體(diabody)和Fd片段。本發明也提供針對表面蛋白的單克隆抗體或多克隆抗體。因此，本發明還提供用于制備針對本發明多肽的單克隆抗體或多克隆抗體的方法。如果需要多克隆抗體，用帶有表位的免疫原性多肽免疫所選哺乳動物(例如小鼠、兔、山羊、馬等)。按照已知方法采集和處理免疫動物血清。如果含針對一種表位的多克隆抗體的血清中含有針對其它抗原的抗體，則可以通過免疫親和層析純化所述多克隆抗體。多克隆抗血清的制備和加工技術是本領域已知的。為了能生產所述抗體，本發明也提供針半抗原化到另一多肽的、用作動物或人的免疫原的本發明多肽或其片段。本領域技術人員也可容易地制備針對多肽中結合細胞表面表位的單克隆抗體。通過雜交瘤制備單克隆抗體的通用方法是眾所周知的。可通過細胞融合以及其它技術制備能產生抗體的無限增殖細胞系，所述其它技術例如用致癌DNA直接轉化B淋巴細胞，或者用Epstein-Barr病毒轉染。可以篩選針對表位而產生的多種單克隆抗體的不同特性；即篩選同種型和表位親和性。一項替代技術涉及篩選噬菌體展示文庫，其中例如噬菌體在其衣殼表面表達scFv片段以及各種互補性決定區(CDR)。該項技術是本領域眾所周知的。對于本發明，術語"抗體"包括保留其結合靶抗原結合活性的完整抗體的片段，除非另有說明。如上所述，這樣的片段包括Fv、F(ab')和F(ab')2片段、以及單鏈抗體(scFv)。此外，抗體及其片段可以是人源化抗體，例如參見EP-A-B9400。試劑(物質，Agent)本文所用的術語"試劑"包括但不限于化合物，例如試驗化合物，所述試驗化合物可以得自或產自任何合適來源，無論是否是天然的。所述試劑可以進行設計或得自化合物文庫，所述化合物文庫可包含肽及其它化合物例如有機小分子、尤其是新型前導化合物。作為實例，所述試劑可以是天然物質、生物大分子或生物材料(例如細菌、真菌或動物(尤其是哺乳動物)細胞或組織)的提取物、有機分子或無機分子、合成試驗化合物、半合成試驗化合物、結構或功能模擬物、肽、肽模擬物、衍生化試驗化合物、由完整蛋白切割而來的肽或合成的肽(例如作為實例，可采用肽合成儀)或通過重組技術合成的肽或它們的組合、重組試驗化合物、天然或非天然試驗化合物、融合蛋白或其等同物和突變體、衍生物或它們的組合。所述試劑可以是氨基酸序列或其化學衍生物。所述物質甚至可以是有機化合物或其它化學物。所述試劑甚至可以是核苷酸序列，所述核苷酸序列可以是有義序列或反義序列。藥物制劑本發明也提供用于治療個體的藥物組合物，其中所述組合物包含治療有效量的本發明的肽、多核苷酸、綴合物和藥物組合。含具有其它形式的DGR的肽或綴合物。至于基本上不含，是指相對于組合物中含總DGR的肽或綴合物(即呈所有異構體形式)而言，組合物中含isoDGR的肽或綴合物(即其中所述DGR基序都呈isoDGR形式的肽或綴合物)的重量百分比(w/wy。)大于50%、更優選大于55%、更優選大于60%、更優選大于65%、更優選大于70%、更優選大于75%、更優選大于80%、更優選大于85%、更優選大于90%、更優選大于95%、更優選大于97%、更優選大于99%。包含具有IsoDGR基序的肽或綴合物的本發明組合物基本上不包含具有其它形式的DGR的肽或綴合物。至于基本上不含，是指相對于組合物中含總DGR的肽或綴合物(即呈所有異構體形式)而言，組合物中含^soDGR的肽或綴合物(即其中所述DGR基序都呈dsoDGR形式的肽或綴合物)的重量百分比(w/wy。)大于50%、更優選大于55%、更優選大于60%、更優選大于65%、更優選大于70%、更優選大于75%、更優選大于80%、更優選大于85%、更優選大于90%、更優選大于95%、更優選大于97%、更優選大于99%。包含具有DDGR基序的肽或綴合物的本發明組合物基本上不包含具有其它形式的DGR的肽或綴合物。至于基本上不含，是指相對于組合物中含總DGR的肽或綴合物(即呈所有異構體形式)而言，組合物中含DDGR的肽或綴合物(即其中所述DGR基序都呈dDGR形式的肽或綴合物)的重量百分比(w/w"/。)大于50%、更優選大于55%、更優選大于60%、更優選大于65%、更優選大于70%、更優選大于75%、更優選大于80%、更優選大于85%、更優選大于90%、更優選大于95%、更優選大于97%、更優選大于99%。藥物組合物可供人用或動物用。通常，醫師將會為單個患者確定最合適的實際劑量，這可因具體個體的年齡、體重和反應而異。組合物可任選包含藥學上可接受的載體、稀釋劑、賦形劑或佐劑。藥物載體、賦形劑或稀釋劑的選擇可按預期給藥途徑和標準藥學實踐而進行。藥物組合物可包含或向載體、賦形劑或稀釋劑中添加任何合適粘合劑、潤滑劑、懸浮劑、包衣劑、增溶劑以及有助于或增加病毒進入耙位點的其它載體(例如脂質遞送系統)。合適載體和稀釋劑包括等滲鹽水，例如磷酸緩沖鹽溶液。有關賦形劑詳見TheHandbookofPharmaceuticalExcipients,笫2版,Wade&Weller主編,AmericanPharmaceuticalAssociation。適當時，藥物組合物可^t姿以下的一種或多種方式給予吸入、以栓劑或陰道栓劑形式、以洗劑、溶液劑、乳膏劑、軟膏劑或樸粉形式局部給予、通過皮膚貼劑使用、以含有淀粉或乳糖等賦形劑的片劑形式口服、或以膠嚢劑或ovules形式單用或與賦形劑混合、或以含有矯味劑或著色劑的酏劑、溶液劑或混懸劑形式；或者它們可經胃腸外注射，例如海綿體內(intracavernosally)、靜脈內、肌內或皮下。對于胃腸外給藥，組合物最好使用無菌水溶液劑形式，其中可含其它物質，例如足夠的鹽或單糖，以使溶液劑與血液等滲。對于口腔含化或舌下給藥，組合物可以片劑或錠劑形式給予，它們可以按常規方式配制。優選口服或胃腸外給藥用制劑。胃腸外給藥用制劑包括注射用溶液劑或混懸劑和輸注用液體制劑。為了制備胃腸外形式，可將有效量的活性成分溶于或懸浮于無菌載體中，任選添加賦形劑，例如增溶劑、等滲劑、防腐劑、穩定劑、乳化劑或分散劑，并且可以隨后將其分裝到密封的小瓶或安瓿中。可以這樣配制組合物使得每日、每周或每月給予都將提供所需的日劑量。可以理解，可常規配制組合物，用于更少次數的給予，例如每2、4、6、8、10或12小時一次。可以棵核酸構建體的形式直接給予編碼多肽組分的多核苷酸/栽體，優選還包括與宿主細胞基因組同源的側翼序列。有若干已知的轉染技術，可增加哺乳動物細胞對棵核酸構建體的攝取，所述技術例如包括使用轉染劑的技術。這些試劑的實例包括陽離子試劑(例如磷酸釣和DEAE-葡聚糖)和脂轉染劑(lipofectant,例如lipofectamTM和transfectamTM)。通常，核酸構建體與轉染劑混合而制成組合物。將本發明優選的多核苷酸或載體與藥學上可接受的載體或稀釋劑混合而制成藥物組合物。合適的載體和稀釋劑包括等滲鹽水溶液，例如磷酸緩沖鹽溶液。組合物可配制成供胃腸外、肌內、靜脈內、皮下、眼內或經皮給藥用。所述給藥途徑和劑量方案僅供指導用，因為熟練醫師可以容易地針對任何特定患者和病癥來確定最佳給藥途徑和劑量方案。將肽、尤其是細胞因子制備成脂質體形式，可改進其生物學活性。事實上，已經觀察到TNF氨基的酰化作用在體外誘導其疏水性增加，但不損失生物學活性。此外已經報道，與脂質結合的TKF具有不受影響的體外細胞毒性、免疫調節效應和體內毒性降低(Deb等，1989,1990)。包含具有本發明DGR基序的肽和綴合物的本發明優選的組合物基本上不含那些含有相應NGR基序的相應肽和綴合物。優選含DGR肽占總肽(即含有DGR和NGR的肽)的比例超過60%、更優選70%、更優選80%、更優選85%、更優選90%、更優選95%、更優選97%、更優選99%(以重量百分比計)。治療本發明的肽、綴合物和組合物可用于治療性治療。可以理解，本文中提及的所有治療全都包括治愈性治療、姑息治療和預防性治療。在本發明眾多實施方案中進行治療的患者最好是人類患者，盡管應當知道，本發明的原理表明，本發明對所有包括在術語"患者"中的哺乳動物都有效。在這種情況下，認為哺乳動物包括任何哺乳動物物種，其中最好是血管生成相關疾病的治療，尤其是農業用哺乳動物和馴養哺乳動物物種。在一個實施方案中，肽、綴合物或藥物組合物可用于治療或預防癌癥，包括但不限于肺癌、胰腺癌、乳癌、結腸癌、喉癌或卵巢癌。優選的癌癥包括實體瘤。在另一個實施方案中，肽和/或綴合物可用于治療或預防涉及血管生成的疾病，例如a^3表達相關疾病。血管生成是涉及新發育的血管向組織中生長的組織血管形成過程，亦稱新血管形成。該過程是由內皮細胞和平滑肌細胞浸潤而介導的過程。據信，該過程按以下三種方式中的任一種來進行血管可從預先存在的血管上出芽，血管從頭發育可來自前體細胞(血管發生)，或者存在的小血管直徑變大(Blood等，1990)。有許多疾病稱為血管生成性疾病，其中認為血管生成是重要的，所述疾病包括但不限于炎性疾病(例如免疫炎癥和非免疫炎癥、關節炎)、不適當或不及時的血管入侵相關疾病(例如糖尿病性視網膜病、黃斑變性、新血管性青光眼、再狹窄、動脈粥樣石更化斑中的毛細管增殖和骨質疏爭>)、以及癌癥相關疾病(例如實體瘤、轉移實體瘤、血管纖維瘤、晶狀體后纖維組織形成、血管瘤、卡波西肉瘤)等，這些病都需要新血管形成以支持腫瘤生長。因此，抑制患病組織中血管生成的方法可改善疾病癥狀，并且根據疾病，所述方法可用于治愈疾病。在另一相關實施方案中，有待治療的組織是糖尿病性視網膜病、黃斑變性或新血管性青光眼患者的視網膜組織，并且有待抑制的血管生成是視網膜組織的血管生成，其中有視網膜組織的新血管形成。在附加的相關實施方案中，有待治療的組織是實體瘤、轉移瘤、皮膚癌、乳癌、血管瘤或血管纖維瘤等癌癥患者的腫瘤組織，而且有待抑制的血管生成是腫瘤組織的血管生成，其中有腫瘤組織的新血管形成。通常，本發明方法可治療的實體瘤組織包括肺癌、胰腺癌、乳癌、結腸癌、喉癌或卵巢癌等的組織。示例性的腫瘤組織血管生成及其抑制可參見實施例。抑制腫瘤組織血管生成，是特別優選的實施方案，因為在腫瘤生長中新血管形成起到重要作用。如果腫瘤組織新血管形成不存在的話，腫瘤組織得不到所需營養，生長緩慢，停止繼續生長、消退并最終壞死，導致肺瘤^皮殺死。所述方法針對轉移瘤的形成也特別有效，因為(l)它們的形成需要原發性腫瘤血管形成，使得轉移癌細胞能離開原發性腫瘤，和(2)它們在繼發位點上的建立需要新血管形成，以支持轉移瘤的生長。在一個相關實施方案中，本發明考慮到將所述方法的實踐與例如針對實體瘤并用于控制轉移瘤的建立的常規化學療法等其它療法聯用。通常在化療期間或之后給予血管生成抑制劑，雖然優選在化學治療方案后抑制血管生成，此時腫瘤組織通過誘導血管生成再生而響應毒性攻擊，以便向腫瘤組織供血和營養物。另外，優選在手術后，當已經切除實體瘤以預防轉移的時候，給予血管生成抑制療法。在本發明方法用于抑制腫瘤新血管形成時，所述方法也可用于抑制腫瘤組織生長、抑制肺瘤轉移的形成并使已建立的肺瘤消退。(percutaneoustransluminalcoronaryangioplasty)部位遷移和增殖過程，這樣的再狹窄妨礙了血管成形術的成功。可以認為再狹窄期間SMC的遷移和增殖是本發明方法所抑制的血管生成過程。因此，本發明也考慮到用本發明方法抑制在血管成形術后通過抑制血管生成而抑制患者的再狹窄。本發明的肽、綴合物和藥物組合物可用于聯合、獨立或序貫制劑，或者也可與其它診斷或治療劑聯用。TNF/IFN聯合藥物本發明的另一方面涉及修飾的TNF和IFNy聯合藥物的用途。這樣的聯合藥物可用于聯合、獨立或序貫制劑。最好該聯合藥物也與其它診斷或治療藥聯合用于癌癥的治療或診斷，所述其它診斷或治療藥例如多柔比星和美法侖。因此，本發明提供這樣的藥物組合物其包含修飾的TNF和IFN/聯合藥物，以及任選其它腫瘤診斷或抗腫瘤治療藥。而且，這樣的聯合藥物可用于聯合、獨立或序貫制劑。在我們的國際專利公布號WO03/093478中，我們發現定向給予皮克級劑量的細胞因子能增加化療藥的滲透性，為增加化療藥治療指數提供新的令人驚奇的策略。國際專利公布號WO03/093478通過引用全部結合到本文中。更具體地講，我們已經發現，將極低劑量的細胞因子給予腫瘤和含腫瘤血管系統的腫瘤相關環境，是避免負反饋機制并保留其改變藥物通透屏障能力的一種新方法。在本發明該方面的一個實施方案中，可以給予的本發明綴合物的劑量范圍為0.5-500ng/kg、優選的范圍為1-50ng/kg、更優選的范圍5-15ng/kg。在本發明的該方面的一個替代實施方案中，提供藥物組合物，所述組合物包含本發明的綴合物以及IFNy,其中所述綴合物的含量使得綴合物或其代謝物在待治療患者血漿內的含量不大于約35,000ng/天、優選約3，500ng/天、更優選約1，000ng/天。上述劑量是用于70kg患者的劑量。本領域技術人員將會很容易地調整體重不是70kg的患者的所用劑量。所述給藥途徑和劑量方案僅作為指導用，因為熟練醫師將能容易地針對任何具體患者和病癥來確定最佳給藥途徑和劑量方案。附圖簡述圖1.纖連蛋白片段的三維結構和一級序列的示意圖。(A)各片段內和纖連蛋白亞基內的重復序列示意如下I類重復序列(長方形)；n類重復序列(卵圓形)；III類重復序列(正方形)。標明了含有NGR和RGD序列的組件。示意了組織蛋白酶(FN-70KDa)或組織蛋白酶-胰蛋白酶(FN-45和FN-30KDa)的蛋白水解消化所得的天然片段。也示意了倒千里光裂堿(Retronectin)、重組FN-Iw片段和合成FN-I5。(B)示意了FN-l4-s三維PDB結構(ProteinDataBankcode(蛋白質數據庫代碼)lFBR.pdb)。NGR基序(Asn263、Gly264和Arg2")的側鏈。(C)合成FN-I5和Loop-GNGRG和Loop-RGGNG肽和FN-I7和Loop-GNGRG肽的一級序列(參見方法)。圖2.天然纖連蛋白片段的細胞粘附促進特性。包被有天然蛋白水解片段(FN-70KDa、FN-45KDa和FN-30KDa)的微量滴定板促進內皮EA.hy926細胞的粘附。圖3.FN片段的加速老化能增加其促粘附特性。加速老化前后，讓EA,hy926細胞粘附到包被有不同肽和蛋白質的微量滴定板上。在37'C,將肽在O.lM碳酸氫銨緩沖液(pH8.5)中孵育16小時("熱處理")，進行加速老化。粘附到重組FN-I^或對照蛋白(FN-l4-5(SGS))(A)、合成FN-I5(B)、重組NGR-TNF、CNGRCG-TNF"n和對照CARACG-TNF,.u肽(C)、DGR-TNF(D)。將熱處理(37°C)產物和未處理(-20°C)產物吸附到微量滴定板孔的塑料表面(4。C過夜)。用30jig/ml經過熱處理的FN-l5或BSA(B，右)或用10pg/ml重組NGR-TKF或DGR-TNF(C,右)包被的各孔的顯微照片，x200。按照材料與方法所述，進行細胞粘附測定。圖4.FN片段的促粘附特性被PMT抑制。用經過熱處理的FN-l5或NGR-TNF(A)、或用天然FN-30KDa、FN-45KDa或倒千里光裂堿(retronectin)(RN)(B)包被微量滴定板。然后將吸附的蛋白質用PMT酶在37。C處理16小時。孵育后，洗滌除去酶液。再按照材料與方法所述，進行EA,hy926細胞粘附測定。圖5.NGR、DGR和isoDGR基序的穩定性。在0.1M碳酸氬銨緩沖液(pH8.5)(A和B)和DMEM(pH7.3)(A,插圖)中，37。C孵育4小時前后，對NGR-pep及其合成脫酰胺產物(DGR-pep和isoDGR-pep)進行RP-HPLC分析。在C-18柱(PepMapC18，PerSeptiveBiosystem)上如下進行RP-HPLC:緩沖液A，0.1%三氟乙酸(TFA)水溶液；緩沖液B,95%乙腈、0.1%TFA;0。/。B達10min，線性梯度20-40%B達30min、100%B達10min;0%B達15min(流速0.5ml/min)。通過NGR-pep的峰值鑒別峰1、2和3,孵育2小時后，用等量的指定肽(C).NGR-pep(峰1),快速轉化成對應于DGR-pep(峰2)和isoDGR-pep(峰3)的化合物(半壽期2-4小時)。圖6.加速老化后，FN-Is和含有NGR基序的肽與|33整聯蛋白結合。(A)經過熱處理的CNGRC-TKF和TNF與用純化的人整聯蛋白包被的固相的結合。采用單一濃度(5)Lig/ml)或不同濃度(插圖)的CNGRC-TNF和TNF。按照材料與方法所述，用抗TNF抗體檢測結合。(B)生物素化CNGRC-TNFlh、CARAC-TMVu和FN-I5(與鏈霉抗生物素-過氧化物酶復合)與純化的人整聯蛋白的結合。通過與鄰苯二胺(o-phenylendiammine)的顯色反應才企測結合。(C)熱處理前后，生物素化FN-V鏈霉抗生物素-過氧化物酶復合物，與不同量的FN-I4.5或FN-I4.5SGS(上圖)或對應于FN-I5的NGR環的肽(殘基258-271)(下圖)，竟爭性結合0^3包被的板。圖7.NGR-TNF與0^3的結合以及NGR-pep及其脫酰胺產物與(33的結合之間的竟爭性。生物素化NGR-TNF(4pg/ml)與不同量的指定肽混合，并加入到&包被板中。按照材料與方法所述檢測結合。通過非線性回歸分析，用GraphPadPrism軟件，求出IC5。。將抑制濃度(1<:5())對孵育時間作圖，測定FN-l5的脫酰胺動力學。小棒代表所測得的各ICso的置信區間。圖8.脫去酰胺基的FN-I5片段體外抑制細胞與玻連蛋白的粘附并抑制小鼠模型的腫瘤生長。(A)經過熱處理的FN-Is抑制EA.hy926細胞與玻連蛋白的粘附。將玻連蛋白(3嗎/ml)吸附到孩t量滴定板上，按照材料與方法所迷進行細胞粘附測定。(B)將"經過熱處理的"FN-Is反復給予帶有RMA腫瘤的小鼠的抗腫瘤效應。從腫瘤植入后4天開始，在指定時間(箭頭)，動物(5只/組)用200jug"經過熱處理的"FN-I5(i.p.)治療。在笫14天，*p=0.0003,經雙尾t-檢驗進行統計學分析。圖9.NGR-TNF的RP-HPLC分析。NGR-TNF的RP-HPLC顯示有F2和F4兩個主峰，以及Fl和F3兩個小峰。通過測定這些流分中isoAsp的含量，鑒別這些峰內脫酰胺基形式的存在。結果表明，F2含有的isoAsp比F4多得多(表l)。圖10.F2和F4的RP-HPLC和SDS-PAGE。A)通過RP-HPLC對F2和F4進行再次色譜法分析(Re-chromatography)表明，分離后的保留時間不變。B)非還原型SDS-PAGE的考馬斯染色顯示，F2和F4產物中的主要條帶為17-18kDa,正如對TNF單體的預期一樣。圖11.F2在RMA淋巴瘤模型中的抗腫瘤活性。進行了兩項實驗(實驗1和實驗2)。體重16-18g的C57BL/6小鼠(CharlesRiverLaboratories,Calco,Italy)在左脅經皮下注射7x104RMA活細胞，進行攻擊；IO天后，小鼠用0pg、25pg或100pg的F2(100pl)進行治療，2小時后再給予美法侖(50|Lig/100W)。腫瘤大小用平均值土SE表示(5只動物/組)。圖12.NGR-TNF在37。C用碳酸氬銨(pH8.5)處理不同時間后的RP-HPLC。NGR-TNF用0.1M碳酸氫銨緩沖液(pH8.5)稀釋，然后在37°C醉育不同時間。經過熱處理的NGR-TNF用RP-HPLC進行分析。圖13.重組DGR-TNF和NGR-TNF的RP-HPLC(A)和SDS-PAGE(B)。下面的實施例用于進一步說明本發明。實施例1-實施例1-7的材料與方法細胞系與試劑按文獻方法(Curnis等，2005;Ljunggren和Karre,1985)，培養小鼠RMA淋巴瘤細胞和EA,hy926細胞(人內皮細胞與人肺癌A549細胞的融合物)。結晶紫(FlukaChemie);牛血清白蛋白(BSA)、山羊抗兔IgG辣根過氧化物酶綴合物、FN-70KDa、FN-45KDa和FN-30KDa片段(Sigma);RetroNectin(TakaraBiomedicals)。人0^3、0^(55、a5pi和oqP!整聯蛋白(ImmunologicalSciences);鏈霉抗生物素-過氧化物酶(SocietaProdottiAntibiotici)。重組FN-I^和FN-14—5SGS的制備和表征通過RT-PCR,對MSR-3-mel細胞總RNA，使用以下引物，制備編碼人纖連蛋白4-5"類重復序列(FN-I"纖連蛋白殘基184-273)的cDNA(Tanzarella等，1999):5'畫TATATTAAGCTTTCAGTGCCTCTCACACTTCC(反向)。通過PCR,對FN-l4-5質粒，使用以上正向引物和以下反向引物，產生其中NGR被SGS取代的對照片段(FN-l5SGS):5'-TATATTAAGCTTTCAGTGCCTCTCACACTTCCACTCTCCACTGCCGCTG。將擴增片段克隆到pRSET-A質粒(Invitrogen)中，在BL21(DE3)pLysS大腸桿菌細胞中表達為可溶性蛋白(其N端有His-tag),再通過金屬螯合親和色語從細胞提取物中純化。合成肽的制備和表征用AppliedBiosystem433A型肽合成儀，通過化學合成制備各種肽(生物素化和非生物素化的)。使用呈L構型的氨基酸，除非另有說明。也合成了對應于人纖連蛋白的5"I型重復序列(FN-l5),成熟蛋白殘基230-274(檢索號P02751，Swiss-Prot)的合成肽，其具有額外N國端乙酰基-甘氨酸，并用Glu^替代Asp25Q。為了促進FN-I5中的Cys258-Cys"。和Cys2"-Cys26o之間形成二硫鍵(參見圖！)，將CyS258和Cys27D用S-三甲苯基保護起來(該保護基當側鏈脫保護并從樹脂上切割下來時，用三氟乙酸可脫去)，同時Cys23'和Cys26°用S-乙酰氨基曱基保護起來(該保護基用碘處理可脫去)。肽經RP-HPLC純化后，將20iumol肽在300ml8。/。DMSO(pH7)中，在室溫孵育過夜，形成Cys258-Cys2TO的二硫橋。再通過RP-HPLC純化肽并凍干。為了形成第二個Cys2"-Cys柳二硫橋，將13.5jimol肽溶于67ml80%v/v乙酸中并與0.135ml1N鹽酸混合。再將溶于2ml曱醇的21mg碘加入到肽液中，同時攪拌。90分鐘后，加入1mmol抗壞血酸以猝滅缺。再經RP-HPLC純化肽。所有肽溶于無菌水中，等分貯存在-2(TC。經RP-HPLC分析肽的純度。用Ellman試劑(Pierce,Rockford,Illinois)滴定進行測定，所有肽制劑中的游離巰基都<0.1%。MALDI-TOF或ESI-MS質鐠檢查肽的身份。該工作中所用的肽分子量類似于期望值。FN-Is的ESI-MS分析表明存在的額外組分為+144Da，對應于具有未脫去乙酰氨基曱基的FN-I5。CNGRC-TNF、CDGRC-TNF和CNGRC-TNFl"綴合物的制備和表征按照Curnis等(2000)所述，通過重組DNA技術制備鼠TNF和CNGRC-TNF(由鼠TNF與CNGRCG的C-端融合而成)。通過PCR,在CNGRC-TNF質粒，制備編碼CDGRC-TNF(鼠TNF與CDGRCG的C-端融合)的cDNA(Cumis等，2000)，采用以下引物5'-CACCATGGGCAACGGCCGTGGCGGCGTC(正向)；5'-擴增的cDNA克隆到pET101/D-TOPO質粒(Invitrogen)中，在BL21(DE3)大腸桿菌細胞(Novagen)中表達，然后，基本上按照先前用于CNGRC-TNF的方法(Colombo等，2002)，在可溶性p"-TNF受體-Sepharose上進行親和色譜，從細胞提取物中純化。如先前所述(Cumis等，2000),CNGRC-TNF和CDGRC-TNF都經歷了重折疊過程。蛋白質純度和身份經SDS-PAGE、電噴霧質譜和凝膠過濾色譜進行檢查。用L-M小鼠成纖維細胞進行標準溶細胞測定(Corti等,1994),測得CNGRC-TNF和CDGRC-TNF的體外溶細胞活性分別為2.96(±0.56)x108U/mg和2.59(±0.69)x108U/mg。如上所述，通過化學合成，制備對應于NGR-TNF(缺乏TNF活性)和CARAC-TMVu肽的N-端序列的CNGRC-TN!Vn。纖連蛋白片段和肽的加速老化(熱處理)纖連蛋白片段、肽和肽-TNF綴合物用O.lM碳酸氫銨緩沖液(pH8.5)稀釋，37。C孵育16小時后貯存于-20'C,直到進行分析。這些產物在下文稱為"熱處理產物"。異天冬氨酸(isoAsp)定量測定用ISOQUANT異天冬氨酸檢測試劑盒(Promega)定量測定未處理和"熱處理"的CNGRC-TNF和肽中IsoAsp的含量。細胞粘附測定和PIMT處理將未處理和"熱處理"的纖連蛋白片段、肽和肽-TNF綴合物用150mM氯化鈉、50mM磷酸鈉(pH7.3)稀釋到所需濃度，然后加入到96孔聚氯乙烯孩i量滴定板(Falcon,BectonDickinson)中。4。C孵育過夜后，洗滌這些板，接種EA.hy926細胞/含有0.ir。BSA的DMEM(40000細胞/孔)，將其在37°C/5%C02中孵育2-3小時。按照Curnis等(2005)所述，固定貼壁細胞并用結晶紫染色。如下所述，研究了蛋白L-isoAsp/D-Asp(9-曱基轉移酶(PIMT)對不同片段的促粘附特性的效果如上所述，微量滴定板用不同產物包被，再用0.9%氯化鈉洗滌。各孔裝入45pl溶液，其中含0.02mMS-腺苦-L-甲硫氨酸/150mM氯化鈉、:50mM磷酸鈉緩沖液(pH6.8)和5|ulPIMT溶液(來自IsoQuant異天冬氨酸檢測試劑盒，Promega)(終體積50iul/孔)，37。C孵育16小時。孵育后，用0.9%氯化鈉洗滌各板，如上所述地進行細胞粘附測定。肽和蛋白質與整聯蛋白的結合將人aj33、avp5、0^1和0^1整聯蛋白溶液(0.5-2嗎/1111)的含。32+和Mg2+的磷酸緩沖鹽溶液(DPBS，Cambrex)加入到96孔聚氯乙烯孩么量滴定板(50pl/孔)中，4'C孵育過夜。所有后續步驟都在室溫下進行。各板用DPBS洗滌，再與含3%BSA的DPBS(200fil/孔)一起孵育1小時。再次洗滌各板，^XCNGRC-TNP或TNF溶液(5iug/ml、50孔的3%BSA-DPBS),孵育2小時。用DPBS洗涂后，各孔與純化的兔抗鼠TNFIgG/含1%山羊標準血清的3%BSA-DPBS(10)ng/ml、50pl/孔)一起孵育1小時，再加入山羊抗兔過氧化物酶綴合物/同樣的緩沖液(50pl/孔，1小時)。加入鄰苯二胺顯色底物以檢測結合的過氧化物酶。用鏈霉抗生物素-過氧化物酶綴合物復合物，研究了生物素化肽(CNGRC-TNP,.n、CARAC-TNFlu和FN-I》與純化整聯蛋白的結合。通過混合不同量(0.5-l)Lig)的經過熱處理的生物素化^/含3。/()BSA和0.03單位鏈霉抗生物素-過氧化物酶(結合力1pg生物素/單位鏈霉抗生物素-過氧化物酶)的DPBS(終體積15pi),制備復合物。復合物用3%BSA-DPBS稀釋(1:500),加入到包被有如上所述的整聯蛋白的微量滴定板中，在室溫下孵育2小時。用DPBS洗滌后，如上所述通過顯色反應檢測結合的過氧化物酶。各測定一式三份。體內研究動物才莫型研究經過SanRaffaeleHScientificInstitute倫理委員會的批準，并按照規定的指導進行。體重16-18g的C57BL/6N小鼠(CharlesRiverLaboratories,Calco，Italy)在左脅經皮下注射7x104RMA活細胞，進行攻擊；4天后，小鼠每天用200iug經過熱處理的FN-I5(100iul)的0.9Q/o氯化鈉(i.p.)進行治療。如先前所述(Gasparri等,1999),用測徑器測量肺瘤，監測腫瘤生長。當腫瘤直徑達到1.0-1.3cm之前處死動物。腫瘤大小用平均值土SE表示(5只動物/組)。實施例2-纖連蛋白片段加速老化產生NGR依賴性粘附位點纖連蛋白片段加速老化產生NGR依賴性粘附位點研究了EA.hy926細胞與含NGR基序的天然、重組和合成纖連蛋白片段的粘附。首先，研究了以下纖連蛋白蛋白水解片段a)FN-70KDa，含FN-Iw和FN-IlL2重復序列；b)FN-30KDa，含FN-Iw重復序列；c)FN-45KDa，含FN-I6-9和FN-II^(參見圖1的示意圖)。所有片段，在吸附到微量滴定板上之后，都誘導細胞粘附和鋪展(圖2)，表明這些區域內存在促粘附位點。為了研究NGR基序在FN-I5重復序列中的作用，我們分析了FN-I5、FN;5和FN-l4.5SGS片段的促粘附特性，后者對應于其中SGS被NGR取代(殘基263-265)的突變型。重組FN-l4-5(而非SGS突變型)促進細胞粘附(圖3A)。當我們在這些片段中加入0.1M碳酸氫銨緩沖液(pH8.5)，37。C孵育16小時(從這時開始的這種處理稱為"熱處理，，)時，我們觀察到細胞對FN-I4-5(而非FN-l4-sSGS)的粘附增加(圖3A)。這說明以某種方式與NGR序列相關的細胞粘附位點因加速老化而產生。用合成FN-l5也可得到類似結果(圖3B)。為了評價NGR基序是否足以介導這一現象，我們研究了熱處理前后含NGR-基序的短肽的促粘附特性。因為NGR三肽不太可能折疊并與微量滴定板結合，所以我們引入兩個側翼半胱氨酸。使用側翼半胱氨酸的原理是根據這一事實經分子動態模擬，CNGRC肽的預測構象類似于FN-I5重復序列的GNGRG環(Colombo等，2002)。此外，我們將該肽與TNF融合(CNGRC-TNF)或與TKF的前11個殘基融合(CNGRC-TNF,.u,缺乏TOP活性)，以增加對微量滴定板的吸附。不出所料，對CNGRC-TNF進行熱處理可增加細胞粘附(圖3C)。在熱處理前后均未見僅與TNF的粘附(數據未顯示)。同樣，對CNGRC-TNF!.n(而非CARAC-TNF^(對照肽))進行熱處理可增加細胞粘附(圖3C,右)。這些結果支持了這一假說NGR基序在熱處理之后足以促進細胞粘附。令人感興趣的是，重組DNA技術制備的CDGRC-TNF綴合物甚至在熱處理(未顯示)之后仍完全無活性(圖3D),這表明Asn是活性增加的關鍵殘基。總之，這些結果表明，以某種方式涉及FN-I5中NGR基序的Asn殘基的結構變化，會導致產生促粘附位點。實施例3-NGR脫酰胺與細胞粘附增加有關眾所周知，Asn殘基、尤其是其后為Gly的Asn殘基，在生理pH下可經歷非酶促脫酰胺(Robinson和Robinson,2001;Robinson等，2004;St印henson和Clarke,1989;Tyler-Cross和Schirch，1991)。該反應導致形成Asp或isoAsp、L國Asp(LD)、L-isoAsp、(LisoD)、D-Asp(dD)和D-isoAsp(DisoD)，盡管L-構型占優勢(Geiger和Clarke,1987)。因此我們發現，經質譜分析，熱處理后，FN-I5、CNGRC-TNF和CNGRC肽的分子量增加了約1Da。此外，CNGRC-TNF的isoAsp分析表明，熱處理后存在〉0.5pmol的CNGRC-TNF亞基的isoAsp/mol。為了評價熱處理后FN-l5的粘附特性增加是否取決于NGR的脫酰胺，我們將"經過熱處理的"FN-Is和CNGRC-TNF與蛋白L-isoAsp/D-Asp(9-曱基轉移酶(PIMT,—種將L-isoAsp和D-Asp殘基轉化成L-Asp的酶)一起孵育(Aswad、1984;Galletti等，1988;Lowenson和Clarke,1992;McFadden和Clarke,1987;Murray和Clarke,1984)。PIMT幾乎完全抑制了經過熱處理的FN-Is和CNGRC-TNF的促粘附活性(圖4A)。此外，該酶促處理部分抑制天然FN-30KDa(圖4B)和FN-45ICDa片段(未顯示)的促粘附特性，表明Asn脫酰胺也可在天然纖連蛋白片段中發生。為了評價該反應的特異性，我們也評價了PIMT對倒千里光裂堿的效應，后者是一種FN片段，已知能通過RGD而促進細胞粘附(參見圖1)。不出所料，在這種情況下，酶促處理之后未見抑制(圖4B)。相反，在這種情況下，我們觀察到少量而非明顯的增加。并非完全出乎意料的是，RGD也可經歷Asp殘基的異構化，形成isoAsp并失去功能(Geiger和Clarke,1987;Lanthier和Desrosiers,2004;Reissner和Aswad,2003;Stephenson和Clarke,1989)。因此，在這種情況下，PMT預期可"修復，，RGD并增加細胞粘附。總之，這些結果表明，與RGD異構化相反，NGR脫酰胺與細胞粘附測定中"功能獲得"有關。實施例4-NGR脫酰胺動力學研究了在pH7.3(DMEM)和pH8.5(碳酸氬銨)時，NGR的穩定性和^soDGR或DDGR形成的動力學。為了該目的，合成了CNGRCGVRY肽(稱為NGR-pep)并在37。C孵育前后通過反相HPLC進行分析。將殘基GVRY添加到CNGRC的C-端上，以便能夠進行柱吸附。此外，制備了5種肽，即DGR-pep、D-DGR-pep、isoDGR-pep、D-isoDGR和SGR-pep,它們對應于NGR-pep的相同序列，除非在N位置上分別存在D、D-D、L-isoD、D-isoD和S之外。根據主要色譜峰(峰l)的高度，估計NGR-pep在pH7.3和8.;5時的半壽期大約分別為4小時和2小時(圖5A,插圖)。對應于脫酰胺產物的肽在這些條件下是穩定的(圖5B)。為了鑒定各峰并證實所測半壽期對應于Asn脫酰胺(而非其它結構變化)，我們分析了經過熱處理后的NGR-pep肽峰，以及新鮮的NGR-pep或DGR-pep或isoDGR-p印肽。結果顯示，在NGR-pep孵育后觀察到的峰1、2和3分別對應于NGR-pep、DGR-p印和isoDGR-pep肽。要注意的是,在37°C、貯藏在水中超過1周時，NGR-pep是穩定的。實施例5-(Xv(^是pisoDGR和EDGR基序的受體通過直接和竟爭性ELISA，用吸附在微量滴定板上的整聯蛋白，研究了經過熱處理的FN-I5、CNGRC-TNF和短肽與純化06^3、ocv(35、oc^和(Xi^整聯蛋白的結合。我們觀察到所有含NGR的分子(經過熱處理)都與aj33結合，但是很少或完全不與其它整聯蛋白結合(圖6A和圖6B)。用經過熱處理的TNF或用對照CARAC-TMVu肽，未見結合(圖6A和圖6B)，表明NGR是關鍵。要注意的是，我們觀察到甚至在熱處理之前，CNGRC-TNF都能與aj^結合(數據未顯示)，雖然程度較低，這可能是因為在制備和/或測定孵育過程中發生了脫酰胺。為了證實FN-Is的NGR環對整聯蛋白結合的重要性，我們進行了竟爭性結合實驗，使用重組FN-l4-5和FN-^SGS,后者缺乏NGR。不出所料，僅有含NGR的片段能與FN-I5竟爭性結合(33(圖6C)。采用對應于FN-I5的完整256-271環的肽，也觀察到結合竟爭(參見圖1C),但是采用在GNGRG位點上具有顛倒序列(scrambledsequence)的對照肽，則未見結合竟爭(圖6C)。因此，采用nDGR-pep和isoDGR-pep(ECso為0.1juM)以及經過熱處理的FN-I5(ECs。為0.4iLiM)能有效完成這樣的結合反應，但是采用DisoDGR-pep或DGR-pep、NGR-pep、SGR-pep(EC5。>10inM)則有效性更差(圖7)。考慮到isoDGR-pep或DDGR-pep肽在這些測定條件下是穩定的，這些結果表明，isoDGR-pep或oDGR-pep激發oJ33的新配體。實施例6-FN-^中的整聯蛋白結合位點形成的動力學為了研究FN-I5中的整聯蛋白結合位點的動力學，我們進行了額外的竟爭性結合研究，用不同劑量的FN-Is在37'C下、在DMEM中孵育不同時間。有趣的是，當我們將抑制濃度(ICso)與孵育時間作圖時，我們觀察到孵育后24-48小時達到最大竟爭性結合活性(半壽期3.4小時)(圖7B)。該值正好與上述NGR-pep脫酰胺的半壽期相對應，并且進一步支持了這一概念經過熱處理的FN-I5的整聯蛋白結合特性確實與NGR-脫酰胺相關。實施例7-脫酰胺泉的FN-I二片段體外抑制細胞與玻連蛋白的粘附并抑制小鼠模型腫瘤生長眾所周知，a^3整聯蛋白即玻連蛋白受體，在血管生成中起到關鍵性作用(Hynes，2002)。已知能夠抑制該整聯蛋白與ECM蛋白相互作用的化合物能抑制血管生成和腫瘤生長(Brooks等，1994;Brooks等，1995;Friedlander等，1995;Friedlander等，1996;Hammes等，1996)。我們已經觀察到脫酰胺的FN-Is片段能抑制EA.hy926細胞與玻連蛋白的粘附(圖8A)。此外該片段當每天給予帶有RMA淋巴瘤的小鼠時，能顯著抑制體內腫瘤生長(圖犯)。這些結果表明，FN脫酰胺基片段在細胞粘附和腫瘤生物學中起作用。實施例8-脫酰胺泉形式的NGR-TNF的分離為了制備鼠Cys-Asp-Gly-Arg-Cys-Gly-TNF(DGR-TNF)和Cys國isoAsp-Gly-Arg-Cys-Gly-TNF(isoDGR-TNF),我們在大腸桿菌細胞中克隆并表達了Cys-Asn-Gly-Arg-Cys-Gly-TNF(NGR-TNF)，并從該產物中純化得到脫酰胺基形式(在制備過程中自發產生的)。按照Cumis等(2000)所述，首先通過重組DNA技術，使用大腸桿菌，制備編碼NGR-TNF(由TNF與CNGRCG的C端融合而成)的cDNA并進行純化。為了從該制備物中分離出脫酰胺基形式，我們用反相色譜(RP-HPLC)在C-4柱(Hi-pore反相柱，250x4.6mm,Biorad)上進一步進行了如下的純化步驟流動相A;5mM磷酸鈉緩沖液(pH6.8)，其中含5%乙腈水溶液；流動相B,5mM磷酸鈉緩沖液(pH6.8)，其中含70%乙腈水溶液；0%B達10min、30%B達5min、線性梯度30-65%B達35min、100%B達10min、0%B達10min，流速2ml/min。在214nm和280nm處監測洗脫(HPLC,LC-126nM,BeckmanCoulter)。NGR-TNF的RP-HPLC顯示出稱為F2和F4的兩個主峰和稱為Fl和F3的兩個小峰(圖9)。通過測定這些流分中isoAsp的含量，鑒別這些峰內脫酰胺基形式的存在。結果表明，F2含有的isoAsp比F4多得多(表l)。通過RP-HPLC對F2和F4進行再次色i昝法分析表明，分離后的保留時間不變，這說明這些產物是穩定的。非還原型SDS-PAGE的考馬斯染色顯示F2和F4產物中的主要條帶為17-18kDa,正如對TNF單體的預期一樣(圖10,插圖)。進一步表征了F2和F4的生化和生物學特性(表1)。電噴霧質譜分析顯示F2的分子量比F4大1Da。此外，F2和F4針對L-M細胞的溶細胞活性是類似的。將該結果與isoAsp含量數據結合起來看，表明F2相當于脫酰胺基形式的NGR-TNF。為了評價脫酰胺是否發生在N-端CNGRC結構域，我們采用Edman降解方法進行了N-端序列分析(未顯示)。結果證實脫酰胺發生在N-端，因為檢出AspS而未檢出Asn2。該數據和以上數據表明，F2是isoDGR-TNF(75%)和DGR-TNF的混合物，其異天冬氨酰和天冬氨酰殘基在2位上。然后用RMA淋巴瘤模型研究了F2的體內抗腫瘤特性。動物研究經過SanRaffadeHScientificInstitute倫理委員會的批準，并按規定的指導進行。體重16-18g的C57BL/6N小鼠(CharlesRiverLaboratories,Calco,Italy)在左脅經皮下注射7x104RMA活細胞，進行攻擊；10天后，小鼠每天用0pg、25pg或100pgF2(100jil)治療，2小時后給予美法侖(50pg/lOOJul)(GlaxoWellcomeOperations,Dartford,GreatBritain)。所有藥物用含100|ig/ml無內毒素人血清白蛋白(Farma-BiaginiSpA,Lucca，Italy)的0.9%氯化鈉稀釋，經腹膜內給予。如先前所述(34)，用測徑器測量腫瘤，每天監測腫瘤生長。在腫瘤直徑達到1.0-1.3cm之前處死動物。腫瘤大小用平均值士SE表示(5只動物/組)。結果顯示，當與美法侖聯用時，極低劑量的(25pg)F2就可誘導抗腫瘤效應(圖11)。實施例9-用0.1M碳酸氫銨緩沖液處理NGR-TNF，制備isoDGR-TNF/DGR-TNF緩沖液組合物、離子強度、pH和溫度可增加Asn殘基的脫酰胺/異構化率。因此，為了開發制備F2(iDGR-TNF/DGR-TNF)的快速方法，我們用0.1M碳酸氫銨緩沖液(pH8.5)對NGR-TNF進行稀釋，37。C孵育不同時間。用RP-HPLC分析經過熱處理的NGR-TNF。圖12顯示在此處理后F4快速轉化成F2。值得注意的是，處理4小時后未見溶細胞活性損失，表明可開發該方法用于制備isoDGR-TNF/DGR-TNF。實施例10-通過重組DNA技術制備DGR-TNF通過對NGR-TNF質粒進行PCR,采用以下引物，得到編碼DGR-TNF(小鼠TNF與CDGRCG的C-端融合)的cDNA:5'CACCATGTGCGACGGCCGTTGCGGC3'(5'引物):5'CTGGATCCICACAGAGCAATGATCCCAAAG3'(3'引物)。設計這兩種引物是為了將定向克隆到pET101/D-TOPO質粒表達盒(Invitrogen)中。5'引物中有下劃線的序列含有能夠定向克隆和起始翻譯密碼子所需的序列，而3'引物含有終止密碼子(下劃線)。PCR反應和克隆過程按照制造商的說明書所推薦的來進行。DGR-TNFcDNA在BL21(DE3)大腸桿菌細胞(Novagen)中表達，再在可溶性p75-TNF受體-Sepharose上進行如下親和色語，從細胞提取物中純化按照制造商的說明書，將10mg市售重組p75-TNF受體(Embrel)與2.5ml活化-CH-Sepharose(AmershamBiosciencesEuropeGmbH,Freiburg,Germany)4禺聯。柱子用lOOmMTris-HCl緩沖液(pH8.0)充分洗滌，將DGR-TNF粗制提取物上樣，用20mMTris-HCl緩沖液(含有2mMEDTA,pH8.0)稀釋，再用7M尿素、100mMTris-HCl(pH8.0)洗脫而解吸附。再按所述(l)將DGR-TNF重折疊。簡而言之，變性產物對2.33M尿素、100mMTris-HCl(pH8.0),在4。C透析(140min),然后再用1.55M尿素、100mMTris-HCl(pH8.0)(140min)以及1M尿素、100mMTris-HCl(pH8)(140min)透析。最終，產物對100mMTris-HCl(pH8.0)透析(48小時)。產物在13000xg(10min，4。C)離心,再用超濾，經過10KDacut-off濾器進行濃縮。所有用于純化和重折疊步驟的溶液都用無菌無內毒素水(S.A丄.F.LaboratorioFarmacologicoSpA，Bergamo,Italy)來制備。蛋白質濃度用BCA蛋白測定試劑(Pierce,Rockford,Illinois)來測定。蛋白質純度和身份通過SDS-PAGE、電噴霧質譜(ESI-MS)和分析型凝膠過濾色傳來檢查。結果證實了產物的身份(數據未顯示)。通過L-M小鼠成纖維細胞的標準溶細胞測定，來測定DGR-TNF的體外溶細胞活性(2.5x108U/mg)。DGR-TNF的RP-HPLC表明其保留時間類似于得自NGR-TNF的F2(圖13)。表l:F2和F4的分子量、溶細胞活性和isoAsp含量<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>a)通過電噴霧質i普b)通過溶細胞測定，采用L-M鼠成纖維細胞(l)。c)異天冬酖胺殘基通過酶促測定(ISOQUANT,蛋白脫酰胺檢測試劑盒,Promega)進行定量測定，并表示為pmol的isoAsp/pmol的肽(％)。以上說明書提及的所有出版物都通過引用結合到本文中。在不偏離本發明的范圍和精神的前提下，對本發明所述方法和體系所做的各種修改和變動對本領域技術人員來說都是顯而易見的。盡管已經用具體的優選實施方案說明了本發明，但是應當理解，要求保護的發明不應受到這樣具體的實施方案的限制。的確，生物化學和生物工程或相關領域技術人員顯而易見的是，對本發明的所述方式進行的各種修改全都包括在所附權利要求書的范圍之內。參考文獻Aswad,D.W.(1984).Stoichiometricmethylationofporcineadrenocorticotropinbyproteincarboxylmethyltransferaserequiresdeamidationofasparagine25.Evidenceformethylationatthealpha-carboxylgroupofatypicalL-isoaspartylresidues(通過蛋白質羧曱基專爭移酶對豬促腎上腺皮質激素的化學計量曱基化需要天冬酰胺25的脫酰胺。在非典型L-異天冬氨酰殘基的a-羧基上甲基化的證據).JBiolChem259,10714-10721。Blood等，(1990)Bioch.Biophys.Acta，1032:89-118。Boehm,U.,T.Klamp,M.Groot和J.C.Howard.(1997)Cellularresponsestointerferon-gamma(對干擾素-y的纟田胞反應).Annu.Rev.Immunol.15:749-795。Borgia和Fields,(2000)TibTech18:243-251。Brooks,P.C,Montgomery,A.M.,Rosenfeld,M.，Reisfeld,R.A.,Hu,T.,Klier,G.和Cheresh，D.A.(1994).Integrinalphavbeta3antagonistspromotetumorregressionbyinducingapoptosisofangiogenicbloodvessels(整聯蛋白0^3拮抗劑通過誘導血管生成性血管細胞凋亡而促進腫瘤消退).Cell79,1157-1164。Brooks,P.C,Stromblad,S.，Klemke,R.,Visscher,D.,Saikar,F.H.和Cheresh，D.A.(1995).Antiintegrinalphavbeta3blockshumanbreastcancergrowthandangiogenesisinhumanskin(4元整聯蛋白0^|33阻斷人乳癌生長和人皮膚血管生成).JClinInvest96,1815-1822。Busk,M.,Pytela,R.和Sheppard,D.(1992).Characterizationoftheintegrinalphavbeta6asafibronectin陽bindingprotein(整聯蛋白0^|36表征為纖連蛋白-結合蛋白).JBiolChem267,5790-5796。Carswell,E.A.等，(1975)Anendotoxin畫inducedserumfactorthatcausesnecrosisoftumors(—種引起胂瘤壞死的內毒素i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。24.權利要求23的肽，其中所述肽包含選自以下的序列環狀CVLDDGRMEC、線狀CDDGRC、環狀CdDGRC、線狀CdDGRCG或環狀CDDGRCG。25.權利要求13-24中任一項的肽，其中所述肽包含胞外基質蛋白或其片段或衍生物的脫酰胺產物。26.權利要求25的肽，其中所述肽包含纖連蛋白、玻連蛋白、膠原蛋白或層粘連蛋白或其片段或衍生物的脫酰胺產物。27.權利要求26的肽，其中所述肽包含纖連蛋白或其片段或衍生物的脫酰胺產物。28.權利要求27的肽，其中所述肽包含纖連蛋白的FN-I5、FN-I7、FN-IL或FN-III9組件或其片段或衍生物的脫酰胺產物。29.權利要求28的肽，其中所述肽包含纖連蛋白的FN-Is組件或其片段或衍生物的脫酰胺產物。30.權利要求28的肽，其中所述肽包含纖連蛋白的FN-l7組件或其片段或衍生物的脫酰胺產物。31.權利要求2-30中任一項的肽，其中所述肽選擇性抑制o^3整聯蛋白。32.權利要求1或3-31中任一項的肽，其中所述肽抑制內皮細胞與玻連蛋白的粘附。33.前ii^又利要求中任一項的肽，其中所述肽抑制腫瘤生長。34.前^i又利要求中任一項的肽，其中所述肽抑制血管生成。35.前^i又利要求中任一項的肽，其中所述肽不含額外治療藥。36.權利要求35的肽，其中所述額外治療藥是抗癌肽。37.權利要求35或36的肽，其中所述額外治療藥是細胞因子。38.前述權利要求中任一項的肽，其中所述肽包含涉及DGR基序中G和R殘基的轉角。39.前iii又利要求中任一項的肽，其中所述肽包含至多350個氨基酸。40.前述權利要求中任一項的肽，其中所述肽包含至多100個氨基酸。41.前述權利要求中任一項的肽，其中所述肽包含至多50個氨基酸。42.前i^i又利要求中任一項的肽，其中所述肽包含至多25個氨基酸。43.前^i又利要求中任一項的肽，其中所述肽包含至多15個氨基酸。44.前^y又利要求中任一項的肽，所述肽不同于當含有NGR基序的肽代謝而形成的肽。45.—種綴合產物，所述綴合產物包含權利要求1-44中任一項限定的肽以及藥物、細胞因子、細胞因子片段、毒素、凋亡肽、生物反應調節劑、放射性核素、病毒顆粒、基因或造影化合物。46.—種藥物組合物，所述組合物包含有效量的權利要求1-44中任一項限定的肽或權利要求45限定的綴合產物。47.權利要求46的組合物，所述組合物還包含藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。48.權利要求46或47的組合物，所述組合物基本上不包含具有相應NGR基序的肽。49.權利要求46-48中任一項的組合物，所迷組合物的形式為注射用溶液劑或混懸劑或輸注用液體制劑。50.權利要求49的組合物，所述組合物的形式為脂質體。51.—種治療或診斷患有(33相關疾病的患者的方法，所迷方法包括給予權利要求1-44中任一項的肽、權利要求45的綴合產物或權利要求46-50中任一項的藥物組合物。52.—種治療或診斷患有選自以下的(33相關疾病的患者的方法骨質疏松、關節炎、糖尿病性視網膜病、黃斑變性、再狹窄或血管瘤；所述方法包括給予權利要求1-44中任一項的肽、權利要求45的綴合產物或權利要求46-50中任一項的藥物組合物。53.—種治療或診斷患有以下疾病的患者的方法骨質疏松、關節炎、糖尿病性視網膜病、黃斑變性、再狹窄或血管瘤；所迷方法包括給予權利要求1-44中任一項的肽、權利要求45的綴合產物或權利要求46-50中任一項的藥物組合物。54.權利要求53的方法，其中所述方法是治療或診斷骨質疏松患者的方法。55.權利要求53的方法，其中所述方法是治療或診斷關節炎患者的方法。56.權利要求53的方法，其中所述方法是治療或診斷糖尿病性^l網膜病患者的方法。57.權利要求53的方法，其中所述方法是治療或診斷黃斑變性患者的方法。58.權利要求53的方法，其中所述方法是治療或診斷再狹窄患者的方法。59.權利要求53的方法，其中所述方法是治療或診斷血管瘤患者的方法。60.—種治療或診斷癌癥患者的方法，所述方法包括給予權利要求1-44中任一項的肽、權利要求45的綴合產物或權利要求46-50中《壬一項的組合物。61.權利要求60的方法，其中所述癌癥包括實體瘤。62.權利要求60或61的方法，其中所述癌癥是肺癌、胰腺癌、乳癌、結腸癌、喉癌或卵巢癌。63.權利要求1-44中任一項限定的肽與細胞因子的綴合產物。64.細胞因子與包含NGR基序的脫酰胺產物的靶向部分的綴合產物。65.細胞因子與包含DGR基序的靶向部分的綴合產物。66.權利要求65的綴合產物，其中所述DGR是isoDGR。67.權利要求65的綴合產物，其中所述DGR是dDGR。68.權利要求65的綴合產物，其中所述DGR是LisoDGR。69.權利要求63-68中任一項的綴合產物，其中所迷細胞因子是TNF、IFNy、IL-12、IP畫IO、IL-7或EMAPI1。70.權利要求63-68中任一項的綴合產物，其中所述細胞因子是TNF或畫y。71.權利要求70的綴合產物，其中所述細胞因子是TNFot或TNFP。72.權利要求64-71中任一項的綴合產物，其中所迷耙向部分包含序列XDGRX，，其中X選自L、V、A、C、G、Y、P、H、K、Q和I,X，選自C、G、H、L、E、T、Q、R、S和P。73.權利要求64-72中任一項的綴合產物，其中所述扭向部分選自CDGRCVSGCAGRC、DGRAHA、GDGRG、CVLDGRMEC、CDGRC、CDGRCG、LDGRE、YDGRT、LQCICTGDGRGEWKCE、LQCISTGDGRGEWKCE、CICTGDGRGEWKC、CISTGDGRGEWKC、魔CTCVGDGRGEWTCY、纖CTSVGDGRGEWTCY、CTCVGDGRGEWTC或CTSVGDGRGEWTC。74.權利要求73的綴合產物，其中所述靶向部分選自環狀CVLDGRMEC、線狀CDGRC、環狀CDGRC、線狀CDGRCG和環狀CDGRCG。75.權利要求63-74中任一項的綴合產物，其中所述細胞因子用聚乙二醇或酰基殘基來衍生。76.權利要求63-75中任一項的綴合產物，其中所述細胞因子還與選自以下的化合物綴合抗體、抗體片段和生物素，其中所述抗體或其片段針對選自以下的化合物腫瘤抗原、腫瘤血管生成性標記或胞外基質組分。77.權利要求76的綴合產物，其中所述細胞因子為TNF，并且與所述耙向部分和選自以下的化合物綴合抗體、抗體片段和生物素。78.權利要求63-77中任一項的綴合產物，所述綴合產物不同于當含有NGR基序的肽代謝而在體內形成的產物。79.—種藥物組合物，所述組合物包含有效量的權利要求63-78中任一項的綴合產物以及藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。80.權利要求79的組合物，所述組合物的形式為注射用溶液劑或混懸劑或^i主用液體制劑。81.權利要求80的組合物，所述組合物的形式為脂質體。82.—種藥物組合物，所述組合物包含有效量的TNF與權利要求1-44中任一項的肽的綴合產物，以及有效量的IFNY或其編碼多核苦酸。83.—種藥物組合物，所述組合物包含有效量的TNF與包含NGR基序的脫酰胺產物的靶向部分的綴合產物，以及有效量的IFNy或其編碼多核苷酸。84.—種藥物組合物，所述組合物包含有效量的TNF與包含DGR基序的扭向部分的綴合產物，以及有效量的IFNy或其編碼多核苷酸。85.權利要求84的組合物，其中所述DGR是isoDGR。86.權利要求84的組合物，其中所述DGR是dDGR。87.權利要求86的組合物產品，其中所述isoDGR是LisoDGR。88.權利要求82-87中任一項的組合物，所述組合物還包含藥學上可接受的載體和賦形劑。89.權利要求82-88中任一項的組合物，其中所述TNF為TNFot或TNTFP。90.權利要求82-89中任一項的組合物，其中所述耙向部分包含序列XDGRX,基序，其中X選自L、V、A、C、G、Y、P、H、K、Q或I,X，選自C、G、H、L、E、T、Q、R、S或P。91.權利要求82-90中任一項的組合物，其中所述靶向部分選自CDGRCVSGCAGRC、DGRAHA、GDGRG、CVLDGRMEC、CDGRC、CDGRCG、LDGRE、YDGRT、LQCICTGDGRGEWKCE、LQCISTGDGRGEWKCE、CICTGDGRGEWKC、CISTGDGRGEWKC、魔CTCVGDGRGEWTCY、MRCTSVGDGRGEWTCY、CTCVGDGRGEWTC和CTSVGDGRGEWTC。92.權利要求91的組合物，其中所述粑向部分選自環狀CVLDGRMEC、線狀CDGRC、環狀CDGRC、線狀CDGRCG和環狀CDGRCG。93.權利要求82-92中任一項的組合物，其中TNF用聚乙二醇或酰基殘基來衍生。94.權利要求中任一項的組合物，其中TNF還與選自以下的化合物綴合抗體、抗體片段和生物素，其中所述抗體或其片段針對選自以下的化合物肺瘤抗原、腫瘤血管生成性標記或胞外基質組分。95.權利要求94的組合物，其中TNF與耙向部分和選自以下的化合物綴合抗體、和抗體片段和生物素。96.權利要求82-95中任一項的組合物，所述組合物的形式為注射用溶液劑或混懸劑或輸注用液體制劑。97.權利要求82-96中任一項的組合物，所述組合物的形式為脂質體。98.權利要求46-50和79-97中任一項的組合物，所述組合物還包含其它抗腫瘤藥或診斷用腫瘤造影化合物。99.權利要求98的組合物，其中所述其它抗腫瘤藥為多柔比星、美法侖、順鉑、吉西他濱、泰素。100.—種治療或診斷o^3相關疾病的患者的方法，所述方法包括給予權利要求63-78中任一項的綴合產物或權利要求79-99中任一項的組合物。101.—種治療或診斷選自以下的o^3相關疾病的患者的方法骨質疏松、關節炎、糖尿病性視網膜病、黃斑變性、再狹窄或血管瘤；所述方法包括給予權利要求63-78中任一項的綴合產物或權利要求79-99中任一項的組合物。102.—種治療或診斷患有以下疾病的患者的方法骨質疏松、關節炎、糖尿病性視網膜病、黃斑變性、再狹窄或血管瘤；所述方法包括給予權利要求63-78中任一項的綴合產物或權利要求79-99中任一項的組合物。103.權利要求102的方法，其中所述方法是治療或診斷骨質疏松患者的方法。104.權利要求102的方法，其中所述方法是治療或診斷關節炎患者的方法。105.權利要求102的方法，其中所述方法是治療或診斷糖尿病性視網膜病患者的方法。106.權利要求102的方法，其中所述方法是治療或診斷黃斑變性患者的方法。107.權利要求102的方法，其中所述方法是治療或診斷再狹窄患者的方法。108.權利要求102的方法，其中所述方法是治療或診斷血管瘤患者的方法。109.—種治療或診斷癌癥患者的方法，所述方法包括給予權利要求63-78中任一項的綴合產物或權利要求79-99中任一項的組合物。110.權利要求109的方法，其中所述癌癥包括實體瘤。111.權利要求109或110的方法，其中所述癌癥是肺癌、胰腺癌、乳癌、結腸癌、喉癌或卵巢癌。全文摘要一種選擇性抑制α_vβ₃整聯蛋白的肽，所述肽包含具有NGR基序的肽的脫酰胺產物。文檔編號A61K38/00GK101124243SQ200580048537公開日2008年2月13日申請日期2005年12月21日優先權日2004年12月23日發明者A·科爾蒂,F·庫爾尼斯申請人:莫爾梅德股份有限公司;圣拉斐爾德爾蒙特塔博基金中心