降低疾病傳染性的組合物和方法

專利名稱：降低疾病傳染性的組合物和方法
本申請是2003年2月6日提交的目前待決的美國專利申請10/359，889的部分接續申請案；這依次是2002年8月6日提交的國際專利申請PCT/US02/24794的部分接續申請案，指定美國并以英文公開；這依次是2002年4月15日提交的美國專利申請10/122,991的部分接續申請案，現在是美國專利6,596,313；這依次是2001年8月6日提交的美國專利申請09/923,090的部分接續申請案，現在是美國專利6,592,896。
背景技術：
1.發明領域 本發明涉及組合物的預防用途，用于降低微生物造成的疾病感染的發生。更具體的是本發明涉及治療、減輕或預防微生物感染的一種或多種癥狀或副作用的方法，以及減輕微生物感染的感染性或傳染性的方法。
2.相關技術的描述 病毒發病機制是病毒在宿主中產生疾病的方法。病毒的發病機制主要是對特定器官中離散的細胞群的病毒損傷的機制，所述損傷在特定宿主中產生疾病的信號和癥狀。
病毒必須進入宿主細胞以起始感染。進入途徑取決于病毒，包括皮膚、眼、呼吸、GI和泌尿生殖道以及循環系統。一些病毒在侵入位點附近造成組織損傷，尤其是感染上呼吸道的病毒，例如流行性感冒、副流行性感冒、鼻病毒和冠狀病毒。一旦病毒顆粒入侵細胞，病毒編碼的蛋白指導細胞復制病毒基因組并產生病毒特異性蛋白。這些蛋白與病毒基因組包裝形成完整的病毒體并被釋放。在囊膜病毒情況下，病毒體獲得脂膜并將病毒特異糖蛋白插入這個脂膜。囊膜病毒家族包括皰疹病毒科，逆轉錄病毒科，正粘病毒科，副粘病毒科，黃病毒科，披膜病毒科和冠狀病毒科。鼻病毒是不被包膜的小核糖核酸病毒科的成員。
病毒演化出許多進入宿主細胞并起始感染的機制。為與細胞膜融合，病毒具有有膜融合活性的膜糖蛋白。在結合到細胞表面受體后，許多囊膜化的病毒誘導受體介導的胞吞作用，導致細胞形成內體小泡。一旦進入內體小泡，病毒顆粒進行脫殼過程。這確保了對病毒基因組合適的pH，以避免病毒基因組被細胞核酸酶降解。
流感病毒屬于病毒的正粘病毒科家族，它們是包含具有8個片段的負鏈RNA基因組的的囊膜病毒。病毒RNA編碼10種病毒特異性蛋白。感染循環的起始需要病毒包膜與宿主細胞表面受體的結合，然后是受體介導的細胞內吞以及病毒與內體膜的融合。融合過程使病毒基因組可釋放入細胞質中，再移入細胞核，在核內病毒基因組起始病毒轉錄和復制。負責流感受體結合和膜融合的蛋白是血凝素蛋白(HA或H抗原)。對大部分株來說，HA蛋白是病毒體表面最多的糖蛋白。HA蛋白還是中和抗體的靶標。存在三種流感病毒的血清型A，B和C。血清型A和B造成大部分臨床疾病。流感A發生最頻繁，它的致病力更強，是造成大部分傳染性和大流行疾病的原因。根據表面抗原HA和神經氨酸酶(N抗原)，流感A可進一步劃分為亞型，H和N抗原是主要的抗原決定簇。株還可以根據首次分離的地理位置、序列號和分離年份進行分類。神經氨酸酶是一種促進感染宿主細胞釋放新病毒顆粒的酶。第三種蛋白，M蛋白(基質蛋白)，是一種膜通道蛋白，在A株中稱為M2，在B株中稱為NB。這些病毒膜糖蛋白是免疫系統作用的靶標。
流感病毒顆粒結合于上和下呼吸道的上皮細胞，在該處它們侵入細胞，釋放其基因組，控制宿主細胞復制機制以復制病毒蛋白和核酸。成熟的病毒顆粒通過宿主細胞的裂解釋放。由此導致的呼吸道上皮的破壞增加了對二次感染的易感性。流感主要通過呼吸分泌物傳染，這些分泌物通過咳嗽和噴嚏傳播。當污染了病毒的手直接接觸鼻道或眼時，流感還可通過直接接觸傳播。潛伏期從1到4天，感染者通常在癥狀出現前的1或2天具有傳染性，并在發病后5天仍具有傳染性。兒童和免疫受損者釋放病毒的時間更長。
在復制期間流感易在一種或兩種主要表面抗原上發生小的變化(亦即點突變)。這些變化部分是由于病毒轉錄組件缺乏校正和改錯機制。所述的抗原性漂移(drift)是造成季節性流行的原因，因為它使病毒能夠感染先前已接觸病毒的只具有部分免疫力的人。流感A病毒特別易于發生抗原性漂移。H和N抗原上的主要變化導致抗原性漂移。抗原性漂移導致新的病毒亞型，因為只有少數人群具有免疫力，它可以造成重大傳染性和大流行。
流感對人類造成嚴重威脅，因為它引起急性呼吸感染的當地傳染性和全球大流行。在美國，流感病毒每年造成20,000到40,000個死亡病例和接近300,000住院病例(Sandha and Mossad，Influenza in the OlderAdult.Indications for the Use of Vaccine and Antiviral Therapy，Geriatrics5643-51，2001，Oxford et al，InAntigenic Variation，Ed.Craig & Scherf，Academic Press，London pp.53-83，2003)。在1918年的大流行中，普遍認為超過4千萬人死亡。盡管兒童和年輕的成年人經歷更多感染病例，嚴重的疾病更常見于年老或患有慢性疾病如哮喘，糖尿病，腎衰和心臟病的免疫受損的個體中。每年流行病趨勢是在北半球為11到3月，在南半球為4到9月。
禽流感是流感病毒的A型株造成的。禽流感在全世界都有發生。被感染的鳥類顯示廣泛的癥狀，從輕微疾病到高度傳染性的致死疾病。高度傳染性的致死疾病是流感病毒的特別強毒力的病株造成的。感染這種株伴隨著嚴重癥狀的突然發生，例如無力，產蛋量下降，軟殼蛋，頭、眼臉等的腫脹，鼻分泌物，咳嗽或腹瀉，最終導致死亡(WHO，2004)。最近，證實15種亞型能夠感染鳥類，但只有H7、H5和H9亞型與爆發有關。最近亞洲和不列顛哥倫比亞省的爆發分別是H5N1和H7N3株造成的。如上所述，流感病毒是公共衛生的焦點，因為這些病毒缺乏核酸復制的校正機制以及改正這些錯誤的修復系統。因此，流感病毒在轉錄期間容易產生高突變率。此外，流感病毒能夠與不同種類的其他亞型調換或交換遺傳物質，從而使亞型突破種間障礙，種間障礙通常阻止來自一個種的種特異病毒交叉感染另一個無關的種。種間障礙通常阻止禽流感株傳染人類，但偶然的新株可能含有來自禽類和人類流感病株的遺傳物質。當人類與家禽家豬非常接近時，會發生這種遺傳物質的交換。家豬可能作為人類和禽類株的庫。這樣的話家豬作為新株出現的天然孵化器，這種新株能夠傳染人類以及禽類。
在美國現在有4種抗病毒藥物用于流感的治療金剛烷胺，rimatadine，扎那米韋(扎那米韋(RelenzaTM))和奧塞米韋(TamifluTM)。金剛烷胺和rimatadine只對流感A有效。金剛烷胺，rimatadine和奧塞米韋已被批準用于預防。預防被標明只用于流感爆發期間具有高風險的未免疫人群。因為較差的耐受性和抗藥性的發生，抗病毒試劑的用途是有限的。金剛烷胺是最近用于抵抗流感傳染的主要抗病毒化合物，但它的活性只限于流感A病毒。抗神經氨酸酶抑制劑如扎那米韋和奧塞米韋是一類新的被批準用于流感A和B感染的抗病毒試劑(Carr et al.，Influenza Virus Carrying Neuraminidase with Reduced Sensitivity toOseltamiver Carboxylatehas Altered Properties In Vitro and isCompromised for Infectivity and Replicative Ability In Vivo，AntiviralRes.5479-88，2002)。因此，開發新的和有效的抗流感A和B的抗病毒藥物具有重要的臨床意義(Bamford，Neuraminidase Inhibitors asPotential Anti-Influenza Drugs，J.of Enzyme Inhibition，Review 101-16，1995)。
流感疫苗一般在流感季節開始前使用，它們通常給予人群中被認為存在高風險的那部分人。疫苗以好幾種形式存在，目的在于預防或至少緩解疾病癥狀。在接觸病毒前使用疫苗以產生抵抗株的中和抗體，該株最有可能造成大范圍傳染或大流行。但是，疫苗接種費用較大，而且疫苗儲備很快就會耗盡。而且，疫苗不可以包含致病病毒成分。換句話說，疫苗制備取決于估計哪種株將作為主要株出現。因此在任意一年，對抗不同流感株只有有限的預防。此外，采用注射施用疫苗的典型方法對許多人來說是不愉快的。在另一方面，預防治療用于阻止傳染或減輕接觸病毒后的疾病的嚴重性。
奧塞米韋TM以及扎那米韋或RelenzaTM(Glaxo Wellcome，第二代抗病毒劑)是神經氨酸酶抑制劑，它們阻止成熟病毒顆粒的釋放，從而預防鄰近細胞的感染。神經氨酸酶抑制劑減輕流感感染的癥狀，縮短病程。預防必須在癥狀開始的48小時窗口期內進行才能有效，而且存在出現抗性株的風險。
嚴重急性呼吸器官綜合癥(SARS)是21世紀第一種主要的新傳染病。第一個病例于2002年11月出現在中國廣東，但在2003年3月才被認定是一種新的疾病。國際間的航空旅行加速了疾病的傳播，在22個國家都報告了病例。但是，通過現代通訊技術和全球合作努力，該病在確認后4個月內就被控制。該病造成高發病率和高死亡率，癥狀包括高燒，頭痛，肌痛和干咳。在60歲以上人群中死亡率超過60％(Peiris JSet al.，2003)。通過各種實驗室技術手段，包括組織培養物中的病毒擴增和電子顯微鏡研究，SARS被鑒定是一種新的病毒造成的。幾天后測定出的完整基因組序列證實了上述結論被，表明它是造成所述疾病的一種新的冠狀病毒。因此，開發用于抗這種類型傳染病的抗微生物藥物是非常重要的。
其他致病的微生物包括革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌，例如鏈球菌(Streptococcus)，葡萄球菌(Staphylococcus)，大腸桿菌(E.coli)，假單胞菌(Pseudomonas)和嗜血桿菌(Haemophilus)以及真菌感染包括酵母，白念珠菌(C.albicans)。當這些微生物的活動性感染主要用抗生素治療時，一些病人不能耐受抗生素。仍有其他病人希望用可以減輕或去除細菌或真菌感染的癥狀如咽喉痛的治療模式來增強抗生素治療。仍有其他病人希望通過在接觸細菌或真菌生物前、期間或剛剛接觸后的預防治療，阻止或減輕這些細菌或真菌生物感染的嚴重性。
最近的研究興趣集中于不同草本植物，它們含有有效抗氧化化合物，能夠顯著預防慢性疾病，并具有抗微生物或抗腫瘤活性。抗氧化物質例如類黃酮可在許多草本植物中發現，例如蒲公英，姜，綠茶和迷迭香。最近報道在馬-達二氏犬腎(MDCK)細胞中綠茶提取物(GTE)抑制流感A和B病毒的生長，在另一項研究中，綠茶的一種組分，表沒食子兒茶精-3-沒食子酸(EGCG)，阻止外周血淋巴細胞中HIV-1(111B)和Bal HIV株的復制。已經證明這些物質在治療不同疾病的領域是有效的；但在建立抗氧化物質用于預防方法方面還沒有任何進展。
因此，在本領域需要提供一種預防方法，以減少微生物造成的感染疾病的發病率。
發明概述 相應的，本發明的一些實施例的目的是提供一種減輕微生物造成的感染疾病的發病率的方法。
在第一方面，本發明涉及抗微生物組合物用于預防用途的方法，以減少感染疾病的發病率。該方法包括給已經或者將要接觸微生物造成的疾病的哺乳動物或鳥類施用一定量抗微生物組合物的步驟，該組合物具可有從姜獲得的第一種成分；可從綠茶獲得的第二種成分；以及可接受的載體。當給藥時，抗微生物組合物的量可有效減少感染疾病的發生。
在本發明的第二方面，公開了一種預防性抗微生物組合物，它含有從姜獲得的第一種成分；從綠茶獲得的第二種成分；以及可接受的載體。當作為鼻噴霧劑或喉噴霧劑給藥到已經或者將要接觸微生物造成的疾病的哺乳動物或鳥類時，抗微生物組合物可有效減少感染疾病的發病率。
作為本發明特征的這些和不同的其他優點以及新穎性特征在權利要求中特別指出，稱為本文的一部分。但是，為更好理解本發明、其優點及通過使用其而實現的目的，還需參考伴隨描述的事實，其中描述了本發明的優選實施方案。
優選實施方案的詳細詳述 在第一方面，本發明涉及組合物。本發明的組合物包括可從姜，綠茶和姜黃獲得的成分。
此處使用的術語“香料”包括水果香料和植物香料。
此處使用的術語“甜味劑”包括糖，例如葡萄糖、蔗糖和果糖。糖還包括高果糖淀粉糖漿固體、轉化糖、包括山梨糖醇的糖醇及其混合物。人工甜味劑也包括在術語“甜味劑”的范圍內。
此處使用的術語“可接受的”是指適于人/或動物使用的無過度不良副作用(諸如毒性、刺激和過敏反應)，與合理的風險/受益比相匹配的組分。
此外，此處使用的術語“安全和有效量”是指以此處所述的方式使用的一種組分的量，足以產生治療學要求的反應而無過度的不良副作用(諸如毒性、刺激和過敏反應)，與合理的風險/受益比相匹配。
此處使用的術語“抑制”微生物，是指減少或者預防微生物的進一步生長，或者預防微生物結合正常細胞，和/或從正在治療的人或者動物去除一些或所有的感染性顆粒。在實施例中討論了確定微生物抑制的合適方法。
此處使用的術語“傳染性”是指微生物從一個宿主轉移到另一個宿主。
用于本發明的全部活性化合物，如果可得到，可以從其他來源獲得。因此短語“可以從...獲得”或者短語“可能是從...獲得”是指包含從姜黃、姜或綠茶獲得的化合物或者組合物，并因此包含相同的化合物和/或組合物的合成形式以及從其他來源獲得的相同的化合物和/或組合物。
在第一個實施方案中，本發明的組合物包括安全和有效量的從姜獲得的第一種成分和從綠茶獲得的第二種成分，以提供此處所述的一種或多種有益效果。
本發明的組合物的第一種成分可以從姜(Zingiber officinale，通常也稱為姜根)獲得。源于南亞的姜是可以生出達1英尺長和幾乎1英寸寬的草樣葉子的2-4英尺的多年生植物。正如它在雜貨店被稱作姜根一樣，它實際上由刮掉了樹皮樣外層的該植物的地下莖組成。
可用于本發明的姜的活性化合物包括但不限于1，8-桉樹腦、10-脫氫姜二酮、10-姜醇、6-姜二酮、6-姜醇、6-姜烯酚、8-β-17-環氧-λ-反式-12-烯-15，16-二醇、8-姜醇、8-姜烯酚、9-氧代-橙花叔醇、乙醛、乙酸、丙氨酸、α-亞麻酸、α-亞麻酸、α-水芹烯、α-蒎烯、α-萜品烯、α-萜品醇、α-姜烯、芳-姜黃烯、精氨酸、抗壞血酸、天門冬酰胺、β-紅沒藥醇、β-胡蘿卜素、β-欖香烯、β-桉葉油醇、β-芷香酮、β-香葉烯、β-水芹烯、β-蒎烯、β-芹子烯、β-倍半水芹烯、β-谷甾醇、β-崖柏酮、乙酸冰片酯、硼、咖啡酸、鈣、樟腦烯、樟腦、癸酸、辛酸、辣椒素、石竹烯、佳味酚、綠原酸、鉻、檸檬醛、香茅醛、香茅醛、鈷、銅、異丙基苯、姜黃素、半胱氨酸、飛燕草色素、δ-杜松烯、欖香醇、乙酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、金合歡醛、金合歡烯、阿魏酸、糠醛、γ-氨基丁酸、γ-松油烯、香葉醛、香葉醇、乙酸香葉酯、姜酮、谷氨酸、甘氨酸、六氫姜黃素、組氨酸、異姜酮-B、異亮氨酸、莰非醇、卵磷脂、檸檬烯、亞油酸、鎂、錳、甲硫氨酸、單不飽和脂肪酸、月桂烯、楊梅酮、肉豆蔻酸、橙花醛、橙花醇、橙花叔醇、煙酸、鎳、油酸、草酸、p-香豆酸、p-傘花烴、p-羥基苯甲酸、棕櫚酸、泛酸、非洲豆蔻醇、廣藿香醇、苯丙氨酸、五氫黃酮、核黃素、硒、莽草酸、萜品烯-4-醇、硫胺素、色氨酸、香草酸、香草醛、鋅和姜油酮。而且，還可以使用兩種或多種這些活性化合物的混合物。
可以采用多種形式將從姜獲得的本發明組合物的第一種成分摻入本發明的組合物中，所述形式包括提取物，諸如姜粉提取物、姜液提取物、姜粉包括姜根粉和一種或多種姜的活性化合物、部分或者整個姜植株、其酊劑及其混合物。優選的，本發明組合物的第一種成分選自姜提取物和姜根粉。
每克本發明的組合物優選的包含約1mg至約150mg姜根粉。最優選的，每克組合物包含約6mg至約110mg姜根粉。這些范圍在攝取制劑中利用購自Stryka Botanics的姜根粉，以及在噴霧劑中利用購自Kalsec，Inc.of Kalamazoo，Michigan的姜提取物K(AquaresinGinger)作為基線。
在這里給出的各種成分的量是參照組分中的一種形式，即姜根粉。如果某種成分以另一種形式存在，那么要使用的量將提供與此處給定量的那種成分的量相同量的一種或多種活性化合物的量。例如，如果使用姜的酊劑，所用酊劑的量將提供與上面指定的姜根粉所提供的量相等的一種或多種活性化合物的量。這適用于所有組分，此處已經給定該組分某一特定形式的量。
本發明組合物的第二種成分可以獲自綠茶。從綠茶中獲得的第二種成分可能具有抗氧化效果。綠茶是灌木茶(Camellia sinensis)的干的葉和葉芽。綠茶主要產自中國和日本。干茶葉主要由已知為多酚的植物化合物(約36％)組成，主要是黃酮醇(包括兒茶酚)、類黃酮和黃酮二醇。這種葉子還含有植物生物堿(約4％)，包括咖啡因、可可堿和茶堿。
綠茶的藥理活性主要歸功于其活性化合物。用于本發明的綠茶的活性化合物包括但不限于黃酮醇、兒茶酚、類黃酮、黃酮二醇、植物生物堿、咖啡因、可可堿、茶堿、酚酸、蛋白、碳水化合物和礦物質。
從綠茶獲得的第二種成分可以以綠茶粉、綠茶提取物，諸如綠茶粉提取物、綠茶液體提取物以及綠茶的一種或多種活性化合物、部分或者整株綠茶植物體、綠茶葉片、其酊劑或其混合物的形式包括在組合物內。優選的，本發明組合物的第二種成分選自綠茶葉片、綠茶粉和綠茶提取物。更優選的，本發明組合物的第二種成分是綠茶提取物。
每克本發明的組合物優選的包含約1mg至約20mg綠茶提取物。最優選的，每克組合物包含約4mg至約15mg綠茶提取物。這些范圍利用購自Stryka Botanics的綠茶作為攝取制劑的基線，以及購自中國長沙Phytoway公司的綠茶提取物作為噴霧劑的基線。
可以獲自姜、綠茶和姜黃的本發明組合物的成分可以以姜黃粉、姜粉和綠茶粉的形式使用，每種成分可以分別從姜黃根莖、姜根和綠茶葉片磨碎。對合成路線已知的姜、綠茶和姜黃的特定活性化合物，可以合成該活性化合物。如果需要，植物提取物可按下述方式制備。可選的，也可從諸如Kelsec，Inc.of Kalamazoo，MI的商業來源購買姜黃粉、姜粉和綠茶粉和/或一種或多種此處所含的活性化合物。
可用于本發明組合物的植物提取物，例如姜黃提取物、姜提取物、綠茶提取物和辣根(horseradish)提取物可以利用通常的提取程序制備。可選的，提取物可以從諸如Kelsec，Inc.of Kalamazoo，MI的商業來源購買。
從上述任意植物將具有藥學或生物學活性的植物提取物制備成方便給藥的劑型的步驟是本領域公知的。
本發明的組合物可用于治療病毒感染，因為正如本申請的實施例所證明，本發明的組合物具有顯著的抗微生物特性。本發明的組合物也可用作治療組合物，通過給藥患有一種或多種下列癥狀或疾病的病人，來治療一種或多種病毒感染癥狀，包括咽喉痛、充血、咽炎、粘膜炎和/或粘膜發炎。
本發明的組合物也可用于減少感染疾病的發病率。在本發明組合物的這個申請中，安全和有效量的本發明的組合物給藥已經或將要接觸微生物造成的疾病的哺乳動物或鳥類，相對已經或將要接觸微生物造成的疾病但沒有給藥本發明的組合物的哺乳動物或鳥類，可以減少感染所述疾病的發生。
優選的，本發明的組合物可制成任何可接受的劑型，包括但不限于膠囊、片劑、錠劑、圓錠劑(troches)、硬糖果、粉劑、噴霧劑、凝膠劑、酏劑、糖漿以及懸浮液或者溶液。本發明的組合物也可以以營養增補劑的形式給藥，在這種情況下本發明的組合物可以是營養增補劑或者可以構成包含其他成分的營養增補劑的一部分。
本發明的組合物也可與可接受的載體進行配制。可接受的載體包括但不限于(a)碳水化合物，包括甜味劑，更優選的是果糖、蔗糖、糖、葡萄糖、淀粉、乳糖、麥芽糖、麥芽糖糊精、淀粉糖漿固體、蜂蜜固體、市售片劑營養增補劑包括EmdexTM，Mor-RexTM，Royal-TTM，Di-PacTM，Sugar-TabTM，Sweet-RexTM，和New-TabTM；(b)糖醇，包括甘露糖醇、山梨糖醇與木糖醇；和(c)各種相對不可溶的賦形劑，包括磷酸二鈣、硫酸鈣、碳酸鈣、微晶纖維素及其他片劑成分。
本發明的錠劑、片劑和圓錠劑可以在形狀、大小與制造工藝方面有所不同。至于用于口服使用的片劑，可接受的載體可以另外包括乳糖和玉米淀粉。包括例如硬脂酸鎂、十二烷基硫酸鈉與滑石的潤滑劑也可以加入到片劑中。片劑也可以包含諸如檸檬酸鈉、碳酸鈣與磷酸鈣的賦形劑。也可以使用分解劑諸如淀粉、藻酸與復合硅酸鹽。片劑還可以包括粘合劑諸如聚乙烯吡咯烷酮、明膠、PEG-8000與阿拉伯樹膠。
至于用于口服使用的錠劑，常用的可接受載體可以另外的包括諸如PEG-8000的粘合劑。優選的錠劑重量為約0.1至約15克，以在口服時提供合適的溶解率。更優選的，錠劑重量為約1至約6克。
錠劑的制備是本領域公知的，本領域技術人員很容易利用本發明組合物制備錠劑。組合物優選的貯存于氣密性容器和陰涼避光處。
片劑和圓錠劑可利用本領域公知的步驟制備，在可選成分上可以有小的改變。這種改變在本領域普通技術人員熟知的技術范圍內。
可選的，本發明組合物可以與諸如水或者其他液體的溶劑或者分散劑以及任選在藥用載體中配制成諸如糖漿、漱口藥或者噴霧劑的液態形式，用于在持續時間段內將組合物反復施用于口腔以及口咽粘膜。優選的，治療時間為約5至約60分鐘，并且更優選的為約20至約30分鐘，以延長組合物與口及咽喉組織的接觸時間。可選的，這種制劑可以是適于在使用前用水或者其他物質稀釋的濃縮形式。
組合物也可以配制成可咀嚼的形式，諸如軟糖果、橡皮糖、充填液體的糖以及口香糖膠基或者為諸如牙膏與漱口藥的牙用產品的形式。在使用中，可咀嚼的組合物優選在口腔中保持優選約5至60分鐘的持續時間，更優選的約20至30分鐘。牙用產品可以采用這種產品的常規方式使用。
本發明的組合物可以配制成含有或不含稀釋劑的膠囊形式。對于膠囊而言，有效的稀釋劑包括乳糖和干玉米淀粉。當使用懸浮液時，乳化劑和/或懸浮劑可以用于所述懸浮液中。此外，包括上述一種或多種錠劑成分的固體組合物也可用于軟和硬明膠膠囊內。
本發明的組合物也可以配制成鼻氣霧劑或者吸入劑組合物。這種組合物可以利用公知的技術制備。對于這些類型的制劑，合適的載體可以包括以下成分帶有一種或多種防腐劑的鹽、提高生物利用率的吸收促進劑、碳氟化合物和/或傳統的增溶劑或者分散劑。
可選擇的包括在本發明組合物中的其他材料包括白藜蘆醇(三羥基1，2-二苯乙烯)、肌醇、其它的B族-復合維生素以及另外的抗炎物質。此外，本發明組合物還可以包括一些成分，諸如甜味劑、香料、著色劑、染料、防腐劑、乳化劑、懸浮劑、融化劑、賦形劑、緩和劑，和一些溶劑或稀釋劑，諸如水、乙醇、丙二醇、甘油，以及它們的不同組合。
在任選的實施例中，本發明組合物包括以安全和有效量存在的可從姜黃獲得的一種或多種成分，以提供一種或多種此處所述的有益效果。姜黃(Curcuma longa)或者北印度的Haldi被廣泛用作藥物以及印度烹調用的普通成分。姜黃的根莖作為一種細粉用于藥物和食物。
姜黃根莖的黃色色素由三種稱為類姜黃素的化合物組成。這三種類姜黃素的化合物是姜黃素(二阿魏酰基甲烷)、脫甲氧姜黃素(羥基肉桂酰基阿魏酰基甲烷)和雙-脫甲氧姜黃素(二羥基二肉桂酰基甲烷)(參見Drug Analysis，Chromatography and Microscopy，p.169，AnnArbor Science Inc.，1973)。姜黃精油主要由以下化合物組成右旋樟腦(約1％)、環異戊二烯月桂烯(約85％)和對-甲苯基甲基原醇(約5％)(參見E.Gunther，The Essential Oil，pp.123-4，Van Nostrand Co.，1955)。
從姜黃中獲得的本發明組合物的成分優選包括類姜黃素，諸如姜黃素(二阿魏酰基甲烷)、脫甲氧姜黃素(羥基肉桂酰基阿魏酰基甲烷)和雙-脫甲氧姜黃素(二羥基二肉桂酰基甲烷)，和兩種或多種這些類姜黃素的混合物。
從姜黃分離類姜黃素的方法是已知的(參見Janaki and Bose，AnImproved Method for the Isolation of Curcumin From Turmeric，J.IndianChem.Soc.44985，1967)。可選的，用于本發明的類姜黃素可以通過合成方法制備。
可以從姜黃中獲得的成分可以許多不同形式摻入到本發明的組合物中。那些不同的形式優選的包括姜黃的提取物，諸如姜黃粉提取物、姜黃液體提出物、一種或多種類姜黃素化合物以及姜黃粉、部分或者整株姜黃植物體、其酊劑及其混合物。更優選的，從姜黃獲得的可選成分是姜黃提取物。
當使用可從姜黃獲得的成分時，每克本發明的組合物優選包含約1mg至約20mg姜黃粉提取物。最優選的，每克組合物包含約6mg至約1 5mg姜黃粉提取物。這些范圍基于使用95％的姜黃提取物，例如Pharmline，Inc.的攝取制劑形式以及姜黃根提取物(姜黃油樹脂)例如Kalsec，Inc.，Kalamazoo，Michigan的噴霧劑形式。
此外，本發明組合物還可以包括以安全和有效量存在的可從辣根的根獲得的一種或多種成分，以提供一種或多種此處所述的有益效果。
可從辣根的根獲得的可選成分包括辣根(Cochlearia Armoracia)的提取物。辣根包括揮發油，與芥末中發現的相似。這些包括glucosinolates(芥末油葡糖苷類)、水田芥甙(gluconasturtiin)和芥子甙(sinigrin)，在胃中分解時得到烯丙基異硫氰酸酯。
本發明組合物可選的包括乙醇、丙二醇和丙三醇及其不同組合，作為添加的活性成分可占到總重的10％。最優選的，添加直到總重10％的乙醇作為活性成分。更優選的，添加2.5-7％的乙醇。
用于本發明組合物的可選的甜味劑包括但不限于糖精、阿斯巴甜、甜蜜素、安賽蜜、新橙皮苷二氫查耳酮、其他超級甜味劑及其混合物，所述甜味劑可以足夠低的量加入到載體，以免與組合物的主要成分發生化學上的相互作用。
用于本發明組合物的可選的香料包括但不限于薄荷、薄荷醇、桉葉油素、冬青、甘草、丁香、肉桂、留蘭香(spearmint)、櫻桃、檸檬、橙、酸橙、薄荷醇及其各種組合。
優選的，那些來源于姜、綠茶和可選的來自姜黃的上述主要成分構成組合物總重的約0.5％至約90％。更優選的，主要成分構成組合物總重的約10％至約70％。最優選的，主要成分構成組合物總重的約20％至約40％。
所述組合物的非載體成分可以依據用于所述組合物載體的量在本發明的組合物中相應的增減，而對所述組合物的所需應用效果無顯著影響，所述非載體成分包括上述可以從姜黃、姜和綠茶獲得的成分。
減少或預防傳染涉及預防或減少微生物從一個患者(已被感染)傳播到另一個患者(未被感染)。一些患者被認為是感染攜帶者。攜帶者是一些能夠傳播微生物但不遭受急性感染的個體。這些攜帶者可以說是長期(或慢性)被微生物感染。除了長期被感染的傳播者，其他傳染性個體可能是那些被活動性感染，尤其是急性感染早期或晚期的那些個體。本發明的一個方面涉及將本發明的組合物給藥已被微生物感染的哺乳動物或鳥類，以阻止疾病傳播到其他哺乳動物或鳥類和/或減輕已感染哺乳動物或鳥類中的疾病癥狀。
預防治療是針對即將接觸微生物或者剛剛接觸微生物的患者。這種預防治療單用是有效的，也可以有效增強疫苗效果。預防治療也可用于抵抗還沒有疫苗的微生物。在預防治療的情況下，本發明的組合物給藥即將接觸微生物或者剛剛接觸微生物的患者，目的在于減少該患者被微生物活動性感染的發病率。
在另一方面，本發明涉及通過給感染病毒的患者給藥本發明組合物以減輕、治療或者預防病毒感染的至少一種癥狀或者副作用的方法，所述組合物包括可從姜和綠茶中獲得的成分。
在該方法中，患者可以是人、體外細胞系統或者動物。優選的，患者為哺乳動物，更優選為人。在該方法中，可通過給藥本發明組合物可以被抑制的病毒包括，連同其他病毒，鼻病毒、流感病毒、西尼羅河病毒、單純皰疹病毒、HIV-1、HIV-2、腺病毒、冠狀病毒、流感病毒、風疹病毒、黃熱病病毒和呼吸道合胞病毒(RSV)。在一個優選實施例中，通過給藥本發明組合物可以被抑制的病毒至少包括人鼻病毒16、皰疹病毒I(HSV-I)、流感A/Moscow/10/99、禽流感A(H5N1)和B/Guangdong/120/00。
可選的，患者也可以是鳥類(禽)成員，包括常見的商品化家禽火雞、鴨、鵝和雞，不常見一點的是鴕鳥以及其他通常作為家庭寵物的鳥類，例如金絲雀和鸚鵡。可通過直接將組合物噴入鳥的鼻道給藥該組合物或者通過噴霧讓鳥穿行來給藥。因此，該組合物可預防性的施用，以殺病毒或抑制病毒的方式起作用。可選的，組合物可用于減輕病毒的傳染性。
可通過本發明這種方法治療、減輕或者至少部分預防的由病毒引起的癥狀可以包括一種或多種頭痛、關節痛、發燒、咳嗽、打噴嚏、肌肉疼痛、流鼻涕、口干、眩暈及其他與病毒感染有關的癥狀。在鳥類中，這些癥狀包括無力，產蛋量下降，軟殼蛋，腦、眼臉等的腫脹，鼻分泌物，咳嗽或痢疾。
在該方法中，通過給藥本發明組合物可被抑制的微生物包括革蘭氏陽性細菌，例如鏈球菌(Streptococcus)、葡萄球菌(Staphylococcus)，革蘭氏陰性細菌，例如大腸桿菌(E.coli)、假單胞菌(Pseudomonas)、嗜血桿菌(Haemophilus)，和真菌例如組織胞漿菌(Histoplasma)和芽生菌(Blastomycosis)以及酵母例如白念珠菌(C.albicans)和隱球菌(Crytococcus)。
所述組合物的有效量會依據下列因素而改變，諸如接受治療的病人、給藥的特定方式、所用特定活性成分的活性、年齡、體重、一般的健康情況、病人的性別與飲食、給藥時間、排泄率、所用成分的特定組合、組合物主要成分的總量以及疾病或者癥狀的嚴重性。考慮這些因素屬于本領域普通技術人員的技能。
根據需要，組合物可以每天施用約1至約15次，如果需要，更優選的為每天約2至12次，或者根據需要最優選的為每天約6至10次。本發明的組合物可以采用上述任意可接受的劑型給藥，包括但不限于片劑、膠囊、錠劑、圓錠劑、硬糖、粉劑、口腔噴霧劑、鼻噴霧劑、凝膠劑、酏劑、糖漿、可咀嚼的組合物、牙用產品、懸浮液和溶液。
組合物的每一劑量包含安全和有效量的本發明組合物。適于每一治療給藥的有效量包含總共約0.1克至約1克可以從姜與綠茶獲得的成分。更優選的，適于每一治療給藥的有效量包含總共約0.2克至約0.5克可以從姜與綠茶獲得的成分。依照本發明的方法所施用的這種組合物的各種成分的量與上述本發明組合物中的量相同。
優選的，在所述組合物的各口服給藥期間，該組合物在口中保持至少約5至約60分鐘，使該組合物的主要成分在其完全溶解之前與口腔組織或者咽喉接觸。更優選的，該組合物在口中保持至少約15至約30分鐘。
當組合物以噴霧劑形式給藥時，可以減少各活性成分的量，因為例如與錠劑或膠囊相比，噴霧劑組合物可以更直接的將活性成分遞送到需要它們的位置。
下列優選范圍定義根據本發明的方法適于以噴霧劑形式給藥的本發明的組合物。
根據本發明的方法以噴霧劑給藥的每克組合物優選包含大約1mg至大約10mg的aquaresin姜。最優選，每克組合物包含大約3mg至大約7mg的aquaresin姜。
根據本發明的方法以噴霧劑給藥的每克組合物優選包含大約1mg至大約20mg的綠茶葉片提取物。最優選的，每克組合物包含大約4mg至大約15mg的綠茶葉片提取物。
根據本發明的方法以噴霧劑給藥的每克任選實施方案的組合物優選包含大約1mg至大約12mg的可溶性姜黃油樹脂。最優選的，每克組合物包含大約4mg至大約9mg的可溶性姜黃油樹脂。
本發明將通過如下實施例進行進一步說明，所述實施例不應看作以任何方式對本發明進行限制。本發明的范圍將通過所附權利要求進行限定。
實施例1本發明的組合物 利用上述方法配置錠劑形式的本發明的組合物。所述錠劑的成分列舉如下 實施例2咽喉痛的治療 患有咽喉痛的7個病人，通過將錠劑保持在其口腔內大約15-30分鐘直到所述錠劑完全溶解，每人每兩個小時攝取根據實施例1配制的一片錠劑。在任意給定天，沒有病人服用超過10個錠劑的劑量。
接受治療的病人報告在攝入2到20片錠劑后他們的咽喉痛癥狀完全消除。同時發現每一錠劑可以使咽喉痛減輕達6小時。
實施例3組合物殺病毒活性的體外試驗 在這個實施例中應用的殺病毒活性的體外試驗方案以人鼻病毒16(此后稱為“HRV-16”)作為靶病毒，以及由Jacobs等人在Characteristicsof Human diploid MRC-5，Nature(London)，227168-170(1970)中描述的與人組織相關的MRC-5細胞系作為HRV-16病毒的宿主細胞。試驗物質與病毒溫育后，通過顯微鏡觀察肉眼評價由病毒復制誘導的細胞致病作用(CPE)，在用于鼻病毒生長的MRC-5細胞系上測定殘余的病毒感染活性的滴度。更具體的說，通過觀察MRC-5培養物中氣球樣/圓細胞而進行CPE評分。
為確定這種殺病毒的活性，最初以1/20的稀釋度應用實施例1的組合物(此后稱為“物質1”)，然后用生理鹽水通過系列稀釋法進一步稀釋。這種稀釋的組合物與HRV-16一同溫育預定的時間段，然后用細胞感染培養基將反應調節至中性pH值而終止反應。然后將得到的溶液以1/10的稀釋度在測試平板上進行細胞感染來測定對MRC-5細胞上的滴度。每一平板包括僅僅包含感染HRV-16的MRC-5細胞的病毒對照，以及僅僅含有未感染的MRC-5細胞的細胞對照。
所述平板在感染之后再溫育4天。殘余病毒的感染活性利用上述討論的測定法進行測量。根據表1-4顯示的結果，平板上所有的對照都發揮作用。
從所述分析可以得出結論，物質1在1/20的稀釋度1分鐘的溫育時間可有效產生HRV-16病毒log值1.50的降低(-log10 TCID50)。物質1的1/40稀釋1分鐘溫育同樣導致log值減少1.00(-log10 TCID50)。2分鐘和5分鐘的溫育期后實現HRV-16滴度的log值減少1/2。因此這些結果傾向顯示物質1和HRV-16的1分鐘接觸時間將導致最有效的病毒滴度降低。
表1顯示了物質1的不同稀釋度，在終止時間點，MRC-5細胞上的傳染性鼻病毒16的殘余病毒滴度和log值的降低。
表1 表2-4顯示，在物質1不同稀釋度在三個不同的終止時間點，MRC-5細胞上傳染性HRV-16的殘余病毒滴度以及log減少值的第二個實驗的結果。
表2 表3 表4 在表1-4中，TCID50＝-log10 TCID50。
利用Vero細胞作為宿主細胞，使用包括Herpes 1病毒(HSV-1)的其他病毒，利用MDCK細胞作為宿主細胞，使用流感A/Moscow/10/99和B/Guangdong/120/00進行物質1的類似的殺病毒檢測。這些殺病毒檢測的結果概述在下列表5-13中。
表5-7顯示物質1在不同的稀釋度，三個不同的終止時間點，Vero細胞上傳染性HSV-1殘余病毒滴度以及的log減少值。
表5 表6 表7 表8-10顯示物質1在不同的稀釋度，三個不同的終止時間點，流感A/Moscow/10/99的殘余病毒滴度以及log減少值。
表8 表9 表10 表11-13顯示物質1在不同的稀釋度，三個不同的終止時間點，流感B/Guangdong/120/00的殘余病毒滴度以及log減少值。
表11 表12 表13 從上述結果可以看出，物質1可有效抑制或者消滅流感病毒和人鼻病毒。因此，物質1能有效治療流感和普通感冒。
實施例4組合物抑制病毒活性的體外研究 本實施例實行的關于殺病毒活性的體外試驗方案利用人鼻病毒16(HRV-16)作為靶病毒，鼻病毒敏感的人組織相關的Hela細胞作為HRV-16的宿主細胞，由Conant等人在(Basis for a Numbering system.I.HeIa cells for Propagation and Serologic Procedure，J.Immunol.，100107-113，1968)中描述。
物質1以1/20、1/40、1/80、1/160和1/320的稀釋度溶于感染培養基。稀釋物在37℃(5％CO2)培養在MRC-5細胞的平板上30分鐘。溫育后平板的孔內帶有MRC-5細胞的每個物質1的稀釋物以已知的滴度2.30(-log10 TCID50)接觸HRV-16。每一平板容納病毒對照(感染HRV-16病毒的Hela細胞，并且無物質1)，細胞對照(僅Hela細胞)以及不同稀釋度的試驗化合物對照(僅含試驗物質的Hela細胞)。平板上的全部其他標本包含感染HRV-16病毒的Hela細胞以及不同稀釋度的物質1。平板在感染后繼續培養4天。
在物質1與病毒溫育后，通過下列方法檢測病毒誘導的細胞致病作用(CPE)，滴定鼻病毒生長的Hela細胞上殘余病毒的感染活性。
與物質1溫育后殘余活Hela細胞用結晶紫溶液染色。洗滌除去多余的結晶紫，利用甲醇與乙酸的混合物溶解被結晶紫染色的細胞。然后在酶聯免疫吸附讀板儀中測定溶液在540nm處的吸光度。病毒誘導的CPE水平與吸光度成反比。
從結晶紫測定法獲得的結果可以通過公式y＝mx+c確定物質1的毒性濃度以及有效濃度，公式中x相當于物質1的稀釋度，而y相當于物質1對這種細胞的毒性百分比。由此公式，TC50(物質1對所述細胞顯示50％毒性的濃度)是物質1的1/571稀釋度。
這個結果與物質1在不同稀釋度時細胞存活百分比緊密相關，這也是利用結晶紫溶液進行測量，結果如下表14所示。
表14 利用相同的等式，其中x仍然相當于物質1的稀釋度，而y相當于病毒存在條件下物質1的效應百分比，EC50(試驗物質在病毒存在條件下顯示50％效應的濃度)經測定是物質1的1/91的稀釋度。這個結果與利用結晶紫方法測定的物質1在不同稀釋度時存活細胞的百分比密切相關，結果如下表15所示。
表15 在表14和15中，％存活細胞＝(僅化合物/僅細胞)×100；％活細胞＝(僅細胞-化合物+病毒)/(僅細胞-僅病毒)×100。
“僅化合物”表示僅包含Hela細胞和預定稀釋度物質1的孔的測量結果。
“僅細胞”表示僅包含未感染的Hela細胞的孔的測量結果。
“化合物+病毒”表示包含感染HRV-16病毒的Hela細胞和預定稀釋度的物質1的孔的測量結果。
“僅病毒”表示僅包含感染HRV-16病毒的Hela細胞的孔的測量結果。
實施例5本發明的抗微生物錠劑 根據下列配方制備抗微生物錠劑。
1)葡萄糖 865.0mg 2)滑榆樹皮150.0mg 3)硬脂酸 75.0mg 4)姜根 105.0mg(兒童)或者140.0mg(成人) 5)辣根的根70.0mg 6)天然蜂蜜香料40.0mg 7)姜黃提取物(5％姜黃素) 15.0mg 8)綠茶葉片提取物(36％C&P) 14.0mg 9)二氧化硅14.0mg 10)硬脂酸鎂 12.0mg 11)三氯半乳蔗糖/splenda 4.0mg 注意此處C&P指“兒茶酚和石炭酸” 實施例6本發明的抗微生物噴霧劑 根據下列配方制備抗微生物噴霧劑。
1)滑榆樹皮提取物18.52mg 2)可溶解的姜黃油樹脂(約8.5％姜黃素) 8.82mg 3)Aquaresin姜 7.0mg 4)辣根香料WONF 0.62mg 5)綠茶葉片PE50％色度14.0mg 6)天然蜂蜜香料 40.0mg 7)乙醇(95％)@5％68.2mg 8)甘油 603.42mg 9)蒸餾水603.42mg 總重 1364.0mg 實施例7抗微生物錠劑的體外試驗 檢測實施例5的抗微生物錠劑對流感病毒株A/NewCaledonia/20/99(H1/N1)，A/Panama/2007/99(H3N2)和B/Guangdong/120/00感染的MDCK細胞的殺病毒和抑制病毒生長的活性。
為測定殺病毒活性，在1/10、1/20、1/40、1/80、1/160、1/320和1/640稀釋度時測定錠劑。錠劑用等滲生理鹽水(Normasol)稀釋。每一稀釋度在錠劑與每種病毒接觸1、2和5分鐘的終點進行檢測。用1.8ml 0％FBS細胞培養基終止反應。
這個實施例的log減小值記錄為-log10 TCID50并且利用Karber方程式進行計算。
表16-不同稀釋度在1分鐘終止時間點后傳染性A/NewCaledonia/20/99(H1N1)病毒的殘余病毒滴度和log減小值 表17-不同稀釋度在2分鐘終止時間點后傳染性A/NewCaledonia/20/99(H1N1)病毒的殘余病毒滴度和log減小值 表18-不同稀釋度在5分鐘終止時間點后傳染性A/NewCaledonia/20/99(H1N1)病毒的殘余病毒滴度和log減小值 表19-不同稀釋度在1分鐘終止時間點后傳染性A/Panama/2007/99(H3N2)病毒的殘余病毒滴度和log減小值 表20-不同稀釋度在2分鐘終止時間點后傳染性A/Panama/2007/99(H3N2)病毒的殘余病毒滴度和log減小值 表21-不同稀釋度在5分鐘終止時間點后傳染性A/Panama/2007/99(H3N2)病毒的殘余病毒滴度和log減小值 表22-不同稀釋度在1分鐘終止時間點后傳染性B/Guangdong/120/00病毒的殘余病毒滴度和log減小值 表23-不同稀釋度在2分鐘終止時間點后傳染性B/Guangdong/120/00病毒的殘余病毒滴度和log減小值 表24-不同稀釋度在5分鐘終止時間點后傳染性B/Guangdong/120/00病毒的殘余病毒滴度和log減小值 在殺病毒分析中，已知滴度的病毒作為病毒對照；該對照與試驗化合物QR-345經歷相同步驟。所有平板上的流感病毒與病毒對照的滴度均一致的大于2.5(-log10 TCID50)。
實施例8抗微生物噴霧劑的體內試驗 雪貂是一種用于流感傳染研究的已建成的動物模型(Boyd andBeeson，1975；Chen et al.，Induction and Relief of nasal Congestion inFerrets Infected with Influenza，Int.J.Exp.Pathol.7655-64，1995；Scheiblauer et al.，Pathogenicity of Influenza A/Seal/Mass/ 1/80 VirusMutants for Mammalian Species，Arch.Virol.140341-8，1995；Sweet andSmith，Pathogenicity of Influenza Virus，Microbiol.Rev.44303-30，1980；Toms et al.，The relation of Pyrexia and Nasal Inflammatory Response toVirus Levels in Nasal Washings of Ferrets Infected with Influenza Virusesof differing Virulence，Br.J.Exp.Pathol.，58444-58，1997；Webster et al.，Protection of Ferrets Against Influenza Challenge with a DNA Vaccine tohaemagglutinin，Vaccine 121495-8，1994)。雪貂模型已被用于測定流感疫苗的效率(Fenton et al.，1981；Webster et a.，1994)。利用雪貂動物模型的傳染性研究不僅證明流感病毒從供體到受體的傳播，而且還證明了突變對病毒毒力的影響(Herlocher et al.，Ferrets as a TransmissionModel for InfluenzaSequence changes on the HAl of type A(H3N2)Virus，J.of Infect.Diseases 184542-46，2001；Herlocher et al.，Influenzavirus carrying an R292K Mutation in the Neuraminidase Gene is notTransmitted in Ferrets，Antimicrobial Res.5499-1 11，2002)。
在感染流感病毒株A/Sydney/5/97(H3N2)5分鐘前，每組6只共四組幼貂(n+++++a

ve ferret)接受鼻內劑量的實驗或對照組合物。陰性對照組接受磷酸鹽緩沖液(PBS)安慰劑。陽性對照組用TamifluTM(奧司米韋磷酸鹽，來自Nutley，NJ 的Roche Laboratories)處理。一個實驗組用實施例6的鼻噴霧劑處理，另一個實驗組用不包含綠茶提取物的相似的鼻噴霧劑處理。在初次使用后，每天兩次用指定給它們的組合物給藥雪貂。
PBS處理對照組的雪貂顯示感染流感A的雪貂的所有典型癥狀，包括體重減輕、發燒、炎性細胞數增加，并且在感染后的第一天排泄病毒。TamifluTM處理的對照組雪貂沒有經歷體重減輕，沒有病毒排出，沒有經歷炎癥細胞數上升的減少，而且沒有發熱。
實施例6的檢測制劑和相似的不含綠茶提取物的鼻噴霧劑均提供一種低水平的一過性炎癥細胞數的減少，抑制發熱疾病的進展，延緩病毒的排泄，這種方式可能表明病毒的抑制。但是，用實施例6的鼻噴霧劑處理的雪貂同樣顯示體重減少癥狀的減輕。用實施例6的鼻噴霧劑處理的雪貂比用TamifluTM處理的雪貂更有活性。
實施例9體內傳染性和預防試驗 檢測鼻噴霧劑QR-345的性質。QR-345的配方如下 QR-345配方 姜黃油樹脂0.0308重量百分比 Aquaresin姜 0.0326重量百分比 辣根油#58 0.00300重量百分比 綠茶PE 030725 0.0220重量百分比 甘油 2.3368重量百分比 去離子水 97.5749重量百分比 該研究檢測了當被感染的動物接受治療時，對被感染動物附近生活的動物鼻內使用噴霧劑預防病毒傳染的效果以及對未感染動物的預防作用。
在做了電子標簽后，大約6-8個月大、體重700-1200g的五十只雪貂(白子雪貂或者艾鼬，來自Highgate Farms，Lincolnshire，GB)被分成6組，如表25所示。從0天到6天檢測健康值，合適的動物在麻醉狀態下接受鼻內感染，每鼻孔加入0.25ml流感A/Sydney/5/97[H3N2]尿囊儲存液。
表25治療組分布設計 實驗設計中的組3和4顯示為上面的組3，組4和5顯示為上面的組4，組7和8顯示為上面的組5，以及組9和10顯示為上面的組6。組都是配對的，并細分為5個組，只是因為動物福利的原因。
表26-供體動物的感染狀態 傳染性研究 傳染性研究的目的是檢測試驗化合物是否能夠阻止供體雪貂傳染流感病毒給同欄的未感染受體雪貂。每組中一只雪貂接種病毒，大約接種5分鐘后，剩余的未接種動物給藥試驗或者對照化合物。試驗化合物或者對照的體積時每鼻孔0.14ml，每次劑量共0.28ml。接種的動物隔離24小時，然后在第1天重新放入相應的組中。接種的動物每天施用兩次試驗化合物或者合適的對照。剩余的雪貂在整個實驗期間都不接受處理。從第0到6天觀察所有雪貂的臨床表現、體重減輕和發燒情況。在第6天進行鼻內清洗物收集，測量回收的清洗物體積，在實驗記錄上記載鼻清洗物的重量。利用MDCK細胞檢測回收的鼻清洗物的病毒滴度。
表27-31顯示傳染性實驗的結果。表27顯示具有流感鼻癥狀動物的百分比。
表27-具有流感鼻癥狀動物的百分比(排除了供體動物) 表28顯示生理活性降低的動物的百分比。
表28-生理活性降低的動物的百分比(排除了供體動物) 考慮不同的流感疾病標準，并用它們測定顯示癥狀的動物的百分比。當考慮鼻癥狀的時候(表27)，到第4天，安慰劑組100％(4/4)的動物表現流感癥狀，與此相反，在第4天TamifluTM治療組只有50％(4/8)的動物顯示癥狀。QR435治療組沒有動物顯示癥狀。但第6天QR435治療組中37.5％的動物具有鼻癥狀。不清楚這是流感感染還是鼻噴霧劑的刺激作用造成的。
當考慮流感的全身癥狀諸如活動性降低時，到第4天，安慰劑組所有(4/4)的動物表現癥狀，但是在感染后任意一天活性治療組只有一只動物(12.5％)顯示疾病癥狀。
表29顯示治療組中實驗室驗確定的流感和血清轉換。每只動物在免疫激發前、第24天和感染后取血，這樣就可通過血清學確認流感感染。血清轉換定義為抗A/Sydney/5/97(H3N2)的抗HAI抗體升高4倍。在表29中顯示在安慰劑治療組和TamifluTM治療組中100％的動物發生血清轉換。但是，QR435治療組只有57％(4/7)的被檢測動物發生血清轉換。因為設備問題一個血清標本沒被檢測。
表29-化驗確定的流感；治療組的血清轉換 *一只動物在早期被淘汰，未采集標本 表30顯示感染后第6天鼻粘膜的平均病毒排出量。在感染后第6天進行鼻清洗，標本在MDCK細胞上進行流感病毒的滴定。表30顯示兩個活性治療組間動物排出病毒數目的顯著差異。與TamifluTM治療組中所有動物都排出病毒相比，QR435治療組中只有一只動物排出病毒。出乎意料的，安慰劑組中只有一只動物(25％)排出病毒。
表30-實驗室確定的流感；感染后第6天來自鼻粘膜的病毒排出 *一只動物在早期被淘汰，未采集標本 計算治療組的平均病毒排出，用ANOVA比較差異。發現結果是統計學顯著的(p＝0.02)。利用用于多項檢驗的Bonferroni校正進行t-檢驗，發現TamifluTM治療組比安慰劑治療組(p＝0.021)和QR435治療組(p＝0.04)顯著的排出更多的病毒。
表31是治療組的平均最大健康評分值。按照上面預防研究結果中所述計算最大健康值的平均值和標準差。結果是顯著的(p＝0.02)。按上述方法比較各組，兩個治療組的最大健康值均顯著低于安慰劑組(QR435 p＝0.006和TamifluTM p＝0.003)。
表31.治療組的平均最大健康評分值 計算每只動物的包含感染后健康評分值總和的AUC-樣測量值；并且計算治療組的平均值和標準差，用ANVOA比較。
表32顯示治療組間的結果和差異是非常顯著的(p＝0.002)。用t-檢驗和用于多項檢驗的Bonferroni校正比較各組，兩個治療組的健康評分值總和均顯著低于安慰劑組(QR435 p＝0.06和TamifluTM p＝0.03)。
表32.治療組的平均健康評分值總和 利用相似的方法計算感染后平均最大體重變化，用ANVOA比較。結果是不顯著的(p＝0.90)。兩個治療組的體重減輕均顯著低于安慰劑組(QR435 p＝0.055和TamifluTM p＝0.019)。計算比較每只動物的感染后體重改變總和的AUC-樣標準，并且用ANVOA比較。治療組間的差異是不顯著的(p＝0.64)。
預防研究 預防研究的目的是檢測用試驗化合物處理未感染的受體雪貂是否能夠阻止來自感染的供體的病毒感染。每組中一只雪貂接種病毒，大約接種5分鐘后，剩余的未接種動物給藥試驗化合物或者對照化合物。接種的動物隔離24小時，然后在第1天重新放入相應的組中。接種的動物不接受試驗化合物或相應對照的處理。剩余的雪貂每天施用兩次試驗化合物或者相應的對照。試驗化合物或者對照的體積是每鼻孔0.14ml，每次劑量共0.28ml。從第0到6天觀察所有雪貂的臨床表現、體重減輕和發燒情況。在第6天進行鼻內清洗物收集，測量回收的清洗物體積，在實驗記錄上記載鼻清洗物的重量。利用MDCK細胞檢測回收的鼻清洗物的病毒滴度。在第24天取血用作對照分析。
每只供體動物都被成功感染。因為研究參數的需要，證明每只供體動物都被成功感染并且每只動物都顯示感染的臨床現象和血清轉換是非常重要的。但是，在鼻清洗物中未檢測到病毒排出。在供體動物中幾乎不存在或者沒有病毒排出并不奇怪，因為在提取清洗物的那天即第6天前，病毒排出通常已經停止。
表33-38顯示預防實驗的結果。表33顯示具有流感鼻癥狀動物的百分比。表34顯示試驗期間生理活性降低的動物的百分比。
表33-對照組具有流感鼻癥狀動物的百分比(供體動物除外) 表34-生理活性降低的動物的百分比(供體動物除外) 預防研究結果 在預防研究中，第5天安慰劑組中75％(3/4)具有流感感染的鼻癥狀，而第3天TamifluTM組中25％具有鼻癥狀，第5天QR435組中25％具有鼻癥狀。當考慮顯示生理活性降低的動物的百分比時，結果是更引人注目的，因為安慰劑組100％顯示生理活性降低，而TamifluTM組或QR435組沒有動物顯示活性降低的任何跡象。表35顯示治療組的平均最大健康評分值。計算每只動物最大健康評分值的平均值和標準差，然后用ANOVA比較。結果接近于具有顯著性(p＝0.087)。
表35.治療組的平均最大健康值 計算每只動物的包含感染后健康評分值總和的AUC-樣標準；并且計算治療組的平均值和標準差，用ANVOA比較。表35顯示治療組間的結果和差異是非常顯著的(p＜0.0005)。用t-檢驗和用于多項檢驗的Bonferroni校正比較各組，兩個治療組的健康評分值總和均顯著低于安慰劑組。
表36.治療組的平均健康評分值總和 每只動物在被攻擊前、和感染后第24天取血，這樣就可通過血清學確認流感感染。血清轉換是針對接種株的HAl抗體升高4倍。
表37-實驗室確定的流感；治療組的血清轉換 表38顯示實驗室確定的流感和感染后第6天對照組排出病毒的動物的百分比。感染后第6天進行鼻清洗，標本在MDCK細胞上滴定檢測流感病毒。表38顯示兩個活性治療組中排出病毒的動物的數目存在本質差異，即與安慰劑治療組的75％和TamifluTM治療組的87.5％相比，QR435治療組沒有動物排出病毒。
表38-實驗室確定的流感；感染后第6天治療組的病毒排出 計算治療組的平均病毒排出，用ANOVA比較差異。發現結果是統計學顯著的(p＝0.001)。利用用于多項檢驗的Bonferroni校正進行t-檢驗，發現QR435治療組比安慰劑治療組(p＝0.004)和TamifluTM治療組(p＝0.002)顯著的排出更少的病毒。
計算治療組每只動物最大最大體重變化的平均值和標準差，用ANVOA比較。結果是顯著的(p＝0.018)。利用t-檢驗和用于多項檢驗的Bonferroni校正比較各組。兩個治療組的體重減輕均顯著低于(或者非常接近)安慰劑治療組(QR435 p＝0.055和TamifluTM p＝0.019)。
計算每只動物的包含感染后體重改變總和的AUC-樣標準；計算治療組平均值和標準差并且用ANVOA比較。治療組間的差異是不顯著的(p＝0.461)。
利用相似的方法計算感染后平均最大體重變化，用ANVOA比較。結果是顯著的(p＝0.018)。兩個治療組的體重減輕均顯著低于安慰劑組(QR435 p＝0.055和TamifluTM p＝0.019)。計算每只動物的包含感染后體重改變總和的AUC-樣標準，并且用ANVOA比較。治療組間的差異是不顯著的(p＝0.461)。
結論 在傳染性和預防實驗中，用TamifluTM治療(奧司米韋磷酸鹽，每天給藥兩次，每次5mg/kg)的陽性治療組通常可以預防流感癥狀。另一方面，這些動物通過病毒排出和受體動物的血清轉換顯示被感染。與此相反，試驗化合物QR-345可100％有效地預防感染，部分有效地預防傳染。因此，化合物的重要好處在于其預防感染的能力，具體的是抑制病毒顆粒的排出，從而減少病毒的傳播。
實施例10-體外比較抗SARS病毒的殺病毒和抑制病毒活性 在體外檢測兩種組合物QR439和QR439(a)對SARS病毒的殺病毒和抑制病毒活性。QR439按以下配方制備 (1)Aquaresin姜 0.6849重量百分比 (2)姜黃油樹脂0.6466重量百分比 (3)綠茶PE0.4619重量百分比 (4)甘油 49.1039重量百分比 (5)去離子水 49.1039重量百分比 QR439(a)按以下配方制備 (1)Aquaresin姜 0.6840重量百分比 (2)姜黃油樹脂0.6466重量百分比 (3)綠茶PE0.4619重量百分比 (4)辣根油0.063192重量百分比 (5)甘油 49.0723重量百分比 (6)去離子水 49.0723重量百分比 檢測中，陽性對照化合物是1％Triton-X 100(在人造唾液
)中用于殺病毒分析，1％DMSO(PBS中)的利巴韋林(200μ/ml)用于抑制病毒分析。
陰性對照化合物是只用于殺病毒分析的人造唾液(0.1％NaHCO3，18％KH2PO4，0.1％胃粘蛋白，調節pH到6.0-6.5)。Urbani SARS病毒使用時的儲存滴度是105 TCID50/ml。試驗化合物QR439和QR439(a)在Sterets Normasol(Seton Prebbles Ltd)中稀釋以產生下列用于殺病毒分析的稀釋度1/10，1/20，1/40，1/80，1/160，1/320，和1/640。
殺病毒分析方法 在96孔板C1008(Vero 76的一種克隆)細胞上滴定殘余病毒滴度檢測病毒生長。分析結果用于評估CPE(細胞致病作用)，利用Karber方法測定病毒滴度。
實施以下步驟進行殺病毒分析。360μl試驗化合物與40μl病毒混合。攪拌混合物，然后溫育30秒、1、2、4或8分鐘。通過加入3.6ml感染培養基(DMEM，2mM L-谷胺酰胺，HEPES，青霉素-鏈霉素)，反應在特定時間終止。添加感染培基的稀釋效應造成反應終止，因為在這一步病毒和試驗化合物被稀釋10倍。在96孔板C1008(Vero 76的一種克隆)細胞上以10倍稀釋度滴定殘余病毒感染性。C1008細胞在37℃孵育7-10天。結果用于進行CPE評分，并計算病毒滴度。在感染后3、4和5天檢測細胞的CPE。
細胞毒分析方法 所有三種化合物都在C1008細胞上進行細胞毒分析以決定何種稀釋度用于抑制病毒分析。在96孔板的第一孔(復孔形式)加入200μl每種試驗化合物和對照化合物，在整塊板上2倍系列稀釋進行滴定。平板在3 5℃5％CO2條件下溫育。溫育3天后觀察細胞的CPE。
抑制病毒分析的方法 用于抑制病毒分析的稀釋度如下按如下稀釋度的QR439和QR439(a)1/200，1/300，1/400，1/500，1/600。用適當的感染培養基(DMEM，2mM L-谷胺酰胺，HEPES，青霉素-鏈霉素)稀釋每種試驗化合物。每孔C1008細胞(復孔)加入100μl各稀釋的試驗化合物和陽性對照，然后在35℃5％CO2條件下溫育30分鐘。溫育后，每個含試驗化合物和陽性對照的孔加入10μl Urbani SARS病毒(儲存滴度是105 TCID50/ml)。在觀察細胞的CPE前，平板在35℃5％CO2條件下溫育3-5天。記錄CPE后，在平板上進行結晶紫分析，以測量細胞的OD(光密度)。用OD值測定試驗化合物的TC50和EC50。
結果 對試驗化合物進行的細胞毒分析的結果顯示在下面的表39中。每個未稀釋的化合物以復孔形式加入平板第一列的孔中，然后在整個平板中進行2倍系列稀釋。范圍在1/8和1/16稀釋度間的濃度相當于在殺病毒分析中加入平板的試驗化合物的濃度。這是因為加入終止培養基時化合物被1/10稀釋。
表39.細胞毒分析 +兩孔均顯示毒性 -兩孔均顯示無毒 +/1一孔顯示毒性，另一孔顯示無毒 表39顯示在1/8稀釋度(相當于殺病毒分析中使用的未稀釋化合物的稀釋度)兩種試驗化合物對細胞均有毒性。在殺病毒和抑制病毒分析中，稀釋度需要大于1/128以消除毒性。
CPE觀察(表40)顯示三種受檢測化合物中沒有一種檢測到抑制病毒活性。
表40.CPE觀察 +兩孔中均有病毒感染 -兩孔中均無病毒感染 +/-一孔中有病毒感染，另一孔中無病毒感染 T兩孔中均有毒性 ND在第6個系列稀釋度未完成抑制病毒分析 *QR439和QR439(a)的稀釋度為A＝1/200，B＝1/300，C＝1/400，D＝1/500，E＝1/600 對試驗化合物QR439和QR439(a)進行的殺病毒分析的結果分別顯示在表41和42。這些表顯示病毒滴度在試驗化合物1/10稀釋后下降，這相當于未稀釋病毒的1/10稀釋度。
表41.與試驗化合物QR439接觸后病毒滴度的Log減小值 a-log10TCID50/ml *無病毒回收。但是利用Karber計算方法(考慮到初始1/10稀釋度)得到0.5 TCID50/ml滴度。
表42.與試驗化合物QR439(a)接觸后病毒滴度的Log減小值 a-log10TCID50/ml *無病毒回收。但是利用Karber計算方法(考慮到初始1/10稀釋度)得到0.5 TCID50/ml滴度。
結果顯示對QR439來說，除了1/320(30秒)和1/640(30秒、1分鐘和4分鐘)外，從1/40到1/640稀釋度的所有接觸時間點，殺病毒活性都存在顯著降低。結果顯示對QR439(a)來說，除了1/20(4分鐘和8分鐘)外，從1/20到1/60稀釋度的所有接觸時間點，殺病毒活性都存在顯著降低。
實施例11-抗微生物鼻噴霧劑對H3N2流感感染的效果 40只雪貂用流感A/Sydney/5/97[H3N2]感染，每天用上面實施例9使用的QR43 5或者對照化合物治療，持續4天。觀測疾病跡象以及體重、直腸溫度、細胞計數和病毒排出。病毒接種物A/Sydney/5/97是有致病力的，并觀察到疾病跡象，接受安慰劑治療(PBS)的雪貂顯示流感A感染的明顯癥狀。陽性對照(TamifluTM)可有效減少體重減輕、發熱和臨床癥狀。在QR435給藥組未注意到疾病的緩解。
試驗物質是包含1.8％上面實施例9所示配方的活性化合物的鼻噴霧劑。陽性對照物質是TamifluTM(奧司米韋磷酸鹽)，每天5mg/kg給藥兩次。磷酸鹽緩沖鹽水(作為鼻噴霧劑)也被用作對照，鼻內每天給藥4次。
攻擊病毒A/Sydney/5/97[H3N2]來自Retroscreen病毒保藏中心。雪貂成功被流感感染，PBS治療組(陰性對照)顯示相關疾病的典型跡象。TamifluTM治療組(陽性對照)顯示疾病嚴重性的減輕，在病毒排出、體重減輕和疾病值方面均有統計學顯著(或者幾乎顯著)的降低。
兩個試驗化合物治療組(QR435每天兩次和QR435每天四次)都沒有顯示治療目的的疾病緩解。但是，如上面實施例9所示，QR435在抗傳染和預防用途方面是有效的。
實施例12 為減少鼻噴霧劑的刺激性質，并保留先前證明的抗傳染性質，在雪貂模型中檢測不同辣根濃度的效果。QR-435全辣根ALS流涎噴霧制劑成分如下 QR-345制劑 姜黃油樹脂0.0308重量百分比 Aquaresin姜 0.0326重量百分比 辣根油#58 0.00300重量百分比 綠茶PE030725 0.0220重量百分比 甘油 2.3368重量百分比 去離子水 97.5749重量百分比 在50％辣根試驗制劑中，辣根油減少到0.0015％重量，甘油和去離子水增加0.000075％重量。相似的，在25％辣根研究中，辣根油減少到0.000075，甘油和去離子水增加0.001125％重量。
表43顯示不同雪貂組的分布和欄處理規程。因為后勤原因每組被嚴格分成兩欄。每組由4只受體動物和1只供體動物組成。
表43.組分布 QDS＝鼻內每天4次劑量 BDS＝口服每天2次劑量 利用用于動物鑒別和體溫監測的可編程可注射的應答器電子標記動物。從淺表靜脈抽取血液標本，通過心臟穿刺取末端血。
供體雪貂按如下方式鼻內感染從5只的組移出1只動物，動物在麻醉狀態下用0.5ml病毒(每鼻孔0.25ml)感染。供體動物不用試驗物質治療。按照表43所列的治療組分配和表44的研究時間表，受體雪貂接受治療。收集鼻清洗物，測量回收的鼻清洗物體積并稱重以測定鼻清洗物回收的體積。
對抗同源病毒的標本進行HI分析，以檢測雪貂血清陰性以及血清轉換的程度，如果感染后有的話。記錄健康值、體重和體溫。利用苔酚藍計數鼻清洗標本中的所有細胞，以評估從鼻上皮回收的炎癥細胞應答。在MDCK細胞上進行鼻清洗物的病毒排出。
表44.研究時間表 表45顯示接觸流感病毒后供體動物的臨床跡象。從表中可看出，每個供體動物都成功感染了流感病毒。
表45.供體臨床跡象 *參見表43治療規程 用下列參數檢測受體雪貂中的流感相關疾病體重減輕、發熱、病毒排出、血清轉換、臨床鼻和活性跡象、鼻細胞計數。對照組(PBS治療組1a和1b)顯示典型的流感疾病跡象，包括體重減輕、發熱、血清轉換和出現一些疾病的臨床跡象(包括活性和鼻跡象)。TamifluTM治療組沒有顯示任何明顯的臨床跡象，也沒有發生血清轉換，因此證明TamifluTM治療可有效緩解流感疾病。組間的體重減輕百分比的比較表明疾病間存在差異。先找出每只雪貂的最高體重，隨后鑒定最低體重，計算出減輕的體重。最高和最低體重的區別計算為第0天體重作為基本體重的百分比。當比較治療組間的體重減輕時，幾種治療顯示能顯著減輕疾病。表46的結果顯示PBS治療組顯著不同于所有其他治療組。(PBSvs.100％辣根p＝0.008；PBS vs.50％辣根p＝0.022；PBS vs.25％辣根p＝0.005；PBS vs.TamifluTM p＝0.003)。
因此，試驗化合物與陽性對照(TamifluTM)一樣可有效預防被流感感染動物的體重減輕，該流感通過自然傳染途徑來自另一只雪貂。
表46A.結果比較 因變量分散在各欄的體重改變 表46B.配對比較 因變量分散在各欄的體重改變 a.用于多重比較的修正最低顯著差異(相當于無修正) 與先前測量相比，體溫升高大于3SD(標準差)的個體雪貂被認為是患有嚴重發熱疾病。每組的SD根據第一天每組的平均體溫計算。因為第0天麻醉劑的使用可能導致體溫的改變，第1天的體溫更適合用來產生基線平均值和SD。表47概括了發熱情況，所述發熱定義為從先前體溫測量增加3SD。
表47.結果比較 *參見表43的欄治療規程 表48.輕微發熱疾病 *參見表43的欄治療規程 利用發熱的X2分析，所述發熱定義為先前體溫測量增加3SD，測定下列數據 PBS治療vs.50％辣根p＝0.106(表49) PBS vs.10％辣根p＝0.106(表50) PBS vs.TamifluTM p＝0.106(表51) 表48概括了與先前測量體溫相比，體溫明顯增加超過2SD的雪貂數量，所述體溫增加被認為是輕微發熱疾病。
表49.PBS和50％辣根治療之間的發熱雪貂的數目的X2分析(體溫從基線升高＞3SD) x2檢驗 a.只計算2X2表 b.2細胞(50.0％)預期計數少于5。最大預期計數是2.50。
表50.PBS和100％辣根治療之間的發熱雪貂的數目的X2分析(體溫從基線升高＞3SD) x2檢驗 a.只計算2X2表 b.2細胞(50.0％)預期計數少于5。最大預期計數是2.50。
表51.PBS和TamifluTM治療之間的發熱雪貂的數目的X2分析(體溫從基線升高＞3SD) x2檢驗 a.只計算2X2表 b.2細胞(50.0％)預期計數少于5。最大預期計數是2.50。
利用發熱的X2分析，所述發熱定義為先前體溫測量增加2SD，測定下列數據 PBS治療vs.50％辣根p＝0.012(表52) PBS vs.10％辣根p＝0.106(表53) PBS vs.TamifluTM p＝0.106(表54) 表52.PBS和50％辣根治療之間的發熱雪貂的數目的X2分析(體溫從基線升高＞2SD) x2檢驗 a.只計算2X2表 b.4細胞(100.0％)預期計數少于5。最大預期計數是3.50。
表53.PBS和100％辣根治療之間的發熱雪貂的數目的X2分析(體溫從基線升高＞2SD) x2檢驗 a.只計算2X2表 b.2細胞(50.0％)預期計數少于5。最大預期計數是2.50。
表54.PBS和TamifluTM治療之間的發熱雪貂的數目的X2分析(體溫從基線升高＞2SD) x2檢驗 a.只計算2X2表 b.2細胞(50.0％)預期計數少于5。最大預期計數是2.50。
結論 盡管所有試驗化合物治療的雪貂都發生了血清轉換，但具有100％和50％辣根成分的QR-435可以顯著或者幾乎顯著的緩解全身性疾病，這是通過檢測體重和體溫得到的。但是，任何治療都不能根除疾病的其他跡象。對照組顯示流感疾病的臨床跡象。PBS治療組顯示流感感染的典型跡象體重減輕、發熱和血清轉換以及疾病的弱臨床跡象，活性降低和鼻跡象。TamifluTM治療組顯示無顯著的體重減輕、弱臨床跡象、病毒排出、減弱的發熱嚴重程度和無血清轉換。
在試驗治療組，用發熱和體重減輕定義病毒的嚴重程度。當與PBS組比較時，所有治療劑量顯著緩解體重減輕的嚴重性。當發熱定義為體溫增加2SD時，50％辣根治療組顯示發熱發生率的顯著降低。100％辣根治療組也可以根除發熱，被發現是幾乎顯著的。當發熱定義為體溫增加3SD時，100％和50％辣根治療組的發熱發生率接近顯著降低，但25％辣根治療不能根除發熱。因此，100％和50％辣根治療比25％辣根治療能夠更大程度減輕全身跡象。這表明強的劑量依賴性需要50％或更高辣根以根除發熱和體重減輕。50％或更高辣根治療可以降低從供體傳染到受體的病毒滴度，從而減輕疾病癥狀的嚴重性。而且通過以治療方式用50％或更高辣根治療根除疾病也是可能的。
實施例13 記載的第一例人感染禽株的病例是1997年香港18人感染H5N1，導致6人死亡。更近的爆發發生在東南亞，導致大量死亡，如表55所示。
表55.東南亞確診的人H5N1(禽)流感病例(WHO2004) 本研究測定了下面表56-67所列制劑治療從人分離的禽株流感病毒A/Vietnam/I 194/04，H5N1的效果。陰性對照是DMEM-DMSO 1％，而抑制病毒分析中的陽性對照是0.37μM amatadine。殺病毒分析中的陽性對照是1％Tween-20/20％ETOH/PBS(終濃度)。此外，還使用了只有細胞和只有病毒的陽性對照。只有細胞的對照只用維持培養基。對只有病毒的對照，檢測步驟是相似的，除了使用細胞維持培養基取代試驗化合物。表56-57顯示了被檢測的制劑。
表56.制劑I 表56.制劑II 通過視覺觀察細胞致病作用(CPE)確定殺病毒分析的終點，并且采用Karber方法檢測殘余病毒滴度。通過與只有病毒的對照比較，檢測與試驗化合物接觸的病毒滴度的降低。抗病毒活性是1-log10TCID50/ml的減少(參見Oxford，J.S.等人，″Sodium deoxycholateexerts a direct destructive effect on HlV and Influenza viruses in-vitro andinhibits retrovirus-induced pathology in an animal model.″Antiv.Chem.Chemother.，5(3)176-181(1994))。抑制病毒分析的終點也通過視覺CPE值確定。抗病毒活性通過感染的存在與否來表示。
抑制病毒分析 在抑制病毒分析中，制劑I-II被1/10(101)，1/100(102)和1/1000(103)稀釋。此外，未稀釋的制劑I-II(100)也被檢測。在抑制病毒分析中，馬-達二氏犬腎(MDCK)細胞種植于96孔板(100μl/孔)，在37℃5％CO2孵育2天。2天后，細胞用100μl/孔PBS洗滌2次，然后加入100μl/孔感染培養基。細胞中加入1/103稀釋的原倍病毒儲存液，在標準溫育條件下(即37℃和5％CO2)吸附1到2小時。然后向被感染的孔中加入50μl/孔每種試驗制劑(稀釋的和未稀釋的)。平板在標準溫育條件下溫育3天。CPE觀察和結晶紫染色確定分析的終點。此外，在2倍系列稀釋后進行血凝分析(HA)。
進行結晶紫染色時，當使用未稀釋和101稀釋的制劑I時，觀察到一些抑制病毒活性。有效濃度EC50經計算為1/10188(即在1/101和1/102之間的稀釋度)。
在此分析中，所有稀釋度的制劑II的所有試驗孔中均觀察到CPE。進行結晶紫染色時，沒有觀察到制劑II的抑制病毒活性。
表58顯示抑制病毒分析的HA分析數據。
表58.抑制病毒分析活性 *此處記錄的HAU(HA單位)更像是化合物的毒性而不是抗病毒活性造成的。
Amatadine的HA效價范圍從16到32HAU，表明幾乎沒有抗A/Vietnam/1 194/04株的活性。
殺病毒分析 在殺病毒分析中制劑I和II稀釋1/10和1/80。在殺病毒分析中，馬-達二氏犬腎(MDCK)細胞種植于96孔板(100μl/孔)，37℃5％CO2孵育2天。2天后，細胞用100μl/孔PBS洗滌2次，然后加入100μl/孔感染培養基。1/1000稀釋的原倍病毒儲存液(40μl/孔)加入到每種試驗化合物(360μl)，室溫溫育30秒或者5分鐘。通過添加感染培養基(3.6ml)終止反應。反應終止是1/10稀釋造成的。終止混合物以復孔形式(1110μl)加入96孔板第一排，然后10倍系列稀釋后在整個平板進行滴定。平板在標準溫育條件下溫育3天，對CPE評分。在2倍系列稀釋后進行血凝分析(HA)。
表59顯示使用制劑的殺病毒分析的HA數據。
表59.制劑I的殺病毒活性 數據顯示制劑I在5分鐘溫育后具有殺病毒活性，對1/10稀釋度只在30秒溫育后具有殺病毒活性。
表60顯示使用制劑II殺病毒分析的HA數據。
表60顯示制劑II具有一些可以檢測到的殺病毒活性，但與制劑I觀察到的活性比較，數量較低。兩個殺病毒分析的陽性對照都是1％Tween-20/20％ETOH/PBS。陽性對照在所有平板始終＜2HAU，因此顯示良好的抗A/Vietnam/1 194/04株的抗病毒活性。
結論 當在抑制病毒分析中檢測時，制劑I具有可檢測到的抗病毒活性。該活性被分為中等的，導致病毒復制大約10倍降低。但是，當與QR制劑溫育時，在細胞單層觀察到一些非特異變化，因此不能準確定量抗細胞相對抗病毒效果的精確分布。一些新的抗病毒藥物已經被設計，通過影響細胞功能發揮病毒抑制活性。QR混合物的不同成分發揮不同的抗細胞和抗病毒效應是可能的。
制劑II檢測到了殺病毒活性，但制劑II的效果低于制劑I。未來可能的研究方向是分析完整化合物中每種成分的貢獻。
到目前為止，NI(神經酰胺酶(neuramidase)抑制劑)阻滯劑顯示能夠抑制禽流感株H5N1，而amantadine顯示針對禽H5N1株相對無活性。
但是，應該了解，盡管在上面描述中列舉了很多本發明的特征和優點，但它們只是說明性的。在不違反本發明的內涵和外延的條件下，可以對上述方法的運用以及上述本發明的組合物有所改變。意在說明上述說明書中的所有內容應該視為說明性的，并不是限制意義的。本發明的范圍將根據所附權利要求進行確定。
權利要求
1.一種降低微生物傳染性的方法，包括給哺乳動物或者鳥類施用安全和有效量的組合物的步驟，所述哺乳動物或者鳥類已經接觸微生物造成的疾病或者已經感染微生物造成的疾病，所述組合物包含
可從姜獲得的第一種成分；
可從綠茶獲得的第二種成分；
可接受的載體；
給藥后，所述量可有效減少接觸所述哺乳動物或者鳥類的其他哺乳動物或者鳥類感染所述疾病的發病率。
2.權利要求1的方法，其中所述疾病是由選自病毒、細菌、真菌和酵母的微生物造成的。
3.權利要求2的方法，其中微生物是病毒，選自皰疹病毒、HIV病毒、AIDS病毒、流感病毒、H5N1流感病毒、鼻病毒、SARS病毒和呼吸道合胞病毒。
4.權利要求1的方法，其中組合物以選自片劑、膠囊、錠劑、圓錠、硬糖、可咀嚼組合物和牙用產品的形式給藥。
5.權利要求1的方法，其中組合物作為鼻噴霧劑或者咽喉噴霧劑給藥。
6.權利要求1的方法，其中第一種成分選自姜粉提取物、姜液體提取物、姜粉、整株姜植物體的至少一部分、姜酊劑、姜中含有的一種或多種化合物及其混合物；以及
第二種成分選自綠茶粉、綠茶粉提取物、綠茶液體提取物、整株綠茶植物體的至少一部分、綠茶酊劑、綠茶中含有的一種或多種化合物及其混合物。
7.權利要求1的方法，其中第一種成分包含姜根粉，第二種成分包含綠茶提取物。
8.權利要求1的方法，其中每克組合物包含大約1mg至大約20mg的綠茶提取物，以及大約1mg至大約150mg的姜根粉。
9.權利要求1的方法，其中組合物還包含可從姜黃獲得的第三種成分。
10.權利要求9的方法，其中可從姜黃獲得的成分選自姜黃粉提取物、姜黃液體提取物、姜黃提取物、一種或多種類姜黃素化合物、姜黃中含有的一種或多種其他化合物、姜黃粉、整株姜黃植物體的至少一部分、姜黃酊劑及其混合物。
11.權利要求9的方法，其中可從姜黃獲得的成分包含姜黃提取物。
12.權利要求9的方法，其中組合物包含大約1mg至大約20mg的姜黃粉提取物。
13.權利要求9的方法，其中組合物還包含可從辣根的根獲得的第四種成分。
14.權利要求1的方法，其中組合物還包含選自乙醇、白藜蘆醇、丙二醇和甘油的一種或多種成分。
15.權利要求14的方法，其中組合物包含乙醇。
16.一種組合物預防用途的方法，用于減輕疾病的一種或多種嚴重性、疾病癥狀的嚴重性以及疾病癥狀的發生率，包括給已經或者將要接觸疾病的哺乳動物或鳥類施用一定量的組合物的步驟，所述組合物包含
可從姜獲得的第一種成分；
可從綠茶獲得的第二種成分；
可接受的載體；
給藥后，所述量可有效減少疾病的一種或多種嚴重性、疾病癥狀的嚴重性以及疾病癥狀的發生率。
17.權利要求16的方法，其中所述疾病是由選自病毒、細菌、真菌和酵母的微生物造成的。
18.權利要求17的方法，其中病毒選自皰疹病毒、HIV病毒、AIDS病毒、流感病毒、H5N1流感病毒、鼻病毒、SARS病毒和呼吸道合胞病毒。
19.權利要求16的方法，其中組合物以選自片劑、膠囊、錠劑、圓錠、硬糖、可咀嚼組合物和牙用產品的形式給藥。
20.權利要求16的方法，其中組合物作為鼻噴霧劑或者咽喉噴霧劑給藥。
21.權利要求16的方法，其中
第一種成分選自姜粉提取物、姜液體提取物、姜粉、整株姜植物體的至少一部分、姜酊劑、姜中含有的一種或多種化合物及其混合物；
第二種成分選自綠茶粉、綠茶粉提取物、綠茶液體提取物、整株綠茶植物體的至少一部分、綠茶酊劑、綠茶中含有的一種或多種化合物及其混合物。
22.權利要求16的方法，其中第一種成分包含姜根粉，第二種成分包含綠茶提取物。
23.權利要求16的方法，其中每克組合物包含大約1mg至大約20mg的綠茶提取物，以及大約5mg至大約150mg的姜根粉。
24.權利要求16的方法，其中組合物還包含可從姜黃獲得的第三種成分。
25.權利要求24的方法，其中可從姜黃獲得的成分選自姜黃粉提取物、姜黃液體提取物、姜黃提取物、一種或多種類姜黃素化合物、姜黃中含有的一種或多種其他化合物、姜黃粉、整株姜黃植物體的至少一部分、姜黃酊劑及其混合物。
26.權利要求24的方法，其中可從姜黃獲得的成分包含姜黃提取物。
27.權利要求24的方法，其中組合物包含大約1mg至大約20mg的姜黃粉提取物。
28.權利要求16的方法，其中組合物還包含可從辣根的根獲得的第四種成分。
29.權利要求16的方法，其中組合物還包含選自乙醇、白藜蘆醇、丙二醇和甘油的一種或多種成分。
30.權利要求29的方法，其中組合物包含乙醇。
全文摘要
本發明公開了抗微生物組合物用于預防和抗感染的方法。該方法包括給藥哺乳動物或鳥類一定量組合物的步驟，該組合物含有從姜獲得的第一種成分；從綠茶獲得的第二種成分；可選的從姜黃獲得的第三種成分；以及可接受的載體。給藥后，組合物能夠有效降低感染疾病的發病率或預防疾病的傳染。還公開了用于本發明方法中的鼻和喉噴霧劑組合物。
文檔編號A61K36/82GK101111608SQ200580047661
公開日2008年1月23日 申請日期2005年12月14日 優先權日2004年12月14日
發明者理查德·A·羅森布盧姆 申請人:奎格利公司